एक लवी अनुक्रम (BDNFAvi) युक्त Recombinant BDNF एक लागत प्रभावी तरीके से HEK293 कोशिकाओं में उत्पादित किया जाता है और आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी द्वारा शुद्ध है । BDNFavi तो सीधे मोनो-बायोटिनिलेटेड एंजाइम बीरा के साथ एक ट्यूब में है । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बीडीएनएफ की तुलना में बीडीएनफैवी और मोनो-बायोटिनेलेटेड बीडीएनफावी अपनी जैविक गतिविधि को बनाए रखते हैं।
एक लवी अनुक्रम (BDNFAvi) युक्त Recombinant BDNF HEK293 कोशिकाओं में उत्पादित किया जाता है और फिर एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी द्वारा लागत प्रभावी ढंग से शुद्ध । एक ट्यूब में एंजाइम बीरा के साथ सीधे मोनो-बायोटाइनेट बीडीएनएफवी के लिए एक प्रजनन योग्य प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। इस प्रतिक्रिया में, मोनो-बायोटिनेलेटेड बीडीएनएफवी अपनी जैविक गतिविधि को बरकरार रखता है।
न्यूरोट्रोफिन न्यूरोनल विकास और रखरखाव में भूमिका निभाने वाले लक्ष्य-व्युत्पन्न विकास कारक हैं। उन्हें विभिन्न न्यूरोनल डिब्बों के बीच लंबी दूरी के संकेत की अनुमति देने के लिए एंडोसाइटिक मार्ग के साथ तेजी से परिवहन तंत्र की आवश्यकता होती है। न्यूरोट्रोफिन की तस्करी का अध्ययन करने के लिए आणविक उपकरणों के विकास ने वीवो रिकॉर्डिंग में उपयोग करके सेल में इन प्रोटीनों की सटीक ट्रैकिंग को सक्षम किया है। इस प्रोटोकॉल में, हमने मोनो-बायोटिनाइलेटेड बीडीएनएफ के उत्पादन के लिए एक अनुकूलित और लागत प्रभावी प्रक्रिया विकसित की है। माइक्रोग्राम रेंज में एचईके293 कोशिकाओं में बायोटिनाइलेबल एवी सीक्वेंस (बीडीएनएफवी) युक्त एक पुनः संयोजन बीडीएनएफ संस्करण का उत्पादन किया जाता है और फिर आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके आसानी से स्केलेबल प्रक्रिया में शुद्ध किया जाता है। शुद्ध बीडीएनएफ को ट्यूब में एंजाइम बीरा के साथ सीधे इन विट्रो प्रतिक्रिया द्वारा सजातीय मोनो-बायोटिनिलेटेड किया जा सकता है। मोनो-बायोटिनेलेटेड बीडीएनएफ (एलबीटीबीडीएनएफ) की जैविक गतिविधि को विभिन्न फ्लोरोफोरस के लिए स्ट्रेप्टाविडिन-कंजूलेट करने के लिए संयोजित किया जा सकता है। बीडीएनएफवी और एलबीटीबीडीएनएफ ने क्रमशः पश्चिमी दाग और ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर सीआरईबी के सक्रियण का उपयोग करके डाउनस्ट्रीम फॉस्फोरलेटेड लक्ष्यों का पता लगाने के माध्यम से अपनी जैविक गतिविधि को बनाए रखा। स्ट्रेप्टाविडिन-क्वांटम डॉट्स का उपयोग करके, हम सीआरईबी के सक्रियण के साथ mbtBDNF आंतरिककरण सहवर्ती कल्पना करने में सक्षम थे, जिसे फॉस्फो-सीआरईबी विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ पाया गया था। इसके अलावा, स्ट्रेप्टाविडिन-क्वांटम डॉट्स के लिए स्ट्रेप्टाविडिन-क्वांटम डॉट्स के लिए संयुग्मित mbtBDNF माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों में उगाए जाने वाले कॉर्टिकल न्यूरॉन्स में प्रतिगामी परिवहन विश्लेषण के लिए उपयुक्त था। इस प्रकार, ट्यूब में उत्पादित mbtBDNF शारीरिक संकेत एंडोसोम गतिशीलता और न्यूरॉन्स में तस्करी का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण है।
न्यूरॉन्स तंत्रिका तंत्र की कार्यात्मक इकाइयां हैं जिनमें एक जटिल और विशेष आकृति विज्ञान है जो सिनैप्टिक संचार की अनुमति देता है, और इस प्रकार, विविध उत्तेजनाओं के जवाब में समन्वित और जटिल व्यवहार की पीढ़ी। डेनड्राइट्स और एक्सॉन जैसे न्यूरोनल अनुमान न्यूरोनल संचार में शामिल महत्वपूर्ण संरचनात्मक विशेषताएं हैं, और न्यूरोट्रोफिन उनकी आकृति विज्ञान और फ़ंक्शन1का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण खिलाड़ी हैं। न्यूरोट्रोफिन स्रावित विकास कारकों का एक परिवार है जिसमें एनजीएफ, एनटी-3, एनटी-4, और मस्तिष्क-व्युत्पन्न न्यूरोट्रोफिक फैक्टर (बीडीएनएफ)2शामिल हैं। केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में, बीडीएनएफ न्यूरोट्रांसमिशन, डेंड्रिटिक आर्बोराइजेशन, डेंड्रिटिक कताई की परिपक्वता, दीर्घकालिक शक्तिशाली, अन्य3,,4सहित विविध जैविक प्रक्रियाओं में भाग लेता है। इसलिए, बीडीएनएफ न्यूरोनल फ़ंक्शन को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।
विविध सेलुलर प्रक्रियाएं बीडीएनएफ गतिशीलता और कार्य को विनियमित करती हैं। न्यूरोनल सतह पर, बीडीएनएफ ट्रोपोमायोसिन रिसेप्टर किनेज़ बी (TrkB) और/या p75 न्यूरोट्रोफिन रिसेप्टर (p75) को बांधता है । बीडीएनएफ-TrkB और BDNF-p75 परिसरों को एंडोसिटोस किया जाता है और,विभिन्न एंडोसाइटिक ऑर्गेनेल्स5,6,7, 8में क्रमबद्ध कियाजाताहै।,, बीडीएनएफ/ट्राकीएनबी परिसर की सही इंट्रासेलुलर तस्करी विभिन्न न्यूरोनल सर्किट 9 , 10,,11में उचित बीडीएनएफ सिग्नलिंग के लिए आवश्यक है।9 इस कारण से, स्वास्थ्य और रोग में बीडीएनएफ सिग्नलिंग को समझने के लिए बीडीएनएफ तस्करी गतिशीलता और रोगविज्ञानी प्रक्रियाओं में पाए जाने वाले इसके परिवर्तनों की गहरी समझ आवश्यक है। इस प्रक्रिया की निगरानी के लिए उपन्यास और विशिष्ट आणविक उपकरणों के विकास से इस क्षेत्र को आगे बढ़ाने और शामिल नियामक तंत्र की बेहतर समझ की अनुमति देने में मदद मिलेगी ।
न्यूरॉन्स में बीडीएनएफ तस्करी के अध्ययन के लिए कई उपकरण उपलब्ध हैं। आमतौर पर उपयोग की जाने वाली पद्धति में फ्लोरोसेंट अणुओं जैसे ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) या जीएफपी एमसीएचरी12, 13,13के मोनोमेरिक फ्लोरोसेंट लाल-स्थानांतरित संस्करण के साथ टैग किए गए पुनर्संवहन बीडीएनएफ के ट्रांसफेक्शन शामिल हैं। हालांकि, बीडीएनएफ ओवरएक्सप्रेशन की एक बड़ी कमी यह है कि यह इस न्यूरोट्रोफिन की ज्ञात सांद्रता देने की संभावना को समाप्त करता है। इसके अलावा, इसके परिणामस्वरूप सेलुलर विषाक्तता हो सकती है, जो परिणामों की व्याख्या को अस्पष्ट कर सकती है14। एक वैकल्पिक रणनीति एक एपिटोप-टैग किए गए TrkB का ट्रांसफैक्शन है, जैसे फ्लैग-TrkB। यह पद्धति TrkB आंतरिकता गतिशीलता15के अध्ययन की अनुमति देता है, लेकिन इसमें ट्रांसफैक्शन भी शामिल है, जिसके परिणामस्वरूप TrkB फ़ंक्शन और सेलुलर विषाक्तता बदल सकती है। इन पद्धतिगत बाधाओं को दूर करने के लिए, एवी अनुक्रम (बीडीएनएफवी) वाले एनजीएफ और बीडीएनएफएफ के पुनः संयोजन वेरिएंट, जिसे बायोटिन-लिगासे एंजाइम बीरा द्वारा मोनो-बायोटिनीलेटेड किया जा सकता है,16,,17विकसित किए गए थे। बायोटिनेलेटेड रीकॉम्बिनेंट बीडीएनएफ को विभिन्न स्ट्रेप्टाविडिन-बाउंड टूल्स के साथ मिलाया जा सकता है, जिसमें फ्लोरोफोरस, मोती, पैरामैग्नेटिक नैनोकणों को पता लगाने के लिए अन्य लोगों के बीच शामिल हैं। लाइव-सेल इमेजिंग के संदर्भ में, क्वांटम डॉट्स (क्यूडी) अक्सर उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोफोरस बन गए हैं, क्योंकि उनके पास एकल-कण ट्रैकिंग के लिए वांछनीय विशेषताएं हैं, जैसे कि छोटे अणु फ्लोरोफोरस18की तुलना में फोटोब्लैचिंग के लिए बढ़ी हुई चमक और प्रतिरोध।
बीडीएनएफवी का उपयोग करके मोनो-बायोटिनेलेटेड बीडीएनएफ (एलबीटीबीडीएनएफ) का उत्पादन बीडीएनएफवी और बीरा की अभिव्यक्ति को चलाने वाले प्लाज्मिड्स के सह-ट्रांसफैक्शन द्वारा प्राप्त किया गया है, जिसके बाद एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी द्वारा रीकॉम्बिनेंट प्रोटीन की शुद्धि के साथ 1-2 μg बीडीएनएफ प्रति 20 मीटर की उपज के साथ HEK293-कंडीशन संस्कृति मीडिया177. यहां, हम इस प्रोटोकॉल के संशोधन का प्रस्ताव करते हैं जो एचईके 293-वातानुकूलित मीडिया के 500 एमएल से BDNFAvi शुद्धि की अनुमति देता है, जो हेरफेर की आसानी के लिए क्रोमेटोग्राफी-कॉलम आधारित प्रोटोकॉल में प्रोटीन वसूली को अधिकतम करना चाहता है। इस्तेमाल किया ट्रांसफैक्शन एजेंट, पॉलीथीलीनीमाइन (पीआई), ट्रांसफेक्शन उपज का त्याग किए बिना लागत प्रभावी विधि सुनिश्चित करता है। मोनो-बायोटिनिलेशन चरण को सह-ट्रांसफेक्शन से जुड़ी जटिलताओं से बचने और बीडीएनएफ की सजातीय लेबलिंग सुनिश्चित करने के लिए इन विट्रो प्रतिक्रिया के लिए अनुकूलित किया गया है। माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों में बीडीएनएफ के प्रतिगामी अक्षीय परिवहन का अध्ययन करने के लिए पीसीआरईबी और लाइव सेल इमेजिंग की सक्रियता सहित पश्चिमी दाग और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी प्रयोगों द्वारा एमटीबीबीडीएनएफ की जैविक गतिविधि का प्रदर्शन किया गया था। इस प्रोटोकॉल का उपयोग समरूप मोनो-बायोटिनिलेटेड और जैविक रूप से सक्रिय बीडीएनएफ के अनुकूलित, उच्च उपज उत्पादन के लिए अनुमति देता है।
इस लेख में, एक आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी-आधारित प्रक्रिया में एलबीटीबीडीएनएफ के उत्पादन और शुद्धिकरण के लिए एक अनुकूलित पद्धति का वर्णन किया गया है, जो सुंग और सहयोगियों के काम के आधार पर17है। अ…
The authors have nothing to disclose.
लेखकों कृतज्ञता Fondecyt (११७११३७) (FCB), विज्ञान और प्रौद्योगिकी में उत्कृष्टता के बेसल केंद्र (AFB १७०००५) (FCB), मिलेनियम-न्यूकीय से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैus (P07/011-F) (FCB), वेलकम ट्रस्ट सीनियर अन्वेषक पुरस्कार (107116/Z/15/Z) (जीएस) और एक यूके डिमेंशिया रिसर्च इंस्टीट्यूट फाउंडेशन अवार्ड (जीएस) । इस काम को यूनिदाद डी माइक्रोस्कोपिया अवनजादा यूसी (उमा यूसी) ने सपोर्ट किया ।
2 way stopcock | BioRad | 7328102 | Chromatography apparatus component |
2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | BDNF elution buffer |
Acrylamide/Bisacrylamide | BioRad | 1610154 | SDS-PAGE gel preparation |
Amicon Ultra-15 10K | Millipore | UFC901024 | BDNF concentration |
Ammonium Persulfate | Sigma | A9164 | SDS-PAGE gel preparation |
anti B-III-Tubulin antibody | Sigma | T8578 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
anti BDNF antibody | Alomone | AGP-021 | Western blot assays for BDNF quantification |
anti BDNF antibody | Alomone | ANT-010 | Western blot assays for BDNF quantification |
Anti ERK antibody | Cell Signaling | 9102 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
anti pCREB antibody (S133) | Cell Signaling | 9198 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
anti pERK antibody (T202, Y204) | Cell Signaling | 4370 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
anti pTrkB antibody (Y515) | Abcam | ab109684 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-062 | HEK293 maintenance |
ATP | Sigma | A26209 | BDNF monobiotinylation buffer |
B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | Neuron maintenance |
Bicine | Sigma | B3876 | BDNF monobiotinylation buffer |
BirA-GST | BPS Bioscience | 70031 | Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation |
Bovine Fetal Serum | HyClone | HC.SH30396.02 | HEK293 maintenance |
Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence |
D-Biotin | Sigma | B4639 | BDNF monobiotinylation buffer |
Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11965-092 | Neuron seeding |
DMEM Medium | Gibco | 11995-081 | HEK293 maintenance |
Econo Column Funnel | BioRad | 7310003 | Chromatography apparatus component |
EDTA | Merck | 108418 | |
EZ-ECL Kit | Biological Industries | 1633664 | Protein detection by western blotting |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | Neuron and HEK293 maintenance |
Glycerol | Merck | 104094 | BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays |
Hettich Rotina 46R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for clearing the medium of debris |
Hettich Universal 32R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for protein concentrator centrifugation |
Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Neuron seeding |
ImageQuant LAS 500 | GE Healthcare Life Sciences | 29005063 | Western blot image acquisition |
Imidazole | Sigma | I55513 | BDNF buffer modification component |
KCl | Winkler | BM-1370 | PBS component |
KH2PO4 | Merck | 104873 | PBS component |
Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Cover coating for compartmentalized neurons |
Luer Tubing Adaptor | BioRad | 7323245 | Chromatography apparatus component |
Luminata™ Forte Western HRP Substrate | Millipore | WBLUF0100 | Protein detection by western blotting |
Mg(CH3COO)2 | Merck | 105819 | BDNF monobiotinylation buffer |
Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | Mounting reagent for immunofluorescence assays |
MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads | Invitrogen | 65001 | Biotinylation verification |
Na2HPO4 | Merck | 106586 | BDNF buffer modification component |
NaCl | Winkler | BM-1630 | PBS component, BDNF buffer modification component |
NaH2PO4 | Merck | 106346 | BDNF buffer modification component |
Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Neuron maintenance |
Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | 30210 | BDNF AviTag purification |
Nikon Ti2-E | Nikon | Microscope for fluorescence imaging | |
Nitrocellulose Membrane | BioRad | 1620115 | Protein transfer for western blotting |
ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Camera for epifluorescence imaging |
P8340 Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | BDNF buffer modification component |
Paraformaldehyde | Merck | 104005 | Fixative for immunofluorescence assays |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Neuron maintenance |
Poli-D-Lysine | Corning | DLW354210 | Cover coating for compartmentalized neurons |
Poli-L-Lysine | Millipore | P2363 | Cover coating for non-compartmentalized neurons |
Poly-Prep Chromatography Column | BioRad | 7311550 | Chromatography apparatus component |
Polyethyleneimine 25K | Polysciences Inc. | PLY-0296 | HEK293 transfection |
Quantum Dots 655 streptavidin conjugate | Invitrogen | Q10121MP | Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments |
Saponin | Sigma | S4521 | Detergent for immunofluorescence assays |
Sucrose | Merck | 107687 | |
Syldgard 184 silicone elastomer base | Poirot | 4019862 | Microfluidic chamber preparation |
TEMED | Sigma | T9281 | SDS-PAGE gel preparation |
Tris | Winkler | BM-2000 | Lysis buffer component |
Triton X100 | Merck | 108603 | Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays |
Trypsin-EDTA 0.5% | Gibco | 15400-054 | HEK293 passaging |