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Biology

Ensayos de alto rendimiento de límites térmicos críticos en insectos

doi: 10.3791/61186 Published: June 15, 2020

Summary

Los límites térmicos pueden predecir los ambientes que toleran los organismos, que es información valiosa frente al rápido cambio climático. Aquí se describen protocolos de alto rendimiento para evaluar el mínimo térmico crítico y el tiempo de derribo del calor en los insectos. Ambos protocolos maximizan el rendimiento y minimizan el costo de los ensayos.

Abstract

Los límites térmicos superiores e inferiores de plantas y animales son importantes predictores de su rendimiento, supervivencia y distribuciones geográficas, y son esenciales para predecir las respuestas al cambio climático. Este trabajo describe dos protocolos de alto rendimiento para medir los límites térmicos de insectos: uno para evaluar el mínimo térmico crítico (CTmin)y el otro para evaluar el tiempo de desmoción de calor (KDT) en respuesta a un factor de estrés térmico estático. En el ensayomínimo de TC, los individuos son colocados en una columna con camisa de acrílico, sometidos a una rampa de temperatura decreciente, y contados a medida que caen de sus perchas usando un sensor infrarrojo. En el ensayo de KDT de calor, los individuos están contenidos en una placa de 96 pozos, colocada en una incubadora ajustada a una temperatura estresante, caliente, y vídeo grabado para determinar el tiempo en el que ya no pueden permanecer erguidos y moverse. Estos protocolos ofrecen ventajas sobre las técnicas de uso común. Ambos ensayos son de bajo costo y se pueden completar con relativa rapidez (2 h). El ensayomínimo de TC reduce el error del experimentador y puede medir un gran número de individuos a la vez. El protocolo KDT de calor genera un registro de vídeo de cada ensayo y, por lo tanto, elimina el sesgo del experimentador y la necesidad de monitorear continuamente a las personas en tiempo real.

Introduction

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Límites térmicos de insectos
La variación en las condiciones ambientales, incluida la temperatura, es un factor importante que influye en el rendimiento, la aptitud, la supervivencia y la distribución geográfica de los organismos1,,2. Los límites térmicos superiores e inferiores determinan el rango teórico de ambientes que un organismo puede tolerar, y, por lo tanto, estos límites son importantes predictores de las distribuciones vegetales y animales, especialmente frente al cambio climático3,,4. Por lo tanto, los protocolos para medir con precisión los límites térmicos son herramientas importantes para ecologistas, fisiólogos, biólogos evolutivos y biólogos de conservación, entre otros.

Como los animales terrestres más abundantes y diversos, los insectos se utilizan con frecuencia para las mediciones de los límites térmicos. Los máximos térmicos críticos (CTmax)y los mínimos térmicos críticos (CTmin)se utilizan comúnmente para evaluar la variación intra e interespecífica en la tolerancia térmica5,6,7. Mientras que la TCmax y la TCmin se pueden medir para múltiples fenotipos, incluyendo el crecimiento, la producción reproductiva y el comportamiento, se aplican más comúnmente a la función locomotora5,,6,7. Por lo tanto, CTmax (también llamada temperatura de derribo de calor) y CTmin se definen a menudo como las altas y bajas temperaturas a las que los insectos pierden la función motora y son incapaces de permanecer erguidos5,6,7,8,9,10,11. CTmin coincide con la aparición del coma frío, una parálisis reversible provocada por temperaturas frías6. Si bien la parálisis en los límites térmicos es a menudo reversible, la exposición continua a estas temperaturas conduce a la muerte ecológica5.

Métodos comunes para medir los límites térmicos
Se han utilizado diversos aparatos para medir los límites térmicos (resumidos en Sinclair et al.) 6.Brevemente, los insectos se calientan o enfrían en incubadoras12,13, recipientes sumergidos en baños fluidos11,14,15,16, bloques de aluminio10,17, o contenedores enchatados18, y monitoreados hasta que cesa la locomoción. Para controlar los insectos durante el ensayo, el método más común es la observación directa, en la que los individuos son monitoreados continuamente en tiempo real o retrospectivamente con vídeo grabado6,,9,10,11,15,17. Si bien los métodos de observación directa tienen requisitos mínimos de equipo, consumen mucha mano de obra y limitan el rendimiento. Alternativamente, los insectos pueden ser observados indirectamente mediante la recolección de individuos en momentos discretos ya que caen de las perchas6,19,20,21 o utilizando monitores de actividad13.

Los métodos indirectos para medir los límites térmicos son generalmente de mayor rendimiento y potencialmente menos propensos a errores que los métodos de observación directa. El método más común para el monitoreo indirecto utiliza una columna con camisa de temperatura controladacolumna 6,8,19,20,21. Los insectos se colocan dentro de una columna con perchas, y la temperatura de la cámara interior se controla bombeando líquido desde un baño de fluidos con temperatura controlada a través del revestimiento enchacado de la columna. Los individuos que alcanzan su límite térmico caen de su percha y se recogen a temperaturas discretas o intervalos de tiempo. Mientras que este método funciona bien para CTmin,se ha encontrado inadecuado para CTmax,porque las moscas salen voluntariamente de la parte inferior de la columna cuando la temperatura aumenta. El nuevo método descrito aquí elude este problema al contener individualmente moscas durante las mediciones automatizadas.

Además del método de observación, se utilizan comúnmente dos tipos de regímenes de temperatura para evaluar los límites térmicos superiores. Los ensayos dinámicos consisten en aumentar gradualmente la temperatura hasta que se pierde la función motora; que la temperatura es la TC dinámicamáxima7,8,9,13. Por el contrario, los ensayos estáticos consisten en una temperatura estresante constante hasta que se pierde la función motora; ese punto de tiempo es el tiempo de derribo de calor (calor KDT), también llamado CTestático max (sCTmax) en un artículo reciente por J-rgensen et al.7,8,9,16,22. Aunque los ensayos CTmax y heat knockdown (ensayos de KD térmico) producen métricas con diferentes unidades, el modelado matemático de los dos rasgos indica que proporcionan información comparable sobre la tolerancia al calor y ambos son ecológicamente relevantes8,,9. Los ensayos dinámicos producen una temperatura que se puede comparar con las condiciones ambientales, y son preferibles cuando hay grandes diferencias en la tolerancia al calor, como las comparaciones entre especies con nichos térmicos muy diferentes. Sin embargo, debido al alto Q10 para la acumulación de lesiones por calor, un ensayo estático puede ser preferible para detectar tamaños de efectos pequeños, como la variación intraespecífica en la tolerancia al calor9. Además, prácticamente hablando, un ensayo estático requiere un equipo menos sofisticado que un ensayo dinámico.

Objetivo
El objetivo de este artículo es formalizar métodos para ensayosde KD de CT min y calor que se pueden utilizar en futuras investigaciones para evaluar los límites térmicos de los insectos móviles. Los protocolos se adaptan a partir de metodologías previamente establecidas y están diseñados para ser de alto rendimiento, automatizados y rentables. Ambos ensayos se pueden completar en un corto período de tiempo (2 h), lo que significa que se pueden llevar a cabo varios experimentos en un solo día, produciendo grandes cantidades de datos sin sacrificar la repetibilidad ni la precisión. Con esta configuración, la tolerancia al calor de 96 moscas se puede medir simultáneamente, mientras que la columna para CTmin puede contener más de 100 moscas, siempre que haya una superficie adecuada para posarse.

El método de alto rendimiento para observar CTmin modifica la metodología común de columnas encapuchadas con la adición de un sensor infrarrojo para contar automáticamente las moscas. El uso de un sensor infrarrojo para el recuento fue propuesto por primera vez por Shuman et al. en 199623, pero no ha sido ampliamente adoptado. La adición del sensor infrarrojo permite la generación de datos continuos en lugar de recopilar datos a intervalos discretos. Este protocolo también minimiza el error del experimentador al eliminar la entrada manual de datos y la necesidad de cambiar manualmente los tubos de recolección por debajo de la columna jacked en puntos de tiempo discretos.

El método de alto rendimiento para el registro de calor KDT se modifica de dos estudios previos de tolerancia al calor en insectos10,,12. Las moscas individuales se almacenan en una placa de 96 pozos en una incubadora con temperatura controlada y se graba vídeo. Este protocolo minimiza el sesgo del experimentador para determinar el KDT de calor porque los experimentos se pueden revisar y verificar reproduciendo la grabación. Este protocolo también proporciona un conjunto de scripts de Python personalizados que se pueden utilizar para acelerar el análisis de vídeo. El uso de pozos individuales elimina la interferencia que puede ocurrir cuando otros individuos se mueven o caen, lo que puede ser un problema cuando se observan grupos de individuos en la misma arena10,,17. Además, la incubadora de temperatura controlada proporciona una temperatura estable en los 96 pozos, a diferencia del gradiente de temperatura que a veces se observa en un bloque de aluminio10con temperatura controlada. También tenga en cuenta que el método de grabación de pozos 96 se puede adaptar para medir la TC dinámicamáxima y potencialmente CTmin (ver Discusión).

Para demostrar cada protocolo, se compararon los límites térmicos de las hembras Drosophila melanogaster adultas de líneas selectas del Panel de Referencia Genética de Drosophila melanogaster (DGRP)24. Estas líneas se seleccionaron porque los experimentos preliminares indicaban diferencias significativas en la tolerancia térmica. Estos ensayos demostraron ser métodos robustos para discriminar las diferencias en la tolerancia térmica. Los dos protocolos siguientes, el ensayomínimo de CT de alto rendimiento (sección 1) y el ensayo de KD térmico de alto rendimiento (sección 2), describen las acciones necesarias para producir datos de KDTmin y de calor para cualquier etapa de vida de insectos móviles capaz de encajar en los aparatos, como Drosophilaadulta. Para CTmin también es esencial que el insecto sea capaz de posarse. Aquí, cada ensayo se demuestra en Drosophila melanogasteradulto. Sin embargo, pueden ser necesarias modificaciones para otros taxones o etapas de vida6. Los cambios menores pueden incluir el uso de material de posado con aberturas más grandes para acomodar especímenes más grandes en el ensayomin ct o el uso de una cámara de mayor calidad para discernir el KDT sutil de un insecto en movimiento lento o etapa de vida en el ensayo de KD de calor. Este protocolo no describe los métodos para preparar moscas, pero es importante estandarizar los protocolos de cría para garantizar la repetibilidad25 (véase García y Teets26 y Teets y Hahn27). Los protocolos proporcionados incluyen información sobre cómo construir y configurar los aparatos, cómo registrar mediciones y una breve descripción del análisis de datos.

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Protocol

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1. Ensayomínimo de CT de alto rendimiento

  1. Montaje de la columna revestida (Figura 1A, Figura 2)
    1. Cortar los tubos de acrílico más anchos (7 cm x 6,35 cm x 0,3 cm) y más estrechos (5,7 cm x 5,1 cm x 0,3 cm) a longitudes iguales (31,5 cm) con una sierra de corte(Figura 2A). Estos dos tubos serán las paredes exteriores e internas de la columna con chaqueta.
    2. Cortar dos anillos (2 cm de ancho) del tubo de acrílico de media (6,35 cm x 5,7 cm x 0,3 cm) con una sierra de corte(Figura 2A). Estos dos anillos serán los espaciadores entre los tubos interiores y exteriores, creando un espacio entre los dos tubos acrílicos largos para que el fluido fluya.
    3. Taladre cuidadosamente dos orificios en el tubo de acrílico exterior (más ancho), un agujero en la parte superior y otro en la parte inferior. Asegúrese de que cada orificio esté a 3,5 cm del extremo del tubo. Taladre los orificios en lados opuestos del tubo (Figura 2B).
    4. Para reducir el agrietamiento, coloque la cinta en el tubo sobre el punto del orificio futuro y taladre muy lentamente en el ajuste de par más bajo de la broca.
    5. Usando el grifo roscado, enhebrar ambos orificios para que los adaptadores de manguera se puedan atornillar en los dos orificios del tubo exterior. Para reducir el agrietamiento, utilice lubricante y enhebrar lentamente a mano.
    6. Deslice los dos espaciadores sobre la chaqueta interior, uno en cada extremo (abajo y arriba). Deje un espacio pequeño (0,5 cm) entre el espaciador y el extremo de la chaqueta interior (Figura 2B).
    7. Soldar los espaciadores en su lugar utilizando cemento acrílico.
    8. Después de que el cemento en el tubo interior y los espaciadores conjuntos, deslice esta construcción en el tubo exterior más grande con los agujeros. Asegúrese de que los tubos exteriores e interiores estén al ras en ambos extremos. Los espaciadores serán de 0,5 cm desde el final, formando pequeñas trincheras en ambos extremos de la columna (Figura 2C).
    9. Soldar el tubo exterior a los espaciadores utilizando cemento acrílico, utilizando abrazaderas de acero ajustables para mantener el aparato unido. Espera a que se ponga el cemento.
    10. Enrosque los adaptadores de manguera en los orificios del tubo exterior ahora fijados a los espaciadores y al tubo interior.
      NOTA: Los adaptadores sólo deben enhebrar en el tubo exterior y no en el espacio abierto entre los tubos interior y exterior. Si los adaptadores de manguera se enhebran demasiado, acortenlos a la longitud adecuada con una sierra.
    11. Selle los adaptadores de manguera en sus roscas en el tubo exterior con sellador de silicona.
    12. Llene las dos trincheras entre los tubos interior y exterior en ambos extremos de la columna revestida con sellador de silicona.
    13. Para probar la columna, conecte tubos de 0,6 cm de diámetro a los adaptadores de manguera. Conecte el adaptador en la parte inferior de la columna a una fuente de agua con tubo, y el adaptador en la parte superior de la columna a un drenaje con una pieza diferente de tubo.
    14. Pasa el agua a través del aparato desde la parte inferior hasta la parte superior y comprueba si hay fugas. Si hay fugas, identifique de dónde vienen y selle con silicona.
  2. Configuración de la columna con chaqueta y el monitor de embudo Drosophila (DFM)
    1. Fije la columna enchatada a un soporte de réplica con una abrazadera de retorta de tres puntas. Alinee la columna verticalmente con un extremo abierto al techo y el otro abierto al banco de laboratorio (Figura 1B).
    2. Conecte la entrada y salida de fluido de un baño refrigerado con temperatura controlada a las boquillas del adaptador de la columna con tubos de plástico de 0,6 cm de diámetro(Figura 1B). Conecte la entrada de fluido a la boquilla en la parte inferior de la columna y la salida de fluido a la boquilla en la parte superior de la columna.
    3. Corte dos tapones aislantes de espuma circular de 3 cm de espesor (la misma circunferencia que la abertura del compartimento más interior de la columna). Asegúrese de que los enchufes encajen perfectamente y selle la columna más interna cuando se inserte en ambos extremos(Figura 1B).
    4. Perforar un agujero a través del centro de uno de los enchufes y enhebrar el extremo desnudo de un termopar a través del agujero unos 5 cm y asegurar con cinta. Enchufe el otro extremo del termopar en un registrador de datos de termopar.
    5. Conecte el registrador de datos del termopar al ordenador.
    6. Cuña dos piezas de protector de alcantarilla de plástico (5 cm x 7 cm, con aberturas de 0,5 cm de diámetro) dentro de la columna para funcionar como material de posado. Coloque una pieza de protección 2/3rds desde la parte superior de la columna y la otra 1/3rd desde la parte superior de la columna (Figura 1B).
    7. Asegure el enchufe inferior (sin termopar) y el tapón superior (con un termopar). Cuando el enchufe se inserte en la parte superior de la columna, asegúrese de que el termopar no toque los lados de la columna.
    8. Ajuste la altura de la columna en el soporte de réplica para que haya una distancia de 25 cm entre la parte inferior de la columna y la parte superior del banco.
    9. Asegure un anillo de réplica (5 cm de diámetro) al soporte de réplica 5 cm por debajo de la parte inferior de la columna y gire el anillo hacia el lado de la columna.
    10. Fije el DFM directamente en el anillo del replicart(Figura 1B). Conecte todos los componentes electrónicos: la fuente de alimentación, la interfaz de la fuente de alimentación y el ordenador de acuerdo con el protocolo del fabricante.
    11. Una vez conectados los componentes, siga el protocolo del fabricante para finalizar la configuración del software DFM y DFM.
  3. CtMin Ensayo
    1. Gire las válvulas de entrada y salida del baño de fluidos a las posiciones abiertas.
    2. Pulse el botón de encendido para encender el baño de fluidos con control de temperatura y, a continuación, pulse el botón de reproducción para ejecutar un programa que eleva y mantiene la temperatura del baño a 25 oC. Dar el baño de líquido y la columna 5-10 min para alcanzar y mantener 25 oC.
    3. Retire el enchufe en la parte superior de la columna y reemplácelo con un embudo de conversión (5,08 cm de diámetro; véase la figura 1C).
    4. Toque las moscas de su vial de alimentos en la columna.
    5. Retire el embudo y reemplácelo con el enchufe superior rápidamente, cuidado de no dejar escapar a las moscas. Dar a las moscas 5 minutos para asentarse, de vez en cuando tocando el enchufe inferior para animar a las moscas a subir.
    6. Pulse el botón de inicio en el baño de fluidos e inicie el programa de rampa de CTmin (25 oC durante 5 min; 25 oC a 10 oC a 0,5 oC/min; 10 oC durante 2 min; luego de 10 oC a -10 oC a 0,25 oC/min).
      NOTA: Otras variaciones de este protocolo de rampamínima ct se pueden utilizar dependiendo de la cuestión de la investigación (por ejemplo, comparaciones de los efectos de las diferentes tasas de rampa en CTmin28).
    7. Haga clic en abrir el software de grabación de termopar en el ordenador y, a continuación, haga clic en el icono Grabar para comenzar a registrar la temperatura dentro de la columna cada segundo durante el ensayo. Asegúrese de que cada registro de temperatura incluye una marca de tiempo específica para el segundo, de modo que los datos de temperatura se puedan combinar más adelante con los datos del DFM.
    8. Agregue 5 ml de etanol al 90% a un tubo de centrífuga cónica de 15 ml y colóquelo en un bastidor debajo de la columna.
    9. De vez en cuando, toque el tapón inferior de la columna para atraer a las moscas en la parte inferior para subir. La mayoría de las moscas estarán en una percha o cerca de la parte superior de la columna por 15 oC.
    10. A 15 oC, retire el tapón inferior y recoja las moscas que aún estén en el enchufe inferior en el etanol. Cuente y tenga en cuenta que estas moscas fueron recolectadas a 15 oC, pero se desconoce su CTmin.
      NOTA: La temperatura a la que se retira el tapón inferior debe decidirse antes del ensayo y en función de la TCprevista min de la especie de ensayo o tratamiento. Para este ensayo, se eligieron 15 oC en función delmin CT de estas líneas DGRP particulares que se encuentran en los ensayos preliminares.
    11. Coloque un embudo de vidrio de 75 mm de diámetro exterior en el DFM. Ajuste el anillo de réplica, DFM y embudo para que estén debajo de la columna. Asegúrese de que el labio del embudo sella completamente la parte inferior de la columna (Figura 1D).
    12. Inserte la parte inferior del embudo en el tubo de recogida de 15 ml (Figura 1D).
    13. Abra el software DFM en el equipo haciendo clic en el icono Software. El software comenzará inmediatamente a grabar la hora /fecha en la que las moscas alcanzan su CTmin. Las moscas que alcanzan su TCmin pierden la función neuromuscular y caen de sus perchas, y a partir de entonces a través de la DFM.
    14. Supervise si todas las moscas han alcanzado su TCmín.min a medida que la temperatura disminuye comprobando el tapón superior y las perchas para ver si alguna mosca todavía está encaramada (es decir, manteniendo todavía la función neuromuscular). El juicio termina cuando todas las moscas han alcanzado su CTmin.
    15. Al final de la prueba, ajuste el DFM y el embudo lejos de la abertura de la columna. Algunas moscas pueden alcanzar su tomografía computarizadamin, pero permanecen atascadas en la columna (es decir, encerradas en una percha o colgando por un solo gancho tarsal). Abra el enchufe superior y retire estas moscas. Se desconoceel tomografía computarizada de estas moscas.
    16. Combine los archivos de salida .txt del software de grabación de termopar (es decir, temperatura, fecha y hora) y el software DFM (es decir, el número de moscas a través del embudo, la fecha y la hora) utilizando el comando Combinar en RStudio. Combine los dos archivos en función de la variable de fecha y hora compartida.

2. Ensayo de KD térmico de alto rendimiento

  1. Montaje y preparación del aparato
    1. Con un adhesivo, fije la malla de alambre tejida de acero (apertura de 1,5 mm) en la parte inferior de una placa sin fondo de 96 pozos.
    2. Fije imanes a los lados opuestos de la parte inferior de una placa sin fondo de 96 pozos con una pistola de pegamento caliente y pegamento caliente (Figura 3).
    3. Para crear una tapa de tabique personalizada con película adhesiva diseñada para 96 placas de pozo, pegue dos películas de lados pegajosos para formar una lámina de plástico.
    4. Coloque las láminas de plástico sobre la placa de 96 pozos y utilice cinta adhesiva para adherirla a los cuatro lados de la placa. Sobre la abertura de cada pozo de la placa, corte una 'x' en la lámina de plástico con un cortador de caja (es decir, 96 x totales).
    5. Anesthetizar las moscas con CO2 y cargarlas individualmente en cada pozo de la placa de 96 bien sin fondo modificada con un aspirador y tapa del tabique. Retire la tapa del tabique de la placa de 96 pozos mientras las moscas están anestesiadas conCO2 y reemplácela con una tapa transparente ajustada.
    6. Coloque la placa sin fondo de 96 pozos cargada de moscas y con una tapa clara y ajustada en los alimentos. Asegúrese de que las moscas tengan al menos 48 h entre la anestesia deCO2 y el inicio del ensayo (pasos 2.2.1-2.2.5).
      NOTA: La parte inferior de las 96 placas sin fondo modificadas está hecha de malla, por lo que las moscas anestesiadas conCO2 se pueden cargar y dejar en los alimentos durante al menos 48 horas antes de que comience un ensayo. Se puede utilizar cualquier recipiente de plástico >8,5 cm de ancho x 13 cm de largo que tenga al menos 2 cm de profundidad para acomodar una capa de alimento de 1 cm de profundidad.
    7. Fije una cámara web en la parte inferior del interior de una incubadora con cinta adhesiva con cinta. Apunte la cámara directamente hacia arriba (Figura 4). Asegure un estante de incubadora a unos 10 cm por encima de la cámara.
      NOTA: La cámara web apunta y registra la placa de 96 pozos desde abajo para asegurarse de que la mayor parte de la superficie del pozo está a la vista como sea posible (por ejemplo, no bloqueado de la vista por las paredes de pozo de la placa). Cuando las moscas alcanzan su KDT caen al fondo del pozo; en este caso, el lado más cercano a la cámara web, y por lo tanto están a la vista, independientemente de lo lejos que esté su pozo del centro de la vista.
    8. Conecte la cámara web a un ordenador.
    9. Con cinta adhesiva, coloque una hoja blanca de papel (8,5 cm x 13 cm; el área exacta de la parte inferior de la placa de 96 pozos) en la parte inferior del estante(Figura 4). Asegúrese de que el papel llene todo el marco cuando se vea a través de la cámara web.
    10. Coloque una fuente de luz en la incubadora. Utilice papel u otros materiales para humedecer la iluminación y minimizar el deslumbramiento.
      NOTA El paso 2.1.10 es específico de cada incubadora porque la iluminación y los reflejos varían entre las incubadoras. El objetivo es tener suficiente iluminación en la incubadora para proporcionar un buen contraste entre las moscas en cada pozo y la hoja blanca de papel detrás de la placa cuando se ve con la cámara web.
  2. Realización de lasay de KD de calor
    1. Ajuste la incubadora a 37,5 oC y espere unos 30 minutos para dar a la incubadora tiempo para alcanzar y mantener la temperatura deseada. La temperatura exacta dependerá del insecto que se evalúe y de cualquier otra consideración de tiempo.
    2. Coloque la placa de 96 pozos invertida en la incubadora, de tal manera que la parte inferior de la placa (lado de malla) esté contra el papel blanco en la parte inferior de la bandeja (Figura 4). Tome nota de la orientación de los pozos (nombres de columna y fila) en la bandeja y en el marco de la cámara web. Cinta de color a lo largo de los lados de la placa de 96 pozos y los bordes de la hoja blanca de papel pueden verificar la orientación (Figura 4).
      NOTA: Asegúrese de que la temperatura de la incubadora sea consistente con la temperatura dentro de la placa de 96 pozos registrando la temperatura dentro de la placa con un termopar durante un ensayo de prueba del ensayo de calor KD. También es prudente comprobar que hay una variación insignificante en la temperatura entre los pozos de la placa de 96 pozos con múltiples termopares antes de realizar el ensayo de KD de calor.
    3. Cierre la puerta de la incubadora.
    4. Haga clic en Grabar en el software de grabación de vídeo.
    5. Después de 2 h, compruebe la grabación para ver que todas las moscas han llegado a su lugar de descanso final y han dejado de moverse. Una vez que todas las moscas han dejado de moverse, haga clic en Detener en el software de grabación de vídeo. Para los genotipos probados aquí, criados a 25 oC, la mayoría de las moscas alcanzan su KDT por 60 min a 37,5 oC (véase también J-rgensen et al.9).
    6. Deshágase de las moscas.
    7. Utilice los scripts de Python personalizados (Archivos de codificación suplementarios 1-3) para aproximar el tiempo en el vídeo cuando las moscas alcanzan su calor KDT.
      NOTA: El paso 2.2.7 es opcional. Para acelerar el análisis de vídeo, se desarrolló un conjunto de scripts de Python personalizados para medir los cambios en la densidad de píxeles a lo largo del tiempo en cada pozo (consulte Archivo de codificación suplementario). Cuando las moscas dejan de moverse, la densidad de píxeles es constante, y se puede utilizar una gráfica de estos datos para localizar el tiempo aproximado en el vídeo cuando las moscas son derribadas. Aunque puede ser posible utilizar este script para automatizar el análisis de datos, las ligeras imperfecciones actuales en el vídeo conducen a discrepancias menores entre los cambios en la densidad de píxeles y el tiempo de KD verdadero.
    8. Haga clic en abrir el archivo de vídeo y grabar el KDT de cada mosca en cada pozo. La medida más consistente de KDT de calor entre los ensayos y los observadores es registrar el tiempo en el que una mosca alcanza su punto de descanso final.
    9. Realice un seguimiento del vídeo en sentido inverso, centrándose en un solo pozo, y observando el momento en el que la mosca se mueve primero de su lugar de descanso final. Repita este proceso para cada pozo.

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Representative Results

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Los límites térmicos (es decir, CTmin y KDT de calor) de las hembras del Panel de Referencia Genética de Drosophila melanogaster (DGRP) se midieron para demostrar los datos de alto rendimiento generados a partir de los dos protocolos descritos. ElCT min fue ensayado usando las líneas de DGRP 714 (n a 37) y 913 (n a 45). El KDT de calor fue ensayado y comparado con las líneas de DGRP 189 (n x 42) y 461 (n x 42), y los archivos de vídeo se analizaron manualmente. El tiempo total de los experimentos, incluyendo la visualización del video, tomó <2 h para cada protocolo.

Las hembras de la línea DGRP 913 tenían temperaturasmedias de CT significativamente más bajas que las hembras de la línea 714 de DGRP (Figura 5A; Prueba de suma de rango de Wilcoxon, W a 1585, P < 0.001). Las dos líneas tenían distribuciones claramente distintas de CTmín.:la línea 913 tenía unmin ct de 5,00 ± 1,35 oC (media ± SD) y la línea 714 tenía unmin CT de 9,60 ± 1,53 oC.

El calor KDT a 37,5 oC difería significativamente entre las hembras de las líneas DGRP 73 y 461 (Figura 5B; Prueba de suma de rango de Wilcoxon, W a 1658.5, P < 0.001). Aunque hubo variación en el KDT de ambas líneas, se detectaron fácilmente diferencias en los KDT de calor entre las líneas. La línea 73 tenía un KDT medio más largo de 14,8 minutos que la línea 461 (línea 73 KDT media, 55,58 ± 6,92 min; Línea 461 significa KDT, 40.78 ± 6.64 min).

Figure 1
Figura 1: Configuración de la columna con chaqueta para el ensayomin de TC. (A) Columna con chaqueta montada. (B) Columna enchalada con tapones superiores e inferiores que sellan la cámara interior. El termopar se enhebra a través de un orificio en el enchufe superior. El DFM se monta en un anillo de réplica debajo de la columna y se mueve hacia un lado. (C) Inicio de un ensayomínimo de TC. El tapón superior fue removido y las moscas se vertieron en la cámara interior a través de un embudo en la abertura superior de la columna. (D) Columna con chaqueta y DFM durante un ensayomin ct. El enchufe inferior se eliminó de la columna y el DFM y el embudo se colocaron debajo de la columna. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Ilustración técnica de la columna revestida. (A) Cada pieza de tubo de acrílico cortada a la longitud: i) dos anillos espaciadores cortados a 3,5 cm de longitud (paso 1.1.2):ii). el tubo de acrílico más ancho cortado a 31,5 cm (paso 1.1.1); y iii el tubo de acrílico más estrecho cortado a 31,5 cm (paso 1.1.1). (B) Dos orificios (en gris) perforados en la pieza más ancha de tubo de acrílico, 3,5 cm de cada extremo y en lados opuestos (i; paso 1.1.2). Montaje de la pieza de tubo de acrílico más estrecha con los dos anillos espaciadores (ii; pasos 1.1.6 y 1.1.7). (C) La columna con chaqueta completada después de los pasos 1.1.8-1.1.12. Los adaptadores de manguera están indicados en gris. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Vista inferior (izquierda) y superior (derecha) de la placa sin fondo 96. La malla tejida de acero se une a la parte inferior de una placa sin fondo de 96 pozos modificada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Configuración de la incubadora para un ensayo de KD térmico. (A) Webcam y etapa configurada a distancia. (B) Webcam y configuración de la etapa en la incubadora antes de que comience una prueba. La cámara web se fija al suelo de la incubadora y la bandeja está a 10 cm por encima de la cámara web. (C) Orientación de la placa de 96 pozos en el escenario blanco por encima de la cámara web durante un ensayo de KD de calor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Límites térmicos inferiores y superiores de líneas seleccionadas del Panel de referencia genética de Drosophila (DGRP). (A) CT valoresmínimos de dos líneas DGRP. (B) Caliente KDT de dos líneas DGRP a 37,5 oC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Salida de actividad de los scripts de análisis de vídeo de un conjunto de datos de prueba. Cada parcela representa los datos de actividad de un pozo de una placa de 96 pozos. Se analizaron un total de 84 muestras que se muestran. Bueno ID está etiquetado a la derecha de cada histograma.  Haga clic aquí para ver esta figura.

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Los dos métodos detallados anteriormente generan datos de alto rendimiento de métricas ecológicamente relevantes para los límites térmicos superior e inferior. Estos protocolos se basan en metodologías previamente establecidas comunes a la investigación sobre los límites térmicos de insectos (resumidas en Sinclair et al.) 6.Ambos protocolos se pueden completar en un corto período de tiempo (2 h cada uno), producir conjuntos de datos con grandes tamaños de muestra, no sacrificar la repetibilidad o precisión, y minimizar el error del experimentador eliminando la grabación y entrada manual de datos (ensayomínimo ct), o creando grabaciones de vídeo de copia de seguridad de cada ensayo (ensayo KD de calor).

Los resultados representativos se generaron comparando los límites térmicos de las hembras adultas de líneas seleccionadas del DGRP24. Ambos ensayos mostraron diferencias significativas en la tolerancia térmica entre líneas. El tamaño del efecto entre líneas en cada uno de estos ensayos fue relativamente grande, lo que a su vez permitió una diferenciación fiable de los grupos con comparaciones visuales y estadísticas. La gran diferencia de KDT entre las dos líneas DGRP resalta una ventaja potencial de un ensayo estático sobre un ensayo de rampa dinámico; ensayos estáticos pueden ser más capaces de detectar diferencias más pequeñas entre grupos que los ensayos dinámicos9. Las dos líneas DGRP sometidas al ensayo de KD de calor diferían en KDT media en 14,8 min. Como referencia, utilizando un protocolo de rampa dinámica, Rolandi yotros 13 mostraron que la diferencia de los valoresmáximos de CT más altos y más bajos de 34 líneas DGRP era de sólo 1,42 oC, o <6 min con una rampa de 0,25 oC/min.

En relación con otros métodos, hay varias ventajas tanto para el ensayomínimo de TC como para el ensayo de KD térmico descrito aquí. El recuento automatizado en el ensayomínimo de TC reduce la cantidad de tiempo que un experimentador pasa en el aparato, aumentando así la cantidad de tiempo que se puede gastar en otras tareas. El costo de construir la columna con camisa de acrílico es de 50 euros, en comparación con los $400 estimados para comprar una columna con camisa de vidrio hecha a medida. Para el ensayo de KD de calor, la grabación de vídeo elimina la necesidad de observaciones directas en tiempo real y ocupa una pequeña cantidad de espacio físico por muestra. Otros protocolos, como los utilizados por el señor y el9,utilizan un gran acuario para ver a individuos sumergidos en viales separados, pero este método requiere investigadores bien entrenados para comprobar rápidamente los viales en busca de movimiento y una gran cantidad de espacio para el aparato. 13 utilizaron sensores infrarrojos para detectar movimiento o falta de movimiento en CTmax en placas de 96 pozos, mientras que este ensayo de KD de calor utiliza una cámara web barata ($70) para detectar movimiento. Esta cámara puede detectar movimientos sutiles que podrían pasar desa conocer un monitor de actividad infrarroja.

Además, se desarrolló un conjunto de scripts personalizables para estimar rápidamente KDT en el ensayo de KD de calor(Archivo de codificación suplementaria 1-3). Estos scripts se pueden utilizar para ahorrar tiempo al obtener una aproximación aproximada de KDT de calor en cada pozo antes de ver el vídeo, y con una mayor calidad de vídeo estos scripts podrían automatizar potencialmente la grabación de datos. Se han proporcionado tres scripts para procesar el vídeo: FirstFrame.py (Archivo de codificación suplementario 1), que define el primer fotograma de imagen del vídeo; WellDefine.py (Archivo de codificación suplementaria 2), que define cada pozo individual de la placa de 96 pozos en el primer marco de imagen; y MotionDetect.py (Archivo de codificación suplementaria 3), que transforma el archivo de vídeo en una señal de actividad calculando el cambio en la densidad de píxeles entre fotogramas secuenciales. La única entrada al programa es el archivo de vídeo, y la salida incluye estadísticas de resumen y un conjunto de datos de series temporales de actividad por pozo (Figura 6). Las diferencias en la densidad de píxeles entre fotogramas de vídeo se transforman mediante un filtro de escala de grises para reducir las dimensiones de la imagen, un filtro de paso bajo gaussiano para reducir el ruido de la imagen y una operación morfológica de dilatación para aumentar los bordes de los objetos en movimiento. En este caso, la actividad se define como la diferencia absoluta de valores de píxel entre fotogramas secuenciales. A continuación, el KDT de calor se puede estimar como el índice del último fotograma que contiene un valor de actividad mayor que cero. Por ejemplo, el fotograma en el que la actividad se registró por última vez en el bien g12 de un conjunto de datos de muestra (Figura 6) fue justo después de 2.000 s (33,33 min), como se indica en una línea plana. Un observador puede entonces reproducir el video digital y encontrar rápidamente el Heat KDT del pozo g12 con esta marca de tiempo.

Con modificaciones menores y solución de problemas hay aplicaciones adicionales para ambos ensayos, sobre todo con el ensayo de KD de calor. La configuración de grabación de vídeo se podría modificar para grabar tiempos estáticos de derribo en frío, tiempo de recuperación de coma frío o valoresmínimos de CT y CT potencialmentedinámicos. Tiempo de recuperación de coma frío es la cantidad de tiempo que tarda un individuo en reanudar el movimiento después de la tensión fría29. Por lo tanto, el tiempo de recuperación del coma frío podría medirse con esta configuración induciendo el coma frío en la placa de 96 pozos, luego usando la configuración de video para grabar el tiempo de recuperación en la incubadora. Por último, con un ajuste cuidadoso, se podría registrar CTmax dinámico o CTmin en una incubadora de rampa programable. La atención cuidadosa a la temperatura dentro de cada uno de los 96 pozos sería una preocupación, porque ligeras variaciones de temperatura en la incubadora podrían magnificarse entre los pozos como los cambios de temperatura.

Se deben tener en cuenta varias consideraciones al realizar el ensayo ctmin o heat KD. En primer lugar, la calidad, edad, sexo, etapa de vida, antecedentes genéticos, y la experiencia previa de un insecto pueden influir en los límites térmicos6,,13,,30,,31. Para ambos ensayos, los sujetos de prueba deben ser móviles. En segundo lugar, solo se puede ensayarse un grupo a la vez para cada aparatomin de TC. Por lo tanto, variables como la variación diurna en la tolerancia térmica32,33 deben ser consideradas al comparar tratamientos. Una solución a este problema es llevar a cabo ensayosmin por TC de múltiples condiciones de tratamiento con múltiples aparatos al mismo tiempo. En tercer lugar, algunas especies pueden no ser adecuadas para uno o ambos ensayos. Por ejemplo, algunas especies pueden no subir o volar fácilmente a las perchas en el ensayomínimo de TC o pueden cesar la actividad a altas temperaturas antes de que se alcance su KDT de calor, lo que dificultaría discernir un tiempo de derribo. Por último, para garantizar comparaciones precisas en el ensayo de KD térmico, es fundamental que los criterios para KDT (paso 2.2.8) sean coherentes entre réplicas, observadores, ensayos, etc. Para dar cabida a diferentes especies de insectos, pueden ser necesarias modificaciones en cualquiera de los aparatos de ensayo. Las posibles modificaciones incluyen el uso de diferentes tipos de perchas para el ensayomin CT, el uso de placas de cultivo celular con menos pozos y más espacio (48, 24, 12, o 6 pozos) en lugar de la placa de 96 pozos para acomodar insectos más grandes, o ajustar la temperatura utilizada para el ensayo KD de calor para asegurar un tiempo de derribo que no es demasiado rápido o demasiado lento.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Ellie McCabe por la ayuda con la cría de moscas. Este trabajo es apoyado por la subvención 1010996 del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos del Proyecto Hatch del Departamento de Agricultura y la Subvención OIA-1826689 a N.M.T.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) Thermo Scientific; Waltham, MA 153-5401
C922 Pro Stream Webcam Logitech; Newark, CA 960-001087
Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm Any Any
Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 44036
Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 440515
Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 44041
Clear silicone sealant Any Any
Collection tube (15 ml) Any Any
Cordless Drill Any Any
Drosophila Funnel Monitor (DFM) TriKinetics; Waltham, MA DFM Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point
DAM data collection software TriKinetics; Waltham, MA Records data input from the DFM
Fly Storage Lid FlySorter; Seatle, WA FS-96LID-5PK Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay
Fly Storage Plate FlySorter; Seatle, WA FS-96PLATE-5PK Used to hold flies during in the sCTmax assay
Fly Food Tray FlySorter; Seatle, WA FS-TRAY-5PK Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay
Glass funnel Kimax 28950-75 75mm
Gutter guard Any Any ~0.5 cm diameter openings
Hacksaw Any Any
Heratherm Thermo Scientific incubator Thermo Scientific; Waltham, MA OMS100
Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 United States Plastic Corp., OH 61135
Hot glue gun and glue Any Any
Light Source Any Any
Magnets Any Any
OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software OMEGA; Norwalk, CT
OMEGA thermocouple (Type T) OMEGA; Norwalk, CT 5LRTC-TT-K-20-36
Plastic funnel Any Any 2" diameter
Plastic tubing - 0.6 cm diameter United States Plastic Corp., OH 62852
Retort ring Any Any 2" diameter
Retort stand Any Any
Retort three-prong clamp Any Any
Rstudio
Serial port connector (PSIU9) TriKinetics; Waltham, MA PSIU9 Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections
Styrofoam (2" thick) Any Any
Tape Any Any
Uninterrupted Power Supply (PS9-1) TriKinetics; Waltham, MA PS9-1 Power supply for the DFM and PSIU9
Weld-on #4 Acrylic Cement United States Plastic Corp., OH 45737

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References

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Ensayos de alto rendimiento de límites térmicos críticos en insectos
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Awde, D. N., Fowler, T. E., Pérez-Gálvez, F., Garcia, M. J., Teets, N. M. High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects. J. Vis. Exp. (160), e61186, doi:10.3791/61186 (2020).More

Awde, D. N., Fowler, T. E., Pérez-Gálvez, F., Garcia, M. J., Teets, N. M. High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects. J. Vis. Exp. (160), e61186, doi:10.3791/61186 (2020).

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