곤충의 중요한 열 한계에 대한 높은 처리량 해석
Summary
열 제한은 급속한 기후 변화에 직면하여 중요한 정보인 유기체가 견딜 수 있는 환경을 예측할 수 있습니다. 여기에 설명된 곤충의 중요한 열 미니마 및 열 녹다운 시간을 평가하는 고처리량 프로토콜이 있습니다. 두 프로토콜 모두 처리량을 최대화하고 분석 비용을 최소화합니다.
Abstract
식물과 동물의 열 한도가 상하로 성능, 생존 및 지리적 분포를 예측하는 데 필수적이며 기후 변화에 대한 대응을 예측하는 데 필수적입니다. 이 작품은 곤충 열 제한을 측정하기위한 두 개의 고처리량 프로토콜을 설명합니다 : 중요한 열 미니마 (CT분)를평가하기위한 것과 다른 하나는 정적 열 스트레스에 대한 응답으로 열 노크 다운 시간 (KDT)을 평가합니다. CTmin 분석에서 개인은 아크릴 자켓 기둥에 배치되어 온도 경사로가 감소하고 적외선 센서를 사용하여 농어에서 떨어지면 계산됩니다. 열 KDT 분석에서, 개인은 스트레스, 뜨거운 온도로 설정 된 인큐베이터에 배치 96 우물 접시에 포함되어 있으며, 비디오는 더 이상 똑바로 유지하고 이동할 수없는 시간을 결정하기 위해 녹화. 이러한 프로토콜은 일반적으로 사용되는 기술에 비해 이점을 제공합니다. 두 가지 모두 저렴한 비용으로 비교적 빠르게 완료할 수 있습니다(~2h). CTmin 분석은 실험자 오류를 줄이고 한 번에 많은 수의 개인을 측정할 수 있습니다. 열 KDT 프로토콜은 각 분석기의 비디오 레코드를 생성하여 실험자 편향과 개인을 실시간으로 지속적으로 모니터링할 필요성을 제거합니다.
Introduction
곤충의 열 한계
온도를 포함한 환경 조건의 변화는 유기체 의 성능, 적합성, 생존 및 지리적 분포에 영향을 미치는 주요요인이다 1,,2. 상한 및 하열 제한은 유기체가 견딜 수 있는 환경의 이론적 범위를 결정하며, 따라서 이러한 제한은 특히 기후 변화에 직면하여 식물 및 동물 분포의 중요한 예측 변수입니다3,,4. 따라서 열 제한을 정확하게 측정하는 프로토콜은 생태학자, 생리학자, 진화 생물학자 및 보존 생물학자에게 중요한 도구입니다.
가장 풍부하고 다양한 육상 동물로서 곤충은 열 제한을 측정하는 데 자주 사용됩니다. 임계 열 최대(CT최대)및 임계 열 미니마(CTmin)는일반적으로 열 공차,5,6,67의내외 및 상호 특이적 변동을 평가하는 데 사용됩니다. CT최대 및 CT분성장, 생식 출력 및 동작을 포함한 다중 표현형에 대해 측정할 수 있지만, 가장 일반적으로 운동 기능5,,6,,7에적용됩니다. 따라서,CT최대(열 녹다운 온도라고도 함)와 CT분은 곤충이 모터 기능을 잃고,,5,6,7,78,9,,10,,11을똑바로 유지할 수 없는 높고 낮은 온도로 정의됩니다.5 CTmin은 차가운 혼수 상태에 의해 가져온 가역적 인 마비, 차가운 혼수 상태에 대한 발병과일치6. 열 한계에 마비는 종종 가역, 이러한 온도에 지속적인 노출생태사멸에이르게 5.
열 한계를 측정하는 일반적인 방법
다양한 장치가 열 제한을 측정하는 데 사용되었습니다 (싱클레어 등에서 요약) 6.,간략하게 곤충은 인큐베이터(12,,13)에서 가열 또는 냉각되며,12용기는 유체목욕(11,14,15,,16,알루미늄 블록10,,17,또는 재킷 용기18)에침수되어 운동이 중단될 때까지 모니터링된다., 분석 중에 곤충을 모니터링하기 위해, 가장 일반적인 방법은 개인이 지속적으로 녹화 된 비디오,,6,9,,10,,11,15,,17로실시간으로 또는 소급하여 모니터링되는 직접 관찰이다. 직접 관찰 방법은 장비 요구 사항이 최소화되지만 노동 집약적이며 처리량을 제한합니다. 대안적으로, 곤충은6,19,,20,,21에서 떨어지거나 활동모니터(13)를사용하여 개별 시간에 개인을 수집하여 간접적으로 관찰될 수 있다.,
열 제한을 측정하기 위한 간접 적인 방법은 일반적으로 처리량이 높고 직접 관찰 방법보다 잠재적으로 오류가 발생하기 쉽습니다. 간접 모니터링을 위한 가장 일반적인 방법은 재킷 온도 제어 컬럼6,8,819,,20,21을사용합니다.,, 곤충은 농어가있는 기둥 내부에 배치되며, 내부 챔버의 온도는 기둥의 재킷 안대기를 통해 온도 조절 유체 욕조에서 유체를 펌핑하여 제어됩니다. 열 한도에 도달하는 개인은 농어에서 떨어지고 개별 온도 또는 시간 간격으로 수집됩니다. 이 방법은 CT분에적합하지만 온도가 증가할 때 파리가 자발적으로 컬럼 의 바닥에서 걸어 나있기 때문에 CT최대에적합하지 않은 것으로 나타났습니다. 여기에 설명된 새로운 방법은 자동화된 측정 중에 파리를 개별적으로 포함시켜 이 문제를 해결합니다.
관찰 방법 외에도 두 가지 유형의 온도 요법이 일반적으로 상열 제한을 평가하는 데 사용됩니다. 동적 해석은 모터 기능이 손실될 때까지 점차적으로 온도를 증가시로 구성됩니다. 그 온도는 동적 CT최대7,,8,,9,,13이다. 대조적으로, 정적 해석은 모터 기능이 손실될 때까지 일정한 스트레스 온도로 구성됩니다. 그 시점은 열 녹다운 시간(열 KDT)이며, 또한 Jørgensen 외.7,8,,9,,16,,22에의해 최근 논문에서 정적 CT최대(sCT max)라고도한다., CT최대 및 열 녹다운 분석(열 KD 분석)은 서로 다른 단위로 메트릭을 생성하지만, 두 특성의 수학적 모델링은 열 내성에 대한 유사한 정보를 제공하고 생태학적으로 관련된8,,9를나타냅니다. 동적 분해는 환경 조건에 비해 비교할 수 있는 온도를 산출하며, 열 틈새 시장을 가진 종 간의 비교와 같은 열 내성에서 큰 차이가 있을 때 바람직하다. 그러나 열 손상 축적을 위한 Q10이 높기 때문에, 정적 분석은 열내성 차성 변화와 같은 작은 효과 크기를 검출하는 것이 바람직할 수 있다9. 또한, 실질적으로 말하자면, 정적 분석은 동적 분석보다 덜 정교한 장비를 필요로한다.
목표
이 논문의 목적은 향후 연구에서 쓸데옥 곤충의 열 한계를 평가하는 데 사용할 수 있는 CTmin 및 열 KD 에세이에 대한 방법을 공식화하는 것입니다. 이 프로토콜은 이전에 확립된 방법론에서 적용되었으며 높은 처리량, 자동화 및 비용 효율적인 프로토콜로 설계되었습니다. 두 분석 모두 짧은 시간(~2h)으로 완료할 수 있으며, 이는 반복성 이나 정확성을 희생하지 않고 많은 양의 데이터를 생성하여 하루에 여러 실험을 수행할 수 있음을 의미합니다. 이 설정을 사용하면 96개의 파리의 열 내성을 동시에 측정할 수 있으며, CTmin의 컬럼은 수용에 적합한 표면적이 있는 경우 100개 이상의 파리를 보유할 수 있습니다.
CT최소를 관찰하는 높은 처리량 방법은 자동으로 파리수를 계산하는 적외선 센서를 추가하여 일반적인 재킷 컬럼 방법론을 수정합니다. 카운팅을 위한 적외선 센서의 사용은 1996년23년에 Shuman et al.에 의해 처음 제안되었지만 널리 채택되지 않았습니다. 적외선 센서를 추가하면 개별 간격으로 데이터를 수집하는 대신 연속 데이터 생성을 가능하게 합니다. 또한 이 프로토콜은 수동 데이터 입력을 제거하고 개별 시간 지점에서 잭컬럼 아래에 수집 튜브를 수동으로 전환해야 하는 필요성을 제거하여 실험자 오류를 최소화합니다.
열 KDT를 기록하는 고처리량 방법은 곤충10,,12에서열 내성의 두 가지 이전 연구에서 수정된다. 개별 파리는 온도 조절 인큐베이터에 96 웰 플레이트에 저장되며 비디오가 기록됩니다. 이 프로토콜은 실험을 다시 재생하여 실험을 검토하고 확인할 수 있기 때문에 열 KDT를 결정하는 실험자 편향을 최소화합니다. 이 프로토콜은 비디오 분석 속도를 높이는 데 사용할 수 있는 사용자 지정 Python 스크립트 집합도 제공합니다. 개별 우물의 사용은 다른 개인이 이동하거나 넘어질 때 발생할 수있는 간섭을 제거, 개인의 그룹이 같은 경기장에서 관찰 될 때 문제가 될 수있습니다 10,,17. 또한 온도 조절 인큐베이터는 온도 제어 알루미늄블록(10)에서때때로 관찰되는 온도 그라데이션과 달리 모든 96개의 우물에서 안정적인 온도를 제공합니다. 또한 96 개의 잘 기록 방법은 동적 CT최대 및 잠재적으로 CT최소를 측정하도록 조정할 수 있습니다(토론 참조).
각 프로토콜을 입증하기 위해, 드로소필라 멜라노가스터 유전자 참조 패널(DGRP)의 선택 라인에서 성인 드로소필라 멜라노가스터 여성의 열 한계를24를비교하였다. 예비 실험이 열 내성에서 상당한 차이를 나타내기 때문에 이러한 라인을 선택했습니다. 이러한 해석은 열 내성의 차이를 차별하는 견고한 방법임이 입증되었습니다. 다음 두 프로토콜, 높은 처리량 CTmin 분석(섹션 1) 및 고처리량 열 KD 분석(섹션 2)은 성인 Drosophila와같은 장치에 장착할 수 있는 모든 motile 곤충 수명 단계에 대해 CTmin 및 열 KDT 데이터를 생성하는 데 필요한 작업을 설명합니다. CTmin의 경우 곤충이 농어를 앉을 수 있어야 합니다. 여기서, 각 분석은 성인 Drosophila 멜라노가스터에서입증된다. 그러나 다른 taxa 또는 생활 단계6에대해 수정이 필요할 수 있습니다. 사소한 변화는 CTmin 분석에서 더 큰 표본을 수용하기 위해 더 큰 개구부를 가진 농어 재료를 사용하거나 열 KD 분석에서 느린 움직이는 곤충 또는 생명 단계의 미묘한 KDT를 분별하기 위해 더 높은 품질의 카메라를 사용하는 것을 포함할 수 있습니다. 이 프로토콜은 파리 를 준비하는 방법을 설명하지 않지만반복성(25)을 보장하기 위해 양육 프로토콜을 표준화하는 것이 중요합니다(참조 가르시아와 티츠26 및 Teets 및 한27참조). 제공된 프로토콜에는 장치를 구축하고 설정하는 방법, 측정 기록 방법 및 데이터 분석에 대한 간략한 설명이 포함됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
위에 자세히 설명된 두 가지 방법은 상부 및 하한 열 제한에 대한 생태학적으로 관련된 메트릭의 높은 처리량 데이터를 생성합니다. 이러한 프로토콜은 곤충 열 제한에 대한 연구에 공통된 이전에 확립된 방법론을 기반으로 합니다(싱클레어 등에서 요약) 6. 두 프로토콜모두 짧은 시간(~2h h)으로 완료할 수 있고, 샘플 크기가 큰 데이터 세트를 생성하고, 반복성 이나 정확성을 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
플라이 키싱에 도움을 주신 엘리 맥케이브에게 감사드립니다. 이 작품은 미국 농무부 국립 식품 농업 해치 프로젝트 보조금 1010996 및 국립 과학 재단이 N.M.T에 OIA-1826689를 부여하여 지원합니다.
Materials
| ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) | Thermo Scientific; Waltham, MA | 153-5401 | |
| C922 Pro Stream Webcam | Logitech; Newark, CA | 960-001087 | |
| Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm | Any | Any | |
| Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44036 | |
| Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 440515 | |
| Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44041 | |
| Clear silicone sealant | Any | Any | |
| Collection tube (15 ml) | Any | Any | |
| Cordless Drill | Any | Any | |
| Drosophila Funnel Monitor (DFM) | TriKinetics; Waltham, MA | DFM | Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point |
| DAM data collection software | TriKinetics; Waltham, MA | Records data input from the DFM | |
| Fly Storage Lid | FlySorter; Seatle, WA | FS-96LID-5PK | Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay |
| Fly Storage Plate | FlySorter; Seatle, WA | FS-96PLATE-5PK | Used to hold flies during in the sCTmax assay |
| Fly Food Tray | FlySorter; Seatle, WA | FS-TRAY-5PK | Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay |
| Glass funnel | Kimax | 28950-75 | 75mm |
| Gutter guard | Any | Any | ~0.5 cm diameter openings |
| Hacksaw | Any | Any | |
| Heratherm Thermo Scientific incubator | Thermo Scientific; Waltham, MA | OMS100 | |
| Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 | United States Plastic Corp., OH | 61135 | |
| Hot glue gun and glue | Any | Any | |
| Light Source | Any | Any | |
| Magnets | Any | Any | |
| OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software | OMEGA; Norwalk, CT | ||
| OMEGA thermocouple (Type T) | OMEGA; Norwalk, CT | 5LRTC-TT-K-20-36 | |
| Plastic funnel | Any | Any | 2" diameter |
| Plastic tubing – 0.6 cm diameter | United States Plastic Corp., OH | 62852 | |
| Retort ring | Any | Any | 2" diameter |
| Retort stand | Any | Any | |
| Retort three-prong clamp | Any | Any | |
| Rstudio | |||
| Serial port connector (PSIU9) | TriKinetics; Waltham, MA | PSIU9 | Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections |
| Styrofoam (2" thick) | Any | Any | |
| Tape | Any | Any | |
| Uninterrupted Power Supply (PS9-1) | TriKinetics; Waltham, MA | PS9-1 | Power supply for the DFM and PSIU9 |
| Weld-on #4 Acrylic Cement | United States Plastic Corp., OH | 45737 |
References
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
- Angilletta, M. J. . Thermal Adaptation: A Theoretical and Empirical Synthesis. , (2009).
- Coumou, D., Rahms Torf, S. A decade of weather extremes. Nature Climate Change. 2 (7), 491-496 (2012).
- Wang, G., Dillon, M. E. Recent geographic convergence in diurnal and annual temperature cycling flattens global thermal profiles. Nature Climate Change. 4 (11), 988-992 (2014).
- MacMillan, H. A. Dissecting cause from consequence: A systematic approach to thermal limits. Journal of Experimental Biology. 222 (4), 191593 (2019).
- Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: History and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
- Cooper, B. S., Williams, B. H., Angilletta, M. J. Unifying indices of heat tolerance in ectotherms. Journal of Thermal Biology. 33 (6), 320-323 (2008).
- Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits. Functional Ecology. 33 (4), 629-642 (2019).
- Hazell, S. P., Pedersen, B. P., Worland, M. R., Blackburn, T. M., Bale, J. S. A method for the rapid measurement of thermal tolerance traits in studies of small insects. Physiological Entomology. 33 (4), 389-394 (2008).
- Andersen, J. L., et al. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
- Hu, X. P., Appel, A. G. Seasonal variation of critical thermal limits and temperature tolerance in Formosan and eastern subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae). Environmental Entomology. 33 (2), 197-205 (2004).
- Rolandi, C., Lighton, J. R. B., de la Vega, G. J., Schilman, P. E., Mensch, J. Genetic variation for tolerance to high temperatures in a population of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 8 (21), 10374-10383 (2018).
- Overgaard, J., Kristensen, T. N., Sørensen, J. G. Validity of thermal ramping assays used to assess thermal tolerance in arthropods. PLoS ONE. 7 (3), 1-7 (2012).
- Klok, C. J., Chown, S. L. Critical thermal limits, temperature tolerance and water balance of a sub-Antarctic kelp fly, Paractora dreuxi (Lepidoptera: Tineidae). Journal of Insect Physiology. 43, 685-694 (1997).
- Salachan, P. V., Burgaud, H., Sørensen, J. G. Testing the thermal limits: Non-linear reaction norms drive disparate thermal acclimation responses in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 118 (September), 103946 (2019).
- Everatt, M. J., Bale, J. S., Convey, P., Worland, M. R., Hayward, S. A. L. The effect of acclimation temperature on thermal activity thresholds in polar terrestrial invertebrates. Journal of Insect Physiology. 59 (10), 1057-1064 (2013).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The role of the gut in insect chilling injury: Cold-Induced disruption of osmoregulation in the fall field cricket, Gryllus pennsylvanicus. Journal of Experimental Biology. 214 (5), 726-734 (2011).
- Huey, R. B., Crill, W. D., Kingsolver, J. G., Weber, K. E. A method for rapid measurement of heat or cold resistance of small insects. British Ecological Society. 6 (4), 489-494 (1992).
- Jenkins, N. L., Hoffmann, A. A. Genetic and maternal variation for heat resistance in drosophila from the field. Genetics. 137 (3), 783-789 (1994).
- Ransberry, V. E., MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The relationship between chill-coma onset and recovery at the extremes of the thermal window of Drosophila melanogaster. Physiological and Biochemical Zoology. 84 (6), 553-559 (2011).
- Sørensen, M. H., et al. Rapid induction of the heat hardening response in an Arctic insect. Biology Letters. 15 (10), (2019).
- Shuman, D., Coffelt, J. A., Weaver, D. K. A computer-based electronic fall-through probe insect counter for monitoring infestation in stored products. Transactions of the American Society of Agricultural Engineers. 39 (5), 1773-1780 (1996).
- MacKay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: A laboratory handbook. , (2005).
- Garcia, M. J., Teets, N. M. Cold stress results in sustained locomotor and behavioral deficits in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological and Integrative Physiology. 331 (3), 192-200 (2019).
- Teets, N. M., Hahn, D. A. Genetic variation in the shape of cold-survival curves in a single fly population suggests potential for selection from climate variability. Journal of Evolutionary Biology. 31 (4), 543-555 (2018).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 45 (8), 719-726 (1999).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. Mechanisms underlying insect chill-coma. Journal of Insect Physiology. 57 (1), 12-20 (2011).
- Salachan, P. V., Sørensen, J. G. Critical thermal limits affected differently by developmental and adult thermal fluctuations. Journal of Experimental Biology. 220 (23), 4471-4478 (2017).
- Hoffmann, A. A., Hallas, R., Anderson, A. R., Telonis-Scott, M. Evidence for a robust sex-specific trade-off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster. Journal of Evolutionary Biology. 18 (4), 804-810 (2005).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Rapid cold-hardening of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) during ecologically based thermoperiodic cycles. Journal of Experimental Biology. 204 (9), 1659-1666 (2001).
- Sinclair, B. J., Vernon, P., Klok, C. J., Chown, S. L. Insects at low temperatures: An ecological perspective. Trends in Ecology and Evolution. 18 (5), 257-262 (2003).
