Summary
Termiska gränser kan förutsäga de miljöer organismer tolererar, vilket är värdefull information inför snabba klimatförändringar. Beskrivs här är hög genomströmning protokoll för att bedöma kritiska termiska minima och värme knockdown tid i insekter. Båda protokollen maximerar genomströmningen och minimerar kostnaderna för analyserna.
Abstract
Övre och nedre termiska gränser för växter och djur är viktiga prediktorer för deras prestanda, överlevnad och geografiska distributioner, och är viktiga för att förutsäga svar på klimatförändringarna. Detta arbete beskriver två höggenomströmningsprotokoll för mätning av insekts termiska gränser: en för bedömning av kritiska termiska minima (CTmin), och den andra för bedömning av heat knock down-tid (KDT) som svar på en statisk värmestressor. I CTmin-analysen placeras individer i en akrylmantad kolonn, utsätts för en minskande temperaturramp, och räknas när de faller från sittpinnarna med hjälp av en infraröd sensor. I värmen KDT analys, individer finns i en 96 väl platta, placeras i en inkubator inställd på en stressande, varm temperatur, och video inspelad för att bestämma den tid då de inte längre kan förbli upprätt och flytta. Dessa protokoll erbjuder fördelar jämfört med vanligt förekommande tekniker. Båda analyserna är låg kostnad och kan slutföras relativt snabbt (~ 2 h). CTmin-analysen minskar experimenterfel och kan mäta ett stort antal individer på en gång. Den värme KDT protokollet genererar en videoinspelning av varje analys och därmed tar bort experimenter bias och behovet av att kontinuerligt övervaka individer i realtid.
Introduction
Termiska gränser av insekter
Variation i miljöförhållanden, inklusive temperatur, är en viktig faktor som påverkar prestanda, kondition, överlevnad och geografisk fördelning av organismer1,2. Övre och nedre termiska gränser bestämma det teoretiska utbudet av miljöer en organism kan tolerera, och, därför, dessa gränser är viktiga prediktorer för växt-och djurfördelningar, särskilt införklimatförändringarna 3,4. Således protokoll för att exakt mäta termiska gränser är viktiga verktyg för ekologer, fysiologer, evolutionsbiologer, och bevarande biologer, bland andra.
Som de mest förekommande och varierande landlevande djuren används insekter ofta för mätningar av termiska gränser. Kritisk termisk maxima (CTmax) och kritiska termiska minima (CTmin) används vanligen för att bedöma intra- och interspecifik variation i termisk tolerans5,6,7. Medan CTmax och CTmin kan mätas för flera fenotyper, inklusive tillväxt, reproduktiva produktionen, och beteende, de är vanligast tillämpas på rörelseaktivitet funktion5,6,7. Således ctmax (även kallad värme knockdown temperatur) och CTmin definieras ofta som de höga och låga temperaturer vid vilka insekter förlorar motorisk funktion och inte kan förbli upprätt5,6,7,8,9,10,11. CTmin sammanfaller med början av chill koma, en reversibel förlamning som väckts av kalla temperaturer6. Medan förlamning vid de termiska gränserna ofta är reversibel, fortsatt exponering för dessa temperaturer leder till ekologisk död5.
Gemensamma metoder för att mäta termiska gränsvärden
En mängd olika apparater har använts för att mäta termiska gränser (sammanfattas i Sinclair et al.) 6. Kortvarigt, insekter värms upp eller kyls i inkubatorer12,13, behållare nedsänkta i vätskebad11,14,15,16, aluminiumblock10,17, eller mantade behållare18, och övervakas tills förflyttning upphör. För att övervaka insekter under analysen är den vanligaste metoden direkt observation, där individer kontinuerligt övervakas i realtid eller retrospektivt med inspelad video6,9,10,11,15,17. Medan direkta observationsmetoder har minimal utrustning krav, de är arbetsintensiva och begränsa genomströmning. Alternativt kan insekter observeras indirekt genom att samla in individer vid diskreta tider när de faller från sittpinnar6,19,20,21 eller med hjälp av aktivitetsmonitorer13.
Indirekta metoder för att mäta termiska gränser är i allmänhet högre-genomströmning och potentiellt mindre felbenägna än direkta observationsmetoder. Den vanligaste metoden för indirekt övervakning använder en mantad temperaturstyrd kolumn6,8,19,20,21. Insekter placeras inuti en kolonn med sittpinnar, och temperaturen i den inre kammaren styrs genom att pumpa vätska från ett temperaturkontrollerat vätskebad genom kolonnens mantlade foder. Individer som når sin termiska gräns faller från sin abborre och samlas in vid diskreta temperaturer eller tidsintervall. Medan denna metod fungerar bra för CTmin, har det hittats olämpligt för CTmax, eftersom flugor frivilligt gå ut ur botten av kolonnen när temperaturen ökar. Den nya metod som beskrivs här kringgår denna fråga genom att individuellt innehålla flugor under automatiserade mätningar.
Förutom observationsmetoden används ofta två typer av temperaturregimer för att bedöma övre termiska gränsvärden. Dynamiska analyser består av gradvis ökande temperatur tills motorisk funktion går förlorad; att temperaturen är den dynamiska CTmax7,8,9,13. I motsats till statiska analyser består av en konstant stressande temperatur tills motorisk funktion går förlorad; den tidspunkten är värme knockdown tid (värme KDT), även kallad den statiska CTmax (sCTmax) i en nyligen papper av Jørgensen et al.7,8,9,16,22. Även om CTmax och värme knockdown analyser (värme KD-analyser) producerar mätvärden med olika enheter, matematisk modellering av de två egenskaper indikerar de ger jämförbar information om värmetolerans och är både ekologiskt relevanta8,9. Dynamiska analyser ger en temperatur som kan jämföras med miljöförhållanden, och de är att föredra när det finns stora skillnader i värmetolerans, såsom jämförelser mellan arter med vitt skilda termiska nischer. På grund av den höga Q10 för värmeskada ackumulering kan dock en statisk analys vara att föredra för att upptäcka små effektstorlekar, såsom intraspecifik variation i värmetolerans9. Också, praktiskt taget, kräver en statisk analys mindre sofistikerad utrustning än en dynamisk analys.
Mål
Målet med detta papper är att formalisera metoder för CTmin och värme KD analyser som kan användas i framtida forskning för att bedöma termiska gränserna för motila insekter. Protokollen är anpassade från tidigare etablerade metoder och är utformade för att vara höggenomströmning, automatiserad och kostnadseffektiv. Båda analyserna kan slutföras på kort tid (~ 2 h), vilket innebär att flera experiment kan genomföras på en enda dag, producera stora mängder data utan att offra repeterbarhet eller noggrannhet. Med denna uppställning kan värmetoleransen för 96 flugor mätas samtidigt, medan kolonnen för CTmin kan rymma mer än 100 flugor, förutsatt att det finns tillräcklig yta för perching.
Höggenomströmningsmetoden för att observera CTmin ändrar den vanliga jacketed kolonnmetodiken med tillsats av en infraröd sensor för att automatiskt räkna flugor. Användningen av en infraröd sensor för räkning föreslogs först av Shuman et al. 199623 men har inte antagits i stor utsträckning. Tillägget av den infraröda sensorn möjliggör generering av kontinuerliga data snarare än att samla in data med diskreta intervaller. Detta protokoll minimerar också experimenter fel genom att eliminera manuell datainmatning och behovet av att manuellt växla insamlingsrör under jacked kolumnen vid diskreta tidpunkter.
Höggenomströmningsmetoden för registrering av värme KDT modifieras från två tidigare studier av värmetolerans hosinsekter 10,12. Enskilda flugor lagras i en 96 brunnsplatta i en temperaturkontrollerad inkubator och video spelas in. Detta protokoll minimerar experimenter bias i att fastställa värme KDT eftersom experiment kan granskas och verifieras genom att spela upp inspelningen. Det här protokollet innehåller också en uppsättning anpassade Python-skript som kan användas för att snabba upp videoanalys. Användningen av enskilda brunnar eliminerar störningar som kan uppstå när andra individer flyttar runt eller faller över, vilket kan vara ett problem när grupper av individer observeras i samma arena10,17. Vidare ger den temperaturkontrollerade inkubatorn en stabil temperatur över alla 96 brunnar, till skillnad från den temperaturgradient som ibland observeras över ett temperaturkontrollerat aluminiumblock10. Observera också att 96 väl inspelningsmetoden kan anpassas för att mäta dynamisk CTmax och potentiellt CTmin (se Diskussion).
För att demonstrera varje protokoll jämfördes de termiska gränserna för vuxna Drosophila melanogaster-honor från utvalda linjer i Den genetiska referenspanelen för Drosophila melanogaster (DGRP)24. Dessa linjer valdes eftersom preliminära experiment indikerade betydande skillnader i termisk tolerans. Dessa analyser visade sig vara robusta metoder för att diskriminera skillnader i termisk tolerans. Följande två protokoll, ct min-analys med höggenomströmning (avsnitt 1) och hög genomströmningsvärme KD-analys (avsnitt 2), beskriver nödvändiga åtgärder för att ta fram CTmin och värme KDT-data för alla motila insektslivsstadium som kan passa i apparaturerna, såsom vuxna Drosophila. För CTmin är det också viktigt att insekten kan abborre. Här, varje analys påvisas i vuxna Drosophila melanogaster. Ändringar kan dock krävas för andra taxa- eller livsstadium6. Mindre förändringar kan inkludera att använda perching material med större öppningar för att rymma större exemplar i CTmin analys eller använda en högre kvalitet kamera för att urskilja den subtila KDT av en långsam rörelse insekt eller livsstadium i värmen KD analys. Detta protokoll beskriver inte metoder för att förbereda flugor, men det är viktigt att standardisera uppfödningsprotokoll för att säkerställa repeterbarhet25 (se Garcia och Teets26 och Teets och Hahn27). Protokollen som lämnas innehåller information om hur man bygger och ställer in apparaterna, hur man registrerar mätningar och en kort beskrivning av dataanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. HÖGPRESTERANDE CTmin-analys
- Montering av den mantade kolonnen( Bild 1A, Bild 2)
- Skär det bredaste (7 cm x 6,35 cm x 0,3 cm) och smalaste (5,7 cm x 5,1 cm x 0,3 cm) akrylrör till lika långa (31,5 cm) med en bågfil (Figur 2A). Dessa två rör kommer att vara de yttre och innersta väggarna i den mantade kolonnen.
- Skär två ringar (2 cm brett) från det mellanstora (6,35 cm x 5,7 cm x 0,3 cm) akrylröret med en bågfil (Bild 2A). Dessa två ringar kommer att vara distanserna mellan de inre och yttersta rören, vilket skapar ett utrymme mellan de två långa akrylrören för vätska att flöda.
- Borra försiktigt två hål i det yttre (bredaste) akrylröret, ett hål upptill och ett nedtill. Se till att varje hål är 3,5 cm från rörets ände. Borra hålen på motsatta sidor av röret (Bild 2B).
- För att minska sprickbildning, placera tejp på röret över platsen för det framtida hålet och borra mycket långsamt på borrens lägsta momentinställning.
- Med hjälp av gängningskranen, trä båda hålen så att slangadaptrar kan skruvas in i de två hålen i det yttre röret. För att minska sprickbildning, använd smörjmedel, och gänga långsamt för hand.
- Skjut de två distanserna på innerjackan, en i varje ände (nederkant och överkant). Lämna ett litet utrymme (0,5 cm) mellan mellanslag och änden på innermanteln (Bild 2B).
- Svetsa distanserna på plats med hjälp av akrylcement.
- Efter cementen på innerröret och distanser uppsättningar, skjut denna konstruktion i större yttre röret med hålen. Se till att ytter- och innerslangarna är spolande på båda ändarna. Distanserna kommer att vara 0,5 cm från slutet, bildar små diken på båda ändar av kolonnen (Bild 2C).
- Svetsa ytterröret till distanserna med hjälp av akrylcement, med hjälp av justerbara stålklämmor för att hålla ihop apparaten. Vänta tills cementen har satts.
- Trä slangadaptrarna i de hål i det yttre röret som nu är säkrade till distanserna och innerröret.
OBS: Adaptrarna ska endast gänga in i det yttre röret och inte in i det öppna utrymmet mellan de inre och de yttersta rören. Om slangadaptrarna gängar för långt in, förkorta dem till lämplig längd med en bågfil. - Täta slangadaptrar i sina trådar på ytterröret med silikon tätningsmedel.
- Fyll de två diken mellan de inre och yttersta rören i båda ändarna av den mantade kolonnen med silikon tätningsmedel.
- För att testa kolonnen fäster du 0,6 cm diameterslang på slangadaptrarna. Anslut adaptern längst ned på kolonnen till en vattenkälla med slangar, och adaptern längst upp i kolonnen till ett avlopp med en annan bit slangar.
- Kör vatten genom apparaten från botten till toppen och kontrollera om det finns läckor. Om det finns läckor, identifiera var de kommer ifrån och täta med silikon.
- Ställa in den mantade kolonnen och Drosophila Funnel Monitor (DFM)
- Fäst den mantlade kolonnen på ett retortstativ med en tre-prong retort clamp. Rikta in kolonnen vertikalt med ena änden öppen mot taket och den andra öppen mot labbbänken (Bild 1B).
- Anslut vätsketillförseln och uteffekten från ett temperaturstyrt kylbad till kolonnens adaptermunstycken med plastslang med 0,6 cm diameter (Figur 1B). Anslut vätskeingången till munstycket i botten av kolonnen och vätskeutgången till munstycket längst upp på kolonnen.
- Skär två 3 cm tjocka cirkulära skumisolerande pluggar (samma omkrets som öppningen av kolumnens innersta fack). Se till att pluggarna sitter tätt och försegla den innersta kolonnen när de sätts i båda ändar (Bild 1B).
- Pierce ett hål genom mitten av en av pluggarna och trä den nakna änden av ett termoelement genom hålet ca 5 cm och säkra med tejp. Koppla in termoelementens andra ände i en termoelementdatalogger.
- Anslut termoelementdataloggern till datorn.
- Kila två bitar av plasträneskydd (5 cm x 7 cm, med ~0,5 cm diameteröppningar) inuti kolonnen för att fungera som perchingmaterial. Placera en bit av vakt 2/3rds från toppen av kolumnen och den andra 1/3rd från toppen av kolumnen (Bild 1B).
- Säkra bottenpluggen (utan termoelement) och den övre kontakten (med termoelement). När kontakten är isatt längst upp i kolonnen, se till att termoelementet inte vidrör sidor av kolonnen.
- Justera höjden på kolonnen på retortstativet så det finns ett 25 cm avstånd mellan spaltens botten och bänkskivan.
- Säkra en retortring (5 cm diameter) till retortstativ 5 cm under kolonnens botten och rotera ringen av till sidan av kolonnen.
- Ställ DFM direkt på retortringen (Bild 1B). Anslut alla de elektroniska komponenterna: strömförsörjningen, strömförsörjningsgränssnittet och datorn enligt tillverkarens protokoll.
- När komponenterna är anslutna, följ tillverkarens protokoll för att avsluta inställningen av DFM och DFM programvara.
- CtMin Analys
- Vrid in- och utmatningsventilerna i vätskebadet till de öppna lägena.
- Tryck på strömbrytaren för att slå på det temperaturkontrollerade vätskebadet och tryck sedan på uppspelningsknappen för att köra en programhöjning och bibehålla temperaturen i badet till 25 °C. Ge vätskebadet och kolonnen 5-10 min att nå och underhålla 25 °C.
- Ta bort kontakten längst upp på kolonnen och ersätt den med en tratt (5,08 cm diameter; se bild 1C).
- Peka flugor från deras matflaska in i kolonnen.
- Ta bort tratten och ersätta den med den övre kontakten snabbt, noga med att inte låta flugor fly. Ge flugorna 5 min att bosätta sig, ibland knacka på botten kontakten för att uppmuntra flugorna att klättra.
- Tryck på startknappen på vätskebadet och påbörja rampprogrammet CTmin (25 °C i 5 min; 25 °C till 10 °C vid 0,5 °C/min; 10 °C i 2 min; sedan 10 °C till -10 °C vid 0,25 °C/min).
OBS: Andra variationer av detta CTmin rampningsprotokoll kan användas beroende på forskningsfrågan (t.ex. jämförelser av effekterna av olika rampningshastigheter på CTmin28). - Klicka på öppna termoelementinspelningsprogramvaran på datorn och klicka sedan på ikonen Spela in för att börja registrera temperaturen inuti kolumnen varje sekund under analysens hela tid. Se till att varje temperaturregistrering omfattar en tidsstämpel som är specifik för den andra, så att temperaturdata senare kan slås samman med data från DFM.
- Tillsätt 5 mL av 90% etanol till ett 15 mL koniskt centrifugrör och placera det i ett rack under kolonnen.
- Ibland, peka på botten kontakten av kolumnen för att locka några flugor på botten för att klättra. De flesta flugor kommer att vara på en abborre eller nära toppen av kolonnen med 15 °C .
- Vid 15 °C, ta bort bottenpluggen och samla upp eventuella flugor fortfarande på bottenpluggen i etanolen. Räkna och notera att dessa flugor samlades vid 15 °C men deras CTmin är okänd.
OBS: Den temperatur vid vilken bottenproppen tas bort bör beslutas före analysen och baseras påtestartens eller behandlingens förutsagda CT min. För denna analys valdes 15 °C baserat på CTmin av dessa särskilda DGRP-linjer som påträffas i preliminära analyser. - Placera en 75 mm ytterdiameters glastratt i DFM. Justera retortringen, DFM och tratten så att de finns under kolonnen. Se till att trattens läpp helt tätar kolonnens botten (Bild 1D).
- För in trattens undersida i uppsamlingsröret 15 mL (Bild 1D).
- Öppna DFM-programvaran på datorn genom att klicka på ikonen Programvara. Programvaran kommer omedelbart att börja registrera tid / datum vid vilken flugor når sin CTmin. Flugor som når sin CTmin förlorar neuromuskulär funktion och faller från sina sittpinnar, och därefter genom DFM.
- Övervaka om alla flugorna har nått sin CTmin som temperaturen minskar genom att kontrollera den övre kontakten och sittpinnar för att se om några flugor fortfarande uppflugen (dvs. fortfarande upprätthålla neuromuskulär funktion). Rättegången avslutas när alla flugorna har nått sin CTmin.
- Vid slutet av rättegången justerar du DFM och tratt bort från kolonnöppningen. Vissa flugor kan nå sin CTmin men förblir fast i kolonnen (dvs. inklämd i en abborre eller dinglande av en enda haserlig krok). Öppna den övre kontakten och ta bort dessa flugor. CT minav dessa flugor är okänd.
- Kombinera utdatafilerna .txt från programvaran för termoelementinspelning (dvs. temperatur, datum och tid) och DFM-programvaran (dvs. antal flugor genom tratten, datum och tid) med kommandot Slå samman i RStudio. Sammanfoga de två filerna baserat på den delade datum/tid-variabeln.
2. Hög genomströmning värme KD analys
- Apparatmontering och beredning
- Med ett lim, fixera stål vävda trådnät (~ 1,5 mm bländare) till botten av en 96 väl no-bottom platta.
- Fäst magneter på de motsatta sidorna av botten av en 96 väl no-bottom platta med en varm limpistol och varmt lim (Figur 3).
- För att tillverka en anpassad septum lock med självhäftande film avsedd för 96 brunnsplattor, stick två filmer klibbiga sidor tillsammans för att bilda en räfflade plastfolie.
- Placera plastlakan över 96 väl plattan och använda tejp för att hålla den till alla fyra sidor av plattan. Över öppningen till varje brunn på plattan, skär ett 'x' i plastarket med en låda fräs (dvs. 96 totalt x's).
- Bedöva flugor med CO2 och ladda dem individuellt i varje brunn av den modifierade 96 väl no-bottom plattan med en aspirator och septum lock. Ta bort septumlocket från 96 brunnsplattan medan flugorna bedövas med CO2 och ersätt det med ett tättslutande klart lock.
- Placera 96 väl utan botten plattan laddad med flugor och med en tydlig åtsittande lock på mat. Se till att flugorna har minst 48 h mellan CO 2-anestesieringen och starten av analysen (steg 2.2.1-2.2.5).2
OBS: Botten av den modifierade 96 väl no-bottom plattor är gjord av nät, så flugor sövda med CO2 kan laddas och lämnas på mat i minst 48 h innan en prövning börjar. Alla plastbehållare >8,5 cm bred x 13 cm lång som är minst 2 cm djup för att rymma ett 1 cm djupt lager av mat kan användas. - Fixera en webbkamera på botten av insidan av en temperaturkontrollerad inkubator med tejp. Rikta kameran direkt uppåt (Bild 4). Säkra en inkubatorhylla ca 10 cm ovanför kameran.
OBS: Webbkameran pekar upp och registrerar 96 väl plattan underifrån för att säkerställa så mycket av brunnen ytan är i sikte som möjligt (t.ex. inte blockeras ut ur sikte av brunnen väggar av plattan). När flugorna når sin KDT de faller till botten av brunnen; i detta fall, den sida som ligger närmast webbkameran, och är därför i sikte oavsett hur långt deras brunn är från siktcentrum. - Anslut webbkameran till en dator.
- Med tejp, fäst ett vitt pappersark (8,5 cm x 13 cm; det exakta området för botten av 96 brunnsplattan) på botten av hyllan (Bild 4). Se till att papperet fyller hela ramen när det visas via webbkameran.
- Placera en ljuskälla i inkubatorn. Använd papper eller andra material för att dämpa belysningen och minimera bländning.
OBS Steg 2.1.10 är specifikt för varje inkubator eftersom belysning och reflektioner varierar mellan inkubatorer. Målet är att ha tillräcklig belysning i inkubatorn för att ge en bra kontrast mellan flugorna i varje brunn och det vita pappersarket bakom plattan när den betraktas med webbkameran.
- Utför värmen KD-analysen
- Ställ inkubatorn på 37,5 °C och vänta ca 30 min för att ge inkubatorn tid att nå och bibehålla önskad temperatur. Den exakta temperaturen kommer att bero på den insekt som bedöms och eventuella andra tidsöverväganden.
- Placera 96 brunnsplattan inverterad i inkubatorn, så att plattans botten (nätsidan) ligger mot det vita papperet på fackets botten (Bild 4). Ta del av orienteringen av brunnarna (kolumn- och radnamn) på facket och i ramen för webbkameran. Färgad tejp längs sidorna av den 96 brunnsplattan och kanterna på det vita papperet kan verifiera orienteringen (Bild 4).
OBS: Säkerställ att inkubatortemperaturen överensstämmer med temperaturen inuti 96 brunnsplattan genom att registrera temperaturen inuti plattan med ett termoelement under en testförsök av värme KD-analysen. Det är också klokt att kontrollera att det finns försumbar variation i temperatur mellan brunnar av 96 väl plattan med flera termoelement innan du leder värme KD analys. - Stäng inkubatordörren.
- Klicka på Spela in på programvaran för videoinspelning.
- Efter 2 h, kontrollera inspelningen för att se att alla flugor har nått sin sista viloplats och slutat röra sig. När alla flugor har slutat röra sig, klicka på Stoppa på videoinspelningsprogramvaran. För de genotyper som testas här, uppfödda vid 25 °C, når de flesta flugor sina KDT med 60 min vid 37,5 °C (se även Jørgensen et al.9).
- Gör av med flugorna.
- Använd de anpassade Python-skripten (Tilläggskodningsfiler 1-3) för att approximera tiden i videon när flugor når sin värme KDT.
OBS: Steg 2.2.7 är valfritt. För att påskynda videoanalysen utvecklades en uppsättning anpassade Python-skript för att mäta ändringar i pixeltäthet över tid i varje brunn (se Tilläggskodningsfil). När flugorna slutar röra sig är pixeldensiteten konstant, och en tomt på dessa data kan användas för att lokalisera den ungefärliga tiden i videon när flugor slås ner. Även om det kan vara möjligt att använda detta skript för att automatisera dataanalys, för närvarande små brister i videon leda till mindre avvikelser mellan förändringar i pixeldensitet och den sanna KD tid. - Klicka på Öppna videofilen och spela in KDT för varje fluga i varje brunn. Det mest konsekventa måttet på värme KDT mellan försök och observatörer registrerar den tid då en fluga når sin sista viloplats.
- Spåra videon i omvänd, med fokus på en enda brunn, och att man kan spela in den tidpunkt då flugan först flyttar av sin sista viloplats. Upprepa denna process för varje brunn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De termiska gränserna (dvs, CTmin och värme KDT) för honor från Drosophila melanogaster Genetiska referenspanelen (DGRP) mättes för att visa de data med hög genomströmning som genereras från de två beskrivna protokollen. CTmin var assayed med hjälp av DGRP linjerna 714 (n = 37) och 913 (n = 45). Heat KDT analyserades och jämfördes med DGRP-linjerna 189 (n = 42) och 461 (n = 42), och videofiler analyserades manuellt. Den totala tiden för experimenten, inklusive att titta på videon, tog <2 h för varje protokoll.
Hondjur från DGRP-linjen 913 hade betydligt lägre medelvärde ctmin temperaturer än honor från DGRP-linjen 714 (figur 5A; Wilcoxon rankningssumma test, W = 1585, P < 0,001). De två linjerna hade klart distinkta fördelningar av CTmin: linje 913 hade en CTmin på 5,00 ± 1,35 °C (medelvärdet ± SD) och linje 714 hade en CTmin på 9,60 ± 1,53 °C.
Heat KDT vid 37,5 °C skilde sig avsevärt mellan hondjur från DGRP-linjerna 73 och 461 (figur 5B; Wilcoxon rankningssumma test, W = 1658,5, P < 0,001). Även om det fanns variation i KDT av båda linjerna, upptäcktes lätt skillnader i värme KDTs mellan linjerna. Linje 73 hade en 14,8 min längre medelvärde KDT än linje 461 (Linje 73 medelvärdet KDT, 55,58 ± 6,92 min; Linje 461 medelvärdet KDT, 40,78 ± 6,64 min).
Bild 1: Ställa in den mantade kolonnen för CTmin-analysen. (A) Monterad jackad kolonn. (B) Jackad kolonn med topp- och understproppar som tätar innerkammaren. Termoelementet träs genom ett hål i den övre kontakten. DFM monteras till en retort ring under kolonnen och flyttas bort till sidan. (C) Start av en CTmin-analys. Den övre kontakten togs bort och flugor hälldes in i den inre kammaren via en tratt vid kolumnens övre öppning. (D) Jackad kolonn och DFM under en CTmin-analys. Den nedre kontakten togs bort från kolumnen och DFM och tratten placerades under kolumnen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Teknisk illustration av den mantade kolonnen. (A) Varje bit akrylrör skurna till längd: i) två distansringar skurna till 3,5 cm i längd (steg 1.1.2):ii). det bredaste akrylslangen som är skuret till 31,5 cm (steg 1.1.1), och iii det smalaste akrylslangar som är skuret till 31,5 cm (steg 1.1.1). (B) Två hål (i grått) borrade i det bredaste stycke akrylslang, 3,5 cm från vardera änden och på motsatta sidor (i; steg 1.1.2). Montering av den smalaste bit akrylslangen med de två distansringarna (ii; steg 1.1.6 och 1.1.7). (C) Den i sin färdiga mantlade kolonnen efter steg 1.1.8-1.1.12. Slangadaptrar anges i grått. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Undersidan (vänster) och överst (höger) vy över 96 brunns-no-bottom plattan. Stålvävt nät är fäst på botten av en modifierad 96 väl no-bottom platta. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 4: Inkubator setup för en värme KD analys. (A) Webbkamera och scen inrättas på distans. (B) Webcam och scenupplägg i inkubatorn innan en försöksprövning påbörjas. Webbkameran är fast på golvet i inkubatorn och facket är ~ 10 cm ovanför webbkameran. (C) Orientering av 96 väl plattan på den vita scenen ovanför webbkameran under en värme KD analys. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 5: Nedre och övre termiska gränser för utvalda linjer från Drosophila Genetiska referenspanelen (DGRP). (A) CTmin värden på två DGRP linjer. (B) Värm KDT av två DGRP-linjer vid 37,5 °C. Var vänlig klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Bild 6: Aktivitetsutmatning från videoanalysskripten i en testdatauppsättning. Varje observationsyt representerar aktivitetsdata från en brunn av en 96 brunnsplatta. Totalt 84 prover testades och visas. Well ID är märkt till höger om varje histogram. Vänligen klicka här för att se denna siffra.
Kompletterande Kodningsfil 1. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande Kodningsfil 2. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande Kodningsfil 3. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De två metoderna som beskrivs ovan genererar data med hög genomströmning av ekologiskt relevanta mätvärden för övre och nedre termiska gränser. Dessa protokoll bygger på tidigare etablerade metoder som är gemensamma för forskning om insektstermiska gränser (sammanfattas i Sinclair et al.) 6. Båda protokollen kan fyllas i på kort tid (~ 2 h vardera), producera datamängder med stora provstorlekar, inte offra repeterbarhet eller noggrannhet, och minimera experimenter fel genom att eliminera manuell datainspelning och inmatning (CTmin analys), eller genom att skapa backup videoinspelningar av varje analys (värme KD analys).
Representativa resultat genererades genom att jämföra de termiska gränserna för vuxna honor från utvalda linjer i DGRP24. Båda analyserna visade betydande skillnader i termisk tolerans mellan linjer. Effektstorleken mellan linjerna i var och en av dessa analyser var relativt stor, vilket i sin tur möjlig gjorde tillförlitlig differentiering av grupper med visuella och statistiska jämförelser. Den stora skillnaden i KDT mellan de två DGRP-linjerna belyser en potentiell fördel med en statisk analys över en dynamisk rampningsanalys; statiska analyser kan vara bättre på att upptäcka mindre skillnader mellan grupper än dynamiska analyser9. De två DGRP linjer som utsätts för värmen KD analys skilde sig i medelvärdet KDT med 14,8 min. Som referens visade Rolandi et al.13 med hjälp av ett dynamiskt rampprotokoll att skillnaden av de högsta och lägstaCT-maxvärdena på 34 DGRP-linjer endast var 1,42 °C, eller <6 min med en 0,25 °C/min-ramp.
I förhållande till andra metoder, det finns flera fördelar med både CTmin analys och värme KD assay beskrivs här. Automatiserad räkning i CTmin-analysen minskar den tid en försöksarbetare tillbringar vid apparaten, vilket ökar den tid som kan spenderas på andra uppgifter. Kostnaden för att bygga akryl-jacketed kolumnen är ~ $ 50, jämfört med den beräknade $ 400 för att köpa en skräddarsydd glas-mantlade kolumn. För värmen KD-analysen eliminerar videoinspelning behovet av direkta observationer i realtid och upptar en liten mängd fysiskt utrymme per prov. Andra protokoll, såsom de som används av Jørgensen et al.9, använda ett stort akvarium för visning av individer nedsänkt i separata injektionsflaska, men denna metod kräver välutbildade utredare för att snabbt kontrollera injektionsflaska för rörelse och en stor mängd utrymme för apparaten. Rolandi et al.13 används infraröda sensorer för att upptäcka rörelse eller brist pårörelse vid CT max i 96 brunnsplattor, medan denna värme KD-analys använder en billig webbkamera (~ $ 70) för att upptäcka rörelse. Den här kameran kan upptäcka subtila rörelser som kan missas av en övervakare av infraröd aktivitet.
Vidare, en uppsättning anpassningsbara skript för att snabbt uppskatta KDT i värmen KD-analysen utvecklades (Kompletterande Coding File 1-3). Dessa skript kan användas för att spara tid genom att få en grov approximation av värme KDT i varje brunn innan du tittar på videon, och med högre videokvalitet dessa skript skulle kunna automatisera datainspelning. Tre skript för att bearbeta videon har lämnats: FirstFrame.py (Supplementary Coding File 1), som definierar den första bildramen för videon; WellDefine.py (Supplementary Coding File 2), som definierar varje enskild brunn av 96 väl plattan i den första bildramen; och MotionDetect.py (Supplementary Coding File 3), som omvandlar videofilen till en aktivitetssignal genom att beräkna förändringen i bildpunktstäthet mellan sekventiella ramar. Den enda ingången till programmet är videofilen, och utdata innehåller sammanfattande statistik och en tidsserie datamängd av aktivitet per brunn (Bild 6). Skillnader i pixeldensitet mellan videobildrutor omformas med hjälp av ett filter i gråskala för att minska bilddimensioner, ett Gaussiskt lågpassfilter för att minska bildbrus och en vidgningsmorfologiska operation för att öka gränserna för rörliga objekt. I det här fallet definieras aktivitet som den absoluta skillnaden för pixelvärden mellan sekventiella ramar. Värme-KDT kan sedan uppskattas som index för den sista bildrutan som innehåller ett aktivitetsvärde som är större än noll. Till exempel var den ram där aktiviteten senast registrerades i väl g12 av en exempeldatamängd (Bild 6) strax efter 2 000 s (33,33 min), vilket indikeras av en plan linje. En observatör kan sedan spela upp den digitala videon och snabbt hitta Heat KDT av väl g12 med denna tidsstämpel.
Med mindre modifieringar och felsökning finns ytterligare tillämpningar för båda analyserna, framför allt med värme KD-analysen. Videoinspelningsinställningen kan ändras för att spela in statiska kalla knockdown-tider, chill coma recovery-tid eller potentiellt dynamiskaCT-max- och CTmin-värden. Chill koma återhämtningstid är den tid det tar en individ att återuppta rörelse efter kall stress29. Därför kan chill koma återhämtningstid mätas med denna inställning genom att inducera chill koma i 96 väl plattan, sedan använda video setup för att spela in återhämtningstiden i inkubatorn. Slutligen, med noggrann finjustering, kunde dynamisk CTmax eller CTmin registreras i en programmerbar rampning inkubator. Noggrann uppmärksamhet på temperaturen inuti var och en av de 96 brunnarna skulle vara ett problem, eftersom små variationer i temperatur i inkubatorn kan förstoras mellan brunnar som temperaturen ändras.
Flera överväganden bör beaktas vid utförandet antingen CTmin eller värme KD analys. Först och främst, kvaliteten, ålder, kön, livsstadium, genetisk bakgrund, och tidigare erfarenhet av en insekt kan påverka termiska gränser6,13,30,31. För båda analyserna måste testpersonerna vara motila. Andra, endast en grupp kan analyseras i taget för varje CTmin apparat. Därför måste variabler som dygnsvariation i termisk tolerans32,33 beaktas vid jämförelse av behandlingar. En lösning på detta problem är att genomföra CTmin analyser av flera behandlingstillstånd med flera apparater samtidigt. För det tredje kan vissa arter inte vara lämpliga för en eller båda assays. Till exempel, vissa arter kan inte lätt klättra eller flyga till sittpinnar i CTmin analys eller kan upphöra med aktiviteten vid höga temperaturer innan deras värme KDT nås, vilket skulle göra det svårt att urskilja en knockdown tid. Slutligen, för att säkerställa korrekta jämförelser i värmen KD analys, är det viktigt att kriterierna för KDT (steg 2.2.8) är konsekvent mellan replikat, observatörer, prövningar, etc. För att rymma olika insektsarter kan det krävas ändringar av någon av testapparaterna. Potentiella ändringar inkluderar att använda olikamin typer av sittpinnar för CT min-analysen, använda cellodlingsplattor med färre brunnar och mer utrymme (48, 24, 12 eller 6 brunnar) i stället för 96 brunnsplattan för att rymma större insekter, eller justera temperaturen som används för värme-KD-analysen för att säkerställa en knockdown-tid som inte är för snabb eller för långsam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Ellie McCabe för hjälp med fly uppfödning. Detta arbete stöds av United States Department of Agriculture National Institute of Food and Agriculture Hatch Project bidrag 1010996 och National Science Foundation bevilja OIA-1826689 till N.M.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) | Thermo Scientific; Waltham, MA | 153-5401 | |
| C922 Pro Stream Webcam | Logitech; Newark, CA | 960-001087 | |
| Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm | Any | Any | |
| Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44036 | |
| Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 440515 | |
| Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44041 | |
| Clear silicone sealant | Any | Any | |
| Collection tube (15 ml) | Any | Any | |
| Cordless Drill | Any | Any | |
| Drosophila Funnel Monitor (DFM) | TriKinetics; Waltham, MA | DFM | Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point |
| DAM data collection software | TriKinetics; Waltham, MA | Records data input from the DFM | |
| Fly Storage Lid | FlySorter; Seatle, WA | FS-96LID-5PK | Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay |
| Fly Storage Plate | FlySorter; Seatle, WA | FS-96PLATE-5PK | Used to hold flies during in the sCTmax assay |
| Fly Food Tray | FlySorter; Seatle, WA | FS-TRAY-5PK | Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay |
| Glass funnel | Kimax | 28950-75 | 75mm |
| Gutter guard | Any | Any | ~0.5 cm diameter openings |
| Hacksaw | Any | Any | |
| Heratherm Thermo Scientific incubator | Thermo Scientific; Waltham, MA | OMS100 | |
| Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 | United States Plastic Corp., OH | 61135 | |
| Hot glue gun and glue | Any | Any | |
| Light Source | Any | Any | |
| Magnets | Any | Any | |
| OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software | OMEGA; Norwalk, CT | ||
| OMEGA thermocouple (Type T) | OMEGA; Norwalk, CT | 5LRTC-TT-K-20-36 | |
| Plastic funnel | Any | Any | 2" diameter |
| Plastic tubing - 0.6 cm diameter | United States Plastic Corp., OH | 62852 | |
| Retort ring | Any | Any | 2" diameter |
| Retort stand | Any | Any | |
| Retort three-prong clamp | Any | Any | |
| Rstudio | |||
| Serial port connector (PSIU9) | TriKinetics; Waltham, MA | PSIU9 | Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections |
| Styrofoam (2" thick) | Any | Any | |
| Tape | Any | Any | |
| Uninterrupted Power Supply (PS9-1) | TriKinetics; Waltham, MA | PS9-1 | Power supply for the DFM and PSIU9 |
| Weld-on #4 Acrylic Cement | United States Plastic Corp., OH | 45737 |
References
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
- Angilletta, M. J. Thermal Adaptation: A Theoretical and Empirical Synthesis. , New York, NY. (2009).
- Coumou, D., Rahms Torf, S. A decade of weather extremes. Nature Climate Change. 2 (7), 491-496 (2012).
- Wang, G., Dillon, M. E. Recent geographic convergence in diurnal and annual temperature cycling flattens global thermal profiles. Nature Climate Change. 4 (11), 988-992 (2014).
- MacMillan, H. A. Dissecting cause from consequence: A systematic approach to thermal limits. Journal of Experimental Biology. 222 (4), 191593 (2019).
- Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: History and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
- Cooper, B. S., Williams, B. H., Angilletta, M. J. Unifying indices of heat tolerance in ectotherms. Journal of Thermal Biology. 33 (6), 320-323 (2008).
- Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits. Functional Ecology. 33 (4), 629-642 (2019).
- Hazell, S. P., Pedersen, B. P., Worland, M. R., Blackburn, T. M., Bale, J. S. A method for the rapid measurement of thermal tolerance traits in studies of small insects. Physiological Entomology. 33 (4), 389-394 (2008).
- Andersen, J. L., et al. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
- Hu, X. P., Appel, A. G. Seasonal variation of critical thermal limits and temperature tolerance in Formosan and eastern subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae). Environmental Entomology. 33 (2), 197-205 (2004).
- Rolandi, C., Lighton, J. R. B., de la Vega, G. J., Schilman, P. E., Mensch, J. Genetic variation for tolerance to high temperatures in a population of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 8 (21), 10374-10383 (2018).
- Overgaard, J., Kristensen, T. N., Sørensen, J. G. Validity of thermal ramping assays used to assess thermal tolerance in arthropods. PLoS ONE. 7 (3), 1-7 (2012).
- Klok, C. J., Chown, S. L. Critical thermal limits, temperature tolerance and water balance of a sub-Antarctic kelp fly, Paractora dreuxi (Lepidoptera: Tineidae). Journal of Insect Physiology. 43, 685-694 (1997).
- Salachan, P. V., Burgaud, H., Sørensen, J. G. Testing the thermal limits: Non-linear reaction norms drive disparate thermal acclimation responses in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 118 (September), 103946 (2019).
- Everatt, M. J., Bale, J. S., Convey, P., Worland, M. R., Hayward, S. A. L. The effect of acclimation temperature on thermal activity thresholds in polar terrestrial invertebrates. Journal of Insect Physiology. 59 (10), 1057-1064 (2013).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The role of the gut in insect chilling injury: Cold-Induced disruption of osmoregulation in the fall field cricket, Gryllus pennsylvanicus. Journal of Experimental Biology. 214 (5), 726-734 (2011).
- Huey, R. B., Crill, W. D., Kingsolver, J. G., Weber, K. E. A method for rapid measurement of heat or cold resistance of small insects. British Ecological Society. 6 (4), 489-494 (1992).
- Jenkins, N. L., Hoffmann, A. A. Genetic and maternal variation for heat resistance in drosophila from the field. Genetics. 137 (3), 783-789 (1994).
- Ransberry, V. E., MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The relationship between chill-coma onset and recovery at the extremes of the thermal window of Drosophila melanogaster. Physiological and Biochemical Zoology. 84 (6), 553-559 (2011).
- Sørensen, M. H., et al. Rapid induction of the heat hardening response in an Arctic insect. Biology Letters. 15 (10), (2019).
- Shuman, D., Coffelt, J. A., Weaver, D. K. A computer-based electronic fall-through probe insect counter for monitoring infestation in stored products. Transactions of the American Society of Agricultural Engineers. 39 (5), 1773-1780 (1996).
- MacKay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. Drosophila: A laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2005).
- Garcia, M. J., Teets, N. M. Cold stress results in sustained locomotor and behavioral deficits in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological and Integrative Physiology. 331 (3), 192-200 (2019).
- Teets, N. M., Hahn, D. A. Genetic variation in the shape of cold-survival curves in a single fly population suggests potential for selection from climate variability. Journal of Evolutionary Biology. 31 (4), 543-555 (2018).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 45 (8), 719-726 (1999).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. Mechanisms underlying insect chill-coma. Journal of Insect Physiology. 57 (1), 12-20 (2011).
- Salachan, P. V., Sørensen, J. G. Critical thermal limits affected differently by developmental and adult thermal fluctuations. Journal of Experimental Biology. 220 (23), 4471-4478 (2017).
- Hoffmann, A. A., Hallas, R., Anderson, A. R., Telonis-Scott, M. Evidence for a robust sex-specific trade-off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster. Journal of Evolutionary Biology. 18 (4), 804-810 (2005).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Rapid cold-hardening of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) during ecologically based thermoperiodic cycles. Journal of Experimental Biology. 204 (9), 1659-1666 (2001).
- Sinclair, B. J., Vernon, P., Klok, C. J., Chown, S. L. Insects at low temperatures: An ecological perspective. Trends in Ecology and Evolution. 18 (5), 257-262 (2003).
