Analyser med høy gjennomstrømning av kritiske termiske grenser i insekter
Summary
Termiske grenser kan forutsi miljøene organismene tolererer, noe som er verdifull informasjon i møte med raske klimaendringer. Beskrevet her er høy gjennomstrømningsprotokoller for å vurdere kritisk termisk minima og varme knockdown tid i insekter. Begge protokollene maksimerer gjennomstrømningen og minimerer kostnadene for analysene.
Abstract
Øvre og nedre termiske grenser for planter og dyr er viktige prediktorer for deres prestasjoner, overlevelse og geografiske fordelinger, og er avgjørende for å forutsi tiltak mot klimaendringer. Dette arbeidet beskriver to høygjennomstrømningsprotokoller for måling av insekts termiske grenser: en for å vurdere kritisk termisk minima (CT min ), ogdenandre for å vurdere varme slå ned tid (KDT) som svar på en statisk varmestressor. I CTmin-analysen plasseres individer i en akryljakket kolonne, utsatt for en avtagende temperaturrampe, og telles når de faller fra perches ved hjelp av en infrarød sensor. I varmen KDT analyse, enkeltpersoner er inneholdt i en 96 brønnplate, plassert i en inkubator satt til en stressende, varm temperatur, og video registrert for å bestemme tidspunktet da de ikke lenger kan forbli oppreist og flytte. Disse protokollene gir fordeler fremfor vanlige teknikker. Begge analysene er lave kostnader og kan fullføres relativt raskt (~ 2 h). CTmin analysen reduserer experimenter feil og kan måle et stort antall individer på en gang. Varme-KDT-protokollen genererer en videoopptak av hver analyse og fjerner dermed eksperimentererbias og behovet for å kontinuerlig overvåke enkeltpersoner i sanntid.
Introduction
Termiske grenser for insekter
Variasjon i miljøforhold, inkludert temperatur, er en viktig faktor som påvirker ytelsen, kondisjonen, overlevelsen og den geografiskefordelingen av organismer 1,,2. Øvre og nedre termiske grenser bestemmer det teoretiske spekteret av miljøer en organisme kan tolerere, og derfor er disse grensene viktige prediktorer for plante- og dyrefordelinger, spesielt i møte medklimaendringer 3,4. Dermed er protokoller for å måle termiske grenser nøyaktig viktige verktøy for økologer, fysiologer, evolusjonære biologer og bevaringsbiologer, blant andre.
Som de mest tallrike og mangfoldige terrestriske dyrene brukes insekter ofte til målinger av termiske grenser. Kritisk termisk maxima (CTmax) og kritisk termisk minima (CTmin) brukes vanligvis til å vurdere intra- og interspesifikk variasjon i termisktoleranse 5,,6,,7. Mens CTmax og CTmin kan måles for flere fenotyper, inkludert vekst, reproduktiv produksjon og atferd, brukes de oftest på lokomotoriskfunksjon 5,,6,,7. Dermed er CTmax (også kalt varme knockdown temperatur) og CTmin ofte definert som de høye og lave temperaturene der insekter mister motorfunksjonen og ikke kan forbli oppreist5,,6,,7,,8,,9,,10,,11. CTmin sammenfaller med utbruddet av chill koma, en reversibel lammelse forårsaket av kalde temperaturer6. Mens lammelse ved de termiske grensene ofte er reversibel, fører fortsatt eksponering for disse temperaturene til økologisk død5.
Vanlige metoder for måling av termiske grenser
En rekke apparater har blitt brukt til å måle termiske grenser (oppsummert i Sinclair et al.) 6. Kort, insekter er oppvarmet eller avkjølt i inkubatorer12,13, beholdere nedsenket i flytende bad11,14,15,16, aluminiumblokker 10,17, eller jakkede beholdere18, og overvåket til bevegelse opphører. For å overvåke insekter under analysen er den vanligste metoden direkte observasjon, der enkeltpersoner overvåkes kontinuerlig i sanntid eller retrospektivt med innspilt video6,9,10,11,15,17. Mens direkte observasjonsmetoder har minimale utstyrskrav, er de arbeidskrevende og begrenser gjennomstrømningen. Alternativt kan insekter observeres indirekte ved å samle individer til diskrete tider når de faller fra perches6,19,20,21 eller ved hjelp av aktivitetsmonitorer13.
Indirekte metoder for måling av termiske grenser er generelt høyere gjennomstrømming og potensielt mindre feil utsatt enn direkte observasjonsmetoder. Den vanligste metoden for indirekte overvåking bruker en jakket temperaturkontrollert kolonne6,8,19,20,21. Insekter plasseres inne i en kolonne med perches, og temperaturen i det indre kammeret styres ved å pumpe væske fra et temperaturkontrollert væskebad gjennom den jakkede foringen av kolonnen. Personer som når sin termiske grense faller fra abbor og samles ved diskrete temperaturer eller tidsintervaller. Mens denne metoden fungerer bra for CTmin, har den blitt funnet uegnet for CTmax, fordi fluer frivillig går ut av bunnen av kolonnen når temperaturen øker. Den nye metoden som er beskrevet her omgår dette problemet ved å individuelt inneholde fluer under automatiserte målinger.
I tillegg til observasjonsmetoden brukes to typer temperaturregimer ofte til å vurdere øvre termiske grenser. Dynamiske analyser består av gradvis økende temperatur til motorfunksjonen går tapt; at temperaturen er den dynamiske CTmax7,8,9,13. I motsetning består statiske analyser av en konstant stressende temperatur til motorfunksjonen går tapt; det tidspunktet er varme knockdown tid (varme KDT), også kalt statisk CTmax (sCTmax) i en nylig papir av Jørgensen et al.7,8,9,16,22. Selv om CTmax og varme knockdown analyser (varme KD-analyser) produserer beregninger med forskjellige enheter, indikerer matematisk modellering av de to egenskapene at de gir sammenlignbar informasjon om varmetoleranse og er begge økologisk relevante8,9. Dynamiske analyser gir en temperatur som kan sammenlignes med miljøforhold, og de er å foretrekke når det er store forskjeller i varmetoleranse, for eksempel sammenligninger mellom arter med vidt forskjellige termiske nisjer. På grunn av den høye Q10 for opphopning av varmeskader kan imidlertid en statisk analyse være å foretrekke for å oppdage små effektstørrelser, for eksempel intraspesifikk variasjon ivarmetoleranse 9. Også praktisk talt krever en statisk analyse mindre sofistikert utstyr enn en dynamisk analyse.
Målet
Målet med dette papiret er å formalisere metoder for CTmin og varme KD-analyser som kan brukes i fremtidig forskning for å vurdere de termiske grensene for motile insekter. Protokollene er tilpasset fra tidligere etablerte metoder og er utformet for å være høy gjennomstrømning, automatisert og kostnadseffektiv. Begge analysene kan fullføres på kort tid (~ 2 timer), noe som betyr at flere eksperimenter kan utføres på en enkelt dag, og produserer store mengder data uten å ofre repeterbarhet eller nøyaktighet. Med dette oppsettet kan varmetoleransen til 96 fluer måles samtidig, mens kolonnen for CTmin kan holde mer enn 100 fluer, forutsatt at det er tilstrekkelig overflateareal for perching.
Metoden for høy gjennomstrømming for å observere CTmin endrer den vanlige jakkede kolonnemetodikken med tillegg av en infrarød sensor for automatisk å telle fluer. Bruken av en infrarød sensor for telling ble først foreslått av Shuman et al. i 199623, men har ikke blitt allment vedtatt. Tilsetningen av den infrarøde sensoren gjør det mulig å samle kontinuerlige data i stedet for å samle inn data med diskrete intervaller. Denne protokollen minimerer også eksperimentererfeil ved å eliminere manuell dataregistrering og behovet for å manuelt bytte innsamlingsrør under den jekkede kolonnen på diskrete tidspunkter.
Høy gjennomstrømningsmetoden for registrering av varme KDT er modifisert fra to tidligere studier av varmetoleranse hosinsekter 10,12. Individuelle fluer lagres i en 96 brønnplate i en temperaturkontrollert inkubator og video blir tatt opp. Denne protokollen minimerer eksperimentererbias ved å bestemme varme-KDT fordi eksperimenter kan gjennomgås og verifiseres ved å spille av opptaket. Denne protokollen gir også et sett med tilpassede Python-skript som kan brukes til å øke hastigheten på videoanalyse. Bruk av individuelle brønner eliminerer forstyrrelser som kan oppstå når andre individer beveger seg rundt eller faller over, noe som kan være et problem når grupper av individer observeres i samme arena10,17. Videre gir den temperaturkontrollerte inkubatoren en stabil temperatur på tvers av alle 96 brønner, i motsetning til temperaturgradienten som noen ganger observeres over en temperaturkontrollert aluminiumsblokk10. Vær også oppmerksom på at 96-brønnopptaksmetoden kan tilpasses for å måle dynamisk CTmax og potensielt CTmin (se Diskusjon).
For å demonstrere hver protokoll ble de termiske grensene for voksne Drosophila melanogaster kvinner fra utvalgte linjer av Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP)sammenlignet 24. Disse linjene ble valgt fordi foreløpige eksperimenter indikerte betydelige forskjeller i termisk toleranse. Disse analysene viste seg å være robuste metoder for diskriminering av forskjeller i termisk toleranse. Følgende to protokoller,CT min-analyse med høy gjennomstrømning (avsnitt 1) og høy gjennomstrømningsvarme KD-analyse (avsnitt 2), beskriver de nødvendige tiltakene for å produsere CTmin og varme KDT-data for ethvert motilt insektlivsstadium som er i stand til å passe inn i apparatene, for eksempel voksne Drosophila. For CTmin er det også viktig at insektet kan abbor. Her er hver analyse demonstrert hos voksne Drosophila melanogaster. Endringer kan imidlertid være nødvendig for andre taxa eller livsstadier6. Mindre endringer kan omfatte bruk av perching materiale med større åpninger for å imøtekomme større prøver i CTmin analyse eller bruke en høyere kvalitet kamera for å skjelne den subtile KDT av en langsom bevegelig insekt eller livsstadium i varmen KD analyse. Denne protokollen beskriver ikke metoder for å forberede fluer, men det er viktig å standardisere oppdrettsprotokoller for å sikre repeterbarhet25 (se Garcia og Teets26 og Teets og Hahn27). Protokollene som er gitt inkluderer informasjon om hvordan du bygger og setter opp apparater, hvordan du registrerer målinger, og en kort beskrivelse av dataanalyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
De to metodene som er beskrevet ovenfor, genererer data med høy gjennomstrømning av økologisk relevante beregninger for øvre og nedre termiske grenser. Disse protokollene bygger på tidligere etablerte metoder som er felles for forskning på insektsmiske grenser (oppsummert i Sinclair et al.) 6. Begge protokollene kan fullføres på kort tid (~ 2 timer hver), produsere datasett med store prøvestørrelser, ikke ofre repeterbarhet eller nøyaktighet, og minimere eksperimentererfeil ved å e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Ellie McCabe for hjelp med flyoppdragelse. Dette arbeidet støttes av United States Department of Agriculture National Institute of Food and Agriculture Hatch Project grant 1010996 og National Science Foundation gi OIA-1826689 til N.M.T.
Materials
| ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) | Thermo Scientific; Waltham, MA | 153-5401 | |
| C922 Pro Stream Webcam | Logitech; Newark, CA | 960-001087 | |
| Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm | Any | Any | |
| Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44036 | |
| Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 440515 | |
| Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44041 | |
| Clear silicone sealant | Any | Any | |
| Collection tube (15 ml) | Any | Any | |
| Cordless Drill | Any | Any | |
| Drosophila Funnel Monitor (DFM) | TriKinetics; Waltham, MA | DFM | Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point |
| DAM data collection software | TriKinetics; Waltham, MA | Records data input from the DFM | |
| Fly Storage Lid | FlySorter; Seatle, WA | FS-96LID-5PK | Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay |
| Fly Storage Plate | FlySorter; Seatle, WA | FS-96PLATE-5PK | Used to hold flies during in the sCTmax assay |
| Fly Food Tray | FlySorter; Seatle, WA | FS-TRAY-5PK | Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay |
| Glass funnel | Kimax | 28950-75 | 75mm |
| Gutter guard | Any | Any | ~0.5 cm diameter openings |
| Hacksaw | Any | Any | |
| Heratherm Thermo Scientific incubator | Thermo Scientific; Waltham, MA | OMS100 | |
| Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 | United States Plastic Corp., OH | 61135 | |
| Hot glue gun and glue | Any | Any | |
| Light Source | Any | Any | |
| Magnets | Any | Any | |
| OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software | OMEGA; Norwalk, CT | ||
| OMEGA thermocouple (Type T) | OMEGA; Norwalk, CT | 5LRTC-TT-K-20-36 | |
| Plastic funnel | Any | Any | 2" diameter |
| Plastic tubing – 0.6 cm diameter | United States Plastic Corp., OH | 62852 | |
| Retort ring | Any | Any | 2" diameter |
| Retort stand | Any | Any | |
| Retort three-prong clamp | Any | Any | |
| Rstudio | |||
| Serial port connector (PSIU9) | TriKinetics; Waltham, MA | PSIU9 | Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections |
| Styrofoam (2" thick) | Any | Any | |
| Tape | Any | Any | |
| Uninterrupted Power Supply (PS9-1) | TriKinetics; Waltham, MA | PS9-1 | Power supply for the DFM and PSIU9 |
| Weld-on #4 Acrylic Cement | United States Plastic Corp., OH | 45737 |
References
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
- Angilletta, M. J. . Thermal Adaptation: A Theoretical and Empirical Synthesis. , (2009).
- Coumou, D., Rahms Torf, S. A decade of weather extremes. Nature Climate Change. 2 (7), 491-496 (2012).
- Wang, G., Dillon, M. E. Recent geographic convergence in diurnal and annual temperature cycling flattens global thermal profiles. Nature Climate Change. 4 (11), 988-992 (2014).
- MacMillan, H. A. Dissecting cause from consequence: A systematic approach to thermal limits. Journal of Experimental Biology. 222 (4), 191593 (2019).
- Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: History and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
- Cooper, B. S., Williams, B. H., Angilletta, M. J. Unifying indices of heat tolerance in ectotherms. Journal of Thermal Biology. 33 (6), 320-323 (2008).
- Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits. Functional Ecology. 33 (4), 629-642 (2019).
- Hazell, S. P., Pedersen, B. P., Worland, M. R., Blackburn, T. M., Bale, J. S. A method for the rapid measurement of thermal tolerance traits in studies of small insects. Physiological Entomology. 33 (4), 389-394 (2008).
- Andersen, J. L., et al. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
- Hu, X. P., Appel, A. G. Seasonal variation of critical thermal limits and temperature tolerance in Formosan and eastern subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae). Environmental Entomology. 33 (2), 197-205 (2004).
- Rolandi, C., Lighton, J. R. B., de la Vega, G. J., Schilman, P. E., Mensch, J. Genetic variation for tolerance to high temperatures in a population of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 8 (21), 10374-10383 (2018).
- Overgaard, J., Kristensen, T. N., Sørensen, J. G. Validity of thermal ramping assays used to assess thermal tolerance in arthropods. PLoS ONE. 7 (3), 1-7 (2012).
- Klok, C. J., Chown, S. L. Critical thermal limits, temperature tolerance and water balance of a sub-Antarctic kelp fly, Paractora dreuxi (Lepidoptera: Tineidae). Journal of Insect Physiology. 43, 685-694 (1997).
- Salachan, P. V., Burgaud, H., Sørensen, J. G. Testing the thermal limits: Non-linear reaction norms drive disparate thermal acclimation responses in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 118 (September), 103946 (2019).
- Everatt, M. J., Bale, J. S., Convey, P., Worland, M. R., Hayward, S. A. L. The effect of acclimation temperature on thermal activity thresholds in polar terrestrial invertebrates. Journal of Insect Physiology. 59 (10), 1057-1064 (2013).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The role of the gut in insect chilling injury: Cold-Induced disruption of osmoregulation in the fall field cricket, Gryllus pennsylvanicus. Journal of Experimental Biology. 214 (5), 726-734 (2011).
- Huey, R. B., Crill, W. D., Kingsolver, J. G., Weber, K. E. A method for rapid measurement of heat or cold resistance of small insects. British Ecological Society. 6 (4), 489-494 (1992).
- Jenkins, N. L., Hoffmann, A. A. Genetic and maternal variation for heat resistance in drosophila from the field. Genetics. 137 (3), 783-789 (1994).
- Ransberry, V. E., MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The relationship between chill-coma onset and recovery at the extremes of the thermal window of Drosophila melanogaster. Physiological and Biochemical Zoology. 84 (6), 553-559 (2011).
- Sørensen, M. H., et al. Rapid induction of the heat hardening response in an Arctic insect. Biology Letters. 15 (10), (2019).
- Shuman, D., Coffelt, J. A., Weaver, D. K. A computer-based electronic fall-through probe insect counter for monitoring infestation in stored products. Transactions of the American Society of Agricultural Engineers. 39 (5), 1773-1780 (1996).
- MacKay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: A laboratory handbook. , (2005).
- Garcia, M. J., Teets, N. M. Cold stress results in sustained locomotor and behavioral deficits in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological and Integrative Physiology. 331 (3), 192-200 (2019).
- Teets, N. M., Hahn, D. A. Genetic variation in the shape of cold-survival curves in a single fly population suggests potential for selection from climate variability. Journal of Evolutionary Biology. 31 (4), 543-555 (2018).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 45 (8), 719-726 (1999).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. Mechanisms underlying insect chill-coma. Journal of Insect Physiology. 57 (1), 12-20 (2011).
- Salachan, P. V., Sørensen, J. G. Critical thermal limits affected differently by developmental and adult thermal fluctuations. Journal of Experimental Biology. 220 (23), 4471-4478 (2017).
- Hoffmann, A. A., Hallas, R., Anderson, A. R., Telonis-Scott, M. Evidence for a robust sex-specific trade-off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster. Journal of Evolutionary Biology. 18 (4), 804-810 (2005).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Rapid cold-hardening of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) during ecologically based thermoperiodic cycles. Journal of Experimental Biology. 204 (9), 1659-1666 (2001).
- Sinclair, B. J., Vernon, P., Klok, C. J., Chown, S. L. Insects at low temperatures: An ecological perspective. Trends in Ecology and Evolution. 18 (5), 257-262 (2003).
