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Biology

곤충의 중요한 열 한계에 대한 높은 처리량 해석

doi: 10.3791/61186 Published: June 15, 2020

Summary

열 제한은 급속한 기후 변화에 직면하여 중요한 정보인 유기체가 견딜 수 있는 환경을 예측할 수 있습니다. 여기에 설명된 곤충의 중요한 열 미니마 및 열 녹다운 시간을 평가하는 고처리량 프로토콜이 있습니다. 두 프로토콜 모두 처리량을 최대화하고 분석 비용을 최소화합니다.

Abstract

식물과 동물의 열 한도가 상하로 성능, 생존 및 지리적 분포를 예측하는 데 필수적이며 기후 변화에 대한 대응을 예측하는 데 필수적입니다. 이 작품은 곤충 열 제한을 측정하기위한 두 개의 고처리량 프로토콜을 설명합니다 : 중요한 열 미니마 (CT분)를평가하기위한 것과 다른 하나는 정적 열 스트레스에 대한 응답으로 열 노크 다운 시간 (KDT)을 평가합니다. CTmin 분석에서 개인은 아크릴 자켓 기둥에 배치되어 온도 경사로가 감소하고 적외선 센서를 사용하여 농어에서 떨어지면 계산됩니다. 열 KDT 분석에서, 개인은 스트레스, 뜨거운 온도로 설정 된 인큐베이터에 배치 96 우물 접시에 포함되어 있으며, 비디오는 더 이상 똑바로 유지하고 이동할 수없는 시간을 결정하기 위해 녹화. 이러한 프로토콜은 일반적으로 사용되는 기술에 비해 이점을 제공합니다. 두 가지 모두 저렴한 비용으로 비교적 빠르게 완료할 수 있습니다(~2h). CTmin 분석은 실험자 오류를 줄이고 한 번에 많은 수의 개인을 측정할 수 있습니다. 열 KDT 프로토콜은 각 분석기의 비디오 레코드를 생성하여 실험자 편향과 개인을 실시간으로 지속적으로 모니터링할 필요성을 제거합니다.

Introduction

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곤충의 열 한계
온도를 포함한 환경 조건의 변화는 유기체 의 성능, 적합성, 생존 및 지리적 분포에 영향을 미치는 주요요인이다 1,,2. 상한 및 하열 제한은 유기체가 견딜 수 있는 환경의 이론적 범위를 결정하며, 따라서 이러한 제한은 특히 기후 변화에 직면하여 식물 및 동물 분포의 중요한 예측 변수입니다3,,4. 따라서 열 제한을 정확하게 측정하는 프로토콜은 생태학자, 생리학자, 진화 생물학자 및 보존 생물학자에게 중요한 도구입니다.

가장 풍부하고 다양한 육상 동물로서 곤충은 열 제한을 측정하는 데 자주 사용됩니다. 임계 열 최대(CT최대)및 임계 열 미니마(CTmin)는일반적으로 열 공차,5,6,67의내외 및 상호 특이적 변동을 평가하는 데 사용됩니다. CT최대 및 CT분성장, 생식 출력 및 동작을 포함한 다중 표현형에 대해 측정할 수 있지만, 가장 일반적으로 운동 기능5,,6,,7에적용됩니다. 따라서,CT최대(열 녹다운 온도라고도 함)와 CT분은 곤충이 모터 기능을 잃고,,5,6,7,78,9,,10,,11을똑바로 유지할 수 없는 높고 낮은 온도로 정의됩니다.5 CTmin은 차가운 혼수 상태에 의해 가져온 가역적 인 마비, 차가운 혼수 상태에 대한 발병과일치6. 열 한계에 마비는 종종 가역, 이러한 온도에 지속적인 노출생태사멸에이르게 5.

열 한계를 측정하는 일반적인 방법
다양한 장치가 열 제한을 측정하는 데 사용되었습니다 (싱클레어 등에서 요약) 6.,간략하게 곤충은 인큐베이터(12,,13)에서 가열 또는 냉각되며,12용기는 유체목욕(11,14,15,,16,알루미늄 블록10,,17,또는 재킷 용기18)에침수되어 운동이 중단될 때까지 모니터링된다., 분석 중에 곤충을 모니터링하기 위해, 가장 일반적인 방법은 개인이 지속적으로 녹화 된 비디오,,6,9,,10,,11,15,,17로실시간으로 또는 소급하여 모니터링되는 직접 관찰이다. 직접 관찰 방법은 장비 요구 사항이 최소화되지만 노동 집약적이며 처리량을 제한합니다. 대안적으로, 곤충은6,19,,20,,21에서 떨어지거나 활동모니터(13)를사용하여 개별 시간에 개인을 수집하여 간접적으로 관찰될 수 있다.,

열 제한을 측정하기 위한 간접 적인 방법은 일반적으로 처리량이 높고 직접 관찰 방법보다 잠재적으로 오류가 발생하기 쉽습니다. 간접 모니터링을 위한 가장 일반적인 방법은 재킷 온도 제어 컬럼6,8,819,,20,21을사용합니다.,, 곤충은 농어가있는 기둥 내부에 배치되며, 내부 챔버의 온도는 기둥의 재킷 안대기를 통해 온도 조절 유체 욕조에서 유체를 펌핑하여 제어됩니다. 열 한도에 도달하는 개인은 농어에서 떨어지고 개별 온도 또는 시간 간격으로 수집됩니다. 이 방법은 CT분에적합하지만 온도가 증가할 때 파리가 자발적으로 컬럼 의 바닥에서 걸어 나있기 때문에 CT최대에적합하지 않은 것으로 나타났습니다. 여기에 설명된 새로운 방법은 자동화된 측정 중에 파리를 개별적으로 포함시켜 이 문제를 해결합니다.

관찰 방법 외에도 두 가지 유형의 온도 요법이 일반적으로 상열 제한을 평가하는 데 사용됩니다. 동적 해석은 모터 기능이 손실될 때까지 점차적으로 온도를 증가시로 구성됩니다. 그 온도는 동적 CT최대7,,8,,9,,13이다. 대조적으로, 정적 해석은 모터 기능이 손실될 때까지 일정한 스트레스 온도로 구성됩니다. 그 시점은 열 녹다운 시간(열 KDT)이며, 또한 Jørgensen 외.7,8,,9,,16,,22에의해 최근 논문에서 정적 CT최대(sCT max)라고도한다., CT최대 및 열 녹다운 분석(열 KD 분석)은 서로 다른 단위로 메트릭을 생성하지만, 두 특성의 수학적 모델링은 열 내성에 대한 유사한 정보를 제공하고 생태학적으로 관련된8,,9를나타냅니다. 동적 분해는 환경 조건에 비해 비교할 수 있는 온도를 산출하며, 열 틈새 시장을 가진 종 간의 비교와 같은 열 내성에서 큰 차이가 있을 때 바람직하다. 그러나 열 손상 축적을 위한 Q10이 높기 때문에, 정적 분석은 열내성 차성 변화와 같은 작은 효과 크기를 검출하는 것이 바람직할 수 있다9. 또한, 실질적으로 말하자면, 정적 분석은 동적 분석보다 덜 정교한 장비를 필요로한다.

목표
이 논문의 목적은 향후 연구에서 쓸데옥 곤충의 열 한계를 평가하는 데 사용할 수 있는 CTmin 및 열 KD 에세이에 대한 방법을 공식화하는 것입니다. 이 프로토콜은 이전에 확립된 방법론에서 적용되었으며 높은 처리량, 자동화 및 비용 효율적인 프로토콜로 설계되었습니다. 두 분석 모두 짧은 시간(~2h)으로 완료할 수 있으며, 이는 반복성 이나 정확성을 희생하지 않고 많은 양의 데이터를 생성하여 하루에 여러 실험을 수행할 수 있음을 의미합니다. 이 설정을 사용하면 96개의 파리의 열 내성을 동시에 측정할 수 있으며, CTmin의 컬럼은 수용에 적합한 표면적이 있는 경우 100개 이상의 파리를 보유할 수 있습니다.

CT최소를 관찰하는 높은 처리량 방법은 자동으로 파리수를 계산하는 적외선 센서를 추가하여 일반적인 재킷 컬럼 방법론을 수정합니다. 카운팅을 위한 적외선 센서의 사용은 1996년23년에 Shuman et al.에 의해 처음 제안되었지만 널리 채택되지 않았습니다. 적외선 센서를 추가하면 개별 간격으로 데이터를 수집하는 대신 연속 데이터 생성을 가능하게 합니다. 또한 이 프로토콜은 수동 데이터 입력을 제거하고 개별 시간 지점에서 잭컬럼 아래에 수집 튜브를 수동으로 전환해야 하는 필요성을 제거하여 실험자 오류를 최소화합니다.

열 KDT를 기록하는 고처리량 방법은 곤충10,,12에서열 내성의 두 가지 이전 연구에서 수정된다. 개별 파리는 온도 조절 인큐베이터에 96 웰 플레이트에 저장되며 비디오가 기록됩니다. 이 프로토콜은 실험을 다시 재생하여 실험을 검토하고 확인할 수 있기 때문에 열 KDT를 결정하는 실험자 편향을 최소화합니다. 이 프로토콜은 비디오 분석 속도를 높이는 데 사용할 수 있는 사용자 지정 Python 스크립트 집합도 제공합니다. 개별 우물의 사용은 다른 개인이 이동하거나 넘어질 때 발생할 수있는 간섭을 제거, 개인의 그룹이 같은 경기장에서 관찰 될 때 문제가 될 수있습니다 10,,17. 또한 온도 조절 인큐베이터는 온도 제어 알루미늄블록(10)에서때때로 관찰되는 온도 그라데이션과 달리 모든 96개의 우물에서 안정적인 온도를 제공합니다. 또한 96 개의 잘 기록 방법은 동적 CT최대 및 잠재적으로 CT최소를 측정하도록 조정할 수 있습니다(토론 참조).

각 프로토콜을 입증하기 위해, 드로소필라 멜라노가스터 유전자 참조 패널(DGRP)의 선택 라인에서 성인 드로소필라 멜라노가스터 여성의 열 한계를24를비교하였다. 예비 실험이 열 내성에서 상당한 차이를 나타내기 때문에 이러한 라인을 선택했습니다. 이러한 해석은 열 내성의 차이를 차별하는 견고한 방법임이 입증되었습니다. 다음 두 프로토콜, 높은 처리량 CTmin 분석(섹션 1) 및 고처리량 열 KD 분석(섹션 2)은 성인 Drosophila와같은 장치에 장착할 수 있는 모든 motile 곤충 수명 단계에 대해 CTmin 및 열 KDT 데이터를 생성하는 데 필요한 작업을 설명합니다. CTmin의 경우 곤충이 농어를 앉을 수 있어야 합니다. 여기서, 각 분석은 성인 Drosophila 멜라노가스터에서입증된다. 그러나 다른 taxa 또는 생활 단계6에대해 수정이 필요할 수 있습니다. 사소한 변화는 CTmin 분석에서 더 큰 표본을 수용하기 위해 더 큰 개구부를 가진 농어 재료를 사용하거나 열 KD 분석에서 느린 움직이는 곤충 또는 생명 단계의 미묘한 KDT를 분별하기 위해 더 높은 품질의 카메라를 사용하는 것을 포함할 수 있습니다. 이 프로토콜은 파리 를 준비하는 방법을 설명하지 않지만반복성(25)을 보장하기 위해 양육 프로토콜을 표준화하는 것이 중요합니다(참조 가르시아와 티츠26 및 Teets 및 한27참조). 제공된 프로토콜에는 장치를 구축하고 설정하는 방법, 측정 기록 방법 및 데이터 분석에 대한 간략한 설명이 포함됩니다.

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Protocol

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1. 높은 처리량 CT 분석

  1. 자켓 기둥 조립(그림 1A, 그림 2)
    1. 가장 넓은(7cm x 6.35cm x 0.3 cm)과 가장 좁은(5.7cm x 5.1 cm x 0.3 cm) 아크릴 튜브를 같은 길이(31.5cm)로 절단한다(그림2A).Figure 2 이 두 개의 튜브는 재킷 기둥의 외부 및 가장 안쪽 벽이 될 것입니다.
    2. 중형(6.35cm x 5.7cm x 0.3cm)에서 2개의 링(2cm 너비)을 쇠톱으로 아크릴 튜브로 자른다.Figure 2A 이 두 링은 내부와 바깥쪽 튜브 사이의 스페이서가 되어 유체가 흐르기 위해 두 개의 긴 아크릴 튜브 사이의 공간을 만듭니다.
    3. 조심스럽게 외부 (가장 넓은) 아크릴 튜브에 두 개의 구멍을 드릴, 상단에 하나의 구멍과 하단에 하나. 각 구멍이 튜브 끝에서 3.5cm인지 확인합니다. 튜브의 반대쪽에 구멍을 뚫습니다(그림2B).
    4. 크래킹을 줄이려면, 미래의 구멍 위에 튜브에 테이프를 놓고 드릴의 가장 낮은 토크 설정에 매우 느리게 드릴.
    5. 스레딩 탭을 사용하여 호스 어댑터를 외부 튜브의 두 구멍으로 나사로 나사로 만들 수 있도록 두 구멍을 스레드합니다. 균열을 줄이려면 윤활유를 사용하고 손으로 천천히 스레드하십시오.
    6. 두 스페이서를 각 끝(아래쪽과 위쪽)에 하나씩 안쪽 재킷에 밀어 넣습니다. 스페이서와 내부 재킷의 끝 사이에 작은 공간 (0.5cm)을 둡니다(그림 2B).
    7. 아크릴 시멘트를 사용하여 스페이서를 제자리에 용접합니다.
    8. 내부 튜브와 스페이서세트의 시멘트가 놓인 후, 이 구조를 구멍이 있는 더 큰 외관으로 밀어 넣습니다. 외부 튜브와 내부 튜브가 양쪽 끝에 플러시되어 있는지 확인합니다. 스페이서는 끝에서 0.5cm가 되어 기둥의 양쪽 끝에 작은 참호를 형성합니다(그림2C).
    9. 아크릴 시멘트를 사용하여 외부 튜브를 스페이서에 용접하여 조절 가능한 강철 클램프를 사용하여 장치를 함께 고정시하십시오. 시멘트가 설정 될 때까지 기다립니다.
    10. 호스 어댑터를 바깥쪽 튜브의 구멍에 스레드하여 스페이서와 내부 튜브에 고정됩니다.
      참고: 어댑터는 외부 튜브에만 스레드해야 하며 내부 튜브와 바깥쪽 튜브 사이의 열린 공간에 연결하지 않아야 합니다. 호스 어댑터가 너무 멀리 스레드경우, 쇠톱으로 적절한 길이로 그들을 단축.
    11. 호스 어댑터를 실리콘 실란트로 외부 튜브의 스레드로 밀봉합니다.
    12. 재킷 컬럼의 양쪽 끝에 있는 내부 와 가장 바깥쪽 튜브 사이에 실리콘 실란트로 두 개의 트렌치를 채웁니다.
    13. 컬럼을 테스트하려면 0.6cm 직경 의 튜브를 호스 어댑터에 연결합니다. 컬럼 하단의 어댑터를 튜브가 있는 수원에 연결하고 기둥 상단의 어댑터를 다른 튜브 조각이 있는 드레인에 연결합니다.
    14. 장치에서 상단까지 장치를 통해 물을 실행하고 누출을 확인합니다. 누출이 있는 경우 어디에서 오는지 확인하고 실리콘으로 밀봉하십시오.
  2. 재킷 기둥 과 드로소필라 깔때기 모니터 설정 (DFM)
    1. 재킷 기둥을 3구레토르트 클램프로 레토르트 스탠드에 고정합니다. 기둥을 천장에 열고 다른 쪽 끝이 실험실벤치(그림 1B)에열려 있는 것으로 수직으로 정렬합니다.
    2. 온도 조절식 냉장 욕조에서 0.6cm 직경 플라스틱튜브(그림 1B)를사용하여 컬럼의 어댑터 노즐에 유체 입력 및 출력을 연결합니다. 유체 입력을 열 하단의 노즐에 연결하고 유체 출력을 열 상단의 노즐에 연결합니다.
    3. 2 개의 3cm 두께의 원형 폼 절연 플러그 (기둥의 가장 안쪽 구획의 개구와 동일한 둘레)를 잘라냅니다. 플러그가 잘 맞는지 확인하고 양끝에 삽입할 때 가장 안쪽 의 열을 밀봉합니다(그림1B).
    4. 플러그 중 하나의 중앙을 관통하고 약 5cm 구멍을 통해 열전대의 맨 끝을 스레드 테이프로 고정합니다. 열전대의 다른 쪽 끝을 열전대 데이터 로거에 연결합니다.
    5. 열전대 데이터 로거를 컴퓨터에 연결합니다.
    6. 기둥 내부에 플라스틱 거터 가드 2장(직경 5cm x 7cm, 직경 0.5cm)을 쐐기하여 앉는 재료로 작용합니다. 열 의 상단에서 가드 2/3RDs의 한 조각을 놓고 다른 1/3rd는 열의 상단에서(그림 1B).
    7. 아래쪽 플러그(열전대 없이)와 상단 플러그(열전대)를 고정합니다. 플러그가 열 상단에 삽입되면 열전대가 열의 측면에 닿지 않도록 합니다.
    8. 레토르트 스탠드의 열 높이를 조정하여 열 의 바닥과 벤치 상단 사이의 거리가 25cm입니다.
    9. 레토르트 링(직경 5cm)을 열 아래 5cm 아래에 레토르트 스탠드에 고정하고 링을 기둥 의 측면으로 회전시합니다.
    10. 레토르트링(그림 1B)에DFM을 직접 설정합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 전원 공급 장치, 전원 공급 장치 인터페이스 및 컴퓨터를 모두 연결합니다.
    11. 구성 요소가 연결되면 제조업체의 프로토콜을 따라 DFM 및 DFM 소프트웨어의 설정을 완료합니다.
  3. 코네티컷 시험
    1. 유체 욕조의 입력 및 출력 밸브를 열린 위치로 돌립니다.
    2. 전원 버튼을 눌러 온도 조절 유체 목욕을 켜고 플레이 버튼을 눌러 목욕의 온도를 25°C로 올리고 유지관리하는 프로그램을 실행합니다. 25°C에 도달하고 유지하기 위해 유체 목욕및 컬럼을 5-10분 간 제공합니다.
    3. 열 상단의 플러그를 제거하고 깔때기로 바꿉니다(직경 5.08cm; 그림 1C참조).
    4. 음식 유리병에서 기둥으로 파리를 누릅니다.
    5. 깔때기를 제거하고 플라이가 탈출하지 않도록주의, 신속하게 상단 플러그로 교체합니다. 파리를 5분 간 정착시키면 가끔 하단 플러그를 두드려 파리가 올라가도록 유도합니다.
    6. 유체 목욕의 시작 버튼을 누르고 CTmin 램핑 프로그램(25°C5 분~ 0.5°C/min에서 25°C~ 10°C, 2분 동안 10°C, 0.25°C/분에서 10°C~ -10°C)를 시작합니다.
      참고: 이 CTmin 램핑 프로토콜의 다른 변형은 연구 질문(예: CT28에대한 다른 램핑 속도의 효과의 비교)에 따라 사용될 수 있습니다.
    7. 컴퓨터에서 열전대 기록 소프트웨어를 열어 클릭한 다음 기록 아이콘을 클릭하여 분석 기간 동안 매 초마다 열 내부의 온도를 기록하기 시작합니다. 각 온도 기록에 두 번째에 특정한 타임스탬프가 포함되어 있는지 확인하여 온도 데이터를 나중에 DFM의 데이터와 병합할 수 있습니다.
    8. 15mL 원심분리기 튜브에 90% 에탄올 5mL를 넣고 열 아래 랙에 놓습니다.
    9. 때때로, 상승 바닥에 있는 모든 파리를 유혹하는 열의 하단 플러그를 누릅니다. 대부분의 파리는 농어 또는 15 °C에 의해 열의 상단 근처에있을 것입니다.
    10. 15 °C에서 바닥 플러그를 제거하고 에탄올의 하단 플러그에 있는 파리를 수집합니다. 이 파리는 15°C에서 수집되었지만 CT분은 알려지지 않았습니다.
      참고: 바닥 플러그가 제거되는 온도는 분석 전에 결정되어야 하며 시험 종 또는 치료의 예측 CTmin을 기준으로 결정되어야 합니다. 이 분석의 경우, 15°C는 예비 분석에서 발견되는 이러한 특정 DGRP 라인의 CT분에 기초하여 선택되었다.
    11. 75mm 외부 직경 유리 깔때기를 DFM에 넣습니다. 레토르트 링, DFM 및 깔때기를 조정하여 열 아래에 있도록 합니다. 깔때기의 입술이 컬럼의 바닥을 완전히 밀봉하는지 확인합니다(그림1D).
    12. 깔때기의 바닥을 15mL 수집튜브(도 1D)에삽입합니다.
    13. 소프트웨어 아이콘을 클릭하여 컴퓨터에서 DFM 소프트웨어를 엽니다. 이 소프트웨어는 즉시 파리가 CT분에도달하는 시간 / 날짜를 기록하기 시작합니다. 그들의 CT분에 도달 하는 파리 신경 근육 기능을 잃고 그들의 농어에서 가을, 그리고 그 후 DFM을 통해.
    14. 모든 파리가 정상 플러그와 농어를 확인하여 온도가 감소함에 따라 모든 파리가 CT분에 도달했는지 여부를 모니터링하여 파리가 여전히 자리 잡고 있는지 확인하십시오 (즉, 여전히 신경 근육 기능을 유지). 모든 파리가 CT분에도달하면 평가판이 끝납니다.
    15. 평가판이 끝나면 DFM을 조정하고 열 개구부에서 깔때기를 제거합니다. 일부 파리는 CT분에 도달 할 수 있지만 열에 갇혀 남아있을 수 있습니다 (즉, 농어에 쐐기 또는 하나의 타르 솔에 매달려). 상단 플러그를 열고 이러한 파리를 제거합니다. 이 파리의 CT분은 알 수 없습니다.
    16. RStudio의 병합 명령을 사용하여 열전대 기록 소프트웨어(예: 온도, 날짜 및 시간)와 DFM 소프트웨어(예: 깔때기, 날짜 및 시간을 통한 파리 수)의 .txt 출력 파일을 결합합니다. 공유 날짜/시간 변수를 기반으로 두 파일을 병합합니다.

2. 높은 처리량 열 KD 분석

  1. 장치 조립 및 준비
    1. 접착제를 사용하여 강철 직조 와이어 메쉬(~1.5mm 조리개)를 96개의 잘 바닥이 없는 플레이트의 바닥에 고정합니다.
    2. 96의 바닥의 반대편에 자석을 부착하여 뜨거운 접착제 총과 핫접착제(그림 3)를장착합니다.
    3. 96개의 웰 플레이트용으로 설계된 접착제 필름으로 커스텀 중격 뚜껑을 제작하려면 두 개의 필름을 끈적거리는 면을 함께 붙이면 능선 플라스틱 시트를 형성합니다.
    4. 플라스틱 시트를 96 웰 플레이트 위에 놓고 테이프를 사용하여 접시의 네 면모두에 부착하십시오. 플레이트의 각 우물에 구멍을 통해 상자 커터 (즉, 총 96 x)로 플라스틱 시트에 'x'를 잘라냅니다.
    5. CO2로 파리를 마취하고 배구대와 중격 뚜껑이있는 수정 된 96 개의 잘 바닥 이없는 플레이트의 각 우물에 개별적으로 적재합니다. 파리가 CO2로 마취되는 동안 96 웰 플레이트에서 중격 뚜껑을 제거하고 꽉 끼는 투명 뚜껑으로 교체하십시오.
    6. 파리로 가득 찬 96 개의 잘 바닥이없는 접시를 음식에 뚜껑을 단단히 고정시하십시오. 파리가 CO2 마취와 분석 시작 사이에 48h 이상 있는지 확인하십시오 (단계 2.2.1-2.2.5 단계).
      참고: 수정된 96개의 잘 바닥이 없는 플레이트의 바닥은 메쉬로 만들어지므로 CO2로 마취된 파리를 적재하고 시험이 시작되기 전에 최소 48시간 동안 음식에 남을 수 있습니다. 모든 플라스틱 용기 >8.5cm 너비 x 13cm 길이는 1cm 깊이의 음식을 수용할 수 있도록 깊이 2cm 이상입니다.
    7. 테이프로 온도 제어 인큐베이터의 내부 하단에 웹캠을 수정합니다. 카메라를 직접 위로가리킵니다(그림 4). 카메라 위 약 10cm 의 인큐베이터 선반을 고정하십시오.
      참고: 웹캠은 아래에서 96개의 웰 플레이트를 가리키고 기록하여 가능한 한 잘 보이는 표면의 많은 것을 확인합니다(예: 플레이트의 우물 벽에 의해 시야에서 차단되지 않음). 파리가 KDT에 도달하면 우물 의 바닥에 떨어집니다. 이 경우 웹캠에 가장 가까운 측면이 있으므로 시야 중심에서 얼마나 멀리 떨어져 있는지에 관계없이 볼 수 있습니다.
    8. 웹캠을 컴퓨터에 연결합니다.
    9. 테이프를 사용하여 흰색 용지(8.5cm x 13cm, 96웰 플레이트의 바닥의 정확한 면적)를 선반 바닥에 부착합니다(그림4). 웹캠을 통해 볼 때 용지가 전체 프레임을 채웁니다.
    10. 인큐베이터에 광원을 배치합니다. 종이 나 다른 재료를 사용하여 조명을 약화시키고 눈부심을 최소화하십시오.
      참고 단계 2.1.10은 인큐베이터마다 조명과 반사가 다르기 때문에 각 인큐베이터에 만릅니다. 목표는 각 우물의 파리와 웹캠으로 볼 때 접시 뒤에 있는 흰색 종이 사이에 좋은 대조를 제공하기 위해 인큐베이터에 충분한 조명을 갖는 것입니다.
  2. 열 KD 분석 수행
    1. 인큐베이터를 37.5°C로 설정하고 약 30분 정도 기다려 인큐베이터에게 원하는 온도를 도달하고 유지할 수 있는 시간을 준다. 정확한 온도는 평가되는 곤충과 다른 시간 고려 사항에 따라 달라집니다.
    2. 플레이트(메쉬 측)의 바닥이 트레이의 바닥에 있는 백서에대하여(도 4)에반하는 등 인큐베이터에 반전된 96개의 웰 플레이트를 놓습니다. 트레이와 웹캠 프레임의 우물(열 및 행 이름)의 방향을 기록합니다. 흰색 용지의 96 웰 플레이트와 모서리의 측면을 따라 색 테이프는 방향을 확인할 수 있습니다(도 4).
      참고: 인큐베이터 온도가 열 KD 분석의 시험 시험 중에 열전대로 플레이트 내부의 온도를 기록하여 96 웰 플레이트 내부의 온도와 일치하는지 확인합니다. 또한 열 KD 분석기를 수행하기 전에 여러 열전대와 96 웰 플레이트의 우물 사이의 온도가 무시할 수 있는지 확인하는 것이 신중하다.
    3. 인큐베이터 문을 닫습니다.
    4. 비디오 녹화 소프트웨어의 레코드를 클릭합니다.
    5. 2시간 후, 모든 파리가 마지막 휴식 장소에 도달하고 이동을 중지한 것을 확인하기 위해 기록을 확인합니다. 모든 파리가 이동을 중지하면 비디오 녹화 소프트웨어 중지를 클릭합니다. 여기서 테스트된 유전자형의 경우, 25°C에서 사육된 대부분의 파리는 37.5°C에서 60분까지 KDT에 도달합니다(Jørgensen외. 9참조).
    6. 파리를 폐기하십시오.
    7. 사용자 지정 Python스크립트(보충 코딩 파일 1-3)를사용하여 플라이가 열 KDT에 도달할 때 비디오의 시간을 대략적으로 설명합니다.
      참고: 2.2.7 단계는 선택 사항입니다. 비디오 분석을 가속화하기 위해 각 웰의 시간 별 픽셀 밀도 변화를 측정하기 위해 사용자 지정 Python 스크립트 집합이개발되었습니다(추가 코딩 파일 참조). 파리가 이동을 중지하면 픽셀 밀도가 일정하며 이러한 데이터의 플롯을 사용하여 파리가 무너질 때 비디오에서 대략적인 시간을 찾을 수 있습니다. 이 스크립트를 사용하여 데이터 분석을 자동화할 수 있지만 현재 비디오의 약간의 결함으로 인해 픽셀 밀도 변화와 실제 KD 시간 간의 약간의 불일치가 발생할 수 있습니다.
    8. 비디오 파일을 열고 각 플라이의 KDT를 각 웰에 기록합니다. 시험과 관찰자 사이의 열 KDT의 가장 일관된 측정은 비행이 최종 휴식 장소에 도달하는 시간을 기록하는 것입니다.
    9. 비디오를 역으로 추적하고 단일 우물에 초점을 맞추고 플라이가 먼저 마지막 휴식 지점에서 이동하는 시간을 지적합니다. 각 웰에 대해 이 프로세스를 반복합니다.

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Representative Results

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드로소필라 멜라노가스터 유전자 참조 패널(DGRP)으로부터 여성의 열 한계(즉, CTmin 및 heat KDT)는 두 개의 기술된 프로토콜에서 생성된 고처리량 데이터를 입증하기 위해 측정하였다. CT분은 DGRP 라인 714(n =37) 및 913(n = 45)을 사용하여 분석하였다. 열 KDT는 DGRP 라인(189)(n =42) 및 461(n= 42)과 비교하여 분석되었고, 비디오 파일은 수동으로 분석하였다. 비디오 시청을 포함한 실험의 총 시간은 각 프로토콜에 대해 <2h를 걸렸습니다.

DGRP 선 913에서 여성은 DGRP 라인 714에서 여성보다 상당히 낮은 평균 CT 온도를 했다(그림 5A; 윌콕슨 랭크 합계 테스트, W = 1585, P & 0.001). 두 라인은 CTmin의뚜렷한 분포를 가졌다 : 라인 913은 5.00 ± 1.35 °C (평균 ± SD)의 CT분과 라인 714는 9.60 ± 1.53 °C의 CT분이었다.

37.5°C에서 열 KDT는 DGRP 선 73 및 461(도 5B에서여성 들 사이에서 크게 달랐다; 윌콕슨 랭크 합계 테스트, W = 1658.5, P< 0.001). 두 라인의 KDT에 변화가 있었지만, 선 간 열 KDT의 차이는 쉽게 감지되었습니다. 73호선은 KDT보다 14.8분 더 길었으며(73호선 평균 KDT, 55.58 ± 6.92분; 461호선은 KDT, 40.78± 6.64분)을 의미한다.

Figure 1
그림 1: CT최소 분석기의 재킷 컬럼 설정입니다. (A)조립 된 재킷 기둥. (B)내부 챔버를 밀봉 상단 및 하단 플러그 와 재킷 기둥. 열전대는 상단 플러그의 구멍을 통해 나사로 연결됩니다. DFM은 열 아래의 레토르트 링에 장착되어 측면으로 이동합니다. (C)CT 분석의 시작. 상단 플러그를 제거하고 기둥의 상단 개구부에서 깔때기를 통해 파리가 내부 챔버에 부어졌다. (D)CT 분석 중 자켓 열 및 DFM. 아래쪽 플러그가 열에서 제거되었고 DFM 및 깔때기가 열 아래에 배치되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 재킷 열의 기술 일러스트레이션입니다. (A)아크릴 튜브의 각 조각은 길이로 잘라 : i) 두 스페이서 반지길이 3.5cm로 잘라 (단계 1.1.2):ii). 가장 넓은 아크릴 튜브컷은 31.5cm(1.1.1단계); 그리고 iii 가장 좁은 아크릴 튜브 컷 31.5 cm (단계 1.1.1). (B)두 개의 구멍 (회색) 아크릴 튜브의 가장 넓은 조각으로 드릴, 각 끝에서 3.5cm 와 반대쪽 (i; 단계 1.1.2). 두 스페이서 링과 아크릴 튜브의 가장 좁은 조각의 조립 (ii; 단계 1.1.6 및 1.1.7). (C)1.1.8-1.1.12 단계 후 완성 된 재킷 컬럼. 호스 어댑터는 회색으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 하단(왼쪽) 및 아래쪽(오른쪽) 뷰 96 음의 바닥 이면 플레이트. 강철 직조 메쉬는 수정 된 96 잘 바닥 플레이트의 바닥에 부착됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 열 KD 분석에 대한 인큐베이터 설정. (A)멀리서 세트된 웹캠 과 스테이지. (B)시험이 시작되기 전에 인큐베이터에서 웹캠 및 스테이지 설정. 웹캠은 인큐베이터의 바닥에 고정되고 트레이는 웹캠 위에 ~ 10cm입니다. (C)열 KD 분석 중 웹캠 위의 흰색 스테이지에서 96 웰 플레이트의 방향. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 드로소필라 유전자 참조 패널(DGRP)에서 선택 라인의 하부 및 상부 열 제한. (A)두 개의 DGRP 라인의 CT최소 값입니다. (B)37.5°C에서 두 개의 DGRP 라인의 열 KDT. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 테스트 데이터 집합의 비디오 분석 스크립트에서 활동 출력합니다. 각 플롯은 96 웰 플레이트의 한 웰의 활동 데이터를 나타냅니다. 총 84개의 샘플을 테스트하고 표시하였다. 그럼 ID는 각 히스토그램의 오른쪽에 표시됩니다.  이 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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위에 자세히 설명된 두 가지 방법은 상부 및 하한 열 제한에 대한 생태학적으로 관련된 메트릭의 높은 처리량 데이터를 생성합니다. 이러한 프로토콜은 곤충 열 제한에 대한 연구에 공통된 이전에 확립된 방법론을 기반으로 합니다(싱클레어 등에서 요약) 6. 두 프로토콜모두 짧은 시간(~2h h)으로 완료할 수 있고, 샘플 크기가 큰 데이터 세트를 생성하고, 반복성 이나 정확성을 희생하지 않으며, 수동 데이터 기록 및 입력(CTmin assay)을 제거하거나 각 분석(열 KD 분석)의 백업 비디오 녹화를 만들어 실험자 오류를 최소화할 수 있습니다.

대표적인 결과는 DGRP24의선택선으로부터 성인 여성의 열한계를 비교하여 생성되었다. 두 해석 모두 선 간 열 내성에서 상당한 차이를 보였다. 이러한 각 어설션의 선 사이의 효과 크기는 상대적으로 컸으며, 시각적 및 통계적 비교를 통해 그룹의 안정적인 분화를 허용했습니다. 두 DGRP 라인 간의 KDT의 큰 차이는 동적 램핑 분석에 대한 정적 분석의 잠재적 이점을 강조합니다. 정적 해석은 동적 assays9보다그룹 간의 작은 차이를 더 잘 감지할 수 있습니다. 열KD 분석기를 실시하는 두 개의 DGRP 라인은 평균 KDT에서 14.8분 으로 차이가 나있다. 참고로, 동적 램핑 프로토콜을 사용하여 Rolandi 외13은 34 DGRP 라인의 가장 높고 낮은 CT최대 값의 차이가 0.25 °C /min 램프로 1.42 °C 또는 <6 분이었다는 것을 보여주었습니다.

다른 방법에 비해, 여기에 설명 된 CT 분석 및 열 KD 분석 모두에 몇 가지 장점이 있습니다. CTmin 분석에서 자동 계산하면 실험자가 장치에서 보내는 시간을 줄여 다른 작업에 소요될 수 있는 시간을 증가시킵니다. 아크릴 자켓 열을 구축하는 비용은 ~ $ 50이며, 맞춤형 유리 자켓 열을 구입하는 것으로 추정되는 $ 400에 비해. 열 KD 분석의 경우 비디오 녹화는 실시간으로 직접 관찰할 필요가 없으며 샘플당 소량의 물리적 공간을 차지합니다. Jørgensen외. 9에의해 사용되는 것과 같은 다른 프로토콜은 별도의 바이알에 잠긴 개인을 보기 위해 대형 수족관을 사용하지만,이 방법은 신속하게 운동에 대한 바이알과 장치에 대한 공간의 많은 양을 확인하기 위해 잘 훈련 된 조사자가 필요합니다. Rolandi 외.13 은 96 웰 플레이트에서 CT최대에서 움직임이나 움직임의 부족을 감지하기 위해 적외선 센서를 사용했으며,이 열 KD 분석은 움직임을 감지하기위한 저렴한 웹캠 (~ $ 70)을 사용합니다. 이 카메라는 적외선 활동 모니터에서 놓칠 수 있는 미묘한 움직임을 감지할 수 있습니다.

또한, 열 KD 분석에서 KDT를 신속하게 추정하기 위한 사용자 지정 가능한 스크립트 세트가 개발되었습니다(추가코딩 파일 1-3). 이러한 스크립트는 비디오를 시청하기 전에 각 우물에서 열 KDT의 대략적인 근사치를 얻어 시간을 절약하는 데 사용할 수 있으며, 비디오 품질이 높아서 이러한 스크립트는 데이터 녹화를 자동화할 수 있습니다. 비디오를 처리하는 세 가지 스크립트가 제공되었습니다: 비디오의 첫 번째 이미지 프레임을 정의하는FirstFrame.py(추가 코딩 파일 1); WellDefine.py(보충 코딩 파일 2)이는 첫 번째 이미지 프레임에서 96 웰 플레이트의 각 개별 우물을 정의; 및MotionDetect.py(보충 코딩 파일 3)은순차적 프레임 간의 픽셀 밀도 변화를 계산하여 비디오 파일을 활동 신호로 변환합니다. 프로그램에 대한 유일한 입력은 비디오 파일이며, 출력에는 요약 통계 및 웰당 활동의 시계열 데이터 집합이 포함됩니다(그림6). 비디오 프레임 간의 픽셀 밀도 차이는 그레이스케일 필터를 사용하여 이미지 치수를 줄이고 이미지 노이즈를 줄이는 가우시안 로우 패스 필터, 움직이는 물체의 테두리를 높이기 위한 팽창 형태 학적 작업 등을 변환합니다. 이 경우 활동은 순차적 프레임 간의 픽셀 값의 절대 차이로 정의됩니다. 그런 다음 열 KDT는 0보다 큰 활동 값을 포함하는 마지막 프레임의 인덱스로 추정할 수 있습니다. 예를 들어, 샘플 데이터집합(그림 6)의g12에서 마지막으로 기록된 액은 플랫 라인에 의해 표시된 대로 2,000s(33.33분) 직후였다. 그런 다음 관찰자는 디지털 비디오를 재생하고 이 타임 스탬프로 잘 g12의 열 KDT를 신속하게 찾을 수 있습니다.

사소한 수정 및 문제 해결과 함께 특히 열 KD 분석과 함께 분석 모두에 대한 추가 응용 프로그램이 있습니다. 비디오 녹화 설정을 수정하여 정적 콜드 넉다운 시간, 혼수 상태에 대한 복구 시간 냉각 또는 잠재적으로 동적 CT최대 값 및 CT최소 값을 기록할 수 있습니다. 차가운 혼수 회복 시간은 감기스트레스(29)이후의 움직임을 재개하는 데 걸리는 시간입니다. 따라서, 냉각 혼수 회복 시간은 96 웰 플레이트에서 차가운 혼수 상태에 냉각 혼수 상태에 유도한 다음 비디오 설정을 사용하여 인큐베이터에서 복구 시간을 기록함으로써 이 설정으로 측정될 수 있다. 마지막으로, 신중한 미세 조정으로 동적 CT최대 또는 CT최소는 프로그래밍 가능한 램핑 인큐베이터에 기록될 수 있습니다. 96개의 우물 의 각 내부 온도에 주의주의가 있을 것이고, 이는 인큐베이터의 온도변화가 온도가 변함에 따라 우물 사이에 확대될 수 있기 때문이다.

CT최소 또는 열 KD 분석작업을 수행할 때 고려해야 할 몇 가지 고려 사항을 고려해야 합니다. 무엇보다도, 곤충의 품질, 나이, 성별, 생활 단계, 유전적 배경 및 이전의 경험은 열 제한6,,13,,30,,31에영향을 미칠 수 있다. 두 검사 모두 시험 대상자는 motile이어야 합니다. 둘째, 각 CT 장치에 대해 한 번에 하나의 그룹만 분석할 수 있다. 따라서, 열공성차성(32)의대지 변동과 같은변수는,33은 처리를 비교할 때 고려될 필요가 있다. 이 문제에 대한 한 가지 해결책은 동시에 여러 장치를 가진 다중 치료 조건의 CTmin 에세이를 수행하는 것입니다. 셋째, 일부 종은 하나 또는 둘 다 에세이에 적합하지 않을 수 있습니다. 예를 들어, 일부 종은 CTmin 분석에서 쉽게 올라가거나 비행하지 않거나 열 KDT에 도달하기 전에 고온에서 활동을 중단 할 수 있으므로 낙마 시간을 분별하기가 어려울 수 있습니다. 마지막으로, 열 KD 분석에서 정확한 비교를 보장하기 위해, KDT (단계 2.2.8)에 대한 기준은 복제, 관찰자, 시험 등 사이에 일관성이 중요하다. 상이한 곤충 종을 수용하기 위해서는 시험 장치 중 하나에 대한 수정이 필요할 수 있다. 잠재적인 수정은 CTmin 분석에 대한 다양한 유형의 농어를 사용하여, 더 적은 우물과 더 많은 공간을 가진 세포 배양 플레이트를 사용하여 (48, 24, 12, 또는 6 우물) 대신 96 큰 곤충을 수용하기 위해 잘 플레이트, 또는 열 KD 분석에 사용되는 온도를 조정하여 너무 빠르거나 너무 느리지 않은 녹다운 시간을 보장합니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

플라이 키싱에 도움을 주신 엘리 맥케이브에게 감사드립니다. 이 작품은 미국 농무부 국립 식품 농업 해치 프로젝트 보조금 1010996 및 국립 과학 재단이 N.M.T에 OIA-1826689를 부여하여 지원합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) Thermo Scientific; Waltham, MA 153-5401
C922 Pro Stream Webcam Logitech; Newark, CA 960-001087
Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm Any Any
Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 44036
Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 440515
Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 44041
Clear silicone sealant Any Any
Collection tube (15 ml) Any Any
Cordless Drill Any Any
Drosophila Funnel Monitor (DFM) TriKinetics; Waltham, MA DFM Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point
DAM data collection software TriKinetics; Waltham, MA Records data input from the DFM
Fly Storage Lid FlySorter; Seatle, WA FS-96LID-5PK Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay
Fly Storage Plate FlySorter; Seatle, WA FS-96PLATE-5PK Used to hold flies during in the sCTmax assay
Fly Food Tray FlySorter; Seatle, WA FS-TRAY-5PK Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay
Glass funnel Kimax 28950-75 75mm
Gutter guard Any Any ~0.5 cm diameter openings
Hacksaw Any Any
Heratherm Thermo Scientific incubator Thermo Scientific; Waltham, MA OMS100
Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 United States Plastic Corp., OH 61135
Hot glue gun and glue Any Any
Light Source Any Any
Magnets Any Any
OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software OMEGA; Norwalk, CT
OMEGA thermocouple (Type T) OMEGA; Norwalk, CT 5LRTC-TT-K-20-36
Plastic funnel Any Any 2" diameter
Plastic tubing - 0.6 cm diameter United States Plastic Corp., OH 62852
Retort ring Any Any 2" diameter
Retort stand Any Any
Retort three-prong clamp Any Any
Rstudio
Serial port connector (PSIU9) TriKinetics; Waltham, MA PSIU9 Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections
Styrofoam (2" thick) Any Any
Tape Any Any
Uninterrupted Power Supply (PS9-1) TriKinetics; Waltham, MA PS9-1 Power supply for the DFM and PSIU9
Weld-on #4 Acrylic Cement United States Plastic Corp., OH 45737

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References

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곤충의 중요한 열 한계에 대한 높은 처리량 해석
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Awde, D. N., Fowler, T. E., Pérez-Gálvez, F., Garcia, M. J., Teets, N. M. High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects. J. Vis. Exp. (160), e61186, doi:10.3791/61186 (2020).More

Awde, D. N., Fowler, T. E., Pérez-Gálvez, F., Garcia, M. J., Teets, N. M. High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects. J. Vis. Exp. (160), e61186, doi:10.3791/61186 (2020).

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