Summary

Diferenciación neuronal de las células madre embrionarias del ratón in vitro

Published: June 02, 2020
doi:

Summary

Aquí, establecimos un método de bajo costo y fácil de operar que dirige la diferenciación rápida y eficiente de las células madre embrionarias a las neuronas. Este método es adecuado para la popularización entre laboratorios y puede ser una herramienta útil para la investigación neurológica.

Abstract

La diferenciación neuronal de las células madre embrionarias del ratón (MESC) es una herramienta potencial para dilucidar los mecanismos clave implicados en la neurogénesis y potencialmente ayudar en la medicina regenerativa. Aquí, establecimos un método eficiente y de bajo costo para la diferenciación neuronal de los MESC invitro, utilizando la estrategia de cribado combinatorio. En las condiciones definidas aquí, la formación de cuerpos embrionados de 2 días + protocolo de inducción de ácido retinoico de 6 días permite una diferenciación rápida y eficiente de los mESC en células precursoras neuronales (NPC), como lo ve la formación de A2lox bien apilado y similar a un neurite y 129 derivados que son nestin positivos. El estado saludable de los cuerpos embrionarios y el punto de tiempo en el que se aplica el ácido retinoico (AR), así como las concentraciones de AR, son críticos en el proceso. En la diferenciación posterior de los PNJ en las neuronas, N2B27 medio II (complementado por medio neurobasal) podría apoyar mejor el mantenimiento a largo plazo y la maduración de las células neuronales. El método presentado es altamente eficiente, de bajo costo y fácil de operar, y puede ser una poderosa herramienta para la neurobiología y la investigación en biología del desarrollo.

Introduction

Las células madre embrionarias (ESC) son pluripotentes y pueden diferenciarse en células precursoras neuronales (NPC) y posteriormente en neuronas bajo ciertas condiciones1. La neurogénesis basada en ESC proporciona la mejor plataforma para imitar la neurogénesis, sirviendo así como una herramienta útil para estudios de biología del desarrollo y potencialmente ayuda en medicina regenerativa2,3. En las últimas décadas, muchas estrategias se han divulgado para inducir neurogénesis embrionaria, como el método transgénico4,utilizando moléculas pequeñas5,utilizando una matriz 3D microambiente6,y la técnica de co-cultivo7. Sin embargo, la mayoría de estos protocolos son condicionantes o difíciles de operar, por lo que no son adecuados para su uso en la mayoría de los laboratorios.

Para encontrar un método fácil de operar y de bajo costo para lograr una diferenciación neuronal eficiente de los mESC, aquí se utilizó una estrategia de cribado combinatoria. Como se describe en la Figura 1,todo el proceso de neurogénesis embrionaria se dividió en 2 fases. La Fase I se refiere al proceso de diferenciación de los MESC a los PNJ, y la fase II se relaciona con la diferenciación posterior de los PNJ en las neuronas. Sobre la base de los principios de fácil operación, bajo costo, materiales fácilmente disponibles y alta eficiencia de diferenciación, se eligieron siete protocolos en la Fase I y tres protocolos en la Fase II basados en el sistema tradicional de cultivo monocapa adherente o sistema de formación de cuerpos embrionados8,9. La eficiencia de diferenciación de los protocolos en ambas fases se evaluó utilizando la observación de morfología celular y el ensayo de inmunofluorescencia. Mediante la combinación del protocolo más eficiente de cada fase, establecimos el método optimizado para la diferenciación neuronal de los mESC.

Protocol

1. Cultivo de células madre embrionarias del ratón Prepare platos o platos de cultivo celular recubiertos de gelatina al 0,1%. Añadir 2 ml de gelatina esterilizada del 0,1% (0,1% w/v en agua) a platos de cultivo celular de 60 mm. Rockear suavemente para asegurar incluso el recubrimiento de los platos de cultivo celular. Coloque los platos en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C y deje el recubrimiento durante 1 h. Retire la solución de gelatina del 0,1% antes de semb…

Representative Results

La formación de cuerpos embrionados de 2 días + la inducción por AR de 6 días funciona mejor en la dirección de la diferenciación de los MESC en PNJ (Fase I). Para determinar el protocolo óptimo que mejor promueve la diferenciación de los MESC en PNJ (Fase I), se probaron 7 protocolos tanto en A2lox como en 129 mESCs(Cuadro 1)y se monitorizó el estado de diferenciación de cada grupo utilizando microscopio ligero. Como se muestra en la Figura 3A, la mayoría de los …

Discussion

En el presente estudio, establecimos un método simple y eficaz para la diferenciación neuronal de los mESC, con materiales de bajo costo y fácil obtención. En este método, 2 días de formación de cuerpos embrionados seguidos de 6 días de inducción por AR pueden promover eficazmente la diferenciación de los MESC en LOSP (Fase I-protocolo 3). Para la diferenciación de fase II, N2B27 medio II (Fase II-protocolo 3) más eficazmente inducen la diferenciación de los NPC en las neuronas. Para garantizar el éxito, se…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 31501099) y el Departamento de Educación Media y Joven de la Provincia de Hubei, China (No. Q20191104). Además, agradecemos al profesor Wensheng Deng de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Wuhan por proporcionar las líneas de células madre embrionarias del ratón A2lox.

Materials

Anti-Nestin antibody [Rat-401] Abcam Ab11306 stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit Sigma Aldrich T2200 stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG Beyotime A0428 stored at -20 °C and protect from light
B-27 Supplement (50X), serum free Gibco 17504044 stored at -20 °C, and protect from light
CHIR-99021 (CT99021) Selleck S1263 stored at -20 °C
Coverslips NEST 801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG Beyotime A0516 stored at -20 °C and protect from light
DME/F-12 1:1 (1x) HyClone SH30023.01B stored at 4 °C
Fetal bovine serum HyClone SH30084.03 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Fluorescence microscopy Olympus CKX53
Gelatin Gibco CM0635B stored at room temperature
GlutaMAX Supplement Gibco 35050061 stored at 4 °C
Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer Beyotime P0103 stored at 4 °C
KnockOut DMEM/F-12 Gibco 12660012 stored at 4 °C
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828028 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Leukemia Inhibitory Factor human Sigma L5283 stored at -20 °C
Mounting Medium With DAPI – Aqueous, Fluoroshield Abcam ab104139 stored at 4 °C and protect from light
MEM Non-essential amino acids solution Gibco 11140076 stored at 4 °C
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502048 stored at -20 °C and protect from light
Normal goat serum Jackson 005-000-121 stored at -20 °C
Neurobasal Medium Gibco 21103049 stored at 4 °C
Nonadhesive bacterial dish Corning 3262
Phosphate Buffered Saline (1X) HyClone SH30256.01B stored at 4 °C
Penicillin/ Streptomycin Solution HyClone SV30010 stored at 4 °C
PD0325901(Mirdametinib) Selleck S1036 stored at -20 °C
Retinoic acid Sigma R2625 stored at -80 °C and protect from light
Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells Cyagen MUAES-01001 Maintained in feeder-free culture system
Stem-Cellbanker (DMSO free) ZENOAQ stem cellbanker DMSO free stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Trypsin 0.25% (1X) Solution HyClone SH30042.01 stored at 4 °C
Triton X-100 Sigma T8787
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023 stored at 4 °C and protect from light
4% paraformaldehyde Beyotime P0098 stored at -20 °C
6 – well plate Corning 3516
60 mm cell culture dish Corning 430166
15 ml centrifuge tube NUNC 339650

References

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Cite This Article
Mao, X., Zhao, S. Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro. J. Vis. Exp. (160), e61190, doi:10.3791/61190 (2020).

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