Hög genomströmningsanalyser av kritiska termiska gränser hos insekter
Summary
Termiska gränser kan förutsäga de miljöer organismer tolererar, vilket är värdefull information inför snabba klimatförändringar. Beskrivs här är hög genomströmning protokoll för att bedöma kritiska termiska minima och värme knockdown tid i insekter. Båda protokollen maximerar genomströmningen och minimerar kostnaderna för analyserna.
Abstract
Övre och nedre termiska gränser för växter och djur är viktiga prediktorer för deras prestanda, överlevnad och geografiska distributioner, och är viktiga för att förutsäga svar på klimatförändringarna. Detta arbete beskriver två höggenomströmningsprotokoll för mätning av insekts termiska gränser: en för bedömning av kritiska termiska minima (CTmin), och den andra för bedömning av heat knock down-tid (KDT) som svar på en statisk värmestressor. I CTmin-analysen placeras individer i en akrylmantad kolonn, utsätts för en minskande temperaturramp, och räknas när de faller från sittpinnarna med hjälp av en infraröd sensor. I värmen KDT analys, individer finns i en 96 väl platta, placeras i en inkubator inställd på en stressande, varm temperatur, och video inspelad för att bestämma den tid då de inte längre kan förbli upprätt och flytta. Dessa protokoll erbjuder fördelar jämfört med vanligt förekommande tekniker. Båda analyserna är låg kostnad och kan slutföras relativt snabbt (~ 2 h). CTmin-analysen minskar experimenterfel och kan mäta ett stort antal individer på en gång. Den värme KDT protokollet genererar en videoinspelning av varje analys och därmed tar bort experimenter bias och behovet av att kontinuerligt övervaka individer i realtid.
Introduction
Termiska gränser av insekter
Variation i miljöförhållanden, inklusive temperatur, är en viktig faktor som påverkar prestanda, kondition, överlevnad och geografisk fördelning av organismer1,2. Övre och nedre termiska gränser bestämma det teoretiska utbudet av miljöer en organism kan tolerera, och, därför, dessa gränser är viktiga prediktorer för växt-och djurfördelningar, särskilt införklimatförändringarna 3,4. Således protokoll för att exakt mäta termiska gränser är viktiga verktyg för ekologer, fysiologer, evolutionsbiologer, och bevarande biologer, bland andra.
Som de mest förekommande och varierande landlevande djuren används insekter ofta för mätningar av termiska gränser. Kritisk termisk maxima (CTmax) och kritiska termiska minima (CTmin) används vanligen för att bedöma intra- och interspecifik variation i termisk tolerans5,6,7. Medan CTmax och CTmin kan mätas för flera fenotyper, inklusive tillväxt, reproduktiva produktionen, och beteende, de är vanligast tillämpas på rörelseaktivitet funktion5,6,7. Således ctmax (även kallad värme knockdown temperatur) och CTmin definieras ofta som de höga och låga temperaturer vid vilka insekter förlorar motorisk funktion och inte kan förbli upprätt5,6,7,8,9,10,11. CTmin sammanfaller med början av chill koma, en reversibel förlamning som väckts av kalla temperaturer6. Medan förlamning vid de termiska gränserna ofta är reversibel, fortsatt exponering för dessa temperaturer leder till ekologisk död5.
Gemensamma metoder för att mäta termiska gränsvärden
En mängd olika apparater har använts för att mäta termiska gränser (sammanfattas i Sinclair et al.) 6. Kortvarigt, insekter värms upp eller kyls i inkubatorer12,13, behållare nedsänkta i vätskebad11,14,15,16, aluminiumblock10,17, eller mantade behållare18, och övervakas tills förflyttning upphör. För att övervaka insekter under analysen är den vanligaste metoden direkt observation, där individer kontinuerligt övervakas i realtid eller retrospektivt med inspelad video6,9,10,11,15,17. Medan direkta observationsmetoder har minimal utrustning krav, de är arbetsintensiva och begränsa genomströmning. Alternativt kan insekter observeras indirekt genom att samla in individer vid diskreta tider när de faller från sittpinnar6,19,20,21 eller med hjälp av aktivitetsmonitorer13.
Indirekta metoder för att mäta termiska gränser är i allmänhet högre-genomströmning och potentiellt mindre felbenägna än direkta observationsmetoder. Den vanligaste metoden för indirekt övervakning använder en mantad temperaturstyrd kolumn6,8,19,20,21. Insekter placeras inuti en kolonn med sittpinnar, och temperaturen i den inre kammaren styrs genom att pumpa vätska från ett temperaturkontrollerat vätskebad genom kolonnens mantlade foder. Individer som når sin termiska gräns faller från sin abborre och samlas in vid diskreta temperaturer eller tidsintervall. Medan denna metod fungerar bra för CTmin, har det hittats olämpligt för CTmax, eftersom flugor frivilligt gå ut ur botten av kolonnen när temperaturen ökar. Den nya metod som beskrivs här kringgår denna fråga genom att individuellt innehålla flugor under automatiserade mätningar.
Förutom observationsmetoden används ofta två typer av temperaturregimer för att bedöma övre termiska gränsvärden. Dynamiska analyser består av gradvis ökande temperatur tills motorisk funktion går förlorad; att temperaturen är den dynamiska CTmax7,8,9,13. I motsats till statiska analyser består av en konstant stressande temperatur tills motorisk funktion går förlorad; den tidspunkten är värme knockdown tid (värme KDT), även kallad den statiska CTmax (sCTmax) i en nyligen papper av Jørgensen et al.7,8,9,16,22. Även om CTmax och värme knockdown analyser (värme KD-analyser) producerar mätvärden med olika enheter, matematisk modellering av de två egenskaper indikerar de ger jämförbar information om värmetolerans och är både ekologiskt relevanta8,9. Dynamiska analyser ger en temperatur som kan jämföras med miljöförhållanden, och de är att föredra när det finns stora skillnader i värmetolerans, såsom jämförelser mellan arter med vitt skilda termiska nischer. På grund av den höga Q10 för värmeskada ackumulering kan dock en statisk analys vara att föredra för att upptäcka små effektstorlekar, såsom intraspecifik variation i värmetolerans9. Också, praktiskt taget, kräver en statisk analys mindre sofistikerad utrustning än en dynamisk analys.
Mål
Målet med detta papper är att formalisera metoder för CTmin och värme KD analyser som kan användas i framtida forskning för att bedöma termiska gränserna för motila insekter. Protokollen är anpassade från tidigare etablerade metoder och är utformade för att vara höggenomströmning, automatiserad och kostnadseffektiv. Båda analyserna kan slutföras på kort tid (~ 2 h), vilket innebär att flera experiment kan genomföras på en enda dag, producera stora mängder data utan att offra repeterbarhet eller noggrannhet. Med denna uppställning kan värmetoleransen för 96 flugor mätas samtidigt, medan kolonnen för CTmin kan rymma mer än 100 flugor, förutsatt att det finns tillräcklig yta för perching.
Höggenomströmningsmetoden för att observera CTmin ändrar den vanliga jacketed kolonnmetodiken med tillsats av en infraröd sensor för att automatiskt räkna flugor. Användningen av en infraröd sensor för räkning föreslogs först av Shuman et al. 199623 men har inte antagits i stor utsträckning. Tillägget av den infraröda sensorn möjliggör generering av kontinuerliga data snarare än att samla in data med diskreta intervaller. Detta protokoll minimerar också experimenter fel genom att eliminera manuell datainmatning och behovet av att manuellt växla insamlingsrör under jacked kolumnen vid diskreta tidpunkter.
Höggenomströmningsmetoden för registrering av värme KDT modifieras från två tidigare studier av värmetolerans hosinsekter 10,12. Enskilda flugor lagras i en 96 brunnsplatta i en temperaturkontrollerad inkubator och video spelas in. Detta protokoll minimerar experimenter bias i att fastställa värme KDT eftersom experiment kan granskas och verifieras genom att spela upp inspelningen. Det här protokollet innehåller också en uppsättning anpassade Python-skript som kan användas för att snabba upp videoanalys. Användningen av enskilda brunnar eliminerar störningar som kan uppstå när andra individer flyttar runt eller faller över, vilket kan vara ett problem när grupper av individer observeras i samma arena10,17. Vidare ger den temperaturkontrollerade inkubatorn en stabil temperatur över alla 96 brunnar, till skillnad från den temperaturgradient som ibland observeras över ett temperaturkontrollerat aluminiumblock10. Observera också att 96 väl inspelningsmetoden kan anpassas för att mäta dynamisk CTmax och potentiellt CTmin (se Diskussion).
För att demonstrera varje protokoll jämfördes de termiska gränserna för vuxna Drosophila melanogaster-honor från utvalda linjer i Den genetiska referenspanelen för Drosophila melanogaster (DGRP)24. Dessa linjer valdes eftersom preliminära experiment indikerade betydande skillnader i termisk tolerans. Dessa analyser visade sig vara robusta metoder för att diskriminera skillnader i termisk tolerans. Följande två protokoll, ct min-analys med höggenomströmning (avsnitt 1) och hög genomströmningsvärme KD-analys (avsnitt 2), beskriver nödvändiga åtgärder för att ta fram CTmin och värme KDT-data för alla motila insektslivsstadium som kan passa i apparaturerna, såsom vuxna Drosophila. För CTmin är det också viktigt att insekten kan abborre. Här, varje analys påvisas i vuxna Drosophila melanogaster. Ändringar kan dock krävas för andra taxa- eller livsstadium6. Mindre förändringar kan inkludera att använda perching material med större öppningar för att rymma större exemplar i CTmin analys eller använda en högre kvalitet kamera för att urskilja den subtila KDT av en långsam rörelse insekt eller livsstadium i värmen KD analys. Detta protokoll beskriver inte metoder för att förbereda flugor, men det är viktigt att standardisera uppfödningsprotokoll för att säkerställa repeterbarhet25 (se Garcia och Teets26 och Teets och Hahn27). Protokollen som lämnas innehåller information om hur man bygger och ställer in apparaterna, hur man registrerar mätningar och en kort beskrivning av dataanalys.
Protocol
Representative Results
Discussion
De två metoderna som beskrivs ovan genererar data med hög genomströmning av ekologiskt relevanta mätvärden för övre och nedre termiska gränser. Dessa protokoll bygger på tidigare etablerade metoder som är gemensamma för forskning om insektstermiska gränser (sammanfattas i Sinclair et al.) 6. Båda protokollen kan fyllas i på kort tid (~ 2 h vardera), producera datamängder med stora provstorlekar, inte offra repeterbarhet eller noggrannhet, och minimera experimenter fel genom att …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Ellie McCabe för hjälp med fly uppfödning. Detta arbete stöds av United States Department of Agriculture National Institute of Food and Agriculture Hatch Project bidrag 1010996 och National Science Foundation bevilja OIA-1826689 till N.M.T.
Materials
| ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) | Thermo Scientific; Waltham, MA | 153-5401 | |
| C922 Pro Stream Webcam | Logitech; Newark, CA | 960-001087 | |
| Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm | Any | Any | |
| Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44036 | |
| Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 440515 | |
| Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44041 | |
| Clear silicone sealant | Any | Any | |
| Collection tube (15 ml) | Any | Any | |
| Cordless Drill | Any | Any | |
| Drosophila Funnel Monitor (DFM) | TriKinetics; Waltham, MA | DFM | Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point |
| DAM data collection software | TriKinetics; Waltham, MA | Records data input from the DFM | |
| Fly Storage Lid | FlySorter; Seatle, WA | FS-96LID-5PK | Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay |
| Fly Storage Plate | FlySorter; Seatle, WA | FS-96PLATE-5PK | Used to hold flies during in the sCTmax assay |
| Fly Food Tray | FlySorter; Seatle, WA | FS-TRAY-5PK | Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay |
| Glass funnel | Kimax | 28950-75 | 75mm |
| Gutter guard | Any | Any | ~0.5 cm diameter openings |
| Hacksaw | Any | Any | |
| Heratherm Thermo Scientific incubator | Thermo Scientific; Waltham, MA | OMS100 | |
| Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 | United States Plastic Corp., OH | 61135 | |
| Hot glue gun and glue | Any | Any | |
| Light Source | Any | Any | |
| Magnets | Any | Any | |
| OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software | OMEGA; Norwalk, CT | ||
| OMEGA thermocouple (Type T) | OMEGA; Norwalk, CT | 5LRTC-TT-K-20-36 | |
| Plastic funnel | Any | Any | 2" diameter |
| Plastic tubing – 0.6 cm diameter | United States Plastic Corp., OH | 62852 | |
| Retort ring | Any | Any | 2" diameter |
| Retort stand | Any | Any | |
| Retort three-prong clamp | Any | Any | |
| Rstudio | |||
| Serial port connector (PSIU9) | TriKinetics; Waltham, MA | PSIU9 | Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections |
| Styrofoam (2" thick) | Any | Any | |
| Tape | Any | Any | |
| Uninterrupted Power Supply (PS9-1) | TriKinetics; Waltham, MA | PS9-1 | Power supply for the DFM and PSIU9 |
| Weld-on #4 Acrylic Cement | United States Plastic Corp., OH | 45737 |
References
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
- Angilletta, M. J. . Thermal Adaptation: A Theoretical and Empirical Synthesis. , (2009).
- Coumou, D., Rahms Torf, S. A decade of weather extremes. Nature Climate Change. 2 (7), 491-496 (2012).
- Wang, G., Dillon, M. E. Recent geographic convergence in diurnal and annual temperature cycling flattens global thermal profiles. Nature Climate Change. 4 (11), 988-992 (2014).
- MacMillan, H. A. Dissecting cause from consequence: A systematic approach to thermal limits. Journal of Experimental Biology. 222 (4), 191593 (2019).
- Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: History and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
- Cooper, B. S., Williams, B. H., Angilletta, M. J. Unifying indices of heat tolerance in ectotherms. Journal of Thermal Biology. 33 (6), 320-323 (2008).
- Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits. Functional Ecology. 33 (4), 629-642 (2019).
- Hazell, S. P., Pedersen, B. P., Worland, M. R., Blackburn, T. M., Bale, J. S. A method for the rapid measurement of thermal tolerance traits in studies of small insects. Physiological Entomology. 33 (4), 389-394 (2008).
- Andersen, J. L., et al. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
- Hu, X. P., Appel, A. G. Seasonal variation of critical thermal limits and temperature tolerance in Formosan and eastern subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae). Environmental Entomology. 33 (2), 197-205 (2004).
- Rolandi, C., Lighton, J. R. B., de la Vega, G. J., Schilman, P. E., Mensch, J. Genetic variation for tolerance to high temperatures in a population of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 8 (21), 10374-10383 (2018).
- Overgaard, J., Kristensen, T. N., Sørensen, J. G. Validity of thermal ramping assays used to assess thermal tolerance in arthropods. PLoS ONE. 7 (3), 1-7 (2012).
- Klok, C. J., Chown, S. L. Critical thermal limits, temperature tolerance and water balance of a sub-Antarctic kelp fly, Paractora dreuxi (Lepidoptera: Tineidae). Journal of Insect Physiology. 43, 685-694 (1997).
- Salachan, P. V., Burgaud, H., Sørensen, J. G. Testing the thermal limits: Non-linear reaction norms drive disparate thermal acclimation responses in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 118 (September), 103946 (2019).
- Everatt, M. J., Bale, J. S., Convey, P., Worland, M. R., Hayward, S. A. L. The effect of acclimation temperature on thermal activity thresholds in polar terrestrial invertebrates. Journal of Insect Physiology. 59 (10), 1057-1064 (2013).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The role of the gut in insect chilling injury: Cold-Induced disruption of osmoregulation in the fall field cricket, Gryllus pennsylvanicus. Journal of Experimental Biology. 214 (5), 726-734 (2011).
- Huey, R. B., Crill, W. D., Kingsolver, J. G., Weber, K. E. A method for rapid measurement of heat or cold resistance of small insects. British Ecological Society. 6 (4), 489-494 (1992).
- Jenkins, N. L., Hoffmann, A. A. Genetic and maternal variation for heat resistance in drosophila from the field. Genetics. 137 (3), 783-789 (1994).
- Ransberry, V. E., MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The relationship between chill-coma onset and recovery at the extremes of the thermal window of Drosophila melanogaster. Physiological and Biochemical Zoology. 84 (6), 553-559 (2011).
- Sørensen, M. H., et al. Rapid induction of the heat hardening response in an Arctic insect. Biology Letters. 15 (10), (2019).
- Shuman, D., Coffelt, J. A., Weaver, D. K. A computer-based electronic fall-through probe insect counter for monitoring infestation in stored products. Transactions of the American Society of Agricultural Engineers. 39 (5), 1773-1780 (1996).
- MacKay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: A laboratory handbook. , (2005).
- Garcia, M. J., Teets, N. M. Cold stress results in sustained locomotor and behavioral deficits in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological and Integrative Physiology. 331 (3), 192-200 (2019).
- Teets, N. M., Hahn, D. A. Genetic variation in the shape of cold-survival curves in a single fly population suggests potential for selection from climate variability. Journal of Evolutionary Biology. 31 (4), 543-555 (2018).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 45 (8), 719-726 (1999).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. Mechanisms underlying insect chill-coma. Journal of Insect Physiology. 57 (1), 12-20 (2011).
- Salachan, P. V., Sørensen, J. G. Critical thermal limits affected differently by developmental and adult thermal fluctuations. Journal of Experimental Biology. 220 (23), 4471-4478 (2017).
- Hoffmann, A. A., Hallas, R., Anderson, A. R., Telonis-Scott, M. Evidence for a robust sex-specific trade-off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster. Journal of Evolutionary Biology. 18 (4), 804-810 (2005).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Rapid cold-hardening of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) during ecologically based thermoperiodic cycles. Journal of Experimental Biology. 204 (9), 1659-1666 (2001).
- Sinclair, B. J., Vernon, P., Klok, C. J., Chown, S. L. Insects at low temperatures: An ecological perspective. Trends in Ecology and Evolution. 18 (5), 257-262 (2003).
