Summary

Un protocole amélioré pour purifier et directement mono-biotinylate recombinant BDNF dans un tube pour les études de trafic cellulaire dans les neurones

Published: July 11, 2020
doi:

Summary

Le BDNF recombinant contenant une séquence Avi (BDNFAvi) est produit dans les cellules HEK293 d’une manière rentable et est purifié par la chromatographie d’affinité. BDNFavi est alors directement mono-biotinylé avec l’enzyme BirA dans un tube. BDNFavi et BDNFavi mono-biotinylés conservent leur activité biologique par rapport au BDNF disponible dans le commerce.

Abstract

Le BDNF recombinant contenant une séquence Avi (BDNFAvi) est produit dans des cellules HEK293, puis purifié de manière rentable par chromatographie d’affinité. Un protocole reproductible a été développé pour mono-biotinylate directement BDNFAvi avec l’enzyme BirA dans un tube. Dans cette réaction, le BDNFAvi mono-biotinylé conserve son activité biologique.

Les neurotrophines sont des facteurs de croissance dérivés de la cible qui jouent un rôle dans le développement et l’entretien des neurones. Ils nécessitent des mécanismes de transport rapide le long de la voie endocytique pour permettre la signalisation longue distance entre les différents compartiments neuronaux. Le développement d’outils moléculaires pour étudier le trafic de neurotrophines a permis le suivi précis de ces protéines dans la cellule à l’aide de l’enregistrement in vivo. Dans ce protocole, nous avons développé une procédure optimisée et rentable pour la production de BDNF mono-biotinylée. Une variante recombinante de BDNF contenant une séquence d’avi biotinylable (BDNFAvi) est produite dans les cellules HEK293 dans la gamme de microgrammes, puis purifiée dans une procédure facilement évolutive utilisant la chromatographie d’affinité. Le BDNF purifié peut alors être homogènement mono-biotinylé par une réaction in vitro directe avec l’enzyme BirA dans un tube. L’activité biologique du BDNF mono-biotinylé (mbtBDNF) peut être conjuguée à la streptavidine-conjuguée à différents fluorophores. BDNFAvi et mbtBDNF conservent leur activité biologique démontrée par la détection de cibles phosphorylyées en aval à l’aide de la tache occidentale et de l’activation du facteur de transcription CREB, respectivement. En utilisant des points streptavidine-quantiques, nous avons pu visualiser l’internalisation mbtBDNF concomitante à l’activation du CREB, qui a été détecté avec un anticorps spécifique au phospho-CREB. En outre, mbtBDNF conjugué aux points streptavidin-quantum était approprié pour l’analyse rétrograde de transport dans les neurones corticaux cultivés dans les chambres microfluidiques. Ainsi, dans le tube produit mbtBDNF est un outil fiable pour étudier la dynamique de signalisation physiologique endosome et le trafic dans les neurones.

Introduction

Les neurones sont les unités fonctionnelles du système nerveux possédant une morphologie complexe et spécialisée qui permet la communication synaptique, et donc, la génération de comportements coordonnés et complexes en réponse à divers stimuli. Les projections neuronales telles que les dendrites et les axones sont des caractéristiques structurelles essentielles impliquées dans la communication neuronale, et les neurotrophines sont des acteurs essentiels pour déterminer leur morphologie et leur fonction1. Les neurotrophines sont une famille de facteurs de croissance sécrétés qui incluent NGF, NT-3, NT-4, et le facteur neurotrophique cerveau-dérivé (BDNF)2. Dans le système nerveux central (SNC), BDNF participe à divers processus biologiques, y compris la neurotransmission, l’arborisation dendritique, la maturation des épines dendritiques, la potentialisation à long terme, entre autres3,4. Par conséquent, BDNF joue un rôle essentiel dans la régulation de la fonction neuronale.

Divers processus cellulaires régulent la dynamique et la fonction de BDNF. Sur la surface neuronale, le BDNF lie le récepteur de la tropomyosine kinase B (TrkB) et/ou le récepteur de la neurotrophine p75 (p75). Les complexes BDNF-TrkB et BDNF-p75 sont endocytosés et triés dans différentes organites endocytiques5,6,7,8. Le trafic intracellulaire correct du complexe BDNF/TrkB est nécessaire pour la signalisation BDNF appropriée dans différents circuits neuronaux9,10,11. Pour cette raison, une compréhension profonde de la dynamique du trafic BDNF et de ses altérations trouvées dans les processus pathophysiologiques est essentielle pour comprendre la signalisation BDNF dans la santé et la maladie. La mise au point d’outils moléculaires nouveaux et spécifiques pour surveiller ce processus aidera à faire avancer ce domaine et permettra de mieux comprendre les mécanismes de réglementation impliqués.

Il existe plusieurs outils disponibles pour l’étude du trafic BDNF dans les neurones. Une méthodologie couramment utilisée implique la transfection du BDNF recombinant marqué avec des molécules fluorescentes telles que la protéine fluorescente verte (GFP) ou la variante monomérique fluorescente de GFP mCherry12,13. Cependant, une lacune majeure de la surexpression BDNF est qu’elle élimine la possibilité de fournir des concentrations connues de cette neurotrophine. En outre, il peut entraîner la toxicité cellulaire, obscurcissant l’interprétation des résultats14. Une stratégie alternative est la transfection d’un TrkB marqué par épitope, tel que Flag-TrkB. Cette méthodologie permet l’étude de la dynamique d’internalisation TrkB15, mais elle implique également la transfection, qui pourrait entraîner une altération de la fonction TrkB et la toxicité cellulaire. Pour surmonter ces obstacles méthodologiques, des variantes recombinantes de NGF et bdnf contenant une séquence Avi (BDNFAvi), qui peuvent être mono-biotinylées par l’enzyme biotin-ligase BirA, ont été développées16,17. Le BDNF recombinant biotinylé peut être couplé à différents outils liés à la streptavidine, qui comprennent des fluorophores, des perles, des nanoparticules paramagnétiques, entre autres, pour la détection. En termes d’imagerie des cellules vivantes, les points quantiques (QD) sont devenus fréquemment utilisés fluorophores, car ils ont des caractéristiques souhaitables pour le suivi des particules uniques, tels que la luminosité accrue et la résistance au photobleaching par rapport aux fluorophores de petites molécules18.

La production de BDNF mono-biotinylée (mbtBDNF) à l’aide de BDNFAvi a été réalisée par co-transfection de plasmides conduisant à l’expression de BDNFAvi et BirA, suivie par la purification de la protéine recombinante par chromatographie d’affinité avec un rendement de 1-2 μg de BDNF par 20 mL de 20 mL de milieux de culture17HEK293-conditionnés . Ici, nous proposons une modification de ce protocole qui permet la purification BDNFAvi à partir de 500 mL de supports conditionnés HEK293, qui vise à maximiser la récupération des protéines dans un protocole basé sur la chromatographie-colonne pour faciliter la manipulation. L’agent de transfection utilisé, la polyéthylèneimine (Î.-P.-É.), assure une méthode rentable sans sacrifier le rendement de la transfection. L’étape mono-biotinylation a été adaptée à une réaction in vitro afin d’éviter les complications associées aux co-transfections et d’assurer l’étiquetage homogène du BDNF. L’activité biologique du mbtBDNF a été démontrée par des expériences occidentales de microscopie de tache et de fluorescence, y compris l’activation du PCREB et de l’imagerie cellulaire vivante pour étudier le transport axonal rétrograde du BDNF dans les chambres microfluidiques. L’utilisation de ce protocole permet une production optimisée et à haut rendement de BDNF mono-biotinylée homogène et biologiquement active.

Protocol

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives approuvées par le CONICYT (Commission nationale chilienne pour la recherche scientifique et technologique). Les protocoles utilisés dans cette étude ont été approuvés par les Comités de biosécurité et de bioéthique et de bien-être animal de la Pontificia Universidad Católica de Chile. Des expériences impliquant des vertébrés ont été approuvées par le Comité de bioéthique et de bien-être animal de la Pontificia Universidad Cat?…

Representative Results

L’utilisation d’un protocole chromatographique basé sur les colonnes permet le traitement de volumes importants de supports conditionnés HEK293. Dans la figure 1, les résultats de la purification de BDNFAvi à partir de 500 mL de support conditionné sont affichés. Les élutions consécutives de BDNFAvi des perles d’agarose Ni-NTA donnent des concentrations décroissantes de BDNFAvi (Figure 1A). Après quatre ellutions consécutives (chacune d’une du…

Discussion

Dans cet article, une méthodologie optimisée pour la production et la purification du mbtBDNF dans une procédure basée sur la chromatographie d’affinité est décrite, basée sur le travail de Sung et collaborateurs17. Les optimisations comprennent l’utilisation d’un réactif transfection rentable (Î.-P.-É.) tout en maintenant l’efficacité de méthodes de transfection plus coûteuses comme la lipofectamine. Cette optimisation se traduit par une réduction significative des coûts du…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs reconnaissent avec gratitude le soutien financier de Fondecyt (1171137) (FCB), du Centre basal d’excellence en science et technologie (AFB 170005) (FCB), Millenium-Nucleus (P07/011-F) (FCB), le Wellcome Trust Senior Investigator Award (107116/Z/15/Z) (GS) et un prix de la Uk Dementia Research Institute Foundation (GS). Ce travail a été soutenu par l’Unidad de Microscopía Avanzada UC (UMA UC).

Materials

2 way stopcock BioRad 7328102 Chromatography apparatus component
2-mercaptoethanol Sigma M6250 BDNF elution buffer
Acrylamide/Bisacrylamide BioRad 1610154 SDS-PAGE gel preparation
Amicon Ultra-15 10K Millipore UFC901024 BDNF concentration
Ammonium Persulfate Sigma A9164 SDS-PAGE gel preparation
anti B-III-Tubulin antibody Sigma T8578 Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti BDNF antibody Alomone AGP-021 Western blot assays for BDNF quantification
anti BDNF antibody Alomone ANT-010 Western blot assays for BDNF quantification
Anti ERK antibody Cell Signaling 9102 Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pCREB antibody (S133) Cell Signaling 9198 Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pERK antibody (T202, Y204) Cell Signaling 4370 Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pTrkB antibody (Y515) Abcam ab109684 Western blot assays for BDNF biological activity detection
Antibiotic/Antimycotic Gibco 15240-062 HEK293 maintenance
ATP Sigma A26209 BDNF monobiotinylation buffer
B-27 Supplement Gibco 17504-044 Neuron maintenance
Bicine Sigma B3876 BDNF monobiotinylation buffer
BirA-GST BPS Bioscience 70031 Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation
Bovine Fetal Serum HyClone HC.SH30396.02 HEK293 maintenance
Bovine Serum Albumin Jackson ImmunoResearch 001-000-162 BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence
D-Biotin Sigma B4639 BDNF monobiotinylation buffer
Dithiothreitol Invitrogen 15508-013
DMEM High Glucose Medium Gibco 11965-092 Neuron seeding
DMEM Medium Gibco 11995-081 HEK293 maintenance
Econo Column Funnel BioRad 7310003 Chromatography apparatus component
EDTA Merck 108418
EZ-ECL Kit Biological Industries 1633664 Protein detection by western blotting
Glutamax Gibco 35050-061 Neuron and HEK293 maintenance
Glycerol Merck 104094 BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays
Hettich Rotina 46R Centrifuge Hettich Discontinued Centrifuge used for clearing the medium of debris
Hettich Universal 32R Centrifuge Hettich Discontinued Centrifuge used for protein concentrator centrifugation
Horse Serum Gibco 16050-122 Neuron seeding
ImageQuant LAS 500 GE Healthcare Life Sciences 29005063 Western blot image acquisition
Imidazole Sigma I55513 BDNF buffer modification component
KCl Winkler BM-1370 PBS component
KH2PO4 Merck 104873 PBS component
Laminin Invitrogen 23017-015 Cover coating for compartmentalized neurons
Luer Tubing Adaptor BioRad 7323245 Chromatography apparatus component
Luminata™ Forte Western HRP Substrate Millipore WBLUF0100 Protein detection by western blotting
Mg(CH3COO)2 Merck 105819 BDNF monobiotinylation buffer
Mowiol 4-88 Calbiochem 475904 Mounting reagent for immunofluorescence assays
MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads Invitrogen 65001 Biotinylation verification
Na2HPO4 Merck 106586 BDNF buffer modification component
NaCl Winkler BM-1630 PBS component, BDNF buffer modification component
NaH2PO4 Merck 106346 BDNF buffer modification component
Neurobasal Medium Gibco 21103-049 Neuron maintenance
Ni-NTA Agarose Beads Qiagen 30210 BDNF AviTag purification
Nikon Ti2-E Nikon Microscope for fluorescence imaging
Nitrocellulose Membrane BioRad 1620115 Protein transfer for western blotting
ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera Hamamatsu C13440-20CU Camera for epifluorescence imaging
P8340 Protease Inhibitor Cocktail Sigma P8340 BDNF buffer modification component
Paraformaldehyde Merck 104005 Fixative for immunofluorescence assays
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122 Neuron maintenance
Poli-D-Lysine Corning DLW354210 Cover coating for compartmentalized neurons
Poli-L-Lysine Millipore P2363 Cover coating for non-compartmentalized neurons
Poly-Prep Chromatography Column BioRad 7311550 Chromatography apparatus component
Polyethyleneimine 25K Polysciences Inc. PLY-0296 HEK293 transfection
Quantum Dots 655 streptavidin conjugate Invitrogen Q10121MP Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments
Saponin Sigma S4521 Detergent for immunofluorescence assays
Sucrose Merck 107687
Syldgard 184 silicone elastomer base Poirot 4019862 Microfluidic chamber preparation
TEMED Sigma T9281 SDS-PAGE gel preparation
Tris Winkler BM-2000 Lysis buffer component
Triton X100 Merck 108603 Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays
Trypsin-EDTA 0.5% Gibco 15400-054 HEK293 passaging

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Stuardo, N., Moya-Alvarado, G., Ramírez, C., Schiavo, G., Bronfman, F. C. An Improved Protocol to Purify and Directly Mono-Biotinylate Recombinant BDNF in a Tube for Cellular Trafficking Studies in Neurons. J. Vis. Exp. (161), e61262, doi:10.3791/61262 (2020).

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