Her etablerede vi en billig og nem at betjene metode, der dirigerer hurtig og effektiv differentiering fra embryonale stamceller til neuroner. Denne metode er velegnet til popularisering blandt laboratorier og kan være et nyttigt værktøj til neurologisk forskning.
Den neurale differentiering af mus embryonale stamceller (MESCs) er et potentielt redskab til at belyse de vigtigste mekanismer, der er involveret i neurogenese og potentielt støtte i regenerativ medicin. Her etablerede vi en effektiv og billig metode til neuronal differentiering fra mESC’er in vitro, ved hjælp af strategien for kombinatorisk screening. Under de betingelser, der er defineret her, tillader den 2-dages embryoide kropsdannelse + 6-dages retinosyreinduktionsprotokol hurtig og effektiv differentiering fra mESC’er til neurale prækursorceller (NPC’er), som det ses ved dannelsen af godt stablet og neuritlignende A2lox og 129 derivater, der er Nestin-positive. Den sunde tilstand af embryoiøse kroppe og det tidspunkt, hvor retinosyre (RA) påføres, samt RA-koncentrationerne er kritiske i processen. I den efterfølgende differentiering fra NPC’ere til neuroner kunne N2B27 medium II (suppleret med Neurobasal medium) bedre understøtte langsigtet vedligeholdelse og modning af neuronale celler. Den præsenterede metode er meget effektiv, billig og nem at betjene, og kan være et kraftfuldt værktøj til neurobiologi og udviklingsbiologisk forskning.
Embryonale stamceller (ESC’er) er pluripotente og kan differentiere sig til neurale prækursorceller (NPC’ere) og derefter til neuroner under visse betingelser1. ESC-baseret neurogenese giver den bedste platform til at efterligne neurogenese og tjener dermed som et nyttigt værktøj til udviklingsbiologiske undersøgelser og potentielt støtte i regenerativ medicin2,3. I de seneste årtier er mange strategier blevet rapporteret for at fremkalde embryonal neurogenese, såsom den transgene metode4, ved hjælp af små molekyler5, ved hjælp af en 3D-matrix mikromiljø6, og co-kultur teknikken7. De fleste af disse protokoller er dog enten begrænset eller svære at betjene, og de er derfor ikke egnede til brug i de fleste laboratorier.
For at finde en nem at betjene og billig metode til at opnå effektiv neural differentiering fra mESC’er blev der brugt en kombinatorisk screeningsstrategi her. Som beskrevet i figur 1blev hele processen med embryonal neurogenese opdelt i 2 faser. Fase I henviser til differentieringsprocessen fra MESC’er til NPC’ere, og fase II vedrører den efterfølgende differentiering fra NPC’er til neuroner. Baseret på principperne om nem betjening, lave omkostninger, let tilgængelige materialer og høj differentieringseffektivitet blev syv protokoller i fase I og tre protokoller i fase II valgt baseret på det traditionelle klæbende monolayerkultursystem eller embryoid kropsdannelsessystem8,9. Differentieringseffektiviteten af protokoller i begge faser blev evalueret ved hjælp af cellemorfologiobservation og immunfluorescensanalyse. Ved at kombinere den mest effektive protokol i hver fase etablerede vi den optimerede metode til neural differentiering fra MESC’er.
I denne undersøgelse etablerede vi en enkel og effektiv metode til neuronal differentiering fra mESC’er med lave omkostninger og let opnåede materialer. I denne metode kan 2 dages embryoid kropsdannelse efterfulgt af 6 dages RA induktion effektivt fremme differentieringen af mESC’er i NPC’ere (fase I-protokol 3). For fase II differentiering, N2B27 medium II (fase II-protokol 3) mest effektivt fremkalde differentiering fra NPC’ere i neuroner. For at sikre succes bør der lægges større vægt på flere kritiske trin.</p…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr. 31501099) og midaldrende og unge i Uddannelsesafdelingen i Hubei-provinsen, Kina (nr. Q20191104). Og vi takker professor Wensheng Deng ved Wuhan University of Science and Technology for at levere musens embryonale stamcellelinjer A2lox.
Anti-Nestin antibody [Rat-401] | Abcam | Ab11306 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C, and protect from light |
CHIR-99021 (CT99021) | Selleck | S1263 | stored at -20 °C |
Coverslips | NEST | 801007 | |
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
DME/F-12 1:1 (1x) | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
Fluorescence microscopy | Olympus | CKX53 | |
Gelatin | Gibco | CM0635B | stored at room temperature |
GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | stored at 4 °C |
Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | stored at 4 °C |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
Leukemia Inhibitory Factor human | Sigma | L5283 | stored at -20 °C |
Mounting Medium With DAPI – Aqueous, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | stored at 4 °C and protect from light |
MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140076 | stored at 4 °C |
N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
Normal goat serum | Jackson | 005-000-121 | stored at -20 °C |
Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | stored at 4 °C |
Nonadhesive bacterial dish | Corning | 3262 | |
Phosphate Buffered Saline (1X) | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
Penicillin/ Streptomycin Solution | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
PD0325901(Mirdametinib) | Selleck | S1036 | stored at -20 °C |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | stored at -80 °C and protect from light |
Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells | Cyagen | MUAES-01001 | Maintained in feeder-free culture system |
Stem-Cellbanker (DMSO free) | ZENOAQ | stem cellbanker DMSO free | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
Trypsin 0.25% (1X) Solution | HyClone | SH30042.01 | stored at 4 °C |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | stored at 4 °C and protect from light |
4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
6 – well plate | Corning | 3516 | |
60 mm cell culture dish | Corning | 430166 | |
15 ml centrifuge tube | NUNC | 339650 |