Summary
Beskrevet er cellekulturen og eksponeringsmetoden for en in vitro-bronkial model til realistisk, gentagen indåndingseksponering for partikler til toksicitetstest.
Abstract
Til toksicitetstest af luftbårne partikler er der udviklet luft-væske-interface (ALI) eksponeringssystemer til in vitro-test for at efterligne realistiske eksponeringsforhold. Dette stiller specifikke krav til cellekulturmodellerne. Mange celletyper påvirkes negativt af udsættelse for luft (f.eks. udtørring) og forbliver kun levedygtige i et par dage. Dette begrænser de eksponeringsbetingelser, der kan bruges i disse modeller: Normalt anvendes relativt høje koncentrationer som en sky (dvs. dråber, der indeholder partikler, som sætter sig hurtigt ned) inden for en kort periode. Sådanne forsøgsbetingelser afspejler ikke realistisk langvarig eksponering for lave koncentrationer af partikler. For at overvinde disse begrænsninger brugen af en menneskelig bronchiale epitelcelle linje, Calu-3 blev undersøgt. Disse celler kan dyrkes ved ALI-forhold i flere uger, samtidig med at de bevarer en sund morfologi og et stabilt monolag med stramme vejkryds. Desuden er denne bronchiale model egnet til at teste virkningerne af gentagen eksponering for lave, realistiske koncentrationer af luftbårne partikler ved hjælp af et ALI-eksponeringssystem. Dette system bruger en kontinuerlig luftstrøm i modsætning til andre ALI-eksponeringssystemer, der bruger en enkelt forstøvning, der producerer en sky. Derfor er det kontinuerlige strømningssystem egnet til gentagen og langvarig eksponering for luftbårne partikler, mens det kontinuerligt overvåger partikelegenskaberne, eksponeringskoncentrationen og den leverede dosis. Samlet set er denne bronchiale model i kombination med det kontinuerlige floweksponeringssystem i stand til at efterligne realistiske, gentagne inhalationseksponeringsforhold, der kan bruges til toksicitetstest.
Introduction
Lungerne er sårbare over for indånding eksponering for luftbårne partikler. For at vurdere luftbårne partiklers potentielletoksiciteter der gjort fremskridt med at udvikle luftvæskeeksponeringssystemer (ALI) 1,2,3,4,5. ALI-eksponeringssystemer giver mulighed for mere relevante og realistiske eksponeringsmodeller sammenlignet med traditionel neddykket eksponering via dyrkningsmedium , der ændrer partiklernes egenskaber og kinetik6. ALI-eksponeringssystemerne stiller specifikke krav til cellekulturmodellerne, da modellerne mangler kulturmedie og dermed næringsstoffer på den apikale side. Mange cellemodeller påvirkes negativt af at blive dyrket og eksponeret i luften (f.eks. udtørring) og forbliver kun levedygtige i et par dage. Dette begrænser de eksponeringsbetingelser, der kan anvendes i disse modeller: Normalt anvendes relativt høje koncentrationer inden for en kort periode som sky (dvs. dråber, der indeholder partikler, som slår sig hurtigt ned). Sådanne forsøgsbetingelser afspejler ikke realistisk langtidseksponering for lave koncentrationer af partikler. Der kan således sættes spørgsmålstegn ved resultaternes relevans. For at overvinde disse begrænsninger blev kultur- og eksponeringsprotokollen for en bronkial model bestående af den menneskelige bronchiale epitelcellelinje Calu-37 optimeret.
De fleste in vitro-lungemodeller, der anvendes til ALI-eksponering, indeholder andre cellelinjer såsom A549, BEAS-2B og 16HBE14o- (16HBE) eller primærceller som grundlag8. Disse cellelinjer har den ulempe, at de forbliver levedygtige i kun et par dage, når de dyrkes på ALI. Derudover vokser nogle af disse cellelinjer, når de dyrkes i en periode længere end 5 dage. Endelig A549 celler glip af funktionelle stramme vejkryds og kan derfor ikke danne en stram barriere, der er nødvendig for at efterligne lungerne9,10. Primære epitelceller kan være en god mulighed for ALI eksponering, da de kan dyrkes på ALI i ugevis. Primære celler varierer imidlertid fra parti til parti, er vanskeligere at vedligeholde og er dyrere sammenlignet med cellelinjer, hvilket gør dem mindre egnede til toksicitetstest og screening. Når man sammenligner forskellige menneskelige bronchiale epitelcellelinjer (16HBE, Calu-3, H292 og BEAS-2B), opfylder kun Calu-3-cellerne alle de kriterier, der er nødvendige for realistisk, gentagen ALI-eksponering: de forbliver levedygtige i uger, mens de dyrkes på ALI, giver en høj barriereintegritet, vokser ikke og er lette at kultur og vedligeholde. Calu-3 celler stammer fra en adenocarcinoma og er i stand til at producere slim11,12. Der er uoverensstemmelser om , hvorvidt cellerne kan udvikle cilia11,13. Calu-3 celler er også en egnet model til at studere respiratorisk syncytial virus (RSV) infektioner, der inficerer ciliated luftveje epitelceller14.
Ud over cellemodellen anvendes et automatiseret eksponeringssystem (AES) til luftvæskeeksponering for aerosoler15,16. AES har den fordel, at den bruger en kontinuerlig luftstrøm til at udsætte cellemodellen for aerosoler. Dette er i modsætning til andre luft-væske eksponeringssystemer, der normalt bruger relativt høje koncentrationer inden for en kort periode som en sky (dvs . dråber, der indeholder partikler, der sætter sig hurtigt ned)17,18,19. Disse skysystemer afspejler ikke realistisk langvarig eksponering for lave koncentrationer af partikler. Ved at anvende en kontinuerlig luftstrøm ved hjælp af AES kan cellemodellen udsættes for en lav koncentration af partikler over en længere periode, hvilket afspejler realistiske eksponeringsforhold. En anden fordel i forhold til cloud-systemer er, at AES har mulighed for at forbinde partikelkarakteriseringsinstrumenter, hvilket gør det muligt at måle partikelstørrelse, talkoncentration og masse over tid. En begrænsning af AES er, at den bruger relativt høje luftstrømme mellem 10 mL/min og 100 mL/min.
Protocol
1. Forberedelse af cellekulturmedium (CCM)
- Forbered en flaske på 500 mL minimum essentielt medium (MEM) suppleret med glutamin.
- Der tilsættes 5 ml penicillin-streptomycin (dvs. 100 U/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin).
- Der tilsættes 5 ml ikke-essentielle aminosyreopløsninger (NEAA).
- Der tilsættes 10 ml amphotericin B (valgfrit).
- Tilsæt 50 mL FBS (varme inaktiveret, følg ATCC-protokollen for varmeinaktivering; (https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/AnimCellCulture_Guide.ashx, side 19)).
2. Subkulturering af Calu-3 celler
BEMÆRK: Calu-3 celler dyrkes i T75- eller T175-cellekulturkolber ved 37 °C og 5% CO2. Cellerne passeres med 60-80 % sammenløb hver 7. dag med CCM-fornyelse hver 2-3. dag. CCM hældes af, og frisk CCM (T25 = 5 mL, T75 = 15 mL, og T175 = 25 mL)pipetteres i kolben, og kolben anbringes tilbage i inkubatoren. Cellerne skal passeres mindst 2x efter optøning, før de anvendes i forsøg, eller før frysning, og de bør ikke passeres mere end 25x i alt.
- Bekræft, om kolben har et sammenløb på 60-80 % ved at kontrollere under et let mikroskop.
- Hæld CCM fra kolben.
- Cellerne vaskes 2x med 5 ml 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) uden calcium og uden magnesium. Kasser HBSS efter hver vask. HBSS fjerner serum, som hæmmer trypsin.
- Der tilsættes 3 mL trypsin-EDTA til en T75 (4 mL for en T175) og kolben anbringes tilbage i inkubatoren ved 37 °C og 5% CO2 i 10-15 min. Kontroller efter 10 minutter, hvilket sikrer, at cellerne er blevet løsrevet fra kolbens overflade. Hvis cellerne dyrkes til >80% sammenløb, vil de ikke løsne ved hjælp af trypsin 0,05% og trypsin 0,25% kunne anvendes.
- Der tilsættes 6 mL (dvs. dobbelt så meget trypsin-EDTA-volumen, der oprindeligt blev tilsat) CCM til kolben, og kolberne rokkes forsigtigt for at sikre korrekt blanding. Dette er for at sikre, at trypsin er blevet neutraliseret af FBS i CCM og dens aktivitet på cellerne standset. Hvis trypsin får lov til at forblive i kontakt med cellerne for længe, vil de ikke fastgøre igen, når de sættes i en ny cellekulturkolbe.
- Kolbens samlede indhold hældes i et 50 mL centrifugerør.
- Centrifuge cellerne i 5 min ved 130 x g, hvilket sikrer, at centrifuge er korrekt afbalanceret.
- Vend forsigtigt det hætteglas, der indeholder cellerne, tilbage til aseptiske forhold, og fjern supernatanten forsigtigt uden at forstyrre pelletlen. Supernatanten kan hældes af, og resten pipetters af, hvilket sikrer, at pellet ikke forstyrres.
- Resuspend celle pellet i 1 mL CCM ved pipetter op og ned, indtil alle celler er suspenderet (dvs. ingen pellet eller celle agglomerater observeres). Yderligere CCM kan tilsættes for at fortynde celleaffjedringen.
- Tæl cellerne, både døde og levende, i 1 mL CCM ved hjælp af et hæmocytometer. Hvis det er nødvendigt for korrekt optælling, fortyndes cellerne i 3 eller 4 mL.
- Sæt cellerne i den krævede CCM-volumen, og tilsæt celleophænget i hver kolbe. For at opnå omkring 80% sammenløb i en uge, frø 2 x 106 celler i en T75 eller 6 x 106 celler i en T175.
- Kolben rokkes forsigtigt, og den placeres derefter tilbage i inkubatoren ved 37 °C og 5% CO2.
- Udskift med frisk CCM hver 2-3 dage og subkultur, når cellerne når 60-80% sammenløb.
3. Såning Calu-3 celler på kultur skær
BEMÆRK: Skær fås med forskellige porestørrelser. Små porestørrelser (f.eks. 0,4 μm) har den fordel, at cellerne vokser lettere og kan opnå en god barriere allerede efter 5 dages dyrkning under neddykkede forhold målt ved Trans Epitelial Electrical Resistance (TEER). Men når de er interesseret i partikeltranslokation, er disse porer for små og vil fange partiklerne. Derfor vælges større porestørrelser (f.eks. 3 μm) normalt til at teste partikler. Når du bruger en større porestørrelse, har cellerne brug for længere tidsperioder (f.eks. 7-10 dages dyrkning under neddykkede forhold) for at opnå en god TEER.
- Forbered celleophæng med kendt koncentration efter trin 2.1-2.10.
- Fortyndes celler til en koncentration på 5 x 105 celler/mL i forvarmet CCM til 6 brøndindsatser eller 2,5 x 105 celler/mL for 12 brøndindsatser.
- Tag en cellekulturplade med skær og læg under aseptiske forhold.
- Fyld basolateralsiden med 2 mL forvarmet CCM til 6 brøndindsatser eller 1 mL til 12 brøndindsatser. Mens du tilføjer kulturmediet, skal du tage indsatsen ud ved hjælp af pincet.
- Bland forsigtigt celleaffjedringen ved at pipette op og ned. Pipette 1,0 mL for 6 brøndindsatser og 500 μL for 12 brønde (svarende til 100.000 celler/cm2)på toppen af membranen i cellekulturindsatsen med 0,4 μm porer. For 3,0 μm porer skal celletætheden øges til 128.000 celler/cm2.
- Cellekulturpladen dækkes og inkuberes ved 37 °C og 5% CO2.
- Skift CCM hver 2-3 dage.
- Lad cellerne blive sammenflydende i 7 dage under neddykkede forhold, før de fortsætter med at kultur på ALI.
- Mål TEER.
- Tag et Epithelial Voltohmmeter suppleret med Chopstick Electrode Set, og oplad batterisystemet natten over.
- Afbryd Voltohmmeteret fra opladeren, og tilslut spisepindeelektroden.
- Rengør elektroden med 70% ethanol.
- Placer elektroden i CCM'en ved at sætte den længere elektrode i det eksterne dyrkningsmedie, indtil den rører bunden af skålen og sætter den kortere elektrode i mediet uden at røre membranen.
- Start med en tom indsats uden celler. Vent, indtil målingen stabiliseres, og skriv modstanden ned i Ohms. Denne måling er skærmembranens modstand uden celler (dvs. blindprøve).
- Gentag målingen for hvert skær, og træk den tomme modstand fra for at opnå den sande modstand.
- Til dataanalyse multipliceres modstandsværdierne med indsætningens overfladeareal i Ω x cm2. For en 6 brøndindsats er overfladearealet 4,67 cm2. Så hvis en modstand på 600 Ohm måles, og baggrunden er 120 Ohm, er modstanden 480 Ohm, som derefter ganges med overfladearealet på 4,67 cm2 for i alt 2.241,6 Ohm x cm2. TEER skal være >1.000 Ω x cm2 for at fortsætte.
- Fjern CCM'en fra den apikale side af indsatsen.
- Der tilsættes 2 mL forvarmet CCM til 6 brønd og 1 mL til 12 brøndindsatser på basolateralsiden af brønden (dvs. under cellekulturindsatsen). CCM'en skal røre membranen fra bunden, men ikke lække på toppen af indsatsen.
- På dette tidspunkt celler er apically udsat for luft, som kaldes dyrkning på ALI.
- Dyrkningsceller ved ALI i inkubatoren ved 37 °C og 5% CO2 i 7 dage før eksponering.
- Skift basolateral CCM hver 2-3 dage. Cellerne kan bruges på ALI i 6 uger.
4. Forberedelse af eksponeringsopsætningen
BEMÆRK: I afsnit 5-7 beskrives præparater til partikeleksponering ved hjælp af en automatiseret eksponeringsstation (AES, se materialetabel). Opsætningen til partikelforstøvning og karakterisering er også kompatibel med andre ALI-eksponeringssystemer fra andre producenter. Som et eksempel er eksponeringen for partikler beskrevet nedenfor. Sådanne systemer kan også bruges til andre eksponeringer, såsom sensibiliserende, cigaretrøg og dieseludstødning. Figur 1 viser AES og et eksponeringsmodul. Figur 2 viser en skematisk gengivelse af eksponeringsopsætningen, herunder alle andre instrumenter.
- Før du starter en eksponering ved hjælp af AES, skal du forbinde systemet med flere instrumenter til måling af aerosolegenskaber; disse måles i en sidestrøm lige før aerosolerne kommer ind i kabinettet.
BEMÆRK: En flow splitter bruges til at forbinde sidestrømmen til eksponeringskarakteriseringsudstyret. Generelt anvendes følgende udstyr: scanning af mobilitetspartikelstørrelser (SMPS), optisk partikelstørrelse (OPS), kondenspartikeltæller (CPC), konisk element oscillerende mikrobalance (TEOM). SMPS- og OPS-målingerne udføres 1x i timen og bruger den samme slange fra flowdeleren. CPC og TEOM udfører kontinuerlig måling, og data fra begge er logget på en Egernmodel 2020-datalogger. Derudover bestemmes gravimetrisk massekoncentration ved hjælp af en mikrobalance i kontrolleret relativ luftfugtighed (40-70%) temperatur (21-23 °C). Teflonfiltre vejes før og efter hver eksponering for at bekræfte eksponeringskoncentrationen. For at fange udstødningen anvendes et HEPA-filter. Opsætningen, herunder manipuleret nanomateriale (ENM) suspensioner og forstøver er alle placeret i et flow kabinet for at forhindre enhver eksponering for mennesker. AES kan bruges til at teste mange forskellige typer ENM'er, herunder metaller og metaloxider. - Forbered en nanomateriale suspension kort før eksponering. Normalt fremstilles en 1% suspension som en lagerløsning. For eksempel suspendere 100 mg nanomateriale i 10 mL rent vand.
BEMÆRK: Ved DQ12-eksponering anvendes 300 mg til at opnå ca. 2 μg/cm2. Denne mængde kan anvendes i en enkelt eksponering eller opdeles over gentagne eksponeringer (f.eks. suspenderes 300 mg i 30 mL for en enkelt eksponering, eller 21,5 mg suspenderes i 2,15 mL frisk hver dag i 3 ugers gentagen eksponering). Suspensionen er frisklavet på hver eksponeringsdag. Partikelaffjedringen sonikeres i 16 minutter ved hjælp af sondeordinering. Volumenet af 1% bestandsopløsningen justeres til et samlet volumen på 100 ml ved at tilsætte rent vand. - Sæt ENM suspensionen i en lille flaske med en hætte og en magnetisk omrører for at forhindre afregning af partiklerne. Tilslut flasken til en peristaltisk pumpe via et lille rør, og juster flowet til 25 mL/h.
- Tilslut den peristaltiske pumpe til en sprøjtedyse, og juster indstillingerne, så den tillader kontinuerlig aerosolisering.
- Sprøjtedysen er monteret på et 60 cm langt aluminiumsrør (blandekammer, diameter 15 cm, opvarmet til 60 °C). Opsætningen er forbundet til AES via et 1,5 meter langt kobberrør (diameter 15 cm). Oven på AES fjerner en slaglegeme alle aerosoler, der er større end 2,5 μm.
- Tilslut sprøjtedysen til 3 bar trykluft gennem to massestrømsregulatorer (MFC) for at muliggøre forstøvning af suspensioner. En strøm på 14 L/min anvendes til sprøjtedysen, den anden MFC til blanding af luften i røret.
- Dagen før eksponeringens start skal du tænde for AES'en, så kabinettet kan nå en temperatur på 37 °C.
- Tænd luftstrømmen og fugtigheden i kabinettet 2 timer før eksponeringens start for at nå 85% fugtighed. Tænd for opvarmningen af de eksponeringskamre, hvor indsatsen med cellerne placeres.
- Tænd for kvartsmikrobalancen (QCM), og angiv den oprindelige værdi til 0 ved hjælp af softwaren. Begynd at logge. Hver 10 s måles massen og udtrykkes som ng/cm2.
- Varm cellekulturmediet op til 37 °C i et vandbad (~20-30 min.).
5. Forberedelse Calu-3 celler til eksponering
BEMÆRK: For en typisk ALI-eksponering ved hjælp af AES er der brug for 15-20 skær med et sammenflydende cellelag. Disse består af 3 rene luftkontroller, 3 inkubatorkontroller, der håndteres på samme måde som de andre skær uden eksponering i AES, 6-8 skær til aerosoleksponering (afhængigt af brugen af 0, 1 eller 2 mikrovægte), 1-3 skær til kontrolmålinger (f.eks. maksimal LDH-frigivelse) og 3 ekstra skær, hvis TEER for nogle af skærene ikke er tilstrækkelig. Cellerne skal have en TEER på >1.000 Ω x cm2 for at fortsætte.
- På den første dag af eksponeringen skal cellerne vaskes 1x med CCM, kontrollere cellemorfologien og måle TEER for cellemodellen ved hjælp af et Voltohmmeter. Cellerne skal danne et stramt monolag uden huller.
- Sæt 2 mL/1 mL HEPES bufferet CCM uden FCS til basolateralsiden af 6 brønd/12 brøndplader og overfør dyrkningsindsatserne med celler til de nye plader.
BEMÆRK: Under eksponering er der ingen CO2 til stede i AES. Derfor anvendes HEPES bufferet dyrkningsmedium (25 mM HEPES) under transport og eksponering. Dette medie bruges til både de eksponerede celler i AES og inkubatorkontrolcellerne. - Hvis tiden til transport af cellekulturerne til AES er mere end 5 min., skal cellerne anbringes i en bærbar inkubator på 37 °C under transporten.
6. Håndtering af AES under en eksponering
- På AES fyldes eksponeringsmodulerne med HEPES-bufferet CCM uden føtal kalveserum (FCS). Mængden af CCM afhænger af den anvendte enhed og typen af cellekulturindsats. Husk, at for at holde cellerne på ALI, skal mediet nå bunden af membranen, men bør ikke lække oven på membranen. Når du bruger 6 brøndindsatser, tilsættes 6 mL HEPES-bufferet CCM til eksponeringsmodulerne.
- Overfør indsatserne med celler fra pladerne til eksponeringsmodulerne ved hjælp af steril pincet. Kontroller, at der ikke er luftbobler på basolateralsiden af cellerne, og fjern eventuelle CCM'er på den apikale side af indsatsen. Hvis der er nogle luftbobler på basolateralsiden, skal du forsigtigt dreje indsatserne ved hjælp af den sterile pincet, indtil de fjernes. Opbevar pladerne med CCM i en inkubator til overførsel efter en eksponering.
- Brug berøringsskærmen til at vælge eksponeringsvarighed, luftstrømshastighed og elektrostatisk aflejringsforbedring. Displayet kan også bruges til at kontrollere fugtighed og temperatur. Normalt vælges en eksponeringsvarighed på 4 timer med en strømningshastighed på 50 mL/min på indsatserne ved 37 °C og 85% fugtighed.
BEMÆRK: Modulerne på første niveau (figur 1) anvendes til ren lufteksponering; skær i dette niveau bruges som ren luft eksponering kontrol. De andre moduler i andet og tredje niveau kan bruges til aerosoleksponering, herunder to moduler til kvartskrystalmikrobalancer (QCM) til måling af deposition online. - Lækagetesten skal udføres, før eksponeringen påbegyndes. Lækagen skal være mindre end 5 mL/min. Følg vejledningen på AES-skærmen. Når lækagetesten er færdig, kan eksponeringen startes. I tilfælde af lækage skal slangen kontrolleres.
- Ved eksponeringens afslutning skal du åbne døren til et AES-modul, åbne eksponeringsmodulerne, placere cellekulturindsatserne tilbage til cellekulturpladerne og overføre pladerne til den bærbare inkubator.
- Mediet indsamles fra modulerne (dvs. eksponerede prøver) og fra pladerne (dvs. inkubatorkontroller) til senere analyse, f.eks.
- Tilbage på cellekulturlaboratoriet overføres cellekulturindsatserne til plader fyldt med frisk standard CCM. Sæt cellekulturpladerne i inkubatoren indtil næste eksponering eller indtil analyse.
- Efter den sidste eksponeringsdag sættes indsatserne i inkubatoren indtil næste dag.
- Dagen efter den endelige eksponering tilsættes CCM til den apikale side for at måle TEER ved hjælp af et Voltohmmeter. Saml både den apikale og basolaterale CCM separat til analyse af cytokiner.
- Fjern alle CCM og udføre en celle levedygtighed analyse ved at tilføje, for eksempel en spredning reagens til den apikale side.
7. Rengøring af AES
- Fyld eksponeringsmodulerne med vand, vent i 1 minut, og fjern vandet. Fyld derefter modulerne med 70% ethanol, lad det stå i 10 minutter, og fjern ethanolen. Rengør eksponeringstrompeterne også med 70% ethanol.
- Stop fugtighedskontrollen på 85 %, men lad kabinettets temperatur stå ved 37 °C til næste forsøg.
Representative Results
Denne artikel indeholder en metode til dyrkning og eksponering af humane bronchiale epitelceller ved ALI, der efterligner realistiske, gentagne inhalationseksponeringsbetingelser, der kan bruges til toksicitetstest. Karakteristika for både cellemodellen og eksponeringssystemet er afgørende for at opnå en realistisk eksponeringsmodel for indånding, der kan anvendes til gentagen eksponering. Resultaterne af disse karakteristika er vist nedenfor.
Krav til cellemodel og valg
Ved valg af en passende cellemodel skal der tages hensyn til følgende karakteristika:
- Cellemodellen skal være i stand til at danne et sammenløbet monolayer med fungerende stramme knudepunkter for at efterligne lungebarrieren.
- Cellemodellen skal vise optimal ydeevne, når den gentagne gange udsættes for konditioneret (temperatur og fugtighed) luft.
- Cellemodellen skal reagere på en eksponering.
Denne undersøgelse startede med fire forskellige menneskelige bronchiale epitelcellelinjer: 16HBE, Calu-3, H292 og BEAS-2B. Disse anvendes alle i vid udstrækning til toksicitetstest af nanomaterialer og kemikalier. Af de fire cellelinjer opfyldte kun Calu-3-cellerne alle ovennævnte krav. Cellerne dannede et monolag med tætte vejkryds (figur 3), der forblev en stabil barriere over tid målt ved TEER, mens de andre cellelinjer enten ikke dannede en barriere eller viste et fald i barrierefunktionen, når de dyrkede sig ved ALI (Figur 4). Derudover havde H292 og BEAS-2B en tendens til at vokse til flere cellelag, når de dyrkes i en længere periode. Traditionelle neddykkede celle dyrkning og ALI dyrkning varierede meget, fordi der på ALI næringsstoffer var kun tilgængelige fra basolateral side og cellerne blev udsat for tørre forhold på den apikale side. Disse tilstande kan forårsage stress for cellemodellerne, hvilket kan observeres ved at måle cellens levedygtighed over tid. Cellelinjer 16HBE, H292 og BEAS-2B viste alle en øget LDH-frigivelse, når de blev dyrket ved ALI, mens Calu-3-celler kun viste en lille LDH-frigivelse (Figur 5).
Dernæst blev Calu-3-modellens reaktion på stoffer testet. Som et positivt kontrolstof blev LPS administreret via forstøvning til modellens apikale side. Den deponerede dosis var 0,25 μg/cm2. Calu-3 cellerne viste en reaktion på lipopolysaccharid (LPS) ved en stigning i LDH frigivelse og i tumor nekrose faktor alfa (TNF-α) frigivelse (Figur 6).
Endelig blev Calu-3 monolayer udsat for kvarts silica (DQ12) nanomaterialer (IOM, Edinburgh). Krystallinsk silica kan fremkalde silikose og kan også forårsage lungetumorer. Derfor har Det Internationale Kræftforskningscenter (IARC) klassificeret krystallinsk silica som et kræftfremkaldende stof i gruppeI 20. Virkningsmekanismen for krystallinsk silica menes at være via induktion af vedvarende betændelse forårsaget af dens reaktive overflade21,22,23. Flere in vivo undersøgelser i både rotter og mus rapporterer induktion af inflammation og histopatologi ændringer, herunder tumorer og fibrose, efter indånding eksponering for krystallinsk silica24,25,26,27,28,29. Disse virkninger observeres alle efter gentagen eksponering og/eller langsigtet opfølgning. Calu-3-modellen blev brugt til at undersøge, om observationerne fra in vivo-undersøgelserne kunne efterlignes ved hjælp af en in vitro-model, der kunne udsættes gentagne gange på ALI.
Calu-3 celler blev eksponeret i 3 på hinanden følgende uger, 5 dage om ugen, 4 timer om dagen til DQ12. Den deponerede dosis blev målt ved hjælp af en QCM. Den gennemsnitlige deponerede dosis var 120 ng/cm2 pr. dag med en kumulativ dosis på 1,6 μg/cm 2 ,svarendetil de doser, der fremkalder en virkning in vivo. Andre partikelegenskaber er vist i tabel 1. Efter 3 ugers eksponering fremkaldte DQ12 ingen signifikante virkninger i TEER, celle levedygtighed, og monocyt chemoattractant protein 1 (MCP-1) frigivelse, sammenlignet med ren luft kontrol(Figur 7). Efterhånden som der forventedes mere toksicitet af DQ12 baseret på in vivo-dataene, blev partiklernes reaktivitet kontrolleret ved hjælp af en acellulær analyse i henhold til den protokol, der var optimeret inden for EU-projektet GRACIOUS (leverance 5.3). DQ12-batchens reaktivitet var lavere end forventet (figur 8), størrelsesordener lavere sammenlignet med de positive kontrolpartikler carbon black (CB). Denne mangel på reaktivitet kan forklare fraværet af en toksicitetsrespons i Calu-3-modellen.
Figur 1: Den automatiske eksponeringsstation (AES).
Den venstre figur viser ydersiden af kabinettet med berøringspanelet. AES har tre niveauer med eksponeringsmoduler: det øverste niveau for eksponering af ren luft og mellem- og bundniveauet for aerosoleksponeringer. Den rigtige figur viser det eksponeringsmodul, hvor skær med celler placeres. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Skematisk repræsentation af eksponeringsopsætningen.
Fra venstre mod højre: 1) ENM-affjedringen, der er forbundet med sprøjtedysen via en peristaltisk pumpe 2) Ved hjælp af trykluft forstøver sprøjtedysen ENM-suspensionen, og via et blandekammer føres aerosolerne til AES; 3) Lige før du går ind i AES, er aerosolkarakteriseringsinstrumenter forbundet: SMPS, OPS, CPC og TEOM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentativt billede af Calu-3-celler efter dyrkning ved den luftvæskegrænseflade (ALI) i 10 dage.
Fluorescens mikroskopi billede af Calu-3 celler efter dyrkning på ALI i 10 dage. Stramt krydsprotein ZO-1 er farvet i grønt, kerner af cellerne er farvet i blåt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Transepithelial elektrisk modstand (TEER) af fire forskellige cellelinjer i løbet af en kulturperiode på 21 dage.
TEER-værdier på 16HBE, Calu-3, H292 og BEAS-2B, når de dyrkes i 21 dage: de første 7 dage nedsænket, efterfulgt af 14 dage på ALI. TEER-værdier blev korrigeret for indsættets baggrundsmodstand og ganget med indsætningens overfladeareal. Symbolerne og fejllinjerne repræsenterer gennemsnitsværdien og standardafvigelsen for seks skær. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: LDH frigivelse af fire forskellige cellelinjer i løbet af en kulturperiode på 21 dage.
LDH frigivelse af 16HBE, Calu-3, H292, og BEAS-2B når dyrket i 21 dage: 7 dage nedsænket, efterfulgt af 14 dage på ALI. De viste LDH-værdier er relative i forhold til den maksimale LDH-frigivelse pr. celletype. Symbolerne og fejllinjerne repræsenterer gennemsnitsværdien og standardafvigelsen på fem skær. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Cellulære effekter i Calu-3 celler udsat for LPS.
Calu-3 celler blev eksponeret via sky forstøvning til 0,25 μg/cm2 LPS. (a)WST-1-konverteringen. (B) LDH-udløsning. (C) TNF-α frigivelse efter LPS-eksponering. Symbolerne og fejllinjerne repræsenterer gennemsnitsværdier og standardafvigelser for tre skær. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Cellulære effekter i Calu-3 celler udsat for DQ12 nanomaterialer.
Calu-3 celler blev eksponeret i 3 uger (4 timer om dagen, 5 dage om ugen) for DQ12 nanomaterialer, ca. 120 ng/cm2 pr. dag, kumulativ dosis på 1,6 μg/cm2. (A) TEER-værdier. (B) LDH-udløsning. (C) MCP-1-udslip efter DQ12-eksponering. Alle symboler og fejllinjer repræsenterer gennemsnitsværdier og standardafvigelser på tre skær for kontrolelementerne og seks skær for DQ12-eksponeringen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Acellulær reaktivitet af DQ12.
DQ12 blev inkuberet med en 2ʹ,7ʹ-Dichlorfluorescein Diacetate (DCFH-DA) sonde til at detektere dens overfladereaktivitet. Som en positiv kontrol blev carbon black (CB) partikler inkluderet. Sammenlignet med CB har DQ12 meget lav overfladereaktivitet. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Partikelmasse (μg/m3) | Partikelnummer (#/cm3) | Mobilitet partikelstørrelse (nm) | Geometrisk standardafvigelse | Optisk partikelstørrelse (μm) |
| 2969 (418) | 83983 (10215) | 66.6 | 2.5 | 1.1 (1.3) |
Tabel 1: DQ12-eksponeringskarakteristika. Værdier vises som gennemsnit med standardafvigelse i parentes.
Discussion
Dette papir beskriver en metode til dyrkning af humane bronchiale epitelceller under ALI og udsætte denne bronchiale model for aerosoler eller gasser. Fordelen ved at bruge Calu-3 celler er, at de danner stramme vejkryds, forbliver en monolayer, er i stand til at modstå luftstrømmen, og kan dyrkes i ugevis på ALI, i modsætning til mange andre celletyper (f.eks 16HBE, H292, og BEAS-2B). Brug af VITROCELL® automatiseret eksponeringsstation (AES) har den fordel, at cellerne kan eksponeres under realistiske og relevante forhold, da lave koncentrationer kan anvendes ved hjælp af en kontinuerlig luftstrøm.
Fortsatte flowsystemer, såsom AES, har fordele sammenlignet med at bruge skysystemer3,32, som bruger en enkelt forstøvning af en suspension. Det kontinuerlige flow er mere realistisk, og mange variabler som strømningshastighed, fugtighed og temperatur styres. Derudover kan aflejring forbedres ved hjælp af et elektrisk felt. Endelig overvåges aerosolegenskaber som størrelse, antalskoncentration og masse online. En ulempe er, at fortsatte flowsystemer er mere komplekse sammenlignet med cloud-systemer. Derfor er det vigtigt at køre forberedende eksperimenter, der fokuserer på aerosolens partikelegenskaber og den leverede dosis på indsatsen. Partiklernes første startkoncentration og AES-indstillingerne kan derefter justeres for at opnå den ønskede dosis på cellerne33. Afhængigt af den type partikler, der testes, kan aerosolgenereringsmetoden variere. Brugen af elektrostatisk aflejring afhænger af partikeltypen og fungerer bedst for metalliske partikler. For partikler med en positiv overfladeladning skal der påføres et negativt elektrostatisk felt og omvendt.
Det kan være vanskeligt at vælge eksponeringskoncentrationer for ethvert forsøg med luft-væskeeksponering. For DQ12-eksponeringerne var målet at opnå en samlet kumulativ dosis på 1 μg/cm2 efter 3 ugers eksponering, 5 dage om ugen, 4 timer om dagen. Denne dosis svarer til doser, der fremkaldte en effekt in vivo21,25,27,32,33. Ved udførelsen af eksponeringerne var der en vis variation mellem forskellige eksponeringsdage. Selv om den faktisk deponerede dosis på 1,6 μg/cm2 er højere end den 1 μg/cm2, der var beregnet til, kunne dosis have været for lav til at observere virkningerne i Calu-3-modellen. Kun mindre forskelle i TEER, levedygtighed og cytokinrespons blev observeret mellem eksponeringen for ren luft og DQ12-eksponeringen, og disse forskelle var ikke statistisk signifikante. En forklaring på observationen af, at DQ12-eksponering i 3 uger ikke fremkaldte signifikante virkninger i Calu-3-cellerne, er, at makrofager manglede fra Calu-3-modellen. Muligvis, efter DQ12 optagelse makrofager producere proinflammatoriske cytokiner, der kan påvirke Calu-3 celler. En anden forklaring er, at det DQ12-parti, der blev brugt til forsøgene, ikke var så reaktivt som forventet. Ved brug af LPS som et positivt kontrolstof viser Calu-3 et respons målt ved en stigning i LDH-frigivelsen og en stigning i TNF-α frigivelse. Dette indikerer, at modellen kan detektere toksicitet.
Calu-3 cellemodellen har mange fordele, som diskuteret i resultatafsnittet. Desuden, når dyrket i længere tid på ALI, Calu-3 celler kan vokse cilia/cilia-lignende strukturer13 og producere slim11,12,13. På trods af disse fordele har modellen begrænsninger med hensyn til dens fysiologiske relevans. Calu-3 cellelinjerne stammer fra en adenocarcinoma, mens 16HBE og BEAS-2B stammer fra sundt væv. Desværre er de to sidstnævnte ikke egnede til gentagen ALI-eksponering, da de ikke forbliver et stabilt monolag over tid. En anden begrænsning af Calu-3-modellen er, at den kun repræsenterer en enkelt celletype. I den menneskelige lunge er flere celletyper, der interagerer og reagerer forskelligt på eksponering, til stede. Inhalerede partikler vil deponere i forskellige områder af lungerne afhængigt af deres aerodynamiske størrelse. Det er her partiklerne kontakter epitelcellebarrieren, som efterlignet af Calu-3-modellen. I den menneskelige lunge tiltrækkes alveolar makrofager til partiklerne, opsluger dem og rydder dem fra lungerne. Makrofager spiller også en væsentlig rolle i betændelsesresponsen på partikeleksponering. Derfor gøres der en indsats for at udvide Calu-3-modellen ved at tilføje primære makrofager for at efterligne lungebarrieren nærmere. Ulempen ved makrofagerne er, at de kun forbliver levedygtige i ca. 7 dage, når de dyrkes oven på Calu-3-celler ved ALI. Derfor bør makrofager læses ugentligt for at omdanne den nuværende Calu-3-model til en kokulturmodel. Optimeringen af samkulturprotokollen er i øjeblikket i gang.
I betragtning af ovenstående er Calu-3 bronkialmodellen en egnet model til gentagen eksponering for aerosoler af delvis opløselige stoffer som kemikalier fra cigaretrøg og LPS. Disse opløselige stoffer fremkalder betydelige stigninger i cytokinresponser i Calu-3-cellerne. Til test af uopløselige partikler som dieseludstødning og DQ12 er der behov for en cokulturmodel, fordi makrofagerne spiller en afgørende rolle i induktionen af effekter ved partikeleksponering.
For de beskrevne eksponeringer blev der anvendt skærmembraner med 3,0 μm porer. Hovedårsagen til at vælge denne type skær er, at det er muligt at teste translokationen af nanomaterialer. Ved brug af mindre porestørrelse på 0,4 μm vil partikelreglomerater ikke kunne krydse skærmembranen. Ulempen ved at bruge en stor porestørrelse er, at cellerne har brug for længere tid til at vokse sammenløb, og at det er vanskeligere at visualisere cellernes morfologi ved hjælp af lysmikroskopi. Hvis du vil kontrollere, at cellerne udgør et sammenløbet monolag, skal TEER være >1.000 Ω x cm2, før du starter en eksponering.
Tilsammen er Calu-3 bronkialmodellen præsenteret her egnet til brug for gentagen eksponering for aerosoler, mindst op til 3 uger. Modellen kan modstå at blive dyrket og eksponeret via en kontinuerlig luftstrøm og er i stand til at opdage toksicitet for bronchiale epitel.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde er finansieret af EU-projektet PATROLS (Fysiologisk forankrede værktøjer til realistisk nanomaterialerisikobesvarelse) og det nederlandske ministerium for sundhed, velfærd og sport (projekt V/050012). Vi vil gerne takke Dr. Yvonne Staal og Dr. Jan van Benthem for kritisk gennemgang af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01 M NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
| 0.1M (x10) PBS | Gibco | 14200-059 | |
| 2’,7’-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA) | Sigma Aldrich | D6883 | |
| 3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride) | Abcam | ab141525 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15290 | |
| Automated exposure station | Vitrocell | ||
| Cell proliferation reagent WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| CPC | TSI inc., St Paul MN, USA | 3022 | |
| Cytotoxicity detection kit LDH | Roche | 11644793001 | |
| DQ12 | IOM | nanomaterials | |
| ELISA Ready-SET-Go | Fischer Scientific | 88-8086-86, 88-7399-88 | |
| EVOM2 | World Precision Instruments Inc., FL, USA | EVOM2-STX2 | |
| FBS | Greiner bio-one | 758093 | |
| Flow splitter | TSI inc., St Paul MN, USA | model 3708 | |
| Fluorescein diacetate (F-DA) | Sigma Aldrich | F7378 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific Inc. | 14175 | |
| Light microscope | Olympus | CKX41 | |
| Mass flow controllers | MFC, Bronkhorst, the Netherlands | ||
| Methanol (analytical grade) | Sigma Aldrich | 34860 | |
| Microbalance | Sartorius, Goettingen, Germany | ME-5 | |
| Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific Inc. | 41090 | |
| NEAA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140 | |
| OPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3339 | |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15140 | |
| Phenol red free MEM | Gibco | 10500-064 | |
| Pure water | Merck | MilliQ | |
| SMPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3936 | |
| Spray nozzle | Schlick, Coburg, Germany | ||
| Teflon filters | Pall | R2PJ46 | |
| TEOM | Rupprecht & Patashnick NY, USA | series 1400 | |
| Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific Inc. | 690175, 658175, 660175 | |
| Transwell inserts | Corning | 3460, 3462 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 25300 | |
| Tryptan Blue | Sigma Aldrich | T8154 |
References
- Geiser, M., Jeannet, N., Fierz, M., Burtscher, H. Evaluating Adverse Effects of Inhaled Nanoparticles by Realistic In Vitro Technology. Nanomaterials (Basel). 7 (2), 49 (2017).
- Herzog, F., et al. Mimicking exposures to acute and lifetime concentrations of inhaled silver nanoparticles by two different in vitro approaches. The Beilstein Journal of Nanotechnology. 5, 1357-1370 (2014).
- Lenz, A. G., et al. A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposure and application to zinc oxide nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 6, 32 (2009).
- Paur, H. R., et al. In-vitro cell exposure studies for the assessment of nanoparticle toxicity in the lung-A dialog between aerosol science and biology. Journal of Aerosol Science. 42 (10), 668-692 (2011).
- Lacroix, G., et al. Air-Liquid Interface In Vitro Models for Respiratory Toxicology Research: Consensus Workshop and Recommendations. Applied in vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).
- Loret, T., et al. Air-liquid interface exposure to aerosols of poorly soluble nanomaterials induces different biological activation levels compared to exposure to suspensions. Particle and Fibre Toxicology. 13 (1), 58 (2016).
- Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses. Critical Care Research and Practice. 2010, (2010).
- Braakhuis, H. M., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives in Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
- Ren, H., Birch, N. P., Suresh, V. An Optimised Human Cell Culture Model for Alveolar Epithelial Transport. PLoS One. 11 (10), 0165225 (2016).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Papazian, D., Wurtzen, P. A., Hansen, S. W. Polarized Airway Epithelial Models for Immunological Co-Culture Studies. International Archives of Allergy and Immunology. 170 (1), 1-21 (2016).
- Jeong, M. H., et al. In vitro model for predicting acute inhalation toxicity by using a Calu-3 epithelium cytotoxicity assay. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 98, 106576 (2019).
- Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmacology Research. 23 (7), 1482-1490 (2006).
- Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection. Journal of Virological Methods. 174 (1-2), 144-149 (2011).
- Vitrocell. Vitrocell® Automated Exposure Station. , Available from: https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/automated-exposure-station1 (2019).
- Mülhopt, S., et al. Toxicity testing of combustion aerosols at the air-liquid interface with a self-contained and easy-to-use exposure system. Journal of Aerosol Science. 96, 38-55 (2016).
- Vitrocell. VITROCELL® Cloud for the exposure to liquid aerosols. , Available from: https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/vitrocell-cloud-system (2019).
- Endes, C., et al. An in vitro testing strategy towards mimicking the inhalation of high aspect ratio nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), 40 (2014).
- Lenz, A. G., et al. Efficient bioactive delivery of aerosolized drugs to human pulmonary epithelial cells cultured in air-liquid interface conditions. Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (4), 526-535 (2014).
- Borm, P. J., Tran, L., Donaldson, K. The carcinogenic action of crystalline silica: a review of the evidence supporting secondary inflammation-driven genotoxicity as a principal mechanism. Critical Reviews in Toxicology. 41 (9), 756-770 (2011).
- Borm, P. J. A., Fowler, P., Kirkland, D. An updated review of the genotoxicity of respirable crystalline silica. Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 23 (2018).
- Kawasaki, H. A mechanistic review of silica-induced inhalation toxicity. Inhalation Toxicology. 27 (8), 363-377 (2015).
- Sayes, C. M., et al. Changing the dose metric for inhalation toxicity studies: short-term study in rats with engineered aerosolized amorphous silica nanoparticles. Inhalation Toxicology. 22 (4), 348-354 (2010).
- Driscoll, K. E., et al. Pulmonary response to inhaled silica or titanium dioxide. Toxicology and Applied Pharmacology. 111 (2), 201-210 (1991).
- Muhle, H., Kittel, B., Ernst, H., Mohr, U., Mermelstein, R. Neoplastic lung lesions in rat after chronic exposure to crystalline silica. Scandinavian Journal of Work, Environment and Health. 21, Suppl 2 27-29 (1995).
- Peeters, P. M., et al. Silica-induced NLRP3 inflammasome activation in vitro and in rat lungs. Particle and Fibre Toxicology. 11, 58 (2014).
- Reuzel, P. G., Bruijntjes, J. P., Feron, V. J., Woutersen, R. A. Subchronic inhalation toxicity of amorphous silicas and quartz dust in rats. Food and Chemical Toxicology. 29 (5), 341-354 (1991).
- Arts, J. H., Muijser, H., Duistermaat, E., Junker, K., Kuper, C. F. Five-day inhalation toxicity study of three types of synthetic amorphous silicas in Wistar rats and post-exposure evaluations for up to 3 months. Food and Chemical Toxicology. 45 (10), 1856-1867 (2007).
- Cho, W. S., et al. Inflammatory mediators induced by intratracheal instillation of ultrafine amorphous silica particles. Toxicology Letters. 175 (1-3), 24-33 (2007).
- Herzog, F., et al. Exposure of silver-nanoparticles and silver-ions to lung cells in vitro at the air-liquid interface. Particle and Fibre Toxicology. 10 (1), 11 (2013).
- Mülhopt, S., Diabate, S., Krebs, T., Weiss, C., Paur, H. R. Lung toxicity determination by in vitro exposure at the air liquid interface with an integrated online dose measurement. Journal of Physics: Conference Series. 170, 012008 (2009).
- van Ravenzwaay, B., et al. Comparing fate and effects of three particles of different surface properties: nano-TiO(2), pigmentary TiO(2) and quartz. Toxicology Letters. 186 (2), 152-159 (2009).
- Henderson, R. F., et al. A comparison of the inflammatory response of the lung to inhaled versus instilled particles in F344 rats. Fundamental and Applied Toxicology. 24 (2), 183-197 (1995).
