Summary
Beskrivet är cellkultur och exponeringsmetod för en in vitro bronkial modell för realistisk, upprepad inandningsexponering för partiklar för toxicitetstestning.
Abstract
För toxicitetstestning av luftburna partiklar har ali-exponeringssystem (Air-Liquid Interface) utvecklats för in vitro-tester för att efterlikna realistiska exponeringsförhållanden. Detta ställer specifika krav på cellkulturmodellerna. Många celltyper påverkas negativt av exponering för luft (t.ex. uttorkning) och förblir endast livskraftiga i några dagar. Detta begränsar de exponeringsförhållanden som kan användas i dessa modeller: vanligtvis tillämpas relativt höga koncentrationer som ett moln (dvs. droppar som innehåller partiklar, som sätter sig snabbt) inom en kort tidsperiod. Sådana experimentella tillstånd återspeglar inte realistisk långsiktig exponering för låga koncentrationer av partiklar. För att övervinna dessa begränsningar undersöktes användningen av en mänsklig bronkial epitelial cellinje, Calu-3. Dessa celler kan odlas vid ALI-förhållanden i flera veckor samtidigt som de behåller en hälsosam morfologi och ett stabilt monoskikt med snäva korsningar. Dessutom är denna bronkialmodell lämplig för att testa effekterna av upprepade exponeringar för låga, realistiska koncentrationer av luftburna partiklar med hjälp av ett ALI-exponeringssystem. Detta system använder ett kontinuerligt luftflöde i motsats till andra ALI-exponeringssystem som använder en enda nebulisering som producerar ett moln. Därför är det kontinuerliga flödessystemet lämpligt för upprepad och långvarig exponering för luftburna partiklar samtidigt som partikelegenskaper, exponeringskoncentration och levererad dos kontinuerligt övervakas. Sammantaget kan denna bronkialmodell, i kombination med det kontinuerliga flödesexponeringssystemet, efterlikna realistiska, upprepade inhalationsexponeringsförhållanden som kan användas för toxicitetstestning.
Introduction
Lungorna är sårbara för inandningsexponering för luftburna partiklar. För att bedöma den potentiella toxiciteten hos luftburna partiklar har framsteg gjorts för att utveckla luft-vätskegränssnitt (ALI) exponeringssystem1,2,3,4,5. ALI-exponeringssystem möjliggör mer relevanta och realistiska exponeringsmodeller jämfört med traditionell nedsänkt exponering via odlingsmedium som ändrar partiklarnas egenskaper ochkinetik 6. ALI-exponeringssystemen ställer specifika krav på cellkulturmodellerna, eftersom modellerna saknar odlingsmedium och därmed näringsämnen på den apatiska sidan. Många cellmodeller påverkas negativt av att odlas och exponeras i luften (t.ex. uttorkning) och förblir bara livskraftiga i några dagar. Detta begränsar de exponeringsförhållanden som kan användas i dessa modeller: vanligtvis tillämpas relativt höga koncentrationer inom en kort tidsperiod som ett moln (dvs. droppar som innehåller partiklar, som sätter sig snabbt). Sådana försöksbetingade tillstånd återspeglar inte realistisk långsiktig exponering för låga koncentrationer av partiklar. Resultatens relevans kan således ifrågasättas. För att övervinna dessa begränsningar optimerades kultur- och exponeringsprotokollet för en bronkial modell bestående av den mänskliga bronkial epitelial cellinjen Calu-37.
De flesta in vitro-lungmodeller som används för ALI-exponering innehåller andra cellinjer som A549, BEAS-2B och 16HBE14o- (16HBE) eller primärceller som grund8. Dessa cellinjer har nackdelen att de förblir livskraftiga i bara några dagar när de odlas på ALI. Dessutom växer vissa av dessa cellinjer när de odlas under en period längre än 5 dagar. Slutligen saknar A549-celler funktionella snäva korsningar och kan därför inte bilda en tät barriär som behövs för att efterliknalungorna 9,10. Primära epitelceller kan vara ett bra alternativ för ALI-exponering eftersom de kan odlas vid ALI i veckor. Primärceller skiljer sig dock från parti till parti, är svårare att underhålla och dyrare jämfört med cellinjer, vilket gör dem mindre lämpliga för toxicitetstestning och screening. Vid jämförelse av olika humana bronkial epitelial cellinjer (16HBE, Calu-3, H292 och BEAS-2B), endast Calu-3 celler uppfyller alla kriterier som behövs för realistisk, upprepad ALI exponering: de förblir livskraftiga i veckor medan odlas vid ALI, ger en hög barriär integritet, inte överväxt, och är lätta att odla och upprätthålla. Calu-3 celler härstammar från en adenocarcinom och kan producera slem11,12. Det finns inkonsekvenser om cellerna kan utveckla cilia11,13. Calu-3 celler är också en lämplig modell för att studera respiratoriska syncytial virus (RSV) infektioner som infekterar ciliated luftvägarna epitelceller14.
Förutom cellmodellen används ett automatiserat exponeringssystem (AES) för luft-vätskeexponering föraerosoler 15,16. AES har fördelen att den använder ett kontinuerligt luftflöde för att utsätta cellmodellen för aerosoler. Detta står i kontrast till andra luft-vätskeexponeringssystem som vanligtvis använder relativt höga koncentrationer inom en kort tidsperiod som ett moln (dvs. droppar som innehåller partiklar som sätter sig snabbt)17,18,19. Dessa molnsystem återspeglar inte realistisk långsiktig exponering för låga koncentrationer av partiklar. Genom att tillämpa ett kontinuerligt luftflöde med hjälp av AES kan cellmodellen utsättas för en låg koncentration av partiklar under en längre tidsperiod, vilket återspeglar realistiska exponeringsförhållanden. En annan fördel jämfört med molnsystem är att AES har möjlighet att ansluta partikelkarakteriseringsinstrument, vilket möjliggör mätning av partikelstorlek, talkoncentration och massa över tid. En begränsning av AES är att den använder relativt höga luftflöden mellan 10 ml/min och 100 ml/min.
Protocol
1. Förbereda cellkulturmedium (CCM)
- Förbered en flaska på 500 ml minimalt essentiellt medium (MEM) kompletterat med glutamin.
- Tillsätt 5 ml penicillin-streptomycin (dvs. 100 U/mL penicillin och 100 μg/mL streptomycin).
- Tillsätt 5 ml icke-essentiella aminosyror (NEAA) lösning.
- Tillsätt 10 ml amphotericin B (tillval).
- Tillsätt 50 ml FBS (inaktiverad värme, följ ATCC-protokollet för värmeinaktivering; (https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guider/AnimCellCulture_Guide.ashx, sidan 19)).
2. Subkultur av Calu-3-celler
OBS: Calu-3-celler odlas i T75- eller T175-cellkulturkolvar vid 37 °C och 5 % CO2. Cellerna är passagede vid 60-80% confluency var 7: e dag med CCM förnyelse var 2-3 dagar. CCM hälls av och färsk CCM (T25 = 5 ml, T75 = 15 ml och T175 = 25 ml) placeras i kolven och kolven placeras tillbaka i inkubatorn. Celler bör passeras minst 2x efter upptining, före användning i experiment eller före frysning, och de bör inte passeras mer än 25x totalt.
- Kontrollera om kolven är 60–80 % konfluent genom att kontrollera under ett ljusmikroskop.
- Häll av CCM från kolven.
- Tvätta cellerna 2x med 5 ml 1x Hanks balanserade saltlösning (HBSS) utan kalcium och utan magnesium. Kassera HBSS efter varje tvätt. HBSS tar bort serum, vilket hämmar trypsin.
- Tillsätt 3 ml trypsin-EDTA för en T75 (4 ml för en T175) och placera kolven tillbaka i inkubatorn vid 37 °C och 5 % CO2 i 10–15 min. Kontrollera efter 10 min, se till att cellerna har lossnat från kolvens yta. Om cellerna odlas till >80% confluency, kommer de inte att lossna med trypsin 0,05% och trypsin 0,25% kan användas.
- Tillsätt 6 ml (d.v.s. dubbla den trypsin-EDTA-volym som ursprungligen tillsattes) CCM till kolven och gunga försiktigt kolvarna för att säkerställa korrekt blandning. Detta för att säkerställa att trypsin har neutraliserats av FBS i CCM och dess aktivitet på cellerna har stoppats. Om trypsin tillåts hålla kontakten med cellerna för länge kommer de inte att sättas tillbaka när de sätts in i en ny cellkulturkolv.
- Häll hela innehållet i kolven i ett 50 ml centrifugeringsrör.
- Centrifugera cellerna i 5 min vid 130 x g, vilket säkerställer att centrifugen är korrekt balanserad.
- Sätt tillbaka injektionsflaskan som innehåller cellerna till aseptiska förhållanden och ta försiktigt bort supernatanten utan att störa pelleten. Supernatanten kan hällas av och resten pipetted av, vilket säkerställer att pelleten inte störs.
- Återanvänd cellpelleten i 1 ml CCM genom att leda upp och ner tills alla celler är upphängda (dvs. inga pellets- eller cellagglomerater observeras). Ytterligare CCM kan tillsättas för att späda ut cellfjädringen.
- Räkna cellerna, både döda och levande, i 1 ml CCM med hjälp av en hemocytometer. Vid behov för korrekt räkning, späd cellerna i 3 eller 4 ml.
- Häng upp cellerna i den CCM-volym som krävs och tillsätt cellupphängningen i varje kolv. För att uppnå cirka 80% konfluens på en vecka, sådd 2 x 106 celler i en T75 eller 6 x 106 celler i en T175.
- Gunga försiktigt kolven och placera den sedan tillbaka i inkubatorn vid 37 °C och 5 % CO2.
- Ersätt med färsk CCM var 2–3:e dag och subkultur när cellerna når 60–80 % konfluens.
3. Sådd av Calu-3-celler på odlingsinsatser
OBS: Skär finns med olika porstorlekar. Små porstorlekar (t.ex. 0,4 μm) har fördelen att cellerna växer lättare och kan uppnå en bra barriär redan efter 5 dagars odling under nedsänkta förhållanden, mätt med Trans Epitelial Electrical Resistance (TEER). Men när de är intresserade av partikelflyttning är dessa porer för små och kommer att fånga partiklarna. Därför väljs vanligtvis större porstorlekar (t.ex. 3 μm) för att testa partiklar. Vid användning av en större porstorlek behöver cellerna längre tidsperioder (t.ex. 7–10 dagars odling under nedsänkta förhållanden) för att uppnå en bra TEER.
- Förbered cellfjädring med känd koncentration efter steg 2.1–2.10.
- Späd cellerna till en koncentration av 5 x 105 celler/ml i förvärmd CCM för 6 brunnsinsatser eller 2,5 x 105 celler/ml för 12 brunnsinsatser.
- Ta en cellkulturplatta med skär och placera under aseptiska förhållanden.
- Fyll den basolaterala sidan med 2 ml förvärmd CCM för 6 brunnsinsatser, eller 1 ml för 12 brunnsinsatser. När du lägger till kulturmediet tar du ut insatsen med pincett.
- Blanda försiktigt cellfjädringen genom att leda upp och ner. Pipett 1,0 ml för 6 brunnsinsatser och 500 μL för 12 brunnsinsatser (motsvarande 100 000 celler/cm2) på toppenav membranet i cellkulturinsatsen med 0,4 μm porer. För 3,0 μm porer, öka celltätheten till 128 000 cell/cm2.
- Täck cellkulturplattan och inkubera vid 37 °C och 5 % CO2.
- Byt CCM var 2–3:e dag.
- Låt cellerna bli konfluenta i 7 dagar under nedsänkta förhållanden innan de fortsätter att odla vid ALI.
- Mät TEER.
- Ta en Epitelial Voltohmmeter kompletterad med Chopstick Electrode Set och ladda batterisystemet över natten.
- Koppla bort Voltohmmetern från laddaren och anslut ätpinnarlektroden.
- Rengör elektroden med 70% etanol.
- Placera elektroden i CCM genom att placera den längre elektroden i det yttre odlingsmednet tills den vidrör botten av skålen och sätter den kortare elektroden i mediet utan att röra membranet.
- Börja med en tom insats utan celler. Vänta tills mätningen stabiliseras och skriv ner motståndet i Ohms. Denna mätning är skärmembranets motstånd utan celler (dvs. blankbeständighet).
- Upprepa mätningen för varje skär och subtrahera det tomma motståndet för att erhålla det sanna motståndet.
- För dataanalys multiplicerar du motståndsvärdena med skärytan till Ω x cm2. För en 6 brunnsinsats är ytan 4,67 cm2. Således, om ett motstånd på 600 Ohm mäts och bakgrunden är 120 Ohm, är motståndet 480 Ohm, som sedan multipliceras med ytan på 4,67 cm2 för totalt 2 241,6 Ohm x cm2. TEER bör vara >1 000 x Ω cm2 för att fortsätta.
- Ta bort CCM från den apatiska sidan av skären.
- Tillsätt 2 ml förvärmd CCM för 6 brunn och 1 ml för 12 brunnsinsatser på brunnens basolaterala sida (dvs. under cellkulturinsatsen). CCM ska vidröra membranet från botten, men inte läcka på toppen av insatsen.
- Vid denna tidpunkt exponeras celler apiskt för luft, vilket kallas odling vid ALI.
- Odlingsceller vid ALI i inkubatorn vid 37 °C och 5% CO2 i 7 dagar före exponering.
- Byt basolateral CCM var 2-3 dagar. Cellerna kan användas vid ALI i 6 veckor.
4. Förbereda exponeringsinställningen
OBS: Avsnitt 5–7 beskriver preparat för partikelexponering med hjälp av en automatiserad exponeringsstation (AES, se Materialförteckning ). Inställningen för partikelnebulisering och karakterisering är också kompatibel med andra ALI-exponeringssystem från andra tillverkare. Som ett exempel beskrivs exponeringen för partiklar nedan. Sådana system kan också användas för andra exponeringar, såsom sensibilisatorer, cigarettrök och dieselavgaser. Figur 1 visar AES och en exponeringsmodul. Figur 2 visar en schematisk representation av exponeringsinställningen, inklusive alla andra instrument.
- Anslut systemet till flera instrument för att mäta aerosolegenskaper innan du påbörjar en exponering med hjälp av AES. Dessa mäts i en sidoström strax innan aerosolerna kommer in i skåpet.
OBS: En flödesdelare används för att ansluta sidoströmmen till exponeringskaraktäriseringsutrustningen. I allmänhet används följande utrustning: scanning mobility particle sizer (SMPS), optical particle sizer (OPS), condensation particle counter (CPC), avsmalnande element oscillerande mikrobalans (TEOM). SMPS- och OPS-mätningarna utförs 1x per timme och använder samma slangar från flödesdelaren. CPC och TEOM utför kontinuerlig mätning och data från båda loggas på en Ekorremodell 2020 datalogger. Dessutom bestäms den gravimetriska masskoncentrationen med hjälp av en mikrobalans i kontrollerad relativ luftfuktighet (40–70 %) och temperaturförhållanden (21–23 °C). Teflonfilter vägs före och efter varje exponering för att bekräfta exponeringskoncentrationen. För att fånga avgaserna används ett HEPA-filter. Installationen inklusive konstruerade nanomaterialupphängningar (ENM) och nebulisator placeras alla i ett flödesskåp för att förhindra exponering för människor. AES kan användas för att testa många olika typer av ENMs, inklusive metaller och metalloxider. - Förbered en nanomaterialupphängning strax före exponering. Vanligtvis förbereds en 1% suspension som en lagerlösning. Till exempel suspendera 100 mg nanomaterial i 10 ml rent vatten.
OBS: För DQ12-exponering används 300 mg för att uppnå ca 2 μg/cm2. Detta belopp kan användas vid en enda exponering eller delas upp över upprepade exponeringar (t.ex. suspenderas 300 mg i 30 ml för en enda exponering eller 21, 5 mg suspenderas i 2, 15 ml färskt varje dag under 3 veckors upprepad exponering). Suspensionen bereds ny på varje exponeringsdag. Partikelupphängningen är sonikerad i 16 minuter med sond ultraljudsbehandling. Volymen av 1% lagerlösning justeras till en total volym på 100 ml genom tillsats av rent vatten. - Lägg ENM-fjädringen i en liten flaska med lock och magnetomrörare för att förhindra sedimentering av partiklarna. Anslut flaskan till en peristaltisk pump via ett litet rör och justera flödet till 25 ml/h.
- Anslut den peristaltiska pumpen till ett sprutmunstycke och justera inställningarna för att möjliggöra kontinuerlig aerosolisering.
- Sprutmunstycket är monterat på ett 60 cm långt aluminiumrör (blandningskammare, diameter 15 cm, uppvärmd till 60 °C). Installationen ansluts till AES via ett 1,5 meter långt kopparrör (diameter 15 cm). Ovanpå AES tar en slagkraft bort alla aerosoler större än 2,5 μm.
- Anslut sprutmunstycket till 3 bar tryckluft genom två massflödesregulatorer (MFC) för att möjliggöra nebulisering av fjädring. Ett flöde på 14 L/min används för sprutmunstycket, det andra MFC för blandning av luften i röret.
- Dagen före exponeringens början slår du på AES för att skåpet ska kunna nå en temperatur på 37 °C.
- Slå på luftflödet och luftfuktigheten i skåpet 2 timmar före exponeringens början för att nå 85% luftfuktighet. Slå på uppvärmningen av de exponeringskammare där skären med cellerna kommer att placeras.
- Slå på kvartsmikrobalansen (QCM) och ställ in det ursprungliga värdet på 0 med hjälp av programvaran. Börja logga. Var 10:e s mäts massan och uttrycks som ng/cm2.
- Värm cellkulturmedierna till 37 °C i ett vattenbad (~20–30 min).
5. Förbereda Calu-3-celler för exponering
OBS: För en typisk ALI-exponering med AES behövs 15–20 skär med ett sammanflödescellsskikt. Dessa består av 3 renluftsreglage, 3 inkubatorkontroller som kommer att hanteras på samma sätt som de andra skären utan exponering i AES, 6–8 skär för aerosolexponering (beroende på användningen av 0, 1 eller 2 mikrobalanser), 1–3 skär för kontrollmätningar (t.ex. maximal LDH-frisättning) och 3 extra skär om TEER för vissa av skären inte är tillräckligt. Cellerna ska ha en TEER på >1 000 Ω x cm2 för att fortsätta.
- På den första exponeringsdagen tvättar du cellerna 1x med CCM, kontrollerar cellmorfologi och mäter TEER för cellmodellen med hjälp av en Voltohmmeter. Cellerna ska bilda ett tätt monoskikt utan luckor.
- Sätt 2 ml/1 ml HEPES buffrad CCM utan FCS till den basolaterala sidan av 6 brunn/12 brunnsplattor och överför odlingsinsatserna med celler till de nya plattorna.
OBS: Under exponeringen finns ingen CO2 i AES. Därför används HEPES buffrat odlingsmedium (25 mM HEPES) under transport och exponering. Detta medium används för både de exponerade cellerna i AES samt inkubatorkontrollcellerna. - Om tiden för att transportera cellkulturerna till AES är mer än 5 minuter, lägg cellerna i en bärbar inkubator på 37 °C under transporten.
6. Hantering av AES under en exponering
- Vid AES, fyll exponeringsmodulerna med HEPES-buffrad CCM utan fetalt kalvserum (FCS). Mängden CCM beror på vilken enhet som används och vilken typ av cellkultur som infogas. Tänk på att för att hålla celler vid ALI bör mediet nå botten av membranet, men bör inte läcka ovanpå membranet. Vid användning av 6 brunnsinsatser, tillsätt 6 ml HEPES-buffrad CCM till exponeringsmodulerna.
- Överför skären med celler från plattorna till exponeringsmodulerna med sterila pincett. Kontrollera att det inte finns några luftbubblor på cellernas basolaterala sida och ta bort eventuell CCM på den apatiska sidan av skären. Om det finns några luftbubblor på den basolaterala sidan, vrid försiktigt inläggen med hjälp av de sterila pincetterna tills de tas bort. Förvara plattorna som innehåller CCM i en inkubator för överföring efter exponering.
- Använd pekskärmsdisplayen för att välja exponeringstid, luftflödeshastighet och elektrostatisk depositionsförbättring. Displayen kan också användas för att kontrollera luftfuktighet och temperatur. Vanligtvis väljs en exponeringstid på 4 timmar, med en flödeshastighet på 50 ml/min på skären vid 37 °C och 85% luftfuktighet.
OBS: Modulerna på den första nivån (figur 1) används för exponering för ren luft. skär i denna nivå används som rena luftexponeringskontroller. De andra modulerna på andra och tredje nivån kan användas för aerosolexponering, inklusive två moduler för kvartskristallmikrobalanser (QCM) för att mäta nedfall online. - Läckageprovningen bör utföras innan exponeringen påbörjas. Läckaget måste vara mindre än 5 ml/min. Följ anvisningarna på AES-displayen. När läckagetestet är klart kan exponeringen startas. Vid läckage bör slangen kontrolleras.
- I slutet av exponeringen öppnar du dörren till en AES-modul, öppnar exponeringsmodulerna, placerar cellkulturinsatserna tillbaka till cellkulturplattorna och överför plattorna till den bärbara inkubatorn.
- Samla in mediet från modulerna (dvs. exponerade prover) och från plattorna (dvs. inkubatorkontroller) för senare analys, såsom laktatdehydrogenasmätning (LDH).
- Tillbaka på cellkulturlabbet, överför cellkulturinsatserna till plattor fyllda med färsk standard CCM. Lägg cellkulturplattorna i inkubatorn tills nästa exponering eller tills analysen.
- Efter den sista exponeringsdagen lägger du skären i inkubatorn till nästa dag.
- Dagen efter den slutliga exponeringen lägger du till CCM på den apatiska sidan för att mäta TEER med hjälp av en Voltohmmeter. Samla både apical och basolateral CCM separat för analys av cytokiner.
- Ta bort all CCM och utför en cell livsduglighetsanalys genom att till exempel lägga till ett spridningsreagens på den apatiska sidan.
7. Rengöring av AES
- Fyll exponeringsmodulerna med vatten, vänta i 1 minut och ta bort vattnet. Fyll sedan modulerna med 70% etanol, lämna den i 10 minuter och ta bort etanolen. Rengör exponerings trumpeterna också med 70% etanol.
- Stoppa 85% fuktkontroll, men lämna temperaturen på skåpet vid 37 °C för nästa experiment.
Representative Results
Denna artikel ger en metod för odling och exponering av mänskliga bronkial epitelceller vid ALI som efterliknar realistiska, upprepade inandningsexponeringsförhållanden som kan användas för toxicitetstestning. Egenskaper hos både cellmodellen och exponeringssystemet är avgörande för att uppnå en realistisk inhalationsexponeringsmodell som kan användas för upprepade exponeringar. Resultaten på dessa egenskaper visas nedan.
Cellmodellkrav och markering
Vid val av lämplig cellmodell skall följande egenskaper beaktas:
- Cellmodellen ska kunna bilda ett sammanflöde av monoskikt med fungerande snäva korsningar för att efterlikna lungbarriären.
- Cellmodellen bör visa optimal prestanda när den utsätts upprepade gånger för konditionerad luft (temperatur och luftfuktighet).
- Cellmodellen ska svara på en exponering.
Denna studie började med fyra olika mänskliga bronkial epitelial cellinjer: 16HBE, Calu-3, H292 och BEAS-2B. Dessa används alla i stor utsträckning för toxicitetstestning av nanomaterial och kemikalier. Av de fyra cellinjerna uppfyllde endast Calu-3-cellerna alla ovanstående krav. Cellerna bildade ett monoskikt med snäva korsningar (figur 3) som förblev en stabil barriär över tiden mätt med TEER, medan de andra cellinjerna antingen inte utgjorde en barriär eller visade en minskning av barriärfunktionen när de odlades vid ALI (figur 4). Dessutom tenderade H292 och BEAS-2B att växa till flera celllager när de odlades under en längre tidsperiod. Traditionell nedsänkt cellodling och ALI-odling skilde sig kraftigt, eftersom vid ALI var näringsämnen endast tillgängliga från den basolaterala sidan och cellerna utsattes för torra förhållanden på den apatiska sidan. Dessa tillstånd kan orsaka stress för cellmodellerna, vilket kan observeras genom att mäta cellens livskraft över tid. Cellinjerna 16HBE, H292 och BEAS-2B visade alla en ökad LDH-frisättning när de odlades vid ALI, medan Calu-3-celler endast visade en liten LDH-frisättning (figur 5).
Därefter testades svaret från Calu-3-modellen på ämnen. Som ett positivt kontrollämne administrerades LPS via nebulisering till den apatiska sidan av modellen. Den deponerade dosen var 0,25 μg/cm2. Calu-3-cellerna visade en reaktion på lipopolysackarid (LPS) genom en ökning av LDH-frisättningen och tumörnekrosfaktor alfa (TNF- α) frisättning (figur 6).
Slutligen exponerades Monolayer Calu-3 för kvarts kiseldioxid (DQ12) nanomaterial (IOM, Edinburgh). Kristallin kiseldioxid kan inducera kiseldioxid och kan också orsaka lungtumörer. Därför har Internationella byrån för cancerforskning (IARC) klassificerat kristallin kiseldioxid som ett humant cancerframkallande ämne i grupp I20. Verkningsmekanismen för kristallin kiseldioxid tros vara via induktion av ihållande inflammation orsakad av dess reaktiva yta21,22,23. Flera in vivo-studier på både råttor och möss rapporterar induktion av inflammation och histopatologiförändringar, inklusive tumörer och fibros, efter inandningsexponering för kristallinkiseldioxid 24,25,26,27,28,29. Dessa effekter observeras alla efter upprepad exponering och/eller långsiktig uppföljning. Calu-3-modellen användes för att undersöka om observationerna från in vivo-studierna kunde efterliknas med hjälp av en in vitro-modell som kunde exponeras upprepade gånger vid ALI.
Calu-3 celler exponerades i 3 på varandra följande veckor, 5 dagar per vecka, 4 h per dag till DQ12. Den deponerade dosen mättes med hjälp av en QCM. Den genomsnittliga deponerade dosen var 120 ng/cm2 per dag, med en kumulativ dos på 1,6 μg/cm2, liknande de doser som inducerar en effekt in vivo. Andra partikelegenskaper visas i tabell 1. Efter 3 veckors exponering inducerade DQ12 inga signifikanta effekter i TEER, cellens livskraft och monocyt kemoattraktivt protein 1 (MCP- 1) frisättning, jämfört med renluftskontrollerna (figur 7). Eftersom mer toxicitet för DQ12 förväntades baserat på in vivo-data kontrollerades partiklarnas reaktivitet med hjälp av en acellulär analys enligt det protokoll som optimerats inom EU-projektet GRACIOUS (slutbar 5.3). Reaktiviteten hos DQ12-partiet var lägre än väntat (figur 8), storleksordningarna lägre jämfört med de positiva kontrollpartiklarna kolsvart (CB). Denna brist på reaktivitet kan förklara frånvaron av ett toxicitetssvar i Calu-3-modellen.
Figur 1: Den automatiska exponeringsstationen (AES).
Den vänstra figuren visar skåpets utsida med pekskärmen. AES har tre nivåer med exponeringsmoduler: den översta nivån för exponering av ren luft och mitten- och bottennivån för aerosolexponeringar. Den högra figuren visar exponeringsmodulen där skär med celler placeras. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Schematisk representation av exponeringsinställningen.
Från vänster till höger: 1) ENM-fjädringen ansluten till sprutmunstycket via en peristaltisk pump; 2) Med tryckluft nebuliserar sprutmunstycket ENM-fjädringen och via en blandningskammare leds aerosolerna till AES; 3) Strax innan du går in i AES är aerosolkarakteriseringsinstrument anslutna: SMPS, OPS, CPC och TEOM. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Representativ bild av Calu-3-celler efter odling vid det luft-flytande gränssnittet (ALI) i 10 dagar.
Fluorescens mikroskopi bild av Calu-3 celler efter odling vid ALI i 10 dagar. Tätt kopplingsprotein ZO-1 är färgat i grönt, cellkärnorna är färgade i blått. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Transepithelial elektrisk resistans (TEER) av fyra olika cellinjer under en kulturperiod på 21 dagar.
TEER-värdena 16HBE, Calu-3, H292 och BEAS-2B när de odlas i 21 dagar: de första 7 dagarna nedsänkta, följt av 14 dagar vid ALI. TEER-värden korrigerades för skärens bakgrundsbeständighet och multiplicerades med skärytan. Symbolerna och felstaplarna representerar medelvärdet och standardavvikelsen för sex skär. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: LDH-frisättning av fyra olika cellinjer under en kulturperiod på 21 dagar.
LDH release av 16HBE, Calu-3, H292 och BEAS-2B när odlas i 21 dagar: 7 dagar nedsänkt, följt av 14 dagar vid ALI. LDH-värdena som visas är relativa till den maximala LDH-frisättningen per celltyp. Symbolerna och felstaplarna representerar medelvärdet och standardavvikelsen för fem skär. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: Cellulära effekter i Calu-3-celler som exponeras för LPS.
Calu-3 celler exponerades via moln nebulization till 0,25 μg/cm2 LPS. a)WST-1-konverteringen. (B) LDH-frisättning. C)TNF-α efter LPS-exponering. Symbolerna och felstaplarna representerar medelvärden och standardavvikelser för tre skär. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7: Cellulära effekter i Calu-3-celler som exponeras för DQ12 nanomaterial.
Calu- 3 celler exponerades i 3 veckor (4 h per dag, 5 dagar per vecka) för DQ12 nanomaterial, ca 120 ng/cm2 per dag, kumulativ dos på 1,6 μg/cm2. A)TEER-värden. (B) LDH-frisättning. (C) MCP-1 release efter DQ12 exponering. Alla symboler och felstaplar representerar medelvärden och standardavvikelser för tre skär för kontrollerna och sex skär för DQ12-exponeringen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 8: Acellulär reaktivitet hos DQ12.
DQ12 inkuberades med en 2ʹ,7ʹ-Dichlorofluorescein Diacetate (DCFH-DA) sond för att upptäcka dess ytreaktivitet. Som en positiv kontroll inkluderades kolsvarta (CB) partiklar. Jämfört med CB har DQ12 mycket låg yt reaktivitet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Partikelmassa (μg/m3) | Partikelnummer (#/cm3) | Partikelstorlek för rörlighet (nm) | Geometrisk standardavvikelse | Optisk partikelstorlek (μm) |
| 2969 (418) | 83983 (10215) | 66.6 | 2.5 | 1.1 (1.3) |
Tabell 1: Exponeringsegenskaper för DQ12. Värden visas som medelvärden med standardavvikelse inom parentes.
Discussion
Detta dokument beskriver en metod för odling av mänskliga bronkial epitelceller under ALI och exponera denna bronkial modell för aerosoler eller gaser. Fördelen med att använda Calu-3-celler är att de bildar snäva korsningar, förblir ett monoskikt, kan motstå luftflödet och kan odlas i veckor vid ALI, till skillnad från många andra celltyper (t.ex. 16HBE, H292 och BEAS-2B). Att använda VITROCELL® automatiserad exponeringsstation (AES) har fördelen att cellerna kan exponeras under realistiska och relevanta förhållanden eftersom låga koncentrationer kan appliceras med hjälp av ett kontinuerligt luftflöde.
Fortsatta flödessystem, som AES, har fördelar jämfört med att använda molnsystem3,32, som använder en enda nebulisering av en suspension. Det kontinuerliga flödet är mer realistiskt och många variabler som flödeshastighet, luftfuktighet och temperatur styrs. Dessutom kan depositionen förbättras med hjälp av ett elektriskt fält. Slutligen övervakas aerosolegenskaper som storlek, nummerkoncentration och massa online. En nackdel är att fortsatta flödessystem är mer komplexa jämfört med molnsystem. Därför är det viktigt att köra förberedande experiment som fokuserar på aerosolens partikelegenskaper och den levererade dosen på insatsen. Den initiala startkoncentrationen av partiklarna och AES-inställningarna kan sedan justeras för att uppnå önskad dos på cellerna33. Beroende på vilken typ av partiklar som testas kan aerosolgenereringsmetoden skilja sig åt. Användningen av elektrostatisk nedfall beror på partikeltypen och fungerar bäst för metallpartiklar. För partiklar med en positiv ytladdning bör ett negativt elektrostatiskt fält appliceras och vice versa.
Val av exponeringskoncentrationer kan vara svårt för alla luft-vätskeexponeringsexperiment. För DQ12-exponeringarna var målet att uppnå en total kumulativ dos på 1 μg/cm2 efter 3 veckors exponering, 5 dagar per vecka, 4 timmar per dag. Denna dos liknar doser som inducerade en effekt in vivo21,25,27,32,33. När exponeringarna utfördes fanns det en viss variation mellan olika exponeringsdagar. Även om den faktiska deponerade dosen på 1,6 μg/cm2 är högre än den 1 μg/cm2 som siktades på, kan dosen ha varit för låg för att observera effekter i Calu-3-modellen. Endast mindre skillnader i TEER, livskraft och cytokinsvar observerades mellan exponeringen för ren luft och DQ12-exponeringen, och dessa skillnader var inte statistiskt signifikanta. En förklaring till observationen att DQ12 exponering i 3 veckor inte inducera betydande effekter i Calu-3 celler är att makrofager saknades från Calu-3 modellen. Eventuellt, efter DQ12 upptag makrofager producerar proinflammatory cytokiner som kan påverka Calu-3 celler. En annan förklaring är att DQ12-partiet som användes för experimenten inte var så reaktivt som förväntat. Vid användning av LPS som positivt kontrollämne visar Calu-3 ett svar, mätt med en ökning av LDH-frisättningen och en ökning av TNF-α frisättning. Detta indikerar att modellen kan upptäcka toxicitet.
Calu-3-cellmodellen har många fördelar, vilket diskuteras i resultatavsnittet. Dessutom, när odlas under en längre tid vid ALI, kan Calu-3-cellerna växa cilia / cilia-liknande strukturer13 och producera slem11,12,13. Trots dessa fördelar har modellen begränsningar med avseende på dess fysiologiska relevans. Calu-3-cellinjerna härstammar från ett adenocarcinom, medan 16HBE och BEAS-2B härstammar från frisk vävnad. Tyvärr är de två sistnämnda inte lämpliga för upprepad ALI-exponering eftersom de inte förblir ett stabilt monoskikt över tiden. En annan begränsning av Calu-3-modellen är att den bara representerar en enda celltyp. I den mänskliga lungan finns flera celltyper som interagerar och reagerar olika på exponering. Inhalerade partiklar kommer att deponeras i olika delar av lungorna beroende på deras aerodynamiska storlek. Det är här partiklarna kommer i kontakt med epitelcellbarriären, som efterliknas av Calu-3-modellen. I den mänskliga lungan lockas alveolära makrofager till partiklarna, uppslukar dem och rensar dem från lungorna. Makrofager spelar också en viktig roll i inflammationssvaret på partikelexponering. Därför görs ansträngningar för att utöka Calu-3-modellen genom att lägga till primära makrofager för att efterlikna lungbarriären närmare. Nackdelen med makrofagerna är att de förblir livskraftiga endast i ca 7 dagar när de odlas ovanpå Calu-3-celler vid ALI. Därför bör makrofager läsas varje vecka för att omvandla den nuvarande Calu-3-modellen till en kokulturmodell. Optimeringen av kokulturprotokollet pågår för närvarande.
Mot denna ovan är Bronkialmodellen Calu-3 en lämplig modell för upprepad exponering för aerosoler av delvis lösliga ämnen som kemikalier från cigarettrök och LPS. Dessa lösliga ämnen inducerar betydande ökningar av cytokinsvaren i Calu-3-cellerna. För att testa olösliga partiklar som dieselavgaser och DQ12 behövs en kokulturmodell, eftersom makrofagerna spelar en avgörande roll för induktion av effekter genom partikelexponering.
För de beskrivna exponeringarna användes skärmembran med 3,0 μm porer. Det främsta skälet till att välja denna typ av insats är att det är möjligt att testa flyttning av nanomaterial. Vid användning av mindre 0,4 μm porstorlek kommer partikelagglomerat inte att kunna korsa insatsmembranet. Nackdelen med att använda en stor porstorlek är att cellerna behöver längre tid för att växa sammanflöde och att det är svårare att visualisera cellernas morfologi med hjälp av ljusmikroskopi. Om du vill kontrollera att cellerna bildar ett sammanflöde av monoskikt bör TEER vara >1 000 Ω x cm2 innan en exponering påbörjas.
Sammantaget är Calu-3 bronkialmodellen som presenteras här lämplig att använda för upprepad exponering för aerosoler, minst upp till 3 veckor. Modellen tål att odlas och exponeras via ett kontinuerligt luftflöde och kan upptäcka toxicitet för bronkialt epitel.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansieras av EU-projektet PATROLS (Physiologically Anchored Tools for Realistic nanomaterial hazard aSsessment) och det nederländska ministeriet för hälsa, välfärd och idrott (projekt V/050012). Vi vill tacka Dr. Yvonne Staal och Dr. Jan van Benthem för att de kritiskt granskat manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01 M NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
| 0.1M (x10) PBS | Gibco | 14200-059 | |
| 2’,7’-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA) | Sigma Aldrich | D6883 | |
| 3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride) | Abcam | ab141525 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15290 | |
| Automated exposure station | Vitrocell | ||
| Cell proliferation reagent WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| CPC | TSI inc., St Paul MN, USA | 3022 | |
| Cytotoxicity detection kit LDH | Roche | 11644793001 | |
| DQ12 | IOM | nanomaterials | |
| ELISA Ready-SET-Go | Fischer Scientific | 88-8086-86, 88-7399-88 | |
| EVOM2 | World Precision Instruments Inc., FL, USA | EVOM2-STX2 | |
| FBS | Greiner bio-one | 758093 | |
| Flow splitter | TSI inc., St Paul MN, USA | model 3708 | |
| Fluorescein diacetate (F-DA) | Sigma Aldrich | F7378 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific Inc. | 14175 | |
| Light microscope | Olympus | CKX41 | |
| Mass flow controllers | MFC, Bronkhorst, the Netherlands | ||
| Methanol (analytical grade) | Sigma Aldrich | 34860 | |
| Microbalance | Sartorius, Goettingen, Germany | ME-5 | |
| Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific Inc. | 41090 | |
| NEAA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140 | |
| OPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3339 | |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15140 | |
| Phenol red free MEM | Gibco | 10500-064 | |
| Pure water | Merck | MilliQ | |
| SMPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3936 | |
| Spray nozzle | Schlick, Coburg, Germany | ||
| Teflon filters | Pall | R2PJ46 | |
| TEOM | Rupprecht & Patashnick NY, USA | series 1400 | |
| Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific Inc. | 690175, 658175, 660175 | |
| Transwell inserts | Corning | 3460, 3462 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 25300 | |
| Tryptan Blue | Sigma Aldrich | T8154 |
References
- Geiser, M., Jeannet, N., Fierz, M., Burtscher, H. Evaluating Adverse Effects of Inhaled Nanoparticles by Realistic In Vitro Technology. Nanomaterials (Basel). 7 (2), 49 (2017).
- Herzog, F., et al. Mimicking exposures to acute and lifetime concentrations of inhaled silver nanoparticles by two different in vitro approaches. The Beilstein Journal of Nanotechnology. 5, 1357-1370 (2014).
- Lenz, A. G., et al. A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposure and application to zinc oxide nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 6, 32 (2009).
- Paur, H. R., et al. In-vitro cell exposure studies for the assessment of nanoparticle toxicity in the lung-A dialog between aerosol science and biology. Journal of Aerosol Science. 42 (10), 668-692 (2011).
- Lacroix, G., et al. Air-Liquid Interface In Vitro Models for Respiratory Toxicology Research: Consensus Workshop and Recommendations. Applied in vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).
- Loret, T., et al. Air-liquid interface exposure to aerosols of poorly soluble nanomaterials induces different biological activation levels compared to exposure to suspensions. Particle and Fibre Toxicology. 13 (1), 58 (2016).
- Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses. Critical Care Research and Practice. 2010, (2010).
- Braakhuis, H. M., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives in Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
- Ren, H., Birch, N. P., Suresh, V. An Optimised Human Cell Culture Model for Alveolar Epithelial Transport. PLoS One. 11 (10), 0165225 (2016).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Papazian, D., Wurtzen, P. A., Hansen, S. W. Polarized Airway Epithelial Models for Immunological Co-Culture Studies. International Archives of Allergy and Immunology. 170 (1), 1-21 (2016).
- Jeong, M. H., et al. In vitro model for predicting acute inhalation toxicity by using a Calu-3 epithelium cytotoxicity assay. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 98, 106576 (2019).
- Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmacology Research. 23 (7), 1482-1490 (2006).
- Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection. Journal of Virological Methods. 174 (1-2), 144-149 (2011).
- Vitrocell. Vitrocell® Automated Exposure Station. , Available from: https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/automated-exposure-station1 (2019).
- Mülhopt, S., et al. Toxicity testing of combustion aerosols at the air-liquid interface with a self-contained and easy-to-use exposure system. Journal of Aerosol Science. 96, 38-55 (2016).
- Vitrocell. VITROCELL® Cloud for the exposure to liquid aerosols. , Available from: https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/vitrocell-cloud-system (2019).
- Endes, C., et al. An in vitro testing strategy towards mimicking the inhalation of high aspect ratio nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), 40 (2014).
- Lenz, A. G., et al. Efficient bioactive delivery of aerosolized drugs to human pulmonary epithelial cells cultured in air-liquid interface conditions. Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (4), 526-535 (2014).
- Borm, P. J., Tran, L., Donaldson, K. The carcinogenic action of crystalline silica: a review of the evidence supporting secondary inflammation-driven genotoxicity as a principal mechanism. Critical Reviews in Toxicology. 41 (9), 756-770 (2011).
- Borm, P. J. A., Fowler, P., Kirkland, D. An updated review of the genotoxicity of respirable crystalline silica. Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 23 (2018).
- Kawasaki, H. A mechanistic review of silica-induced inhalation toxicity. Inhalation Toxicology. 27 (8), 363-377 (2015).
- Sayes, C. M., et al. Changing the dose metric for inhalation toxicity studies: short-term study in rats with engineered aerosolized amorphous silica nanoparticles. Inhalation Toxicology. 22 (4), 348-354 (2010).
- Driscoll, K. E., et al. Pulmonary response to inhaled silica or titanium dioxide. Toxicology and Applied Pharmacology. 111 (2), 201-210 (1991).
- Muhle, H., Kittel, B., Ernst, H., Mohr, U., Mermelstein, R. Neoplastic lung lesions in rat after chronic exposure to crystalline silica. Scandinavian Journal of Work, Environment and Health. 21, Suppl 2 27-29 (1995).
- Peeters, P. M., et al. Silica-induced NLRP3 inflammasome activation in vitro and in rat lungs. Particle and Fibre Toxicology. 11, 58 (2014).
- Reuzel, P. G., Bruijntjes, J. P., Feron, V. J., Woutersen, R. A. Subchronic inhalation toxicity of amorphous silicas and quartz dust in rats. Food and Chemical Toxicology. 29 (5), 341-354 (1991).
- Arts, J. H., Muijser, H., Duistermaat, E., Junker, K., Kuper, C. F. Five-day inhalation toxicity study of three types of synthetic amorphous silicas in Wistar rats and post-exposure evaluations for up to 3 months. Food and Chemical Toxicology. 45 (10), 1856-1867 (2007).
- Cho, W. S., et al. Inflammatory mediators induced by intratracheal instillation of ultrafine amorphous silica particles. Toxicology Letters. 175 (1-3), 24-33 (2007).
- Herzog, F., et al. Exposure of silver-nanoparticles and silver-ions to lung cells in vitro at the air-liquid interface. Particle and Fibre Toxicology. 10 (1), 11 (2013).
- Mülhopt, S., Diabate, S., Krebs, T., Weiss, C., Paur, H. R. Lung toxicity determination by in vitro exposure at the air liquid interface with an integrated online dose measurement. Journal of Physics: Conference Series. 170, 012008 (2009).
- van Ravenzwaay, B., et al. Comparing fate and effects of three particles of different surface properties: nano-TiO(2), pigmentary TiO(2) and quartz. Toxicology Letters. 186 (2), 152-159 (2009).
- Henderson, R. F., et al. A comparison of the inflammatory response of the lung to inhaled versus instilled particles in F344 rats. Fundamental and Applied Toxicology. 24 (2), 183-197 (1995).
