Summary
Avi 서열을 포함하는 재조합 BDNF(BDNFAvi)는 HEK293 세포에서 비용 효율적인 방식으로 생산되며 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. BDNFavi는 튜브에 효소 BirA와 직접 모노 바이오티니화된다. BDNFavi 및 모노 바이오타이니드 BDNFavi는 시판되는 BDNF와 비교하여 생물학적 활성을 유지합니다.
Abstract
Avi 서열을 포함하는 재조합 BDNF(BDNFAvi)는 HEK293 세포에서 생산된 다음 친화 성염색체에 의해 비용 효율적으로 정제된다. 재현 가능한 프로토콜은 튜브에 효소 BirA와 직접 모노 바이오티니레이트 BDNFAvi를 개발하였다. 이 반응에서, 모노 바이오티니화 BDNFAvi는 그것의 생물학 활동을 유지합니다.
Neurotrophins는 신경 발달 및 유지 보수에 있는 역할을 하는 표적 유래 성장 인자입니다. 그(것)들은 다른 신경 구획 사이 장거리 신호화를 허용하기 위하여 내분비 통로를 따라 급속한 수송 기계장치가 필요합니다. neurotrophins의 인신 매매를 연구하는 분자 공구의 발달은 생체 내 기록을 사용하여 세포에 있는 이 단백질의 정확한 추적을 가능하게 했습니다. 이 프로토콜에서는 모노 바이오타이니드 BDNF 생산을 위한 최적화되고 비용 효율적인 절차를 개발했습니다. 생체개능 avi 서열(BDNFAvi)을 함유한 재조합 BDNF 변종은 마이크로그램 범위의 HEK293 세포에서 생산된 다음 친화성 크로마토그래피를 사용하여 쉽게 확장 가능한 절차로 정제된다. 정제된 BDNF는 튜브내 효소 BirA와의 직접 체외 반응에 의해 균일하게 모노 바이오티니화될 수 있다. 모노 바이오타이니드 BDNF(mbtBDNF)의 생물학적 활성은 상이한 형광에 대한 연쇄상 구각에 공인될 수 있다. BDNFAvi 및 mbtBDNF는 각각 서부 얼룩을 사용하여 하류 인광 표적의 검출및 전사 인자 CREB의 활성화를 통해 입증된 생물학적 활성을 유지한다. 스트렙타비딘 양자점을 사용하여, 우리는 인계 CREB 특정 항체로 검출된 CREB의 활성화와 수반되는 mbtBDNF 내재화를 시각화할 수 있었습니다. 또한, mbtBDNF는 연쇄상 구균-양자점에 공주하여 미세유체 챔버에서 자란 피질 뉴런의 역행 운송 분석에 적합했다. 따라서, 튜브에서 생성된 mbtBDNF는 뉴런에서 생리적 신호 내역및 인신매매를 연구하는 신뢰할 수 있는 도구이다.
Introduction
뉴런은 시냅스 통신을 허용하는 복잡하고 전문적인 형태를 소유하는 신경계의 기능 단위이며, 따라서 다양한 자극에 대응하여 조정되고 복잡한 행동의 생성이다. 점선 및 축삭과 같은 신경 투영은 신경 통신에 관여하는 중요한 구조적 특징이며, neurotrophins는 그들의 형태와 기능1을결정하는 결정적인 선수입니다. Neurotrophins는 NGF, NT-3, NT-4 및 두뇌 유래 신경 영양인자 (BDNF)2를포함하는 분비성장 인자의 가족입니다. 중추신경계(CNS)에서 BDNF는 신경전달, 수지상 식소, 수지상 척추의 성숙, 장기 전능성 등 다양한 생물학적 과정에 참여한다3,,4. 따라서, BDNF는 신경 기능을 조절에 중요한 역할을 한다.
다양한 세포 프로세스는 BDNF 역학 및 기능을 조절합니다. 신경 표면에, BDNF는 tropomyosin 수용체 키나아제 B (TrkB) 및/또는 p75 neurotrophin 수용체 (p75)를 결합합니다. BDNF-TrkB 및 BDNF-p75 복합체는 내분비소로 분류되어 다른 내세포 세포기관5,,6,,7,,8에서분류된다. BDNF/TrkB 복합체의 정확한 세포내 인신 매매는 다른 뉴런회로9,,10,,11에서적절한 BDNF 신호에 필요합니다. 이러한 이유로, BDNF 인신 매매 역학의 깊은 이해와 병리학 적 과정에서 발견 되는 그것의 변경 은 건강 및 질병에 BDNF 신호를 이해 하는 데 필수적이다. 이 과정을 모니터링하는 신규 및 특정 분자 도구의 개발은이 분야를 앞으로 추진하고 관련된 규제 메커니즘을 더 잘 파악하는 데 도움이 될 것입니다.
뉴런에서 BDNF 인신 매매의 연구에 사용할 수있는 몇 가지 도구가 있습니다. 일반적으로 사용되는 방법론은 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 GFP mCherry12,13의단황 형광 적변 변이체와 같은 형광 분자로 태그된 재조합 BDNF의전환과관련이 있다. 그러나, BDNF 과발현의 주요 단점은 이 neurotrophin의 알려진된 농도를 전달의 가능성을 제거 한다는 것입니다. 또한, 세포 독성이 발생할 수 있으며,결과(14)의해석을 모호하게 할 수 있다. 대체 전략은 플래그-TrkB와 같은 에피토프 태그가 지정된 TrkB의 전환입니다. 이 방법론은 TrkB 내재화 역학 의 연구를 허용15,하지만 그것은 또한 트랜스페션을 포함, 변경 된 TrkB 기능 및 세포 독성귀착될 수 있습니다. 이러한 방법론적 장애물을 극복하기 위해, 비틴-리게아제 효소 BirA에 의해 모노 바이오티닝될 수 있는 Avi 서열(BDNFAvi)을 함유하는 NGF 및 BDNF의 재조합 변이체가16,,17로개발되었다. 바이오타이니드 재조합 BDNF는 형광, 구슬, 파라자성 나노 입자를 포함하는 다른 스트렙타비딘 바운드 도구에 결합될 수 있다. 살아있는 세포 이미징의 관점에서, 양자점(QD)은 소분자형광호(18)에비해 광표백에 대한 밝기 및 저항증가와 같은 단일 입자 추적에 바람직한 특성을 가지므로 자주 사용되는 형광이 되고 있다.
BDNFAvi를 이용한 모노바이오티니얼BDNF(mbtBDNF)의 생산은 BDNFAvi와 BirA의 발현을 구동하는 플라스미드의 공동 변환에 의해 달성되었으며, 그 다음으로 20m2의 BDNF 의 수율1-2μg의 수율로 합산 단백질의 정제를달성하였다. 여기서는 조작의 용이성을 위해 크로마토그래피 컬럼 기반 프로토콜에서 단백질 회복을 극대화하고자 하는 HEK293 컨디셔닝 된 미디어의 500mL에서 BDNFAvi 정화를 허용하는 이 프로토콜의 수정을 제안합니다. 사용된 경피제인 폴리에틸렌네이민(PEI)은 경질 수율을 희생하지 않으면서 비용 효율적인 방법을 보장합니다. 모노 바이오타이니션 단계는 공동 트랜스페션과 관련된 합병증을 피하고 BDNF의 균일한 라벨링을 보장하기 위해 체외 반응에 적응되었습니다. mbtBDNF의 생물학적 활성은 마이크로 유체 챔버에서 BDNF의 역행 축축산 수송을 연구하기 위해 pCREB 및 라이브 세포 이미징의 활성화를 포함하여 서양 블롯 및 형광 현미경 실험에 의해 입증되었다. 이 프로토콜을 사용하면 균일한 모노 바이오티니화 및 생물학적 활성 BDNF의 최적화된 고수량 생산을 허용합니다.
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Protocol
모든 실험은 CONICYT (칠레 과학 기술 연구위원회)의 승인 된 지침에 따라 수행되었습니다. 이 연구에서 사용된 프로토콜은 폰티피시아 대학 카톨리카 데 칠레의 생물 보안 및 생물 윤리 및 동물 복지 위원회에 의해 승인되었습니다. 척추 동물과 관련된 실험은 폰티피시아 대학 카톨리카 데 칠레의 생물 윤리 및 동물 복지위원회에 의해 승인되었습니다.
참고: 다음 프로토콜은 HEK293 세포에서 생산된 조건부 배지의 총 부피 500mL로부터 BDNFAvi를 정화하도록 설계되었습니다. BDNFAvi를 정화하기 위해 생산 및 처리되는 조건부 매체의 양은 필요에 따라 위 또는 축소될 수 있습니다. 그러나 이러한 상황에서는 추가 최적화가 필요할 수 있습니다. 프로토콜 전체에 사용되는 배양 매체 및 버퍼의 구성은 보충 재료에서 찾을 수 있습니다.
1. HEK293 컨디셔닝 된 미디어에서 BDNFAvi의 생산 및 정화
- HEK293 세포의 트랜스페트
- HEK293 세포를 37 ºC에서 15cm 배양 요리로 보충DMEM 배지(소 태아 혈청 10%, 글루타민1배보충제, 항생제/항마이코틱)에서 70%로 성장시다.
- 매체를 트랜스페션 버퍼로 변경합니다.
- FEI-DNA 혼합물을 대입용준비한다. DNA와 PEI 25 K를 희석하기 위해 각각 2개의 다른 15 mL 원추형 관을 사용합니다. 플라스미드 DNA 20μg을 한 튜브에 500 μL의 최종 부피로 희석시. 다른 튜브의 500 μL의 최종 부피에서 선형 PEI 25K의 60 μg를 희석시십시오. 실온에서 5분 동안 배양하십시오.
- DNA 용액을 PEI 튜브에 조심스럽게 피펫하여 업다운 모션으로 한 번 혼합합니다. 실온에서 25분 동안 배양하십시오.
- 각 15cm 접시에 걸쳐 PEI DNA 혼합물의 1mL를 드립. 37 ºC에서 3 시간 동안 PEI DNA 혼합물로 세포를 배양합니다.
- 매체를 신선한 인큐베이션 버퍼로 변경합니다.
- 미디어 수집 및 저장
- HEK293 세포의 트랜스퍼전 후 48h의 모든 요리에서 배지를 수집한다. 보충 파일 1의 "상수 수정 버퍼"섹션에 설명 된 솔루션의 집중 된 주식을 준비하고 나열된 최종 농도를 달성하기 위해 HEK293 상체에 추가합니다.
참고: 추가 분석을 위해 셀을 폐기하거나 복구할 수 있습니다. - 15 분 동안 얼음에 매체를 배양.
- 배지를 원심분리기 튜브로 알리쿼트합니다.
- 심정분리기는 4°C 원심분리기에서 45분 동안 10,000 x g에서 배지를 분리합니다. 이 단계는 미디어에 매달린 세포 파편과 죽은 세포의 제거를 허용합니다.
- 슈퍼네이트수집, 최종 농도0.1%로 BSA를 추가한다. 그런 다음 -20 °C에 보관하십시오. 정화 단계에서 더 빠른 해빙을 위해 동결하기 전에 미디어를 알리인용할 수 있습니다.
참고: 최대 2개월의 고정 된 조건 된 미디어의 저장 시간은 긍정적 인 결과를 산출했으며 저장 시간이 길어지지 않았습니다.
- HEK293 세포의 트랜스퍼전 후 48h의 모든 요리에서 배지를 수집한다. 보충 파일 1의 "상수 수정 버퍼"섹션에 설명 된 솔루션의 집중 된 주식을 준비하고 나열된 최종 농도를 달성하기 위해 HEK293 상체에 추가합니다.
- 미디어 농도 및 정화
- 37°C 열조절식에서 미디어를 해동한다.
- 미디어를 원심분리기 튜브로 알리쿼트합니다.
- 원심분리기는 4°C 냉각 원심분리기에서 3,500 x g에서 1h의 배지를 냉각시켰다. 이 단계를 사용하면 잔류 세포 이물질을 제거하여 크로마토그래피 컬럼을 통한 적절한 흐름을 보장할 수 있습니다.
- 10kDa 컷오프로 단백질 농축기를 사용하여 미디어를 500mL에서 100mL로 줄입니다. 최적의 농도를 위해 제조업체에서 권장하는 원심분리 매개 변수를 따르십시오.
- 500 μL의 Ni-NTA 아가로즈 구슬을 농축 된 미디어에 추가하고 로커에서 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
- 크로마토그래피 장치를 조립하고 미디어를 붓습니다. 5분 동안 휴식을 취한 다음 2방향 스톱콕을 열어 중간 이면에 흐르게 합니다.
- 5mL의 워시 버퍼로 구슬을 5분 동안 세척하십시오. 2방향 스톱콕을 열어 세척 버퍼를 빼내십시오. 3번 반복합니다.
- 열에 용출 버퍼 1mL을 추가합니다. 열의 구슬을 다시 일시 중지해야 합니다. 15분 동안 배양한 다음 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브에서 용출을 수집합니다. BDNFAvi의 완전한 용출을 위해 이 단계를 3번 반복합니다.
- 15% 폴리아크릴아미드 젤에 각 용출액의 5 μL 및 시판 가능한 BDNF(40-160 ng)의 다른 농도를 적재한다. 항-BDNF 항체를 사용하여 서양 블로팅에 의한 정제 된 단백질을 검출한다.
- 시판되는 BDNF와 함께 제조된 농도 곡선을 사용하여 각 용출액에서 정제된 BDNFAvi의 농도를 결정한다.
- Aliquot 및 정제 된 BDNFAvi를 -80 °C에 저장합니다.
2. BirA 효소를 사용하여 BDNFAvi의 체외 모노 바이오타이니션
-
체외 모노 바이오타이니션 반응
- 바이오타이니션 완충 시약의 농축 재고 솔루션을 준비합니다. 농축 된 주식의 사용은 재조합 단백질의 희석을 최소화할 것입니다.
- BDNFAvi의 800 ng의 알리쿼트를 취하고 BDNF에 1:1 어금니관계에서 생체자극완완화 시약및 효소 BirA를 추가한다. 예를 들어, 200 μL 최종 반응 부피 추가; BDNFAvi 800 ng, 20 μL Bicine 0.5 M pH 8.3, 20 μl ATP 100 mM, 20 μL MgOAc 100mM, 20 μL d-비오틴 500 μM, 0.8-1 μg ~ 1 μL 을 포함하는 용액의 100 μL은 1 μL 및 1 μL의 1 μL을 완료합니다.
참고: 성공적인 생체자극 반응은 약 30 ng/μL BDNFAvi의 농도를 포함하는 400 μL의 알리쿼트로 수행되어 최종 반응에서 ~20 ng/μL의 최종 농도로 균질적으로 생체화된 BDNFAvi를 초래한다. - 혼합물을 30°C에서 1시간 동안 혼성화 오븐에서 배양합니다.
- 2.1.2 단계와 동일한 양의 ATP 및 BirA를 추가하고 2.1.3 단계를 반복합니다.
- 향후 분석을 위해 -80°C에 보관하거나 즉시 사용할 수 있도록 얼음을 유지하십시오(예: 생체타이니화 품질 관리).
- 바이오타이니션 분석
- 블로킹 버퍼의 1mL에서 BDNF 샘플 당 스트렙타비딘 자기 비드의 30 μL을 차단합니다. 마이크로 센트심분리기 튜브 회전기에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
- 자기 분리 랙을 사용하여 3~5분 동안 또는 버퍼가 구슬을 완전히 지워버리고 차단 버퍼를 버릴 때까지 자기 구슬을 침전시합니다.
- 50 μL의 신선한 블로킹 버퍼와 80 ng의 모노 바이오티니화 BDNFAvi(mbtBDNF) 샘플을 구슬에 추가하여 배피를 통해 완전히 재보습하십시오.
- 약 20 RPM에서 회전하는 미세 원심분리기 튜브 회전기에서 4°C에서 1h에 대한 배양.
- 자기 분리 랙을 사용하여 3~5분 동안 구슬을 수집하고, 분석을 위해 30μL 알리쿼트를 유지하면서 상퍼를 수집합니다.
- PBS의 500 μL로 구슬을 한 번 씻은 다음 자기 분리 랙을 사용하여 3~5분 동안 수집합니다. 상체를 복구하고 분석을 위해 30 μL 알리쿼트를 유지합니다.
- 구슬에 4배 로딩 버퍼의 10 μL을 추가합니다.
- 샘플을 7분 동안 97°C로 가열하여 mbtBDNF를 엘로트합니다.
- 항-BDNF 특이적항체(19)를이용하여 mbtBDNF를 검출한다.
3. mbtBDNF 생물학적 활성 검증
- 서부 블롯에 의한 pTrkB 및 pERK 의 검출.
- 60mm 배양 접시에 2백만 개의 쥐 피질 뉴런을 시드하십시오.
- 7 일 동안 뉴런을 배양 (DIV7). 그런 다음 실험을 시작할 때 배지를 비보충 신경병으로 변경합니다.
- 중간 변화 후 1 시간, 50 ng /mL의 최종 농도에 mbtBDNF를 추가합니다. 37 ºC에서 30 분 동안 배양하십시오. 음의 제어 접시(BDNF로 자극되지 않는)와 양수 제어 접시(50 ng/mL의 시판 가능한 BDNF로 처리)를 유지하십시오.
- 중간 매체를 수집하고 부드럽게 1x PBS로 모든 접시를 씻어. 수집하고 1배 의 PBS를 폐기하십시오.
- 접시를 얼음 위에 놓고 각 접시에 50-80 μL의 용해 버퍼를 추가합니다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 셀을 lyse합니다.
참고: 리시스 단계는 단백질 탈포실화 및 분해를 피하기 위해 가능한 한 빨리 수행해야 합니다. 격렬한 스크레이핑의 1-2 분은 서양 얼룩에 의해 관심있는 단백질을 시각화하기에 충분합니다. - 용해 버퍼를 수집하고 5 s의 최고 속도로 소용돌이 믹서를 저어.
- 10분 동안 14,000 x g(4°C)에서 리시스 버퍼를 원심분리합니다. g
- BCA 단백질 정량화프로토콜(20)에의해 상피물의 단백질 함량을 정량화한다.
- 조건당 단백질30-50 μg를 함유한 알리쿼트에 적재 버퍼를 추가하고 서부 블로팅을 위해 12% 폴리아크릴아미드 젤에 적재합니다. BDNFAvi 생물학적 활성을 확인하기 위해 특정 인-항체를 사용하여 pTrkB 및 pERK를 검출합니다.
- pCREB 면역 형광에 의한 BDNF-QD 생물학적 활성의 검증.
- 씨앗 40,000 랫트 피질 뉴런 10 mm 커버립, 이전에 자동 적으로 및 이전에 설명 된 대로 폴리 L-리신으로 처리21.
- 37 ºC에서 뉴런 유지 보수 버퍼 (보충 재료 참조)에서 7-8 일 동안 뉴런을 배양합니다.
- 실험을 시작하려면 배지를 보충되지 않은 신경 물질 매체로 변경하고 37 ºC에서 1 h로 배양합니다.
- mbtBDNF를 양자점(BDNF-QD)에 결합하여 mbtBDNF 알리쿼트, 필요한 퀀텀닷 스트렙타비딘 컨쥬게이트(streptavidin-QD)를 추가하여 1:1 BDNF-QD 어이어 비율을 달성하도록 준비한다. 그런 다음 신경 물질 배지로 20 μL로 희석하십시오. 튜브를 알루미늄 호일로 감싸서 빛으로부터 보호합니다.
참고: 동일한 양의 퀀텀닷 스트렙타비딘 공주체로 다른 튜브를 준비하고 음의 대조군으로서 신경물질 배지로 20 μL로 희석합니다. - mbtBDNF/ 스트렙타비딘-QD 혼합물을 로커의 실온에서 30분 동안 배양합니다.
- BDNF-QD를 신경유배지에서 원하는 최종 농도(200pM 및 2nM)로 희석한다.
- 비보충 신경물질 배지로 1시간 의 인큐베이션 후, BDNF-QD 또는 스트렙타비딘-QD(대조군)로 뉴런을 37°C에서 30분 동안 200pM 및 BDNF 2nM의 최종 농도로 자극한다.
- 커버립을 1x PBS(37°C)로 3회 세척하고, 포스파타아제 억제제를 함유한 4% 파라포름알데히드 용액으로 커버슬립을 처리하여 15분 동안 세포를 고정한다.
- PBS로 세포를 3회 세척한 다음 블로킹/투과화 버퍼(BSA 5%, Triton X-100 0.5%, 1x 포스파타제 억제제)로 1h로 배양한다.
- 항 pCREB 항체 1:500 (3 % BSA, 0.1 % 트리톤 X-100)을 4 ° C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
- 다음 날, 1x PBS로 3회 세척하고, 이차 항체 1:500(3% BSA, 0.1% 트리톤 X-100)으로 1시간 동안 배양한다.
- 1x PBS로 3회 세척합니다. Hoechst 핵 얼룩 용액 (5 μg /mL)을 7 분 동안 추가합니다.
- 1x PBS로 3회 세척하고 마운트합니다.
- 살아있는 뉴런에서 BDNF-QD의 역행 축축운송 의 시각화
- 이전에 설명된 바와 같이 미세유체 챔버및 종자 뉴런을준비한다 16.
- 문화에서 7-8 일 후, 비 보충 신경 물질 매체로 매체를 변경합니다.
- mbtBDNF를 양자점(BDNF-QD)에 결합하여 mbtBDNF 알리쿼트, 필요한 퀀텀닷 스트렙타비딘 컨쥬게이트(streptavidin-QD)를 추가하여 1:1 BDNF-QD 어이어 비율을 달성하도록 준비한다. 그런 다음 신경 물질 배지로 20 μL로 희석하십시오. 튜브를 알루미늄 호일로 감싸서 빛으로부터 보호합니다.
참고: 동일한 양의 퀀텀닷 스트렙타비딘 공주게이트로 다른 튜브를 준비하고 신경물질 배지를 대조군으로 20 μL로 희석시다. - mbtBDNF/ 스트렙타비딘-QD 혼합물을 로커의 실온에서 30분 동안 배양합니다.
- BDNF-QD를 원하는 최종 농도(2nM)로 희석합니다.
- 비보충 신경물질 배지를 가진 1h의 배양 후 BDNF-QD 또는 대조군 혼합물을 미세유체 챔버의 축축 구획에 첨가한다. BDNF-QD의 순 역행 수송을 보장하기 위해 37 °C에서 210 분 동안 배양하십시오.
- 라이브 셀 이미징의 경우, 이러한 목적(37°C 및 5% CO2)에 적합한 현미경을 사용하여 100배 의 목표를 사용하여 세포 체납구에 근접하는 마이크로그루브 세그먼트에서 축소 역행 수송을 시각화한다. 1 프레임/s에서 이미지를 수집합니다.
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Representative Results
크로마토그래피 컬럼 기반 프로토콜을 사용하면 상당한 양의 HEK293 조건부 미디어를 처리할 수 있습니다. 도 1에서,조건부 미디어의 500mL로부터 BDNFAvi의 정제 결과를 도시한다. Ni-NTA 아가로즈 구슬로부터 BDNFAvi의 연속 출례는 BDNFAvi의 농도감소(도 1A)를산출한다. 4회 연속 출루(각 15분 간) 구슬에 의해 포착된 BDNF의 대부분이 회복됩니다. 용출물의 농도는 6 내지 28 ng/μL범위이며, 총 수율은 BDNFAvi(표1)의약 60μg에 달한다. 생성된 BDNFAvi는 그 때 비생물화BDNFAvi의 부재에 의해 입증된 바와 같이 BirA-GST에 의해 중재된 체외 반응에 의해 효율적으로 생체화되었다(도1B). 도 1B에 제시된 생체세니클은 생성된 총 BDNF의 알리쿼트에 해당하지만, 더 큰 부피를 위해 반응을 확대할 수 있습니다.
이어서, mbtBDNF의 생물학적 활성은 2개의 상이한 실험접근법을 사용하여 평가되었다. 먼저, 60mm 플레이트(200만 뉴런, DIV7)로 시드된 피질 뉴런은 30분 동안 mbtBDNF의 50 ng/mL로 자극되었고, 이어서 단백질은 서부 얼룩 분석을 위해 제조되었다. mbtBDNF의 생물학적 활성은 pTrkB(Y515) 및 pERK(T202/Y204)를 검출함으로써 정량화되었다. TrkB에 BDNF의 결합은 세포 내 도메인에서 자가인포식화 반응을 통해 수용체의 활성화를 유발하고, ERK는 BDNF 신호 전달경로(22)의공지된 표적이다. 두 인광 단백질에 대한 밴드는 상용 BDNF 및 mbtBDNF로 치료된 뉴런에서 유사한 강도를 보였으며 둘 다 대조군상태(도 2A)보다더 강한 신호를 보였다. 이어서, mbtBDNF의 생물학적 활성은 연쇄상구비딘-QD에 결합되어 살아있는 이미징 실험에서 사용될 수 있음을 입증하기 위해 평가되었다. 피질 뉴런은 10mm 커버(커버당 40,000세포, DIV7)로 시드되었고, pCREB를 고정하고 염색하기 전에 30분 동안 200pM 또는 2nM BDNF-QD의 최종 농도로 처리하였다. CREB는 피질 뉴런22,,23에서활성화된 ERK1/2에 의해 표적으로 하는 전사 인자이다. BDNF-QD의 농도가 증가함에 따라 신경세포를 자극하여 CREB의 인산화및핵(도 2B)을둘러싼 QD 입자의 존재량 의존적인 증가가 발생했으며, 이는 BDNF-QD 입자가 내분세포화되었고 BDNF-QD 입자가 내분비화되어 BDNF-QD 와 관련된 신호 경로의 활성화를 촉발시켰다는 것을 나타낸다. pCREB 신호의 두 배 증가는 BDNF-QD(200 pM)의 낮은 농도로 뉴런을 자극할 때 검출되었으며, 반면 2nM으로 자극하면 pCREB신호(도 2C)가3.5배 증가하였다. 이러한 결과는 생체 화BDNFAvi가 생물학적으로 활성화되어 있으며, 면역 형광 및 살아있는 세포 이미징에 적합하게, streptavidin-QD에 결합 할 때 그 활동을 잃지 않는다는 것을 보여줍니다.
마지막으로, BDNF-QD의 이미징 잠재력은 미세유체 챔버를 사용하여 구획화된 배양에서 평가되었다. 피질 뉴런은 미세 유체 챔버에서 시드되었다 (15mm 커버, 50,000 개의 미세 유체 챔버 당 뉴런, DIV7) 축삭 및 소종 호르몬 드로이드 구획을 분리하 3.5 h. 라이브 세포 현미경 검사법을 위해 2 nM BDNF-QD로 자극하였으며, 그 결과 kymographs는 BDNF-QD의 속도를 정량화하는 데 사용되었다(기관3A). 0.91 μm/s의 평균 이동 속도가검출되었다(그림 3B),이는 세포질 다인 매개 수송7,,16의이전 분석에 부합한다. 2nM 스트렙타비딘-QD로 처리된 미세유체 챔버는 키모그래프(그림3A)에의해 도시된 바와 같이 마이크로그루브에서 움직이는 QD를 보여주지 않았다. 동일한 조건하에서 자란 세포는 500 pM 또는 2nM BDNF-QD로 210분 동안 자극한 다음 핵 염색으로 고정및 표시하였다. 도 3C에도시된 바와 같이, 뉴런은 마이크로그루브 및 소마토덴드리틱 구획의 근해 및 탈산 부분을 포함하여 모든 분석된 하위 구획에서 BDNF-QD의 투여 의존적 축적을 보여준다. 대조적으로, 제어 뉴런은 챔버 전체에 거의 QD 신호를 보여주지 않았다. 따라서, BDNF-QD는 미세유체 챔버에서 살아있는 및 고정 된 세포에서 검출될 수 있다.
그림 1: HEK293 세포에서 BDNFAvi의 생산 및 모노 바이오타이니션. HEK293 세포는 PEI 시약 및 BDNFAvi 인코딩 플라스미드를 사용하여 전염되었고, 48h. BDNFAvi는 니켈-니트리로트리아세아제산(Ni-NTA) 크로마토그래피를 사용하여 정화할 수 있는 6배 히스티딘 태그를 함유한 후 수집되었다. 시판되는 재조합 인간 BDNF는 ~13kDa의 예상 분자량을 가지며 BDNFAvi는 ~18kDa의 분자량을 표시합니다. 수지에 묶인 BDNFAvi는 4회 연속 용출 단계로 완전히 출동했다. (A)항체를 이용하여 서양 블롯을 사용하여 집에서 재조합 BDNF 및 상용 BDNF를 검출한다. BDNF에 대한 항체를 사용하여 BDNFAvi를 검출하기 위해 SDS-PAGE 젤에 각 용출물의 상업적으로 이용 가능한 인간 BDNF 및 5 μL의 알려진 양을 포함하는 알리쿼트. 표 1은 각 용출에 존재하는 BDNFAvi의 농도를 나타낸다. 각 용출액에서 BDNF의 양 과 농도는 시판되는 BDNF의 농도 곡선으로부터 의 밀도 분석 및 보간에 의해 얻어졌다. (B)BDNFAvi 생체 자극의 검증. 생체작BDNFAvi(mbtBDNF)의 80나노그램은 4°C에서 1시간 동안 자기 비드(20% 슬러리)에 결합된 스트렙타비딘30μL로 배양하였다. 이어서, 자기 구슬은 자기 분리기때문에 격리되었다. 스트렙타비딘 구슬은 바이오티니얼 BDNFAvi(구슬 차선)를 용인하기 위해 적재 버퍼로 가열되었다. 상수(SN 차선)는 또한 적재 버퍼로 처리되었고, 겔(SN 차선)에 가열 및 적재되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: mbtBDNF 생물학적 활성의 검증. (A)DIV7 피질 뉴런은 혈청이 1시간 동안 굶어 지었으며, 그리고 30분 동안 시판상사용 BDNF 또는 mbtBNF의 50 ng/mL로 자극되었다. 단백질은 인계 항체를 사용하여 TrkB 및 ERK1/2 인산화의 분석을 위해 SDS-PAGE 젤로 추출 및 로드되고 총 TrkB/ER2K에 대한 항체를 이용한 단백질의 총 수준에 비하여. (B)DIV7 피질 뉴런은 혈청이 1h로 굶어 죽인 다음, 30분 동안 스트렙타비딘-QD(BDNF-QD)에 결합된 mbtBDNF의 200 pM 또는 2nM의 최종 농도로 자극하였다. 이어서, 세포는 고정되었고 pCREB는 형광 현미경 분석을 위해 표지되었다. (C)핵pCREB 형광 강도의 정량화. 결과는 평균 ±SEM으로 도시된 3개의 독립적인 실험에서 함께 풀로 진 90개의 뉴런에 해당합니다. 통계 분석은 Tukey의 다중 비교 테스트(****p&0.0001)와 함께 단방향 ANOVA에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 라이브 및 고정 셀에서 BDNF-QD의 시각화. (A)미세유체 챔버에서 자란 DIV7 피질 뉴런은 3.5시간 동안 2nM BDNF-QD의 최종 농도로 축산구에서 자극되었고, 그 후 마이크로그루브의 근접 부분은 살아있는 세포 현미경 설정을 사용하여 이미지화되었다. 대조군 상태(스트렙타비딘-QD로 처리됨)와 BDNF-QD로 치료시 대표적인 키모그래프가 표시됩니다. (B)BDNF-QD 이동 속도의 정량화. 모바일 말장난은 120s의 레코딩에서 10 μm 이상을 이동한 것으로 정의되었습니다. (C) 미세 유체 챔버에서 자란 DIV7 피질 뉴런은 3.5 시간 동안 500 pM 또는 2 nM의 BDNF-QD의 최종 농도로 축산 구획에서 자극된 다음, 핵을 시각화하기 위해 Hoechst로 고정 및 표시하였다. 소마토덴디트 구획과 마이크로그루브의 말단 및 근위 부분의 대표적인 이미지가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 용해화 | BDNF (ng) 5μl | 【ng/μl】 | 총 BDNF [μg] |
| E1 | 142.2 | 28.4 | 28.4 |
| E2 | 101.2 | 20.2 | 20.2 |
| E3 | 65.6 | 13.1 | 13.1 |
| E4 | 30.4 | 6.1 | 6.1 |
| 67.8 |
표 1: BDNFAvi 정제 수율의 정량화(도 1A와 관련). HEK293 세포는 플라스미드 구동 BDNFAvi 발현으로 전염되었고, 단백질은 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 단백질 농도 및 최종 수율은 시판 가능한 재조합 인간 BDNF의 공지된 농도 곡선에서 밀도 측정 분석 및 보간에 의해 계산되었다.
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Discussion
본 문서에서는, 친화도 크로마토그래피 기반 절차에서 mbtBDNF의 생산 및 정화를 위한 최적화된 방법론이 기술되고, 성 및협력자(17)의작업을 기반으로 한다. 최적화는 리포펙타민과 같은 더 비싼 형질 전환 방법의 효율성을 유지하면서 비용 효율적인 트랜스페트 시약 (PEI)의 사용을 포함한다. 이러한 최적화는 프로토콜의 상당한 비용 절감으로 이어지며 높은 비용 효율성을 유지하면서 확장성을 제공합니다. 또한 이 프로토콜에는 최대 2개월 동안 조건부 용지를 동결하는 등 사용 편의성 고려 사항이 포함되어 있습니다. 이러한 최적화는 각 실험실의 요구에 맞게 절차를 조정하고, 비용 효율성을 개선하며, 균일하고 생물학적으로 활동적인 재조합 BDNF를 산출합니다. 프로토콜은 또한 크로마토그래피 장치의 사용을 원추형 튜브내구슬의 중력 강수량으로 대체함으로써 소규모 생산에 적응할 수 있다. 이는 실행 가능한 방법론을 구성하지만 시간이 덜 효율적이며 경험에서 수익률이 낮아졌습니다. 비오틴 라벨BDNF는 형광및 파라마그네틱 나노입자를 포함한 다양한 연쇄타비딘 바운드 프로브에 결합될 수 있어 BDNF 후 내시성 인신 매매 분석을 위한 다양한 유형의 실험을 수행하는 데 유용한 도구입니다. 따라서 이 단백질에 최적화되고 간단한 생산 프로토콜은 이 분야에서 일하는 실험실에 매우 유용합니다.
BDNF24와같은 복잡한 번역 후 변형을 갖는 재조합 단백질의 생산은 종종 올바르게 접히지 않고 따라서 가난한 생물학적활성(25)을갖는 단백질을 초래한다. 따라서, 포유류 세포에서발현은 생리활성 단백질을 얻기 위하여 필요하다. PEI의 사용은 이전에 전감염된 포유류세포(25,,26)에서재조합 단백질의 대규모 생산을 위한 실행 가능한 대안으로 설명되었으며, 학술 실험실의 맥락에서 HEK293 세포의 형질전환에 대한 그 효율성이 강조되고있다. 따라서, 이 세포주를 사용하는 것은 학술 실험실에서 관리할 수 있는 규모로 BDNFAvi를 생성하는 유효한 옵션을 나타낸다. 제안된 프로토콜은 BDNFAvi로 안정적으로 전염되는 HEK293 세포주의 생성에 의해 더 최적화될 수 있으며, 이는 일시적인 과도 배출 단계를 제거하여 시간과 자원을 절약할 수 있습니다. 최적화의 또 다른 잠재적인 소스는 부착 된 세포 대신 현탁액에 있는 세포의 사용입니다. HEK293 세포는 현탁액에서 유지될 수 있으며, 리터당 그램 의 범위에서 상당한 양의 재조합 단백질을 생성할 수있다(28).
프로토콜의 또 다른 개선은 생체 내 전략을 사용하여 BDNFAvi 단백질의 생체 자극, 생체 내 공동 형질 변환 프로토콜의 이전을 대체하는 것입니다. 과도 결합은 여러 세포주에서 입증된 바와 같이 여러 개의 트랜스페션시약(29)으로,구체의 발현 측면에서 예기치 않은 결과를 가질 수 있다. 다양한 요인은 벡터, 세포 유형 및 플라스미드 농도를 포함하는 공동 형질 전환 컨텍스트에서 전관 된 단백질의 발현에 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 여러 가지 요인으로 인해 최적화와 재현성이 복잡한 작업입니다. 다른 한편으로는, 체외 방법론은 생체 자극 반응이 일어나는 조건에 더 나은 통제를 허용합니다. 이 방법론은 재조합 BDNF의 재현 가능하고 균일한 라벨링을 초래합니다.
생물학적 활성 검증 실험에 의해 입증된 바와 같이, 이 프로토콜을 사용하여 생성된 mbtBDNF는 BDNF-TrkB 신호 경로 활성화 측면에서 상업적으로 이용 가능한 재조합 인간 BDNF와 비교된다. 데이터는 또한 BDNF를 streptavidin-QD로 결합하는 것이 BDNF-TrkB 신호링을 방해하지 않는다는 것을 보여줍니다. 또한, 우리는 BDNF-QD가 살아있는 및 고정 된 세포에서 형광 현미경 검사법에 의해 검출 될 수 있음을 보여 주었다. 따라서 mbtBDNF는 역행 축산 인신 매매를 연구하기위한 귀중한 도구를 나타내며 BDNF-GFP16과같은 대체 프로브에 비해 상당한 이점을 제공합니다. 이 문서에 설명된 프로토콜은 mbtBDNF의 생산을 위한 안정적이고 일관된 방법론을 제공하며, 이는 TrkB 또는 p75를 표현하는 다른 신경 모델에서 내피 역학 후 연구에 사용될 수 있습니다. BDNF 시그널링은 뉴런 형태와 기능에 강력한 영향을 미치는33,4,,21,최근 세포 생물학 및 생물 의학 분야에서 관련연구를 만드는30,31,신경 재생을 향상시키기 위한 잠재적치료 도구로 제안되고 있다., BDNF 신호 및 인신 매매의 효과의 연구는 더 신경 세포 생물학의 우리의 이해를 발전시키고 임상 설정에서 그것의 재생 잠재력의 활용을 허용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 폰데시트 (1171137) (FCB), 과학 기술 우수 센터 (AFB 170005) (FCB), 밀레니엄 핵 (P07/011-F) (FCB), 웰컴 트러스트 수석 조사상 (107116/ Z/Z/ 15) 영국 연구소(107116/Z/Z)의 재정 지원을 감사하게 인정합니다. 이 작품은 Unidad 드 마이크로스코피아 아반자다 UC (UMA UC)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 way stopcock | BioRad | 7328102 | Chromatography apparatus component |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | BDNF elution buffer |
| Acrylamide/Bisacrylamide | BioRad | 1610154 | SDS-PAGE gel preparation |
| Amicon Ultra-15 10K | Millipore | UFC901024 | BDNF concentration |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A9164 | SDS-PAGE gel preparation |
| anti B-III-Tubulin antibody | Sigma | T8578 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti BDNF antibody | Alomone | AGP-021 | Western blot assays for BDNF quantification |
| anti BDNF antibody | Alomone | ANT-010 | Western blot assays for BDNF quantification |
| Anti ERK antibody | Cell Signaling | 9102 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pCREB antibody (S133) | Cell Signaling | 9198 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pERK antibody (T202, Y204) | Cell Signaling | 4370 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pTrkB antibody (Y515) | Abcam | ab109684 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-062 | HEK293 maintenance |
| ATP | Sigma | A26209 | BDNF monobiotinylation buffer |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | Neuron maintenance |
| Bicine | Sigma | B3876 | BDNF monobiotinylation buffer |
| BirA-GST | BPS Bioscience | 70031 | Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation |
| Bovine Fetal Serum | HyClone | HC.SH30396.02 | HEK293 maintenance |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence |
| D-Biotin | Sigma | B4639 | BDNF monobiotinylation buffer |
| DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11965-092 | Neuron seeding |
| DMEM Medium | Gibco | 11995-081 | HEK293 maintenance |
| Econo Column Funnel | BioRad | 7310003 | Chromatography apparatus component |
| EDTA | Merck | 108418 | |
| EZ-ECL Kit | Biological Industries | 1633664 | Protein detection by western blotting |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Neuron and HEK293 maintenance |
| Glycerol | Merck | 104094 | BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays |
| Hettich Rotina 46R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for clearing the medium of debris |
| Hettich Universal 32R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for protein concentrator centrifugation |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Neuron seeding |
| ImageQuant LAS 500 | GE Healthcare Life Sciences | 29005063 | Western blot image acquisition |
| Imidazole | Sigma | I55513 | BDNF buffer modification component |
| KCl | Winkler | BM-1370 | PBS component |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | PBS component |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Luer Tubing Adaptor | BioRad | 7323245 | Chromatography apparatus component |
| Luminata™ Forte Western HRP Substrate | Millipore | WBLUF0100 | Protein detection by western blotting |
| Mg(CH3COO)2 | Merck | 105819 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | Mounting reagent for immunofluorescence assays |
| MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads | Invitrogen | 65001 | Biotinylation verification |
| Na2HPO4 | Merck | 106586 | BDNF buffer modification component |
| NaCl | Winkler | BM-1630 | PBS component, BDNF buffer modification component |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | BDNF buffer modification component |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Neuron maintenance |
| Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | 30210 | BDNF AviTag purification |
| Nikon Ti2-E | Nikon | Microscope for fluorescence imaging | |
| Nitrocellulose Membrane | BioRad | 1620115 | Protein transfer for western blotting |
| ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Camera for epifluorescence imaging |
| P8340 Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | BDNF buffer modification component |
| Paraformaldehyde | Merck | 104005 | Fixative for immunofluorescence assays |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Neuron maintenance |
| Poli-D-Lysine | Corning | DLW354210 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Poli-L-Lysine | Millipore | P2363 | Cover coating for non-compartmentalized neurons |
| Poly-Prep Chromatography Column | BioRad | 7311550 | Chromatography apparatus component |
| Polyethyleneimine 25K | Polysciences Inc. | PLY-0296 | HEK293 transfection |
| Quantum Dots 655 streptavidin conjugate | Invitrogen | Q10121MP | Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments |
| Saponin | Sigma | S4521 | Detergent for immunofluorescence assays |
| Syldgard 184 silicone elastomer base | Poirot | 4019862 | Microfluidic chamber preparation |
| TEMED | Sigma | T9281 | SDS-PAGE gel preparation |
| Tris | Winkler | BM-2000 | Lysis buffer component |
| Triton X100 | Merck | 108603 | Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays |
| Trypsin-EDTA 0.5% | Gibco | 15400-054 | HEK293 passaging |
References
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