Summary

Différenciation neuronale des cellules souches embryonnaires de souris in vitro

Published: June 02, 2020
doi:

Summary

Ici, nous avons établi une méthode peu coûteux et facile à utiliser qui dirige la différenciation rapide et efficace des cellules souches embryonnaires en neurones. Cette méthode convient à la vulgarisation entre les laboratoires et peut être un outil utile pour la recherche neurologique.

Abstract

La différenciation neuronale des cellules souches embryonnaires de souris (MESCs) est un outil potentiel pour élucider les mécanismes clés impliqués dans la neurogenèse et potentiellement aider à la médecine régénérative. Ici, nous avons mis en place une méthode efficace et peu coûteux pour la différenciation neuronale des MESCs in vitro, en utilisant la stratégie de dépistage combinatoire. Dans les conditions définies ici, la formation du corps embryoïde de 2 jours + protocole d’induction de l’acide rétinoïque de 6 jours permet une différenciation rapide et efficace des MESC en cellules précurseurs neuronales (PNJ), comme en est la formation d’A2lox bien empilés et neurites et de 129 dérivés positifs à Nestin. L’état sain des corps embryoïdes et le moment où l’acide rétinoïque (PR) est appliqué, ainsi que les concentrations de PR, sont essentiels dans le processus. Dans la différenciation subséquente des PNJ en neurones, N2B27 medium II (complété par le milieu neurobasal) pourrait mieux soutenir le maintien et la maturation à long terme des cellules neuronales. La méthode présentée est très efficace, peu coûteux et facile à utiliser, et peut être un outil puissant pour la neurobiologie et la recherche en biologie du développement.

Introduction

Les cellules souches embryonnaires (ESC) sont pluripotentes et peuvent se différencier en cellules précurseurs neuronales (PNJ) puis en neurones dans certaines conditions1. La neurogenèse basée sur l’ESC fournit la meilleure plate-forme pour imiter la neurogenèse, servant ainsi d’outil utile pour des études de biologie développementale et potentiellement aider à la médecinerégénérative 2,3. Au cours des dernières décennies, de nombreuses stratégies ont été rapportées pour induire la neurogenèse embryonnaire, comme la méthode transgénique4, en utilisant de petites molécules5, en utilisant un microenvironnement matricielle 3D6, et la technique de co-culture7. Cependant, la plupart de ces protocoles sont soit condition limitée ou difficile à utiliser, de sorte qu’ils ne sont pas adaptés à une utilisation dans la plupart des laboratoires.

Pour trouver une méthode facile à utiliser et peu coûteux pour parvenir à une différenciation neuronale efficace des MESC, une stratégie de dépistage combinatoire a été utilisée ici. Tel que décrit dans la figure 1, tout le processus de neurogenèse embryonnaire a été divisé en 2 phases. La phase I se réfère au processus de différenciation des MESC en PNJ, et la phase II se rapporte à la différenciation subséquente des PNJ en neurones. Sur la base des principes du fonctionnement facile, du faible coût, des matériaux facilement disponibles et de l’efficacité de différenciation élevée, sept protocoles de phase I et trois protocoles de phase II ont été choisis en fonction du système traditionnel de culture monocouche adhérente ou du système de formation du corpsembryoïde 8,9. L’efficacité de différenciation des protocoles dans les deux phases a été évaluée utilisant l’observation de morphologie cellulaire et l’essai d’immunofluorescence. En combinant le protocole le plus efficace de chaque phase, nous avons établi la méthode optimisée pour la différenciation neuronale des MESCs.

Protocol

1. Culture embryonnaire de cellules souches de souris Préparer 0,1 % de plats ou d’assiettes de culture cellulaire enduits de gélatine. Ajouter 2 mL de gélatine stérilisée à 0,1 % (0,1 % w/v dans l’eau) aux plats de culture cellulaire de 60 mm. Rock doucement pour assurer un enduit même des plats de culture cellulaire. Mettre les plats dans un incubateur de CO2 à 5% à 37 °C et laisser le revêtement pendant 1 h. Retirer la solution gélatineuse de 0,1 % ava…

Representative Results

La formation de corps embryoïde de 2 jours + l’induction de RA de 6 jours fonctionne mieux sur la direction de la différenciation des MESCs dans les PNJ (phase I). Afin de déterminer le protocole optimal qui favorise le mieux la différenciation des MESC en PNJ (phase I), 7 protocoles ont été testés sur a2lox et 129 mESC(tableau 1)et l’état de différenciation de chaque groupe a été surveillé au microscope léger. Comme le montre la figure 3A, la plupart des d?…

Discussion

Dans la présente étude, nous avons établi une méthode simple et efficace pour la différenciation neuronale des MESCs, avec des matériaux peu coûteux et facilement obtenus. Dans cette méthode, 2 jours de formation du corps embryoïde suivis de 6 jours d’induction de la PR peuvent effectivement favoriser la différenciation des MESC en PNJ (phase I-protocole 3). Pour la différenciation de phase II, N2B27 medium II (Phase II-protocol 3) induit le plus efficacement la différenciation des PNJ en neurones. Pour ass…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux ont été soutenus par la National Natural Science Foundation of China (n° 31501099) et les personnes d’âge moyen et les jeunes du département de l’éducation de la province du Hubei, en Chine (no. Q20191104). Et, nous remercions le professeur Wensheng Deng de l’Université des sciences et de la technologie de Wuhan pour avoir fourni les lignées de cellules souches embryonnaires de souris A2lox.

Materials

Anti-Nestin antibody [Rat-401] Abcam Ab11306 stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit Sigma Aldrich T2200 stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG Beyotime A0428 stored at -20 °C and protect from light
B-27 Supplement (50X), serum free Gibco 17504044 stored at -20 °C, and protect from light
CHIR-99021 (CT99021) Selleck S1263 stored at -20 °C
Coverslips NEST 801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG Beyotime A0516 stored at -20 °C and protect from light
DME/F-12 1:1 (1x) HyClone SH30023.01B stored at 4 °C
Fetal bovine serum HyClone SH30084.03 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Fluorescence microscopy Olympus CKX53
Gelatin Gibco CM0635B stored at room temperature
GlutaMAX Supplement Gibco 35050061 stored at 4 °C
Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer Beyotime P0103 stored at 4 °C
KnockOut DMEM/F-12 Gibco 12660012 stored at 4 °C
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828028 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Leukemia Inhibitory Factor human Sigma L5283 stored at -20 °C
Mounting Medium With DAPI – Aqueous, Fluoroshield Abcam ab104139 stored at 4 °C and protect from light
MEM Non-essential amino acids solution Gibco 11140076 stored at 4 °C
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502048 stored at -20 °C and protect from light
Normal goat serum Jackson 005-000-121 stored at -20 °C
Neurobasal Medium Gibco 21103049 stored at 4 °C
Nonadhesive bacterial dish Corning 3262
Phosphate Buffered Saline (1X) HyClone SH30256.01B stored at 4 °C
Penicillin/ Streptomycin Solution HyClone SV30010 stored at 4 °C
PD0325901(Mirdametinib) Selleck S1036 stored at -20 °C
Retinoic acid Sigma R2625 stored at -80 °C and protect from light
Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells Cyagen MUAES-01001 Maintained in feeder-free culture system
Stem-Cellbanker (DMSO free) ZENOAQ stem cellbanker DMSO free stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Trypsin 0.25% (1X) Solution HyClone SH30042.01 stored at 4 °C
Triton X-100 Sigma T8787
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023 stored at 4 °C and protect from light
4% paraformaldehyde Beyotime P0098 stored at -20 °C
6 – well plate Corning 3516
60 mm cell culture dish Corning 430166
15 ml centrifuge tube NUNC 339650

References

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Cite This Article
Mao, X., Zhao, S. Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro. J. Vis. Exp. (160), e61190, doi:10.3791/61190 (2020).

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