Summary

פרוטוקול משופר כדי לטהר ו מונו ישירות-Biotinylate BDNF בתוך צינור ללימודי סחר בתאי הסלולר בנוירונים

Published: July 11, 2020
doi:

Summary

רקומביננטי BDNF המכיל רצף Avi (Bdnפאבאני) מופק בתאים HEK293 באופן חסכוני ומטוהר על ידי כרומטוגרפיה של זיקה. לאחר מכן BDNFavi באופן ישיר מונו-biotinylated עם בירה אנזים בשפופרת. Bdn, ו מונו-biotinylbdni שמירה על הפעילות הביולוגית שלהם בהשוואה BDNF זמין מסחרית.

Abstract

רקומביננטי BDNF המכיל רצף Avi (Bdnפאבאני) מופק בתאי HEK293 ולאחר מכן מטוהרים ביעילות על ידי כרומטוגרפיה של זיקה. פרוטוקול התפתחות פותחה כדי ישירות מונו-biotinylate אוחר Bdn, עם בירה אנזים בצינור. בתגובה זו, שומרת על הפעילות הביולוגית של מונו-ביוטיליס.

Neurotrophins הם מטרה נגזר גורמי הצמיחה לשחק תפקיד בפיתוח עצבי ותחזוקה. הם דורשים מנגנוני הובלה מהירה לאורך השביל endocytic כדי לאפשר איתות למרחקים ארוכים בין תאים עצביים שונים. התפתחות של כלים מולקולריים כדי ללמוד את הסחר של neurotrophins אפשרה מעקב מדויק של חלבונים אלה בתא באמצעות הקלטה vivo . בפרוטוקול זה פיתחנו הליך מיטבי וחסכוני לייצור BDNF מונו-biotinylated. משתנה bdnf רקומביננטי המכיל רצף avi biotinylable (bdnפאבאני) מופק בתאי HEK293 בטווח יקרוגרם ולאחר מכן מטוהרים בהליך מדרגי בקלות באמצעות כרומטוגרפיה זיקה. BDNF מטוהרים לאחר מכן יכול להיות מונו הומוגנזיס ביולוגי על ידי תגובה ישירה באמצעות מבחנה עם בירה אנזים בצינור. הפעילות הביולוגית של BDNF מונו-biotinated (mbtBDNF) יכול להיות מצומדת כדי streptavidin-מעלה מעלה לתוך fluorophores שונים. BDNFAvi ו בmbtbdnf לשמור על הפעילות הביולוגית שלהם הפגינו באמצעות זיהוי של מטרות זרחתי במורד הזרם באמצעות הכתם המערבי והפעלה של מקדם שעתוק CREB, בהתאמה. באמצעות streptavidin-הנקודות הקוואנטום, היינו מסוגלים לדמיין את הקשר באמצעות הפנמה במקביל עם ההפעלה של CREB, אשר זוהה עם נוגדן מסוים פוספהו-CREB. בנוסף, mbtBDNF מעלה מצועם streptavidin-הנקודות הקוונטיות היה מתאים לניתוח הובלה נסיגה בנוירונים בקליפת הבית הגדול בתאי מיקרופלואידיג. כך, בצינור המיוצר mbtBDNF הוא כלי אמין כדי לחקור את הדינמיקה של איתות פיזיולוגי אנדוכמה וסחר בנוירונים.

Introduction

נוירונים הם יחידות תפקודית של מערכת העצבים בעל מורפולוגיה מורכבת ומיוחדת המאפשרת תקשורת סינפטית, ולכן, הדור של התנהגות מתואמת ומורכבת בתגובה לגירויים שונים. התחזיות הנוירואליות כגון דנדריטים ואקאונים הן תכונות מבניות קריטיות המעורבות בתקשורת עצבית, ונוירוטרופלנים הם שחקנים קריטיים בקביעת המבנה והתפקוד שלהם1. Neurotrophins הם משפחה של גורמי צמיחה מופרש הכוללים NGF, NT-3, NT-4, ואת המוח נגזר neurotrophic factor (BDNF)2. במערכת העצבים המרכזית (cn), bdnf משתתפת בתהליכים ביולוגיים מגוונים, כולל neurotransmission, הארבוריזציה הדנדריטי, התבגרות של השדרה הדנדריטי, פוטנציאל לטווח ארוך, בין השאר3,4. לכן, BDNF משחק תפקיד קריטי בוויסות תפקוד עצבי.

תהליכים סלולאריים שונים מווסת דינמיקה BDNF ותפקוד. על פני השטח העצבי, BDNF מאגד את הקולטן הטרופויוסין קינאז B (TrkB) ו/או קולטן נוירוטרופין p75 (p75). Bdnf-trkb ו-bdnf-p75 מתחמי הם מסודרים וממוינותבתוךמערכות endocytic שונים 5,6,7,8. תקן סחר תאיים של מתחם bdnf/trkb נדרש עבור איתות bdnf נאות במעגלים עצביים שונים9,10,11. מסיבה זו, הבנה עמוקה של הדינמיקה הסחר BDNF ושינויים שנמצאו בתהליכים pathפסלוגיים הוא חיוני כדי להבין את האיתות BDNF בריאות ומחלות. התפתחות הרומן והכלים המולקולריים הספציפיים לניטור תהליך זה יסייעו לנהוג בשדה זה קדימה ולאפשר תפיסה טובה יותר של מנגנוני הרגולציה המעורבים.

ישנם מספר כלים זמינים למחקר של סחר BDNF בנוירונים. מתודולוגיה בשימוש נפוץ כוללת את הרקומביננטי bdnf מתויג עם מולקולות פלורסנט כגון חלבון פלורסנט ירוק (gfp) או הווריאציה monomeric אדום העביר המשתנה של gfp mcherry12,13. עם זאת, קיצור מרכזי של ביטוי overdnf הוא שזה מבטל את האפשרות של אספקת ריכוזים ידועים של נוירוטרופין זה. כמו כן, זה עלול לגרום רעילות הסלולר, מטשטש את הפרשנות של תוצאות14. אסטרטגיה חלופית היא העברה של מעבר החצייה של TrkB מתויג, כגון דגל-TrkB. מתודולוגיה זו מאפשרת ללמוד את הדינמיקה של TrkB הפנמה15, אבל זה כולל גם העברה, אשר עשוי לגרום לתפקוד שונה trkb ורעילות הסלולר. כדי להתגבר על מכשולים מתודולוגיים אלה, רקומביננטי משתנים של ngf ו bdnf המכיל רצף Avi (bdnפאבאני), אשר יכול להיות מונו-biotinated על ידי ביוטין-ligase אנזימים בירה, פותחו16,17. Biotinylated רקומביננטי BDNF יכול להיות מצמידים כלים שונים מאוגד streptavidin, אשר כוללים fluorophores, חרוזים, חלקיקים פאראמגנטים בין היתר לאיתור. מבחינת הדמיה של תא חי, נקודות הקוונטים (QD) הפכו לעתים קרובות fluorophores, כפי שהם מאפיינים רצוי עבור מעקב יחיד חלקיק, כגון בהירות מוגברת ועמידות הלבנת כאשר לעומת מולקולה קטנה fluorophores18.

הייצור של מונו-biotinylated BDNF (mbtBDNF) באמצעות Bdnפאבאני הושגה על ידי העברת שיתוף של פלמידים הנהיגה ביטוי של Bdnפאבאני ובירה, ואחריו טיהור של חלבון רקומביננטי על ידי כרומטוגרפיה של אהדה עם תשואה של 1-2 μg של BDNF ל 20 מ ‘ של מדיה תרבותית ממוזגת17. כאן, אנו מציעים שינוי של פרוטוקול זה המאפשר את טיהור BDNFAvi מ 500 mL של מדיה ממוזג, אשר מבקש למקסם את ההתאוששות מחלבון בפרוטוקול מבוסס טור כרומטוגרפיה על קלות מניפולציה. הסוכן המשמש לזיהום, פוליאתילן, מבטיח שיטה חסכונית מבלי להקריב את התשואה החוצה. הצעד מונו-ביולציה הותאם לתגובת חוץ גופית כדי למנוע את הסיבוכים הקשורים בשיתוף פעולה ולהבטיח תוויות הומוגנית של BDNF. הפעילות הביולוגית של mbtbdnf הוכח על ידי כתמי המערבי וניסויים מיקרוסקופ פלואורסצנטית, כולל הפעלת pcreb ולחיות הדמיה תא ללמוד הובלה סיבי הנסיגה של bdnf בתאי microfluidic. השימוש בפרוטוקול זה מאפשר מיטוב, ייצור תשואה גבוהה של מונו הומוגנית-biotinylated ו פעילים ביולוגית BDNF.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות המאושרות של CONICYT (הנציבות הלאומית של צ’ילה למחקר מדעי וטכנולוגי). הפרוטוקולים ששימשו במחקר זה אושרו על ידי ועדות הביוסקיוריטי והביואתיקה ובעלי החיים של האוניברסיטה האפיפיורית קתליקה דה צ’ילה. הניסויים הכרוכים בבעלי חוליות אושרו על ידי ועדת הרווחה של ביואתי…

Representative Results

השימוש בפרוטוקול מבוסס עמודות כרומטוגרפי מאפשר עיבוד של כמויות משמעותיות של מדיה ממוזגת HEK293. באיור 1, התוצאות של טיהור של BDNFAvi מ 500 mL של מדיה ממוזג מוצגים. הפרשות רצופות של BDNFAvi מ-Ni-נ. ת. ע. מחרוזת תשואה הפחתת ריכוזים של BDNFAvi (איור 1A). לאחר ארבע הפרשות רצופות (כל מ?…

Discussion

במאמר זה, מתודולוגיה ממוטבת לייצור וטיהור של mbtBDNF בהליך מבוסס כרומטוגרפיה הזיקה מתוארת, בהתבסס על עבודתם של סונג ומשתפי פעולה17. המיטובים כוללים את השימוש במיגיב התרגום החסכוני (פיי) תוך שמירה על יעילות של שיטות מעבר יקרות יותר כגון lipofectamine. מיטוב זה מיתרגם הפחתת עלות משמעותית ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים בהכרת תודה התמיכה הפיננסית של Fondecyt (1171137) (FCB), מרכז בסיס של מצוינות במדע וטכנולוגיה (AFB 170005) (FCB), מילניום-גרעין (P07/011-F) (FCB), פרס החוקר הבכיר לאמון (107116/Z/15/Z) (GS) ו בבריטניה מחקר דמנציה פרס קרן (GS). העבודה הזאת נתמכת על ידי Unidad דה מיקרוצאדה Avanzada UC (UMA UC).

Materials

2 way stopcock BioRad 7328102 Chromatography apparatus component
2-mercaptoethanol Sigma M6250 BDNF elution buffer
Acrylamide/Bisacrylamide BioRad 1610154 SDS-PAGE gel preparation
Amicon Ultra-15 10K Millipore UFC901024 BDNF concentration
Ammonium Persulfate Sigma A9164 SDS-PAGE gel preparation
anti B-III-Tubulin antibody Sigma T8578 Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti BDNF antibody Alomone AGP-021 Western blot assays for BDNF quantification
anti BDNF antibody Alomone ANT-010 Western blot assays for BDNF quantification
Anti ERK antibody Cell Signaling 9102 Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pCREB antibody (S133) Cell Signaling 9198 Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pERK antibody (T202, Y204) Cell Signaling 4370 Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pTrkB antibody (Y515) Abcam ab109684 Western blot assays for BDNF biological activity detection
Antibiotic/Antimycotic Gibco 15240-062 HEK293 maintenance
ATP Sigma A26209 BDNF monobiotinylation buffer
B-27 Supplement Gibco 17504-044 Neuron maintenance
Bicine Sigma B3876 BDNF monobiotinylation buffer
BirA-GST BPS Bioscience 70031 Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation
Bovine Fetal Serum HyClone HC.SH30396.02 HEK293 maintenance
Bovine Serum Albumin Jackson ImmunoResearch 001-000-162 BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence
D-Biotin Sigma B4639 BDNF monobiotinylation buffer
Dithiothreitol Invitrogen 15508-013
DMEM High Glucose Medium Gibco 11965-092 Neuron seeding
DMEM Medium Gibco 11995-081 HEK293 maintenance
Econo Column Funnel BioRad 7310003 Chromatography apparatus component
EDTA Merck 108418
EZ-ECL Kit Biological Industries 1633664 Protein detection by western blotting
Glutamax Gibco 35050-061 Neuron and HEK293 maintenance
Glycerol Merck 104094 BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays
Hettich Rotina 46R Centrifuge Hettich Discontinued Centrifuge used for clearing the medium of debris
Hettich Universal 32R Centrifuge Hettich Discontinued Centrifuge used for protein concentrator centrifugation
Horse Serum Gibco 16050-122 Neuron seeding
ImageQuant LAS 500 GE Healthcare Life Sciences 29005063 Western blot image acquisition
Imidazole Sigma I55513 BDNF buffer modification component
KCl Winkler BM-1370 PBS component
KH2PO4 Merck 104873 PBS component
Laminin Invitrogen 23017-015 Cover coating for compartmentalized neurons
Luer Tubing Adaptor BioRad 7323245 Chromatography apparatus component
Luminata™ Forte Western HRP Substrate Millipore WBLUF0100 Protein detection by western blotting
Mg(CH3COO)2 Merck 105819 BDNF monobiotinylation buffer
Mowiol 4-88 Calbiochem 475904 Mounting reagent for immunofluorescence assays
MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads Invitrogen 65001 Biotinylation verification
Na2HPO4 Merck 106586 BDNF buffer modification component
NaCl Winkler BM-1630 PBS component, BDNF buffer modification component
NaH2PO4 Merck 106346 BDNF buffer modification component
Neurobasal Medium Gibco 21103-049 Neuron maintenance
Ni-NTA Agarose Beads Qiagen 30210 BDNF AviTag purification
Nikon Ti2-E Nikon Microscope for fluorescence imaging
Nitrocellulose Membrane BioRad 1620115 Protein transfer for western blotting
ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera Hamamatsu C13440-20CU Camera for epifluorescence imaging
P8340 Protease Inhibitor Cocktail Sigma P8340 BDNF buffer modification component
Paraformaldehyde Merck 104005 Fixative for immunofluorescence assays
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122 Neuron maintenance
Poli-D-Lysine Corning DLW354210 Cover coating for compartmentalized neurons
Poli-L-Lysine Millipore P2363 Cover coating for non-compartmentalized neurons
Poly-Prep Chromatography Column BioRad 7311550 Chromatography apparatus component
Polyethyleneimine 25K Polysciences Inc. PLY-0296 HEK293 transfection
Quantum Dots 655 streptavidin conjugate Invitrogen Q10121MP Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments
Saponin Sigma S4521 Detergent for immunofluorescence assays
Sucrose Merck 107687
Syldgard 184 silicone elastomer base Poirot 4019862 Microfluidic chamber preparation
TEMED Sigma T9281 SDS-PAGE gel preparation
Tris Winkler BM-2000 Lysis buffer component
Triton X100 Merck 108603 Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays
Trypsin-EDTA 0.5% Gibco 15400-054 HEK293 passaging

References

  1. Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
  2. Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
  3. Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
  4. Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1 (2010).
  5. Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A., Lewin, G., Carter, B. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. 220, (2014).
  6. Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
  7. Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293 (2006).
  8. Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070 (2019).
  9. Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, 11-14 (2007).
  10. Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
  11. Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
  12. Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
  13. Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684 (2015).
  14. Biocompare: The Buyer’s Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012)
  15. Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
  16. Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899 (2014).
  17. Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
  18. Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  19. Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. Neuroscience. 154 (3), 978-993 (2008).
  20. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
  21. Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493 (2018).
  22. Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
  23. . The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019)
  24. Mowla, , et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
  25. Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
  26. Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L’Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
  27. Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
  28. Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77 (2019).
  29. Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
  30. Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
  31. Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).

Play Video

Cite This Article
Stuardo, N., Moya-Alvarado, G., Ramírez, C., Schiavo, G., Bronfman, F. C. An Improved Protocol to Purify and Directly Mono-Biotinylate Recombinant BDNF in a Tube for Cellular Trafficking Studies in Neurons. J. Vis. Exp. (161), e61262, doi:10.3791/61262 (2020).

View Video