Her etablerte vi en lav pris og enkel å betjene metode som leder rask og effektiv differensiering fra embryonale stamceller til nevroner. Denne metoden er egnet for popularisering blant laboratorier og kan være et nyttig verktøy for nevrologisk forskning.
Den nevrale differensieringen av mus embryonale stamceller (mESCs) er et potensielt verktøy for å belyse de viktigste mekanismene som er involvert i nevrogenese og potensielt hjelpe til med regenererende medisin. Her etablerte vi en effektiv og rimelig metode for nevronal differensiering fra mESCs in vitro, ved hjelp av strategien for kombinatorisk screening. Under betingelsene som er definert her, tillater den 2-dagers embryoide kroppsdannelsen + 6-dagers retinosyreinduksjonsprotokoll rask og effektiv differensiering fra mESCer til nevrale forløperceller (NPCer), sett ved dannelsen av godt stablet og neurittlignende A2lox og 129 derivater som er Nestin-positive. Den sunne tilstanden til embryolegemer og tidspunktet da retinsyre (RA) påføres, samt RA-konsentrasjonene, er kritiske i prosessen. I den påfølgende differensieringen fra NpCer til nevroner, kunne N2B27 medium II (supplert med Neurobasal medium) bedre støtte det langsiktige vedlikeholdet og modningen av nevronale celler. Den presenterte metoden er svært effektivitet, lave kostnader og enkel å betjene, og kan være et kraftig verktøy for nevrobiologi og utviklingsbiologi forskning.
Embryonale stamceller (ESCer) er pluripotente og kan differensiere til nevrale forløperceller (NpCer) og deretter inn i nevroner under visse forhold1. ESC-basert nevrogenese gir den beste plattformen for å etterligne nevrogenese, og fungerer dermed som et nyttig verktøy for utviklingsbiologistudier og potensielt hjelp til regenerativ medisin2,3. I de siste tiårene har mange strategier blitt rapportert for å indusere embryonal nevrogenese, for eksempel den transgenemetoden 4, ved hjelp av småmolekyler 5, ved hjelp av et 3D-matrisemikromiljø6, og co-kulturteknikken7. Imidlertid er de fleste av disse protokollene enten tilstandsbegrenset eller vanskelig å betjene, og dermed er de ikke egnet for bruk i de fleste laboratorier.
For å finne en enkel å betjene og lav pris metode for å oppnå effektiv neural differensiering fra mESCer, ble en kombinatorisk screeningstrategi brukt her. Som beskrevet i figur 1ble hele prosessen med embryonisk nevrogenese delt inn i 2 faser. Fase I refererer til differensieringsprosessen fra mESCer til NPCer, og fase II er relatert til den påfølgende differensieringen fra NpCer til nevroner. Basert på prinsippene for enkel drift, lave kostnader, lett tilgjengelige materialer og høy differensieringseffektivitet, ble syv protokoller i fase I og tre protokoller i fase II valgt basert på det tradisjonelle tilhengerkultursystemet eller embryoidkroppsdannelsessystem 8,9. Differensieringseffektiviteten til protokoller i begge faser ble evaluert ved hjelp av cellemorfologiobservasjon og immunofluorescence analyse. Gjennom å kombinere den mest effektive protokollen i hver fase, etablerte vi den optimaliserte metoden for neural differensiering fra mESCer.
I den nåværende studien etablerte vi en enkel og effektiv metode for nevronal differensiering fra mESCer, med lave kostnader og lett oppnådde materialer. I denne metoden kan 2 dager med embryoid kroppsdannelse etterfulgt av 6 dager med RA-induksjon effektivt fremme differensiering av mESCer i NPCer (fase I-protokoll 3). For fase II differensiering induserer N2B27 medium II (Fase II-protokoll 3) mest effektivt differensieringen fra NPCer til nevroner. For å sikre suksess, bør mer oppmerksomhet rettes mot flere kritis…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (nr. 31501099) og middelaldrende og unge i utdanningsavdelingen i Hubei-provinsen, Kina (nr. kvartal 20191104). Og vi takker professor Wensheng Deng ved Wuhan University of Science and Technology for å ha gitt musen embryonale stamcellelinjer A2lox.
Anti-Nestin antibody [Rat-401] | Abcam | Ab11306 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C, and protect from light |
CHIR-99021 (CT99021) | Selleck | S1263 | stored at -20 °C |
Coverslips | NEST | 801007 | |
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
DME/F-12 1:1 (1x) | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
Fluorescence microscopy | Olympus | CKX53 | |
Gelatin | Gibco | CM0635B | stored at room temperature |
GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | stored at 4 °C |
Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | stored at 4 °C |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
Leukemia Inhibitory Factor human | Sigma | L5283 | stored at -20 °C |
Mounting Medium With DAPI – Aqueous, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | stored at 4 °C and protect from light |
MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140076 | stored at 4 °C |
N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
Normal goat serum | Jackson | 005-000-121 | stored at -20 °C |
Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | stored at 4 °C |
Nonadhesive bacterial dish | Corning | 3262 | |
Phosphate Buffered Saline (1X) | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
Penicillin/ Streptomycin Solution | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
PD0325901(Mirdametinib) | Selleck | S1036 | stored at -20 °C |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | stored at -80 °C and protect from light |
Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells | Cyagen | MUAES-01001 | Maintained in feeder-free culture system |
Stem-Cellbanker (DMSO free) | ZENOAQ | stem cellbanker DMSO free | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
Trypsin 0.25% (1X) Solution | HyClone | SH30042.01 | stored at 4 °C |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | stored at 4 °C and protect from light |
4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
6 – well plate | Corning | 3516 | |
60 mm cell culture dish | Corning | 430166 | |
15 ml centrifuge tube | NUNC | 339650 |