التمايز العصبي من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في المختبر

Summary

هنا، أنشأنا طريقة منخفضة التكلفة وسهلة التشغيل التي توجه التمايز السريع والفعال من الخلايا الجذعية الجنينية إلى الخلايا العصبية. هذه الطريقة مناسبة لتعميم بين المختبرات ويمكن أن تكون أداة مفيدة للبحوث العصبية.

Abstract

التمايز العصبي للخلايا الجذعية الجنينية الماوس (mESCs) هو أداة محتملة لتوضيح الآليات الرئيسية المشاركة في تكوين الخلايا العصبية ويحتمل أن تساعد في الطب التجديدي. هنا، أنشأنا طريقة فعالة ومنخفضة التكلفة للتمايز العصبي من mESCs في المختبر، باستخدام استراتيجية الفرز الجمعي. في ظل الظروف المحددة هنا، فإن تكوين الجسم الجنيني لمدة يومين + بروتوكول تحريض حمض الريتينويك لمدة 6 أيام يسمح بالتمايز السريع والفعال من الـ mESCs إلى خلايا السلائف العصبية (NPCs)، كما يتضح من تشكيل A2lox و129 مشتقة من النستين المرصوفة بشكل جيد والنوريت الشبيهة بالنيوتريت و129 مشتقًا إيجابيًا. الحالة الصحية للأجسام الجنينية ونقطة الوقت التي يتم فيها تطبيق حمض الريتينويك (RA) ، وكذلك تركيزات RA ، أمر حاسم في هذه العملية. في التمايز اللاحق من NPCs إلى الخلايا العصبية، N2B27 المتوسطة II (تكملها متوسطة العصبية) يمكن أن تدعم بشكل أفضل الصيانة على المدى الطويل ونضوج الخلايا العصبية. الطريقة المعروضة هي الكفاءة العالية ، وانخفاض التكلفة وسهلة التشغيل ، ويمكن أن تكون أداة قوية لبحوث البيولوجيا العصبية والتنمية البيولوجية.

Introduction

الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) هي متعددة القدرات ويمكن أن تفرق إلى الخلايا السليفة العصبية (NPCs) وبعد ذلك إلى الخلايا العصبية في ظل ظروف معينة¹. يوفر تكوين الخلايا العصبية القائم على ESC أفضل منصة لمحاكاة النشوء العصبي ، وبالتالي بمثابة أداة مفيدة لدراسات البيولوجيا التنموية ويحتمل أن تساعد في الطب التجديدي^2،3. في العقود الماضية، وقد تم الإبلاغ عن العديد من الاستراتيجيات لتحفيز تكوين جيني الجنين، مثل طريقة المعدلة وراثيا⁴، باستخدام جزيئات صغيرة⁵، وذلك باستخدام مصفوفة 3D microenvironment⁶، و شارك في ثقافة تقنية⁷. ومع ذلك، فإن معظم هذه البروتوكولات إما محدودة أو صعبة التشغيل، وبالتالي فهي غير مناسبة للاستخدام في معظم المختبرات.

للعثور على طريقة سهلة التشغيل ومنخفضة التكلفة لتحقيق تمايز عصبي فعال من mESCs ، تم استخدام استراتيجية فحص الجمع بين الدمج هنا. كما هو موضح في الشكل 1، تم تقسيم العملية الكاملة من النشوء العصبي الجنيني إلى مرحلتين. وتشير المرحلة الأولى إلى عملية التمايز بين الـ mESCs إلى NPCs، وتتعلق المرحلة الثانية بالتمايز اللاحق من NPCs إلى الخلايا العصبية. استنادا إلى مبادئ عملية سهلة، وانخفاض تكلفة، والمواد المتاحة بسهولة وكفاءة عالية التمايز، تم اختيار سبعة بروتوكولات في المرحلة الأولى وثلاثة بروتوكولات في المرحلة الثانية على أساس نظام ثقافة أحادية الطبقات التقليدية أو نظام تكوين الجسم الجنينية^8،9. وتم تقييم كفاءة التمايز في البروتوكولات في كلتا المرحلتين باستخدام الملاحظة مورفولوجيا الخلية و قياس المناعة. من خلال الجمع بين البروتوكول الأكثر كفاءة في كل مرحلة ، أنشأنا الطريقة المثلى للتمايز العصبي من mESCs.

Protocol

1. ماوس الجنينية خلية جذعية ثقافة إعداد 0.1٪ الأطباق الجيلاتين ثقافة الخلية المغلفة أو لوحات. إضافة 2 مل من معقمة 0.1٪ الجيلاتين (0.1٪ ث / الخامس في الماء) إلى 60 ملم أطباق ثقافة الخلية. صخرة بلطف لضمان حتى طلاء أطباق ثقافة الخلية. وضع الأطباق في 5٪ CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية والسم…

Representative Results

2-يوم تكوين الجسم الجنينية + 6 أيام RA التعريفي يعمل بشكل أفضل على توجيه التمايز من mESCs إلى NPCs (المرحلة الأولى). ولتحديد البروتوكول الأمثل الذي يعزز على أفضل أحسن ال أحسن الهون بين الـ mESCs إلى NPCs (المرحلة الأولى)، تم اختبار 7 بروتوكولات على كل من A2lox و129 mESCs(الجدول 1)وتم رصد حالة التمايز لك…

Discussion

في هذه الدراسة، أنشأنا طريقة بسيطة وفعالة للتمايز العصبي من mESCs، مع انخفاض تكلفة والمواد التي تم الحصول عليها بسهولة. في هذه الطريقة، 2 أيام من تكوين الجسم الجنينية تليها 6 أيام من تحريض RA يمكن أن تعزز بشكل فعال التفريق بين mESCs إلى NPCs (المرحلة الأولى البروتوكول 3). بالنسبة للمرحلة الثانية من ا…

Materials

Anti-Nestin antibody [Rat-401]	Abcam	Ab11306	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit	Sigma Aldrich	T2200	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG	Beyotime	A0428	stored at -20 °C and protect from light
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044	stored at -20 °C, and protect from light
CHIR-99021 (CT99021)	Selleck	S1263	stored at -20 °C
Coverslips	NEST	801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	stored at -20 °C and protect from light
DME/F-12 1:1 (1x)	HyClone	SH30023.01B	stored at 4 °C
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Fluorescence microscopy	Olympus	CKX53
Gelatin	Gibco	CM0635B	stored at room temperature
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	stored at 4 °C
Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer	Beyotime	P0103	stored at 4 °C
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	stored at 4 °C
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Leukemia Inhibitory Factor human	Sigma	L5283	stored at -20 °C
Mounting Medium With DAPI – Aqueous, Fluoroshield	Abcam	ab104139	stored at 4 °C and protect from light
MEM Non-essential amino acids solution	Gibco	11140076	stored at 4 °C
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048	stored at -20 °C and protect from light
Normal goat serum	Jackson	005-000-121	stored at -20 °C
Neurobasal Medium	Gibco	21103049	stored at 4 °C
Nonadhesive bacterial dish	Corning	3262
Phosphate Buffered Saline (1X)	HyClone	SH30256.01B	stored at 4 °C
Penicillin/ Streptomycin Solution	HyClone	SV30010	stored at 4 °C
PD0325901(Mirdametinib)	Selleck	S1036	stored at -20 °C
Retinoic acid	Sigma	R2625	stored at -80 °C and protect from light
Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells	Cyagen	MUAES-01001	Maintained in feeder-free culture system
Stem-Cellbanker (DMSO free)	ZENOAQ	stem cellbanker DMSO free	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Trypsin 0.25% (1X) Solution	HyClone	SH30042.01	stored at 4 °C
Triton X-100	Sigma	T8787
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	stored at 4 °C and protect from light
4% paraformaldehyde	Beyotime	P0098	stored at -20 °C
6 – well plate	Corning	3516
60 mm cell culture dish	Corning	430166
15 ml centrifuge tube	NUNC	339650