Summary
Målet med denne artikkelen er å gi en standardisert tilnærming for å indusere menneskelig levergenitordifferensiering fra pluripotente stamceller. Utviklingen av denne prosedyren med bruksklare medieformuleringer gir brukeren et facile-system for å generere menneskelige leverceller for biomedisinsk forskning og oversettelse.
Abstract
Leversykdom er et eskalerende globalt helseproblem. Mens levertransplantasjon er en effektiv behandlingsmåte, har pasientdødeligheten økt på grunn av mangel på donororgantilgjengelighet. Organmangel påvirker også rutinemessig tilførsel av menneskelige hepatocytter for grunnleggende forskning og klinikken. Derfor er utviklingen av fornybare kilder til humane leverforfederceller ønskelig og er målet med denne studien. For å kunne effektivt generere og distribuere menneskelige leverforfedre i stor skala, ble det utviklet et reproduserbart hepatisk stamcelledifferensieringssystem. Denne protokollen hjelper eksperimentell reproduserbarhet mellom brukere i en rekke cellekulturelle formater og tillater differensieringer ved hjelp av både humane embryonale og induserte pluripotente stamcellelinjer. Dette er viktige fordeler i forhold til dagens differensieringssystemer som vil forbedre grunnforskningen og kan bane vei for klinisk produktutvikling.
Introduction
Leversykdom representerer en global helseutfordring, forårsaker ca 2 millioner dødsfall per år over hele verden1. Selv om det finnes en rekke modellsystemer for å studere leversykdommer og gripe inn klinisk, er rutinemessig bruk av cellebaserte systemer begrenset av betydelige ulemper (for en gjennomgang se Szkolnicka et al.2). Avansert human pluripotent stamcelle (hPSC) kultur og somatiske celle differensieringsmetoder representerer lovende teknologier for å utvikle verktøy for grunnleggende biomedisinsk forskning og fornybare kilder til differensierte celler for klinikken3,4.
Til dags dato er flere protokoller for hepatocyttlignende celle (HLC) differensiering utviklet5,6,7,8. Disse protokollene forsøker å gjenskape aspekter av menneskelig leverutvikling ved hjelp av en kombinasjon av små molekyler og vekstfaktorer9,10. De fleste protokoller består av en trinnvis differensieringsprosess, der hPSCer er primet til definitiv endoderm, etterfulgt av hepatisk stamcellespesifikasjon11,12,13og slutter med HLC-spesifikasjon. HLCer produsert av disse protokollene viser en blanding av foster og voksne fenotyper. Dette inkluderer uttrykket av alfafetokprotein (AFP), for eksempel hepatocyttmarkører som HNF4α og albumin (ALB), samt legemiddelmetaboliseringskapasitet14,15,16. Mellom laboratorier kan HLC-differensiering variere; Derfor er utviklingen av standardiserte protokoller nødvendig. Dette vil gjøre det mulig for forskere å effektivt generere og anvende stamcelleavledede HLCer i stor skala for grunnleggende og klinisk forskning.
Et hepatisk stamcelledifferensieringssystem ble utviklet som kan brukes på både humane embryonale og induserte pluripotente stamcellelinjer ved hjelp av enkle å følge retningslinjer. Denne prosedyren gir homogene populasjoner av leverforfedere i forskjellige kulturvareformater, alt fra cellekulturflasker til 96 brønnplater. Nedenfor er protokollen for å produsere stamcelleavledede leverforfedere i 24 og 96 brønnformater.
Celletettheten som brukes i protokollen som presenteres nedenfor, er spesifisert for en brønn på henholdsvis 24 og 96 brønnplater (se tabell 1). Optimalisering av startcellenummeret kreves for de forskjellige cellekulturplateformatene og cellelinjene. Foreslått startcelletetthet for protokolloptimalisering er 2 x 105 celler/cm2. For tetthetsoptimalisering kan flere celletettheter testes ved å legge til ± 50 000 celler/cm2 om gangen.
Protocol
1. Humant pluripotent stamcelle (hPSC) vedlikehold på laminin-521
- Vedlikehold humane pluripotente celler (hPSC) ved 37 °C og 5 % CO2 i en 6 brønnplate på laminin-521 (LN-521). Fôr cellene daglig med 2 ml stamcellevedlikeholdsmedium (dvs. mTeSR1 medium) per brønn på en 6 brønnplate opp til den valgte sådddagen for differensiering (dag 0).
- Forsikre deg om at ønsket cellesamstrømning på 70-80% oppnås før cellehøsting.
2. Laminin-521 multiwell forberedelse og hPSC såing for differensiering
MERK: For hPSCer som ikke vedlikeholdes på LN-521 (f.eks. matrigel eller fibronectin), del hPSCer på LN-521 og kultur i 1 uke før passaging og fremkalle differensiering for å forbedre effektiviteten av prosessen15,17,18.
- Lamininbelagt plateforberedelse
- Tine et hetteglass med rekombinant LN-521 (100 μg/ml) ved 4 °C i 2 timer eller over natten.
- Forbered en 8 μg/ml-løsning ved å fortynne den opptinte LN-521 i iskald 1x DPBS med Ca2+/Mg2+.
- Tilsett 0,25 ml av 8 μg/ml LN-521-oppløsningen til hver brønn på en 24 brønnplate eller 0,05 ml til hver brønn på en 96 brønnplate. Gyng platen forsiktig fra side til side for å belegge brønnene jevnt med LN-521-oppløsningen.
MERK: For 96 brønnplateformat kan volumdispensering, cellesåing og middels endringer utføres ved hjelp av en halvautomatisk rørledning. For mer informasjon se Meseguer-Ripolles et al.19. - Forsegle de LN-521 belagte platene med en halvgjennomsiktig, fleksibel film og oppbevar den ved 4 °C over natten før bruk.
MERK: LN-521 belagte plater kan brukes i opptil 2 uker når de oppbevares ved 4 °C. Unngå tørking av de lamininbelagte brønnene.
- På dagen for cellesåingen varmes opp de forhåndsbelagte platene i en cellekulturinkubator ved 37 °C i 30–60 minutter.
- Aspirer LN-521-løsningen.
MERK: Unngå direkte kontakt med aspiratoren med bunnen av brønnen for å unngå skade på LN-521-belegget. - Dispenser 0,5 ml stamcellevedlikeholdsmedium med nysupplert 10 μM Rho-assosiert kinase (ROCK)-hemmer Y27632 til hver brønn på en 24 brønnplate eller 0,05 ml til hver brønn på en 96 brønnplate. Plasser platen i inkubatoren til den er klar for cellesåing.
- På den planlagte sådddagen (dag 0) og med en hPSC-sammenheng mellom 70-80%, markerer du alle regioner med spontan differensiering på bunnen av brønnene på 6 brønnplaten.
MERK: Spontan differensiering kan visualiseres ved en grov endring i cellestørrelsen og/eller tilstedeværelsen av forskjellige cellemorfologier ved hjelp av fasekontrastmikroskopi. - Aspirer og kast de merkede områdene av differensiering og det brukte mediet fra brønnene. Vask hver brønn med 1 ml DPBS uten Ca2+/Mg2+ ved romtemperatur (RT).
- Tilsett 1 ml enzymfri dissosiasjonsreagens (se Materialtabellen) til hver brønn og inkuber ved 37 °C i 8–10 minutter til cellene løsner synlig fra platen.
- Bruk en celleskraper til forsiktig å løsne cellene fra brønnene. Pipette innholdet i hver brønn opp og ned 2-4x med en P1000 pipette for å gi en encellet suspensjon. For hver cellelinje, bassengceller fra alle vedlikeholdsbrønner til et sterilt 50 ml rør.
- Vask hver tømt brønn med 1 ml av stamcellevedlikeholdsmediet. Legg vaskene til det tilsvarende røret som inneholder de samlede cellene fra riktig cellelinje.
- For hver cellelinje utfører du tre levedyktige celleantall i de grupperte eksemplene. Beregn gjennomsnittlig antall aktive celler (levende celler/ml) for hver cellelinje.
- Sentrifuger de samlede prøvene ved 250 x g i 5 minutter ved RT. Aspirer supernatanten, og bruk deretter cellepelleten på nytt i 1-3 ml RT stamcellevedlikeholdsmedium, ferskt supplert med 10 μM ROCK-hemmer Y27632.
- For hver cellelinje beregner du ønsket cellenummer per antall brønner som er klargjort i trinn 2.4 (se tabell 1). Resuspend det nødvendige cellenummeret med stamcellevedlikeholdsmedium ferskt supplert med 10 μM ROCK-hemmer Y27632.
- Tilsett de beregnede volum(er) i brønnene på de forberedte og forhåndsbelagte platene fra trinn 2.4 uten å fjerne volumet som er lagt til tidligere. Det totale volumet per brønn vil være 1 ml for en 24 brønnplate og 0,1 ml for en 96 brønnplate. Gyng platene forsiktig fra side til side og frem og tilbake for å sikre jevn celledispersjon gjennom brønnen.
MERK: En jevn cellefordeling over brønnen er nøkkelen for å sikre homogen cellesåing og vellykket differensiering. - Plasser frøplatene i inkubatoren og rock straks frøplatene forsiktig frem og tilbake og fra side til side for å fordele cellene jevnt og opprettholde kulturer ved 37 °C og 5 % CO2.
3. Differensiere hPSCer til levergenitorer på laminin-521
- Forbered medier for definitiv endoderm induksjon (trinn 1) ved hjelp av Endoderm Basal Medium supplert med de riktige tilsetningsstoffene.
- På dag 0 tin flasken på Endoderm Basal Medium over natten ved 4 °C.
- Forbered trinn 1 Middels 1 (til bruk på dag 1) etter behov.
- Tine Supplement MR og Supplement CJ på is.
- Fortynn supplement MR og supplement CJ 1:100 i Endoderm Basal Medium.
- Forbered trinn 1 Middels 2 for bruk på dagene 2–4 etter behov.
- Fortynn supplement CJ 1:100 i Endoderm Basal Medium.
- Forbered medier for den påfølgende hepatiske stamcellespesifikasjonen (trinn 2) differensiering ved hjelp av Hepatisk stamcellemedium.
- På dag 4 tin flasken til Hepatic Progenitor Medium over natten ved 4 °C.
MERK: 1% penicillin/streptomycin (endelige konsentrasjoner på henholdsvis 100 IE/ml og 100 μg/ml) ble brukt til dette eksperimentet. Antibiotika er ikke nødvendig; antibiotikabruk er etter brukerens skjønn.
- På dag 4 tin flasken til Hepatic Progenitor Medium over natten ved 4 °C.
- På dag 1 av differensieringen fjerner du det brukte stamcellevedlikeholdsmediet med 10 μM ROCKi Y-27632 medium fra brønnene og erstatter med 0,5 ml komplett trinn 1 Medium 1 per brønn på en 24 brønnplate og 0,1 ml per brønn på en 96 brønnplate.
- På dag 2, 3 og 4 fjerner du det brukte mediet og mater hver brønn med 0,5 ml trinn 1 Medium 2 per brønn for en 24 brønnplate eller 0,1 ml per brønn på en 96 brønnplate.
- På dag 5 fikser du brønnene for definitiv endoderm differensieringsanalyse via immunocytokjemi. For de resterende brønnene fjerner du det brukte mediet og mater hver brønn med 0,5 ml hepatisk stamcelledifferensieringsmedium per brønn for en 24 brønnplate eller 0,1 ml per brønn på en 96 brønnplate. Oppdater mediet på nytt på dag 6, 7 og 9.
- På dag 10 høster brønner for hepatisk stamcelledifferensieringsanalyse eller fortsetter med ytterligere hepatocyttlignende celledifferensiering.
MERK: På dette tidspunktet ble prøver enten festet med 4% paraformaldehyd (PFA) for immunocytokjemianalyse eller supernatant ble samlet inn for ELISA og celler ble samlet inn for protein kvantifisering.
4. Karakterisering av levergenitor differensiering kulturer generert fra hPSCs på laminin-521
- På dag 5, oppdage uttrykk for definitive endoderm-spesifikke markører ved hjelp av immunstaining.
- På dag 10 oppdager du uttrykk for leverforfederspesifikke markører ved hjelp av immunstaining.
- På dag 10 måler du AFP- og ALB-sekresjon via ELISA ved hjelp av et sett etter produsentens instruksjoner og normaliserer per mg protein som bestemt av en bicinkoninsyre (BCA) proteinanalyse.
- Vurder hepatisk stamcellevariabilitet av 96 brønnplaten ved å kvantifisere prosentandelen av HNF4α positive celler per brønn.
5. Immunocytokjemi og bildeanskaffelse
- På dag 5 og 10 av differensiering, vask cellene 3x med 1x DPBS, med 0,5 ml per brønn av en 24 brønnplate og 0,1 ml per brønn på en 96 brønnplate. Inkuber platen med skånsom risting i 2–5 min ved RT.
MERK: Bruk DPSB uten Ca2+/Mg2+ for immunocytokjemi. - Fest cellene med 4% paraformaldehyd (PFA) ved RT i 15-30 min ved å tilsette 0,3 ml PFA per brønn for en 24 brønnplate og 0,1 ml per brønn på en 96 brønnplate.
- Vask 3x med 1x DPBS som beskrevet i trinn 5.1.
- Permeabiliser membranen med PBST ved hjelp av 0,1% Tween, 1x DPBS og inkuber i 20 min ved RT ved å tilsette 0,3 ml PBST per brønn på en 24 brønnplate og 0,1 ml per brønn på en 96 brønnplate.
- Utfør proteinblokken ved å inkubere cellene med 10% BSA i PBST i 1 time, tilsett 0,3 ml BSA per brønn av en 24 brønnplate og 0,1 ml BSA per brønn på en 96 brønnplate, rist forsiktig ved hjelp av en plate shaker.
- Etter proteinblokkering, erstatt blokkeringsløsningen med det primære antistoffet fortynnet i 1% BSA i PBST og inkuber ved 4 °C med skånsom risting over natten.
MERK: Ikke vask mellom proteinblokk og antistofftilsetning. - Etter 24 timer, vask brønnene 3x med PBST.
- Tilsett det sekundære antistoffet i 1% BSA i PBST. Inkuber 1 time på RT i mørket med mild risting.
- Etter sekundær antistoffinkubasjon, vask brønnene 3x med 1x DPBS og dispenser Hoechst-flekken i henhold til produsentens instruksjoner i 10 min ved RT i mørket med mild risting.
- Vask 3x med 1x DPBS. Platene er nå klare for bildebehandling.
MERK: Oppbevar platene ved 4 °C i mørket til bildebehandling. - Bilde multiwell plate ved hjelp av en høy-innhold bildemikroskop etter immunhiistokjemi. Bildeanskaffelse av flere synsfelt anbefales for å oppnå en sann representasjon av brønnen. Uttrykket for de ulike markørene ble vurdert via cellesegmenteringsanalyse ved hjelp av kommersiell programvare (se Materialfortegnelse) (Figur 1).
MERK: Cellesegmentering kan også utføres ved hjelp av en programvare med åpen kildekode for bildeanalyse, for eksempel CellProfiler eller Fiji20,21.
Representative Results
Hepatisk stamcelledifferensiering fra linjene hESC (H9) og hiPSC (P106) ble utført etter den trinnvise protokollen som er beskrevet i figur 2. Her ble pluripotente stamceller sådd som enkeltceller i LN-521-belagte plater før differensieringsstart. Cellesamtid er nøkkelen for en robust og reproduserbar differensiering. Når riktig samløp ble oppnådd (figur 2), ble differensiering igangsatt. På dag 5 ble definitiv endoderm spesifikasjon vurdert via Sox17 uttrykk. I begge cellelinjene ble Sox17 sterkt uttrykt med 80% ± henholdsvis 0,5% og 87,8% ± 0,5% SEM av Sox17-positive celler for henholdsvis H9 og P106 (Figur 3). På dag 10 viste leverforfedere en brosteinlignende morfologi (figur 2). I tillegg ble hepatisk stamcellespesifikasjon vurdert for HNF4α-, AFP-, ALB- og cytokeratin-19 (CK19)-uttrykk samt AFP- og ALB-proteinsekresjon10,15,22 ( figur4). Både H9 og P106 leverforfederkulturer uttrykte fetal levermarkører som HNF4α (91% ± 0,5% og 90% ± 0,2%), AFP (89,7 % ± 1,8 % og 86 % ± 1,2 %), og CK19 (78,5 % ± 3,2 % og 83,6 ± 1,8 %)(figur 4). AFP-sekresjon ble påvist på dag 10 i begge cellelinjene (32,4 ± 1,6 og 47,8 ± 5,9 ng/ml/mg/24 t) (figur 5). Albuminsyntese ble observert på lavere nivåer (30,7 % ± 1,8 % og 27,2 % ± 1,1 %) (figur 4) og ble ikke påvist via ELISA (figur 5).
Protokollen tillot standardisert produksjon av leverforfedere fra 24 brønner til 96 brønnplater. En halvautomatisk rørledning ble brukt til å produsere 96 brønnplater av leverforfedere fra H9- og P106-cellelinjer som tidligere beskrevet17. Cellenummervariabilitet og hepatisk stamcelledifferensieringseffektivitet ble vurdert ved kvantifisering av HNF4α-uttrykk. Cellesegmentering ble utført for protein kvantifisering via immunfluorescens ved hjelp av et bildeinstrument med høyt innhold (figur 1). På dag 10 viste leverforfedere ingen signifikant variasjon på tvers av rader med >94% av HNF4α-positive celler per brønn for H9 og 97% HNF4α-positive celler for P106 (Figur 6).
Figur 1: Oversikt over cellesegmenteringsrørledning. (A) Ved hjelp av det opprinnelige bildet ble (B) kjernefysisk farging brukt til kjernesegmentering. (C) Et kjernefysisk segmenteringskvalitetskontrolltrinn basert på form og størrelse ble utført for bare å kvantifisere klart segmenterte kjerner. (D) Etter dette ble positive HNF4α-fargede kjerner kvantifisert. (E) Til slutt ble det brukt en intensitetsbasert terskel for å identifisere HNF4α-uttrykkende celler. I C og Erepresenterer grønne kjerner merkede celler, og magentakjerner angir kasserte celler. Skalalinje = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Hepatisk stamcelledifferensiering fra hPSCs. (A) Skjematisk representasjon av hepatisk stamcelledifferensieringsprotokoll. (B) Representative bilder som fremhever de morfologiske endringene under differensiering. På dag 0 (D0) presenterte hPSCer et pakket monolayer av celler. Etter dette ble hPSCer primet til definitiv endoderm på dag 5 (D5). Dette ble etterfulgt av hepatisk forfederdifferensiering på dag 10 (D10). Levergenitorer viste en brosteinlignende cellemorfologi. Skalalinje = 75 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Karakterisering av definitiv endoderm spesifikasjon. På dag 5 ble cellene farget for Sox17, en definitiv endodermmarkør. Andelen Sox17-positive celler var 80 ± 0,5 % for H9 og 87,8 ± 0,5 % for P106. Prosentvis kvantifisering var basert på 10 separate brønner med 6 synsfelt per brønn. Data vises som gjennomsnittlig ± SEM. Skalalinje = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Hepatisk stamcellekarakterisering. På dag 10 ble leverforfedere farget for levermarkører (A) HNF4α, (B) AFP og (C) ALB. For H9 var andelen positive celler 91 % ± 0,4 %, 89,7 % ± 1,8 % og 30,7 % ± henholdsvis 1,8 % for HNF4α, AFP og ALB. For P106 var prosentandelen positive celler henholdsvis 90 % ± 0,2 %, 86 % +/- 1,2 % og 27,2 % ± 1,1 % for henholdsvis HNF4α, AFP og ALB. (D) Cholangiocyte avstamningspotensial ble vurdert via CK19-uttrykk; H9-avledede levergenitorer uttrykte 78,5% ± 3,2% CK19-positive celler, mens 83,6% ± 1,8% av CK19-positive celler ble observert for P106 levergenitorer. Immunglobulin G (IgG) farging ble brukt som en fargingskontroll. Prosentvis kvantifisering var basert på 10 separate brønner med 6 synsfelt per brønn. Data vises som gjennomsnittlig ± SEM. Skalalinje = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Proteinsekresjonsanalyse av leverforfeder. Sekresjonen av alfafetaprotein (AFP) og albumin (ALB) ble analysert i leverforfedrenes kulturer på dag 10 i H9 og P109. Dataene representerer tre biologiske repliker og feilfeltene representerer SD. Utskilte proteiner ble kvantifisert fra 24 h kulturmedium som nanogrammer av utskilt protein per ml per mg protein, n = 3; ND = ikke oppdaget. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Vurdering av brønn-til-brønn-variasjon i 96 brønnplater. (A) Visualisering av en 96 brønnplatevisning av H9-avledede leverforfedere farget med HNF4α. (B) Kvantifisering av HNF4α-positive celler. Gjennomsnitt av celletall per brønn i rader, fra seks synsfelt per godt kvantifisert. Gjennomsnittlig cellenummer på tvers av platen var 94,81% ± 0,22 SEM HNF4α-positive celler per brønn. Det ble ikke observert statistisk signifikante forskjeller mellom brønnene. (C) Visualisering av en 96 brønnplatevisning av P106-avledede levergenitorer farget med HNF4α. (D) Kvantifisering av HNF4α-positive celler. Gjennomsnittlig cellenummer per brønn i rader, fra seks synsfelt per brønn og kvantifisert. Gjennomsnittlig cellenummer over platen var 97,7% ± 0,57 SEM HNF4α-positive celler per brønn. Det ble ikke observert statistisk signifikante forskjeller mellom rader. Brønn H12 ble brukt som immunglobulin G (IgG) fargekontroll. Skalastang = 1 mm. Enveis ANOVA med Tukeys statistiske tester etter hoc ble brukt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Plateformat | Overflateareal (cm2) | Celler per cm2 | Totalt antall celler per brønn | Dispenseringsvolum (ml) | Cellekonsentrasjon (celler/ml) |
| 24-brønns plate | 1.9 | 210526 | 400000 | 0.5 | 800000 |
| 96-brønns plate | 0.32 | 187500 | 60000 | 0.05 | 1200000 |
Tabell 1: Anbefalt celletetthet for de ulike plateformatene for hPSC-cellelinjene som brukes i denne protokollen.
Discussion
Genereringen av humane levergenitorceller fra pluripotente stamceller i stor skala kan representere et lovende alternativ til kadaveraveravledet materiale. Protokollstandardisering og reproduserbarhet er nøkkelen til å sikre teknologioversettelse og innvirkning for biomedisinsk forskning. For å løse dette har tidligere arbeid fokusert på å utvikle en trinnvis differensieringsprotokoll fra hESC og iPSCer ved hjelp av definerte tilsetningsstoffer og matriser15,23,24,25,26,27,28. Ved å gjøre dette har hepatocytt fenotype og reproduserbarhet blitt forbedret, slik at halvautomatiseringen av differensieringsprosessen19. Systemet som presenteres styrkes av kombinasjonen med hyllecellekulturmedier og et facile hepatocyte differensieringssystem.
Tidligere ble pluripotent celletetthet før starten av differensieringsprotokollen fremhevet som en nøkkelvariabel for å oppnå en homogen populasjon av leverforfederceller26. Ved hjelp av denne mer raffinerte prosedyren er det mulig å generere et stort antall stamcelleavledede leverforfedere på en trinnvis måte ved hjelp av et område med startcelletettheter (Tabell 1). På dag 5 ble definitiv endoderm induksjon validert av Sox17 farging (figur 3). Effektiv og robust differensiering i definitiv endoderm ble oppnådd med både testede ESC- og iPSC-linjer, med mer enn 80% som uttrykker Sox17 (Figur 3). På dag 10 viste leverforfedere en jevn brosteinlignende morfologi, og leverstammecellemarkører ble sterkt beriket for både AFP og HNF4α (>86%, figur 4). Ved hjelp av en kombinasjon av manuelle og halvautomatiske teknologier var det mulig å utføre differensiering i flere plateformater19.
I sin nåværende form er celledifferensiering egnet for in vitro-basert eksperimentering. Imidlertid vil celleberikelse sannsynligvis være nødvendig før klinisk anvendelse for å sikre at en homogen populasjon av leverforfedere er forberedt på levering.
Til slutt gir protokollen som er beskrevet her feltet en standardisert tilnærming for å produsere leverforfedere i stor skala. Fremtidig arbeid vil fokusere på produksjon av et nytt medium for påfølgende HLC-differensiering, modning og vedlikehold.
Disclosures
David C. Hay er medgrunnlegger og aksjonær i Stemnovate Ltd. Resten av forfatterne bekrefter at de ikke har noen interessekonflikter i emnet eller materialet som er diskutert i denne artikkelen.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet med priser fra MRC Doctoral Training Partnership (MR/K501293/1), UK Regenerative Medicine Platform (MRC MR/L022974/1 og MR/K026666/1), Chief Scientist Office (TCS/16/37).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
| Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
| Hoechst 33342 Ready Flow Reagent | thermofisher | R37165 | |
| Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
| Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
| Human Serum Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
| mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Operetta High-Content Imaging System | PerkinElmer | HH12000000 | |
| PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
| Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
| STEMdiff Definitive Endoderm Supplement CJ | STEMCELL Technologies | ||
| STEMdiff Definitive Endoderm Supplement MR | STEMCELL Technologies | ||
| STEMdiff Endoderm Basal Medium | STEMCELL Technologies | ||
| STEMdiff Hepatic Progenitor Medium | STEMCELL Technologies | ||
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Antibodies | |||
| Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:200 (mouse) |
| Alpha-fetoprotein | Sigma-Aldrich | A8452 | 1:400 (mouse) |
| HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:400 (rabbit) |
| IgG | DAKO | 1:400 | |
| Sox17 | R&D Systems, Inc. | AF1924 | 1:200 (Goat) |
| Software | |||
| Columbus Image Data Storage and Analysis system | PerkinElmer |
References
- Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S.
- Szkolnicka, D., Hay, D. C. Concise Review: Advances in Generating Hepatocytes from Pluripotent Stem Cells for Translational Medicine. Stem Cells Dayton Ohio. 34 (6), 1421-1426 (2016).
- Heslop, J. A., Duncan, S. A. The Use of Human Pluripotent Stem Cells for Modeling Liver Development and Disease. Hepatology. 69 (3), 1306-1316 (2019).
- Alwahsh, S. M., Rashidi, H., Hay, D. C. Liver cell therapy: is this the end of the beginning. Cell and Molecular Life Sciences. 75 (8), 1307-1324 (2018).
- Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells Dayton Ohio. 26 (4), 894-902 (2008).
- Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
- Hannan, N. R. F., Segeritz, C. -P., Touboul, T., Vallier, L. Production of hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 8 (2), 430-437 (2013).
- Basma, H., et al. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).
- Meseguer-Ripolles, J., Khetani, S. R., Blanco, J. G., Iredale, M., Hay, D. C. Pluripotent Stem Cell-Derived Human Tissue: Platforms to Evaluate Drug Metabolism and Safety. The AAPS Journal. 20 (1), 20 (2017).
- Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A.
- D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Shin, D., et al. Bmp and Fgf signaling are essential for liver specification in zebrafish. Development Cambridge England. 134 (11), 2041-2050 (2007).
- DeLaForest, A., et al. HNF4A is essential for specification of hepatic progenitors from human pluripotent stem cells. Development Cambridge England. 138 (19), 4143-4153 (2011).
- Baxter, M., et al. Phenotypic and functional analyses show stem cell-derived hepatocyte-like cells better mimic fetal rather than adult hepatocytes. Journal of Hepatology. 62 (3), 581-589 (2015).
- Cameron, K., et al. Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1250-1262 (2015).
- Szkolnicka, D., et al. Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs. Stem Cells Translational Medicine. 5 (6), 764-772 (2016).
- Domogatskaya, A., Rodin, S., Boutaud, A., Tryggvason, K. Laminin-511 but Not -332, -111, or -411 Enables Mouse Embryonic Stem Cell Self-Renewal In Vitro. Stem Cells. 26 (11), 2800-2809 (2008).
- Kanninen, L. K., et al. Laminin-511 and laminin-521-based matrices for efficient hepatic specification of human pluripotent stem cells. Biomaterials. 103, 86-100 (2016).
- Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Wang, Y., Hay, D. C. Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (137), e57995 (2018).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7, 100 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Raven, A., et al. Cholangiocytes act as Facultative Liver Stem Cells during Impaired Hepatocyte Regeneration. Nature. 547 (7663), 350-354 (2017).
- Hay, D. C., et al. Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functional hepatocytes with inducible drug metabolism. Stem Cell Research. 6 (2), 92-102 (2011).
- Medine, C. N., et al. Developing High-Fidelity Hepatotoxicity Models from Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Translational Medicine. 2 (7), 505-509 (2013).
- Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Translational Medicine. 3 (2), 141-148 (2014).
- Wang, Y., et al. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (121), e55355 (2017).
- Villarin, B. L., et al. Polymer Supported Directed Differentiation Reveals a Unique Gene Signature Predicting Stable Hepatocyte Performance. Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1820-1825 (2015).
- Wang, Y., et al. Multiomics Analyses of HNF4α Protein Domain Function during Human Pluripotent Stem Cell Differentiation. iScience. 16, 206-217 (2019).
