High-Throughput Assays af kritiske termiske grænser i insekter
Summary
Termiske grænser kan forudsige de miljøer organismer tolerere, hvilket er værdifuld information i lyset af de hurtige klimaændringer. Beskrevet her er high-throughput protokoller til at vurdere kritiske termiske minima og varme knockdown tid hos insekter. Begge protokoller maksimerer gennemløbet og minimerer omkostningerne ved analyserne.
Abstract
Øvre og lavere termiske grænser for planter og dyr er vigtige prædiktorer for deres ydeevne, overlevelse og geografiske fordelinger, og er afgørende for at forudsige reaktioner på klimaændringer. Dette arbejde beskriver to high-throughput protokoller til måling af insekt termiske grænser: en til vurdering af kritiske termiske minima (CTmin), og den anden til vurdering af varme knock down tid (KDT) som reaktion på en statisk varme stressor. I CTmin assay, enkeltpersoner er placeret i en akryl-jacketed kolonne, udsat for en faldende temperatur rampe, og tælles som de falder fra deres siddepinde ved hjælp af en infrarød sensor. I varmen KDT assay, enkeltpersoner er indeholdt i en 96 brøndplade, placeret i en inkubator indstillet til en stressende, varm temperatur, og video optaget til at bestemme det tidspunkt, hvor de ikke længere kan forblive oprejst og flytte. Disse protokoller giver fordele i forhold til almindeligt anvendte teknikker. Begge analyser er lave omkostninger og kan afsluttes relativt hurtigt (~ 2 h). CTmin assay reducerer eksperimentator fejl og kan måle et stort antal personer på én gang. Varmen KDT-protokollen genererer en videooptagelse af hver analyse og fjerner dermed eksperimentatorbias og behovet for løbende at overvåge enkeltpersoner i realtid.
Introduction
Termiske grænser for insekter
Variation i miljøforhold, herunder temperatur, er en væsentlig faktor, der påvirker organismer1,2’sydeevne, kondition, overlevelse oggeografiske fordeling. Øvre og nedre termiske grænser bestemmer det teoretiske område af miljøer en organisme kan tåle, og derfor er disse grænser vigtige prædiktorer for plante- og dyredistributioner, især i lyset afklimaændringerne 3,4. Således protokoller til præcist at måle termiske grænser er vigtige værktøjer for økologer, fysiologer, evolutionære biologer, og bevarelse biologer, blandt andre.
Som de mest udbredte og forskelligartede landdyr anvendes insekter ofte til målinger af termiske grænser. Kritisk termisk maksime (CTmax) og kritiske termiske minima (CTmin) er almindeligt anvendt til at vurdere intra- og interspecifik variation i termisk tolerance5,6,7. Mens CTmax og CTmin kan måles for flere fænotyper, herunder vækst, reproduktiv output, og adfærd, de er mest almindeligt anvendt til bevægelsesfunktion5,,6,7. Ct-max (også kaldet varme knockdown temperatur) og CTmin er således ofte defineret som de høje og lave temperaturer, hvor insekter mister motorisk funktion og ikke er i stand til at forblive oprejst5,6,77,8,9,10,11. CTmin falder sammen med debut af chill koma, en reversibel lammelse anlagt den ved kolde temperaturer6. Mens lammelse ved de termiske grænser ofte er reversibel, fortsat eksponering for disse temperaturer fører til økologisk død5.
Almindelige metoder til måling af termiske grænser
En række apparater er blevet brugt til at måle termiske grænser (sammenfattet i Sinclair et al.) 6.Kort, insekter opvarmes eller afkøles i væksthuse12,,13, beholdere nedsænket i flydende bade11,,14,,15, 16,16, aluminium blokke10,17, eller kappescontainere 18, og overvåges, indtil bevægelse ophører. For at overvåge insekter under analysen er den mest almindelige metode direkte observation, hvor enkeltpersoner løbende overvåges i realtid eller med tilbagevirkende kraft med optaget video6,9,10,11,15,17.9 Mens direkte observationsmetoder har minimale krav til udstyr, er de arbejdskrævende og begrænser gennemløb. Alternativt kan insekter observeres indirekte ved at indsamle individer på diskrete tidspunkter, når de falder frasiddepinde 6,19,20,21 ellerved hjælp af aktivitetsmonitorer13.
Indirekte metoder til måling af termiske grænseværdier er generelt højere gennemløb og potentielt mindre fejlbehæftede end direkte observationsmetoder. Den mest almindelige metode til indirekte overvågning anvender en temperaturstyret kolonne 6,8,19,20,21.8 Insekter er placeret inde i en kolonne med siddepinde, og temperaturen i det indre kammer styres ved at pumpe væske fra en temperatur-kontrolleret væske bad gennem jacketed foring af kolonnen. Personer, der når deres termiske grænse falder fra deres aborre og indsamles ved diskrete temperaturer eller tidsintervaller. Mens denne metode fungerer godt for CTmin, er det blevet fundet uegnet til CTmax,fordi fluer frivilligt gå ud af bunden af kolonnen, når temperaturen stiger. Den nye metode, der er beskrevet her, omgår dette problem ved individuelt at indeholde fluer under automatiserede målinger.
Ud over observationsmetoden anvendes to typer temperaturregimer almindeligvis til at vurdere øvre termiske grænser. Dynamiske analyser består af gradvist stigende temperatur, indtil motorfunktionen går tabt; denne temperatur er den dynamiske CTmax7,8,9,13. I modsætning hertil består statiske analyser af en konstant stressende temperatur, indtil motorfunktionen går tabt; dette tidspunkt er varmen knockdown tid (varme KDT), også kaldet den statiske CTmax (sCTmax)i en nylig papir af Jørgensen et al.7,8,,9,16,22. Selvom CTmax og varme knockdown assays (varme KD-analyser) producere målinger med forskellige enheder, matematisk modellering af de to træk viser, at de giver sammenlignelige oplysninger om varmetolerance og er begge økologisk relevante8,9. Dynamiske analyser giver en temperatur, der kan sammenlignes med miljøforhold, og de er at foretrække, når der er store forskelle i varmetolerance, såsom sammenligninger mellem arter med vidt forskellige termiske nicher. På grund af det høje Q10 for akkumulering af varmeskader kan en statisk analyse dog være at foretrække til påvisning af små effektstørrelser, såsom intraspecifik variation i varmetolerance9. Også, praktisk talt, en statisk analyse kræver mindre sofistikeret udstyr end en dynamisk analyse.
Mål
Formålet med dette papir er at formalisere metoder til CTmin og varme KD assays, der kan bruges i fremtidig forskning til at vurdere de termiske grænser for motile insekter. Protokollerne er tilpasset fra tidligere etablerede metoder og er designet til at være høj-gennemløb, automatiseret, og omkostningseffektiv. Begge analyser kan afsluttes på kort tid (~ 2 h), hvilket betyder, at flere eksperimenter kan udføres på en enkelt dag, producerer store mængder data uden at ofre repeterbarhed eller nøjagtighed. Med denne opsætning kan varmetolerancen på 96 fluer måles samtidigt, mens kolonnen for CTmin kan rumme mere end 100 fluer, forudsat at der er tilstrækkeligt overfladeareal til æder.
Den høje gennemløbsmetode til observation af CTmin ændrer den fælles jacketed kolonne metode med tilføjelse af en infrarød sensor til automatisk at tælle fluer. Brugen af en infrarød sensor til optælling blev først foreslået af Shuman et al. i 199623, men er ikke blevet bredt vedtaget. Tilføjelsen af den infrarøde sensor giver mulighed for generering af kontinuerlige data i stedet for at indsamle data med diskrete intervaller. Denne protokol minimerer også eksperimentatorfejl ved at fjerne manuel dataindtastning og behovet for manuelt at skifte indsamlingsrør under den jacked kolonne på diskrete tidspunkter.
Den høje gennemløbsmetode til registrering af varme KDT ændres fra to tidligere undersøgelser af varmetolerance hos insekter10,12. Individuelle fluer opbevares i en 96 brøndplade i en temperaturstyret inkubator, og video optages. Denne protokol minimerer eksperimentatorbias ved bestemmelse af varme-KDT, fordi eksperimenter kan gennemgås og verificeres ved at afspille optagelsen. Denne protokol indeholder også et sæt brugerdefinerede Python-scripts, der kan bruges til at fremskynde videoanalyse. Brugen af individuelle brønde eliminerer interferens, der kan opstå, når andre personer bevæger sig rundt eller falder over, hvilket kan være et problem, når grupper af personer er observeret i samme arena10,17. Desuden giver den temperaturstyrede inkubator en stabil temperatur på tværs af alle 96 brønde, i modsætning til temperaturgradienten, der undertiden observeres på tværs af en temperaturstyret aluminiumsblok10. Bemærk også, at 96 brøndoptagelsesmetoden kan tilpasses til at måle dynamisk CTmax og potentielt CTmin (se Diskussion).
For at demonstrere hver protokol blev de termiske grænser for voksne Drosophila melanogaster-hunner fra udvalgte linjer i Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP)sammenlignet med 24. Disse linjer blev valgt, fordi indledende forsøg indikerede signifikante forskelle i termisk tolerance. Disse analyser viste sig at være robuste metoder til at diskriminere forskelle i termisk tolerance. De følgende to protokoller, ct min-analyse medhøj overførselshastighed (punkt 1) og højflowvarme KD-analyse (afsnit 2), beskriver de nødvendige foranstaltninger til fremstilling af KDT-data for CTmin og varme for enhver motile insektlevetid, der kan monteres i apparaterne, såsom voksen Drosophila. For CTmin er det også vigtigt, at insektet være i stand til aborre. Her, hver analyse er påvist i voksne Drosophila melanogaster. Der kan dog være behov for ændringer i andre taxa- eller livsfaser6. Mindre ændringer kan omfatte brug af perching materiale med større åbninger til at rumme større prøver i CTmin assay eller ved hjælp af en højere kvalitet kamera til at skelne den subtile KDT af en langsom bevægelse insekt eller livsstadiet i varmen KD assay. Denne protokol beskriver ikke metoder til fremstilling af fluer, men det er vigtigt at standardisere opdrætsprotokollerne for at sikre repeterbarhed25 (se Garcia og Teets26 og Teets og Hahn27). Protokollerne indeholder oplysninger om, hvordan apparaterne opbygges og opsættes, hvordan man registrerer målinger, og en kort beskrivelse af dataanalyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
De to metoder, der er beskrevet ovenfor, genererer data med højt gennemløb af økologisk relevante målinger for øvre og nedre termiske grænser. Disse protokoller bygger på tidligere etablerede metoder, der er fælles for forskning i insekt termiske grænser (sammenfattet i Sinclair et al.) 6.Begge protokoller kan udfyldes på kort tid (~ 2 h hver), producere datasæt med store stikprøvestørrelser, ikke ofrer repeterbarhed eller nøjagtighed, og minimerer eksperimentatorfejl ved at fjer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Ellie McCabe for hjælp med flyveopdræt. Dette arbejde er støttet af United States Department of Agriculture National Institute of Food and Agriculture Hatch Project tilskud 1010996 og National Science Foundation tilskud OIA-1826689 til N.M.T.
Materials
| ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) | Thermo Scientific; Waltham, MA | 153-5401 | |
| C922 Pro Stream Webcam | Logitech; Newark, CA | 960-001087 | |
| Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm | Any | Any | |
| Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44036 | |
| Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 440515 | |
| Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44041 | |
| Clear silicone sealant | Any | Any | |
| Collection tube (15 ml) | Any | Any | |
| Cordless Drill | Any | Any | |
| Drosophila Funnel Monitor (DFM) | TriKinetics; Waltham, MA | DFM | Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point |
| DAM data collection software | TriKinetics; Waltham, MA | Records data input from the DFM | |
| Fly Storage Lid | FlySorter; Seatle, WA | FS-96LID-5PK | Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay |
| Fly Storage Plate | FlySorter; Seatle, WA | FS-96PLATE-5PK | Used to hold flies during in the sCTmax assay |
| Fly Food Tray | FlySorter; Seatle, WA | FS-TRAY-5PK | Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay |
| Glass funnel | Kimax | 28950-75 | 75mm |
| Gutter guard | Any | Any | ~0.5 cm diameter openings |
| Hacksaw | Any | Any | |
| Heratherm Thermo Scientific incubator | Thermo Scientific; Waltham, MA | OMS100 | |
| Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 | United States Plastic Corp., OH | 61135 | |
| Hot glue gun and glue | Any | Any | |
| Light Source | Any | Any | |
| Magnets | Any | Any | |
| OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software | OMEGA; Norwalk, CT | ||
| OMEGA thermocouple (Type T) | OMEGA; Norwalk, CT | 5LRTC-TT-K-20-36 | |
| Plastic funnel | Any | Any | 2" diameter |
| Plastic tubing – 0.6 cm diameter | United States Plastic Corp., OH | 62852 | |
| Retort ring | Any | Any | 2" diameter |
| Retort stand | Any | Any | |
| Retort three-prong clamp | Any | Any | |
| Rstudio | |||
| Serial port connector (PSIU9) | TriKinetics; Waltham, MA | PSIU9 | Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections |
| Styrofoam (2" thick) | Any | Any | |
| Tape | Any | Any | |
| Uninterrupted Power Supply (PS9-1) | TriKinetics; Waltham, MA | PS9-1 | Power supply for the DFM and PSIU9 |
| Weld-on #4 Acrylic Cement | United States Plastic Corp., OH | 45737 |
References
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
- Angilletta, M. J. . Thermal Adaptation: A Theoretical and Empirical Synthesis. , (2009).
- Coumou, D., Rahms Torf, S. A decade of weather extremes. Nature Climate Change. 2 (7), 491-496 (2012).
- Wang, G., Dillon, M. E. Recent geographic convergence in diurnal and annual temperature cycling flattens global thermal profiles. Nature Climate Change. 4 (11), 988-992 (2014).
- MacMillan, H. A. Dissecting cause from consequence: A systematic approach to thermal limits. Journal of Experimental Biology. 222 (4), 191593 (2019).
- Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: History and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
- Cooper, B. S., Williams, B. H., Angilletta, M. J. Unifying indices of heat tolerance in ectotherms. Journal of Thermal Biology. 33 (6), 320-323 (2008).
- Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits. Functional Ecology. 33 (4), 629-642 (2019).
- Hazell, S. P., Pedersen, B. P., Worland, M. R., Blackburn, T. M., Bale, J. S. A method for the rapid measurement of thermal tolerance traits in studies of small insects. Physiological Entomology. 33 (4), 389-394 (2008).
- Andersen, J. L., et al. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
- Hu, X. P., Appel, A. G. Seasonal variation of critical thermal limits and temperature tolerance in Formosan and eastern subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae). Environmental Entomology. 33 (2), 197-205 (2004).
- Rolandi, C., Lighton, J. R. B., de la Vega, G. J., Schilman, P. E., Mensch, J. Genetic variation for tolerance to high temperatures in a population of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 8 (21), 10374-10383 (2018).
- Overgaard, J., Kristensen, T. N., Sørensen, J. G. Validity of thermal ramping assays used to assess thermal tolerance in arthropods. PLoS ONE. 7 (3), 1-7 (2012).
- Klok, C. J., Chown, S. L. Critical thermal limits, temperature tolerance and water balance of a sub-Antarctic kelp fly, Paractora dreuxi (Lepidoptera: Tineidae). Journal of Insect Physiology. 43, 685-694 (1997).
- Salachan, P. V., Burgaud, H., Sørensen, J. G. Testing the thermal limits: Non-linear reaction norms drive disparate thermal acclimation responses in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 118 (September), 103946 (2019).
- Everatt, M. J., Bale, J. S., Convey, P., Worland, M. R., Hayward, S. A. L. The effect of acclimation temperature on thermal activity thresholds in polar terrestrial invertebrates. Journal of Insect Physiology. 59 (10), 1057-1064 (2013).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The role of the gut in insect chilling injury: Cold-Induced disruption of osmoregulation in the fall field cricket, Gryllus pennsylvanicus. Journal of Experimental Biology. 214 (5), 726-734 (2011).
- Huey, R. B., Crill, W. D., Kingsolver, J. G., Weber, K. E. A method for rapid measurement of heat or cold resistance of small insects. British Ecological Society. 6 (4), 489-494 (1992).
- Jenkins, N. L., Hoffmann, A. A. Genetic and maternal variation for heat resistance in drosophila from the field. Genetics. 137 (3), 783-789 (1994).
- Ransberry, V. E., MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The relationship between chill-coma onset and recovery at the extremes of the thermal window of Drosophila melanogaster. Physiological and Biochemical Zoology. 84 (6), 553-559 (2011).
- Sørensen, M. H., et al. Rapid induction of the heat hardening response in an Arctic insect. Biology Letters. 15 (10), (2019).
- Shuman, D., Coffelt, J. A., Weaver, D. K. A computer-based electronic fall-through probe insect counter for monitoring infestation in stored products. Transactions of the American Society of Agricultural Engineers. 39 (5), 1773-1780 (1996).
- MacKay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: A laboratory handbook. , (2005).
- Garcia, M. J., Teets, N. M. Cold stress results in sustained locomotor and behavioral deficits in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological and Integrative Physiology. 331 (3), 192-200 (2019).
- Teets, N. M., Hahn, D. A. Genetic variation in the shape of cold-survival curves in a single fly population suggests potential for selection from climate variability. Journal of Evolutionary Biology. 31 (4), 543-555 (2018).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 45 (8), 719-726 (1999).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. Mechanisms underlying insect chill-coma. Journal of Insect Physiology. 57 (1), 12-20 (2011).
- Salachan, P. V., Sørensen, J. G. Critical thermal limits affected differently by developmental and adult thermal fluctuations. Journal of Experimental Biology. 220 (23), 4471-4478 (2017).
- Hoffmann, A. A., Hallas, R., Anderson, A. R., Telonis-Scott, M. Evidence for a robust sex-specific trade-off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster. Journal of Evolutionary Biology. 18 (4), 804-810 (2005).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Rapid cold-hardening of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) during ecologically based thermoperiodic cycles. Journal of Experimental Biology. 204 (9), 1659-1666 (2001).
- Sinclair, B. J., Vernon, P., Klok, C. J., Chown, S. L. Insects at low temperatures: An ecological perspective. Trends in Ecology and Evolution. 18 (5), 257-262 (2003).
