कीड़ों में क्रिटिकल थर्मल लिमिट्स के उच्च थ्रूपुट परख
Summary
थर्मल सीमा वातावरण जीवों बर्दाश्त है, जो तेजी से जलवायु परिवर्तन के चेहरे में मूल्यवान जानकारी है भविष्यवाणी कर सकते हैं । यहां वर्णित कीड़ों में महत्वपूर्ण थर्मल मिनीमा और गर्मी नॉकडाउन समय का आकलन करने के लिए उच्च-थ्रूपुट प्रोटोकॉल हैं। दोनों प्रोटोकॉल थ्रूपुट को अधिकतम करते हैं और परख की लागत को कम करते हैं।
Abstract
पौधों और जानवरों की ऊपरी और निचली थर्मल सीमाएं उनके प्रदर्शन, अस्तित्व और भौगोलिक वितरण के महत्वपूर्ण भविष्यवक्ता हैं, और जलवायु परिवर्तन के लिए प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी के लिए आवश्यक हैं। यह काम कीट थर्मल सीमा को मापने के लिए दो उच्च-थ्रूपुट प्रोटोकॉल का वर्णन करता है: एक क्रिटिकल थर्मल मिनिमा (सीटीमिन)का आकलन करने के लिए, और दूसरा स्थिर गर्मी तनाव के जवाब में गर्मी के दस्तक समय (केडीटी) का आकलन करने के लिए। सीटीमिन परख में, व्यक्तियों को एक ऐक्रेलिक-जैकेट कॉलम में रखा जाता है, जो कम तापमान रैंप के अधीन होता है, और एक अवरक्त सेंसर का उपयोग करके उनके पर्चों से गिरने के रूप में गिना जाता है। गर्मी केडीटी परख में, व्यक्तियों को 96 अच्छी तरह से प्लेट में रखा जाता है, जो एक तनावपूर्ण, गर्म तापमान के लिए एक इनक्यूबेटर सेट में रखा जाता है, और उस समय को निर्धारित करने के लिए रिकॉर्ड किया गया वीडियो जिस पर वे अब ईमानदार नहीं रह सकते हैं और आगे बढ़ सकते हैं। ये प्रोटोकॉल आमतौर पर उपयोग की जाने वाली तकनीकों पर लाभ प्रदान करते हैं। दोनों परख कम लागत रहे है और अपेक्षाकृत जल्दी (~ 2 घंटे) पूरा किया जा सकता है । सीटीमिन परख प्रयोगकर्ता त्रुटि को कम करती है और एक बार में बड़ी संख्या में व्यक्तियों को माप सकती है। हीट केडीटी प्रोटोकॉल प्रत्येक परख का एक वीडियो रिकॉर्ड उत्पन्न करता है और इस प्रकार प्रयोगकर्ता पूर्वाग्रह और वास्तविक समय में व्यक्तियों की लगातार निगरानी करने की आवश्यकता को हटा देता है।
Introduction
कीड़ों की थर्मल सीमाएं
तापमान सहित पर्यावरणीय स्थितियों में भिन्नता, जीवों के प्रदर्शन, फिटनेस, अस्तित्व और भौगोलिक वितरण को प्रभावित करने वाला एक प्रमुख कारकहै 1,,2। ऊपरी और निचली थर्मल सीमाएं एक जीव को बर्दाश्त कर सकने वाले वातावरण की सैद्धांतिक श्रृंखला निर्धारित करती हैं, और इसलिए, ये सीमाएं पौधे और पशु वितरण के महत्वपूर्ण भविष्यवक्ता हैं, विशेष रूप से जलवायु परिवर्तन3,,4के चेहरे पर। इस प्रकार, थर्मल सीमा को सही ढंग से मापने के लिए प्रोटोकॉल पारिस्थितिकीविदों, फिजियोलॉजिस्ट, विकासवादी जीवविज्ञानियों और संरक्षण जीवविज्ञानियों के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं।
सबसे प्रचुर मात्रा में और विविध स्थलीय जानवरों के रूप में, कीड़ों का उपयोग अक्सर थर्मल सीमाओं के माप के लिए किया जाता है। क्रिटिकल थर्मल मैक्सिमा (सीटीमैक्स)और क्रिटिकल थर्मल मिनिमा (सीटीमिन)का उपयोग आमतौर पर थर्मल सहिष्णुता5, 6, 7,में अंतर-अंतर और अंतरविशिष्ट भिन्नता का आकलन करने के लिए किया,जाताहै।6 जबकि सीटीमैक्स और सीटीमिन को कई फेनोटाइप के लिए मापा जा सकता है, जिसमें विकास, प्रजनन उत्पादन और व्यवहार शामिल हैं, वे सबसे अधिक लोकोमोटर फ़ंक्शन5,6,,7पर लागू होते हैं।, इस प्रकार,,सीटीमैक्स (जिसे हीट नॉकडाउन तापमान भी कहा जाता है) और सीटीमिन को अक्सर उच्च और निम्न तापमान के रूप में परिभाषित किया जाता है जिस पर कीड़े मोटर कार्य खो देते हैं और 5 ,6, 75,8,,9,7,10, 11तक ईमानदार नहीं रह पाते हैं।,, सीटीमिन ठंडा कोमा की शुरुआत के साथ मेल खाता है, एक प्रतिवर्ती पक्षाघात ठंडे तापमान6द्वारा लाया गया है । जबकि थर्मल सीमा पर पक्षाघात अक्सर उलटा होता है, इन तापमानों के निरंतर संपर्क में पारिस्थितिक मृत्यु 5 की ओरजाताहै।
थर्मल सीमा को मापने के लिए सामान्य तरीके
थर्मल सीमा को मापने के लिए विभिन्न प्रकार के उपकरणों का उपयोग किया गया है (सिंक्लेयर एट अल में संक्षेप में। 6. संक्षेप में, कीड़ों को इनक्यूबेटर12, 13,तरल पदार्थ स्नान में डूबे कंटेनरों में गर्म या ठंडा किया,जाताहै11,,14,,15,,16,एल्यूमीनियम ब्लॉक10,,17,या जैकेट कंटेनर18,और लोकोमोशन समाप्त होने तक निगरानी की जाती है। परख के दौरान कीड़ों की निगरानी करने के लिए, सबसे आम विधि प्रत्यक्ष अवलोकन,11,है, जिसमें व्यक्तियों को रिकॉर्ड किए गए वीडियो,6, 9,10,11, 15, 17के साथ वास्तविक समय या भूतलक्षी प्रभाव से लगातार निगरानी की जाती है।,,1517 जबकि प्रत्यक्ष अवलोकन विधियों में न्यूनतम उपकरण आवश्यकताएं होती हैं, वे श्रम-प्रधान होते हैं और थ्रूपुट को सीमित करते हैं। वैकल्पिक रूप से, कीड़ों को अप्रत्यक्ष रूप से असतत समय पर व्यक्तियों को इकट्ठा करके देखा जा सकता है क्योंकि वेपर्चों 6,19,20,,21 से गिरते हैं या गतिविधि का उपयोग करके13पर नजर रखता है।
थर्मल सीमाओं को मापने के लिए अप्रत्यक्ष तरीके आम तौर पर उच्च-थ्रूपुट होते हैं और प्रत्यक्ष अवलोकन विधियों की तुलना में संभावित रूप से कम त्रुटि प्रवण होती है। अप्रत्यक्ष निगरानी के लिए सबसे आम तरीका एक जैकेट तापमान नियंत्रित कॉलम 6 ,8,,19,6,20, 21का उपयोग करता है।,,21 कीड़े पर्चों के साथ एक कॉलम के अंदर रखा जाता है, और आंतरिक कक्ष का तापमान कॉलम की जैकेट अस्तर के माध्यम से तापमान नियंत्रित तरल पदार्थ स्नान से तरल पदार्थ पंप करके नियंत्रित होता है। ऐसे व्यक्ति जो अपनी थर्मल सीमा तक पहुंचते हैं, वे अपने पर्च से गिरते हैं और असतत तापमान या समय अंतराल पर एकत्र किए जाते हैं। हालांकि यह विधि सीटीमिनके लिए अच्छी तरह से काम करती है, यह सीटीमैक्सके लिए अनुपयुक्त पाई गई है, क्योंकि तापमान बढ़ने पर मक्खियां स्वेच्छा से कॉलम के नीचे से बाहर निकल जाती हैं। यहां वर्णित नई विधि स्वचालित माप के दौरान व्यक्तिगत रूप से युक्त मक्खियों द्वारा इस मुद्दे को दरकिनार करती है।
अवलोकन की विधि के अलावा, दो प्रकार की तापमान व्यवस्थाओं का उपयोग आमतौर पर ऊपरी थर्मल सीमाओं का आकलन करने के लिए किया जाता है। जब तक मोटर फ़ंक्शन खो नहीं जाता है तब तक गतिशील परख में धीरे-धीरे बढ़ता तापमान होता है; वह तापमान डायनेमिक सीटीमैक्स7, 8,9,,13है .9 इसके विपरीत, स्थिर परख में मोटर फ़ंक्शन खो जाने तक लगातार तनावपूर्ण तापमान होता है; वह समय बिंदु हीट नॉकडाउन समय (हीट केडीटी) है, जिसे हाल ही में एक पेपर में स्टेटिक सीटीमैक्स (एससीटी,8,9,16,22मैक्स)भी कहाजाताहै। यद्यपि सीटीमैक्स और हीट नॉकडाउन परख (हीट केडी परख) विभिन्न इकाइयों के साथ मैट्रिक्स का उत्पादन करते हैं, दो लक्षणों की गणितीय मॉडलिंग इंगित करती है कि वे गर्मी सहिष्णुता के बारे में तुलनीय जानकारी देते हैं और पारिस्थितिक रूप से प्रासंगिक8,,9दोनों हैं। गतिशील परख एक तापमान है कि पर्यावरण की स्थिति की तुलना में किया जा सकता है उपज, और वे बेहतर कर रहे है जब वहां गर्मी सहिष्णुता में बड़े अंतर हैं, जैसे व्यापक रूप से अलग थर्मल niches के साथ प्रजातियों के बीच तुलना के रूप में । हालांकि, गर्मी की चोट संचय के लिए उच्च Q10 के कारण, एक स्थिर परख छोटे प्रभाव आकार का पता लगाने के लिए बेहतर हो सकता है, जैसे गर्मी सहिष्णुता9में अंतरविशिष्ट भिन्नता। इसके अलावा, व्यावहारिक रूप से बोल रहा हूं, एक स्थिर परख एक गतिशील परख की तुलना में कम परिष्कृत उपकरणों की आवश्यकता है ।
उद्देश्य
इस पेपर का उद्देश्य सीटीमिन और हीट केडी परख के लिए तरीकों को औपचारिक रूप देना है जिसका उपयोग भविष्य के शोध में मोटिवल कीड़ों की थर्मल सीमाओं का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। प्रोटोकॉल पहले से स्थापित तरीकों से अनुकूलित किए जाते हैं और उच्च-थ्रूपुट, स्वचालित और लागत प्रभावी होने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। दोनों परखें कम समय (~ 2 एच) में पूरी की जा सकती हैं, जिसका अर्थ है कि एक ही दिन में कई प्रयोग किए जा सकते हैं, जिससे दोहराने की क्षमता या सटीकता का त्याग किए बिना बड़ी मात्रा में डेटा का उत्पादन होता है। इस सेटअप के साथ, 96 मक्खियों की गर्मी सहिष्णुता को एक साथ मापा जा सकता है, जबकि सीटीमिन के लिए कॉलम 100 से अधिक मक्खियों को पकड़ सकता है, बशर्ते कि पर्चिंग के लिए पर्याप्त सतह क्षेत्र हो।
सीटीमिन को देखने के लिए उच्च-थ्रूपुट विधि स्वचालित रूप से मक्खियों को गिनने के लिए एक अवरक्त सेंसर के अलावा आम जैकेट कॉलम पद्धति को संशोधित करती है। मतगणना के लिए एक अवरक्त सेंसर का उपयोग पहले १९९६२३ में शुमन एट अल द्वारा प्रस्तावित किया गया था लेकिन इसे व्यापक रूप से नहीं अपनाया गया है । अवरक्त सेंसर के अलावा असतत अंतराल पर डेटा एकत्र करने के बजाय निरंतर डेटा की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है । यह प्रोटोकॉल मैन्युअल डेटा प्रविष्टि को नष्ट करके प्रयोगकर्ता त्रुटि को भी कम करता है और असतत समय बिंदुओं पर लानत कॉलम के नीचे संग्रह ट्यूबों को मैन्युअल रूप से स्विच करने की आवश्यकता है।
गर्मी रिकॉर्ड करने के लिए उच्च थ्रूपुट विधि केडीटी को कीड़ों में गर्मी सहनशीलता के दो पिछले अध्ययनों से संशोधित किया जाता है10,,12। व्यक्तिगत मक्खियों को तापमान नियंत्रित इनक्यूबेटर में 96 अच्छी प्लेट में संग्रहीत किया जाता है और वीडियो रिकॉर्ड किया जाता है। यह प्रोटोकॉल हीट केडीटी का निर्धारण करने में प्रयोगकर्ता पूर्वाग्रह को कम करता है क्योंकि रिकॉर्डिंग को वापस खेलकर प्रयोगों की समीक्षा और सत्यापन किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल कस्टम पायथन स्क्रिप्ट का एक सेट भी प्रदान करता है जिसका उपयोग वीडियो विश्लेषण को गति देने के लिए किया जा सकता है। व्यक्तिगत कुओं का उपयोग हस्तक्षेप को समाप्त करता है जो अन्य व्यक्तियों के चारों ओर घूमते हैं या गिर जाते हैं, जो एक समस्या हो सकती है जब व्यक्तियों के समूहों को एक ही क्षेत्रमें 10,,17में मनाया जाता है। इसके अलावा, तापमान नियंत्रित इनक्यूबेटर सभी ९६ कुओं में एक स्थिर तापमान प्रदान करता है, तापमान ढाल के विपरीत कई बार एक तापमान नियंत्रित एल्यूमीनियम ब्लॉक10भर में मनाया । यह भी ध्यान दें कि 96 अच्छी तरह से रिकॉर्डिंग विधि गतिशील सीटीअधिकतम और संभावित सीटीमिनट को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (चर्चा देखें)।
प्रत्येक प्रोटोकॉल को प्रदर्शित करने के लिए, ड्रोसोफिला मेलनोगास्टर जेनेटिक रेफरेंस पैनल (डीजीआरपी) की चुनिंदा पंक्तियों से वयस्क ड्रोसोफिला मेलनोगेस्टर महिलाओं की थर्मल सीमाओं की तुलना24की गई थी। इन पंक्तियों का चयन इसलिए किया गया क्योंकि प्रारंभिक प्रयोगों ने थर्मल सहिष्णुता में महत्वपूर्ण अंतर का संकेत दिया । ये परख थर्मल सहिष्णुता में मतभेदों को भेदभाव करने के लिए मजबूत तरीके साबित हुए । निम्नलिखित दो प्रोटोकॉल, उच्च-थ्रूपुट सीटीमिन परख (धारा 1) और उच्च-थ्रूपुट हीट केडी परख (धारा 2), वयस्क ड्रोसोफिलाजैसे उपकरणों में फिटिंग करने में सक्षम किसी भी मोती कीट जीवन चरण के लिए सीटीमिन और हीट केडीटी डेटा का उत्पादन करने के लिए आवश्यक कार्यों का वर्णन करते हैं। सीटीमिन के लिए यह भी आवश्यक है कि कीट पर्च करने में सक्षम हो। यहां, प्रत्येक परख वयस्क ड्रोसोफिला मेलनोगास्टरमें प्रदर्शित किया जाता है। हालांकि, अन्य टैक्सा या जीवन चरणों6के लिए संशोधनों की आवश्यकता हो सकती है। मामूली परिवर्तनों में सीटीमिन परख में बड़े नमूनों को समायोजित करने के लिए बड़े उद्घाटन के साथ पर्चिंग सामग्री का उपयोग करना या गर्मी केडी परख में धीमी गति से चलती कीट या जीवन चरण के सूक्ष्म केडीटी को समझने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले कैमरे का उपयोग करना शामिल हो सकता है। यह प्रोटोकॉल मक्खियों को तैयार करने के तरीकों का वर्णन नहीं करता है, लेकिन रिपीटेबिलिटी25 सुनिश्चित करने के लिए पालन प्रोटोकॉल का मानकीकरण करना महत्वपूर्ण है (गार्सिया और टीट्स26 और Teets और Hahn27देखें)। प्रदान किए गए प्रोटोकॉल में उपकरणों का निर्माण और स्थापना करने के तरीके, माप रिकॉर्ड करने के तरीके और डेटा विश्लेषण का संक्षिप्त विवरण शामिल है।
Protocol
Representative Results
Discussion
ऊपर विस्तृत दो तरीके ऊपरी और निचले थर्मल सीमाओं के लिए पारिस्थितिक रूप से प्रासंगिक मैट्रिक्स के उच्च-थ्रूपुट डेटा उत्पन्न करते हैं। ये प्रोटोकॉल कीट थर्मल सीमाओं पर शोध करने के लिए पहले से स्थापित …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम मक्खी पालन के साथ सहायता के लिए ऐली McCabe शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को संयुक्त राज्य अमेरिका के कृषि विभाग द्वारा समर्थित किया जाता है राष्ट्रीय खाद्य और कृषि हैच परियोजना संस्थान अनुदान १०१०९९६ और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान OIA-१८२६६८९ N.M.T.
Materials
| ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) | Thermo Scientific; Waltham, MA | 153-5401 | |
| C922 Pro Stream Webcam | Logitech; Newark, CA | 960-001087 | |
| Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm | Any | Any | |
| Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44036 | |
| Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 440515 | |
| Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44041 | |
| Clear silicone sealant | Any | Any | |
| Collection tube (15 ml) | Any | Any | |
| Cordless Drill | Any | Any | |
| Drosophila Funnel Monitor (DFM) | TriKinetics; Waltham, MA | DFM | Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point |
| DAM data collection software | TriKinetics; Waltham, MA | Records data input from the DFM | |
| Fly Storage Lid | FlySorter; Seatle, WA | FS-96LID-5PK | Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay |
| Fly Storage Plate | FlySorter; Seatle, WA | FS-96PLATE-5PK | Used to hold flies during in the sCTmax assay |
| Fly Food Tray | FlySorter; Seatle, WA | FS-TRAY-5PK | Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay |
| Glass funnel | Kimax | 28950-75 | 75mm |
| Gutter guard | Any | Any | ~0.5 cm diameter openings |
| Hacksaw | Any | Any | |
| Heratherm Thermo Scientific incubator | Thermo Scientific; Waltham, MA | OMS100 | |
| Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 | United States Plastic Corp., OH | 61135 | |
| Hot glue gun and glue | Any | Any | |
| Light Source | Any | Any | |
| Magnets | Any | Any | |
| OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software | OMEGA; Norwalk, CT | ||
| OMEGA thermocouple (Type T) | OMEGA; Norwalk, CT | 5LRTC-TT-K-20-36 | |
| Plastic funnel | Any | Any | 2" diameter |
| Plastic tubing – 0.6 cm diameter | United States Plastic Corp., OH | 62852 | |
| Retort ring | Any | Any | 2" diameter |
| Retort stand | Any | Any | |
| Retort three-prong clamp | Any | Any | |
| Rstudio | |||
| Serial port connector (PSIU9) | TriKinetics; Waltham, MA | PSIU9 | Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections |
| Styrofoam (2" thick) | Any | Any | |
| Tape | Any | Any | |
| Uninterrupted Power Supply (PS9-1) | TriKinetics; Waltham, MA | PS9-1 | Power supply for the DFM and PSIU9 |
| Weld-on #4 Acrylic Cement | United States Plastic Corp., OH | 45737 |
References
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