Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Улучшенный протокол для очищения и непосредственно моно-биотинилат рекомбинантный BDNF в трубе для клеточного исследования торговли в нейронах

Published: July 11, 2020 doi: 10.3791/61262
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,3, 4, 1,3
1Department of Physiology, Faculty of Biological Sciences, Pontificia Universidad Católica de Chile, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Faculty of Biological Sciences, Center for Aging and Regeneration (CARE UC), Pontificia Universidad Católica de Chile, 3Institute of Biomedical Sciences. Faculty of Medicine and Faculty of Life Sciences, Universidad Andrés Bello, 4Department of Neuromuscular Diseases, UCL Queen Square Institute of Neurology and UK Dementia Research Institute at UCL, University College London Campus

Summary

Рекомбинантный BDNF, содержащий последовательность Ави (BDNFAvi), производится в клетках HEK293 экономически эффективным образом и очищается с помощью хроматографии сродства. BDNFavi после этого сразу mono-biotinylated с энзимом BirA в пробке. BDNFavi и моно-биотинилированные BDNFavi сохраняют свою биологическую активность по сравнению с коммерчески доступным BDNF.

Abstract

Рекомбинантный BDNF, содержащий последовательность Ави (BDNFAvi), производится в клетках HEK293, а затем экономически эффективно очищается с помощью хроматографии сродства. Воспроизводимый протокол был разработан непосредственно для непосредственно моно-биотинилата BDNFAvi с ферментом BirA в трубке. В этой реакции моно-биотинилированный БДФФАВИ сохраняет свою биологическую активность.

Нейротрофины являются целевыми факторами роста, играющими роль в развитии и поддержании нейронов. Они требуют быстрых транспортных механизмов вдоль эндоцитного пути, чтобы позволить междугородной сигнализации между различными нейронными отсеками. Разработка молекулярных инструментов для изучения оборота нейротрофинов позволила точно отслеживать эти белки в клетке с помощью записи in vivo. В этом протоколе мы разработали оптимизированную и экономически эффективную процедуру производства моно-биотинилированного БДФ. Рекомбинантный вариант BDNF, содержащий биотинилизируемую последовательность ави (BDNFAvi), производится в клетках HEK293 в диапазоне микрограммов, а затем очищается в легко масштабируемой процедуре с помощью хроматографии сродства. Очищенный BDNF может быть однородно моно-биотинилирован прямой реакцией в пробирке с ферментом BirA в трубке. Биологическая активность моно-биотинилированных БДНФ (mbtBDNF) может быть сопряжена с стрептавидин-конъюгирована с различными фторфорами. BDNFAvi и mbtBDNF сохраняют свою биологическую активность, продемонстрированную путем обнаружения фосфорилированных целей ниже по течению с использованием западной помарки и активации транскрипцио-фактора CREB, соответственно. Используя стрептавидин-квантовые точки, мы смогли визуализировать интернализации mbtBDNF, сопутствующей активации CREB, которая была обнаружена с помощью фонофо-КРИБ специфического антитела. Кроме того, mbtBDNF, сопряженный со стрептавидин-квантовыми точками, подходит для ретроградного транспортного анализа в корковых нейронах, выращенных в микрофлюидных камерах. Таким образом, в трубке производится mbtBDNF является надежным инструментом для изучения физиологических сигнальных эндосомной динамики и оборота в нейронах.

Introduction

Нейроны являются функциональными единицами нервной системы, обладающими сложной и специализированной морфологией, которая позволяет синаптической коммуникации, и, таким образом, генерации скоординированного и сложного поведения в ответ на различные раздражители. Нейронные проекции, такие как дендриты и аксоны являются критическими структурными особенностями, участвующими в нейрональной коммуникации, и нейротрофины являются ключевыми игроками в определении их морфологии и функции1. Нейротрофины являются семейство выделяется факторов роста, которые включают NGF, NT-3, NT-4, и мозг полученных нейротрофический фактор (BDNF)2. В центральной нервной системе (ЦНС) БДНТ участвует в различных биологических процессах, включая нейротрансмиссию, дендритную арборизацию, созревание дендритных шипов, долгосрочную потенцию, среди прочих3,4. Таким образом, BDNF играет важную роль в регулировании нейронных функций.

Разнообразные клеточные процессы регулируют динамику и функцию BDNF. На нейрональной поверхности, BDNF связывает тропомиозин рецептор киназы B (TrkB) и / или рецептора нейротрофина p75 (p75). Комплексы BDNF-TrkB и BDNF-p75 до конца сортируются и сортируются в различных эндоцитных органеллах5,,6,,7,,8. Правильный внутриклеточный оборот комплекса BDNF/TrkB необходим для правильной сигнализации BDNF в различных нейрональных схемах9,,10,,11. По этой причине для понимания BDNF сигнализации в области здоровья и болезней необходимо глубокое понимание динамики оборота БДНФ и ее изменений, обнаруженных в патофизиологических процессах. Разработка новых и конкретных молекулярных инструментов для мониторинга этого процесса поможет продвинуть вперед эту область и позволит лучше понять соответствующие механизмы регулирования.

Есть несколько инструментов, доступных для изучения BDNF торговли нейронами. Широко используемая методология включает в себя трансфекцию рекомбинантного BDNF, помеченного флуоресцентнымимолекулами,такими как зеленый флуоресцентный белок (GFP) или мономерный флуоресцентный красно-сдвинутый вариант GFP mCherry12,13. Однако основным недостатком переэкспрессии BDNF является то, что он исключает возможность доставки известных концентраций этого нейротрофина. Кроме того, это может привести к клеточной токсичности, заслоняя интерпретацию результатов14. Альтернативной стратегией является трансфекция TrkB с эпитопом, например Flag-TrkB. Эта методология позволяет изучать динамику интернализации TrkB15,но она также включает в себя трансфекцию, которая может привести к изменению функции TrkB и клеточной токсичности. Для преодоления этих методологических препятствий были разработаны рекомбинантные варианты NGF и BDNF, содержащие последовательность Ави (BDNFAvi), которые могут быть моно-биотинилированные биотин-лигазным ферментом BirA, были разработаны16,17. Биотиниолетированные рекомбинантные BDNF могут быть соединены с различными стрептавидин-связанных инструментов, которые включают фторфоры, бусы, парамагнитные наночастицы среди других для обнаружения. С точки зрения изображения живых клеток, квантовые точки (ЗД) стали часто использоваться фторфоры, так как они имеют желательные характеристики для одночастичего отслеживания, такие как повышенная яркость и устойчивость к фотоотмоблы по сравнению с небольшой молекулы фторфоров18.

Производство моно-биотинилированных BDNF (mbtBDNF) с использованием BDNFAvi было достигнуто путем котрансляции плазмидов, движущих выражение BDNFAvi и BirA, а затем очистка рекомбинантного белка сродством хроматографии с выходом 1-2 г BDNF на 20 мл HEK293-кондиционированных культурных носителей17. Здесь мы предлагаем модификацию этого протокола, которая позволяет для очистки BDNFAvi от 500 мЛ HEK293-кондиционированных средств массовой информации, которая стремится к максимальному восстановлению белка в хроматографии-колонке протокол для простоты манипуляции. Используемый трансфекционный агент, полиэтиленимин (PEI), обеспечивает экономичный метод без ущерба для трансфекционного выхода. Моно-биотинилирование шаг был адаптирован к реакции in vitro, чтобы избежать осложнений, связанных с со-трансфекции и обеспечить однородную маркировку BDNF. Биологическая активность mbtBDNF была продемонстрирована западными экспериментами по микро- и флуоресценции, включая активацию pCREB и изображения живых клеток для изучения ретроградного аксонального переноса БДНФ в микрофлюидных камерах. Использование этого протокола позволяет оптимизировать, высокодоходное производство однородного моно biotinylated и биологически активных BDNF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты проводились в соответствии с утвержденными руководящими принципами КОНИКИТ (Чилийская национальная комиссия по научно-техническим исследованиям). Протоколы, используемые в данном исследовании, были одобрены Комитетами по биобезопасности и биоэтике и защите животных Папского университета Католики де Чили. Эксперименты с участием позвоночных были одобрены Комитетом по биоэтике и защите животных Папского университета Католики де Чили.

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол был разработан для очистки BDNFAvi от общего объема 500 мЛ обусловленного носителя, произведенного в клетках HEK293. Количество обусловленной среды, которая производится и обрабатывается для очистки BDNFAvi может быть вверх или вниз по мере необходимости. Однако в этих условиях может потребоваться дальнейшая оптимизация. Состав культурных носителей и буферов, используемых на протяжении всего протокола, можно найти в дополнительных материалах.

1. Производство и очистка BDNFAvi от HEK293-условией средств массовой информации

  1. Трансфекция клеток HEK293
    1. Выращивайте клетки HEK293 до 70% сливаются в дополненной среде DMEM (10% сыворотки плода крупного рогатого скота, 1x добавка глутамата, 1x антибиотик/антимикотический) в 15 см культуры блюда при 37 oC.
    2. Измените средний на трансфекционный буфер.
    3. Подготовка смеси PEI-ДНА для трансфекции. Используйте две различные конические трубки 15 мЛ, чтобы разбавить ДНК и PEI 25 K, соответственно. Разбавить 20 мкг плазмидной ДНК в окончательном объеме 500 мл в одной трубке. Разбавить 60 мкг линейного PEI 25K в окончательном объеме 500 мл в другой трубе. Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
    4. Тщательно пипени ДНК раствор в трубку PEI, смешивая один раз вверх-вниз движения. Инкубировать при комнатной температуре в течение 25 мин.
    5. Протешить 1 мЛ смеси PEI-ДНА на каждом 15-сантиметровом блюде. Инкубировать клетки смесью PEI-ДНА на 3 ч при 37 oC.
    6. Измените средний и свежий инкубационный буфер.
  2. Сбор и хранение мультимедиа
    1. Соберите носитель из всех блюд 48 ч после трансфекции клеток HEK293. Подготовьте концентрированные запасы решений, описанных в разделе "супернатантный буфер модификации" Дополнительного файла 1, и добавьте их в супернатант HEK293 для достижения перечисленных окончательных концентраций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть отброшены или восстановлены для дальнейшего анализа.
    2. Инкубировать среду во льду в течение 15 мин.
    3. Aliquot среды в центрифуги труб.
    4. Центрифуга средний на 10000 х г в течение 45 мин в центрифуге 4 градусов по Цельсию. Этот шаг позволяет устранить клеточный мусор и мертвые клетки, взвешенные в средствах массовой информации.
    5. Соберите супернатанты, добавьте BSA с окончательной концентрацией 0,1%. а затем хранить при -20 градусов по Цельсию. Средства массовой информации могут быть заготовлены перед замораживанием для более быстрого оттаивания во время шага очищения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время хранения замороженных условных носителей сроком до 2 месяцев дало положительные результаты, более длительное время хранения не было оценено.
  3. Концентрация и очистка средств массовой информации
    1. Оттепель средств массовой информации в 37 кк терморегулируемой ванне.
    2. Aliquot средств массовой информации в центрифуги труб.
    3. Центрифуга средний на 1 ч при 3500 х г в 4 градусов по Цельсию охлажденной центрифуги. Этот шаг позволяет устранить оставшийся клеточный мусор для обеспечения адекватного потока через столбец хроматографии.
    4. Используйте белковые концентраторы с отсечки 10 кДа, чтобы уменьшить количество носителей с 500 мл до 100 мл. Для оптимальной концентрации следуйте рекомендуемым от производителем параметрам центрифугации.
    5. Добавьте 500 мл бисера Ni-NTA agarose в концентрированные носители и инкубировать на ночь при 4 градусах в рокере.
    6. Соберите хроматографию аппарата и залить средства массовой информации в него. Пусть он отдыхает в течение 5 минут, а затем открыть 2-путь stopcock, чтобы средний поток через.
    7. Вымойте бисер с 5 мл буфера мытья в течение 5 мин. Убедитесь в том, чтобы восстановить бисер в колонке. Слейте буфер мыть, открыв 2-путь stopcock. Повторите 3 раза.
    8. Добавьте 1 мл буфера elution к столбцу. Убедитесь в том, чтобы восстановить бисер в колонке. Инкубировать в течение 15 мин, а затем собрать элуат в 1,5 мл микроцентрифуги трубки. Повторите этот шаг 3 раза для полного elution BDNFAvi.
    9. Нагрузка 5 МЛ каждого элуата и различных концентраций коммерчески доступных BDNF (40-160 нг) в 15% полиакриламид гель. Обнаружить очищенный белок с помощью западного blotting с помощью анти-BDNF антитела.
    10. Определите концентрацию очищенного BDNFAvi в каждом eluate используя кривую концентрации подготовленную с коммерчески имеющимся BDNF.
    11. Aliquot и хранить очищенные BDNFAvi при -80 градусов по Цельсию.

2. Мономотинобрия BDNFAvi с использованием фермента BirA

  1. Реакция моно-биотинилирования в пробирке
    1. Подготовка концентрированных стоковых растворов биотинилирования буферных реагентов. Использование концентрированных запасов позволит свести к минимуму разбавление рекомбинантного белка.
    2. Возьмите aliquot 800 нг BDNFAvi и добавьте биотинилирование буферных реагентов и фермента BirA в 1:1 моляр отношение к BDNF. Например, для добавления объема окончательной реакции на 200 МЛ; 100 МЛ раствора, содержащего 800 нг BDNFAvi, 20 мл бицина 0,5 М рН 8,3, 20 мл АТР 100 мМ, 20 мл MgOAc 100 мМ, 20 мл д-биотина 500 мкМ, 0,8-1 мкг к 1 мл BirA-GST, а также до 200 мл с ультрапурной водой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Успешные реакции биотинилирования были выполнены с aliquots 400 qL, содержащих концентрацию около 30 нг / L BDNFAvi, в результате чего однородно биотинилированных BDNFAvi к окончательной концентрации 20 нг / ЗЛ в окончательной реакции.
    3. Инкубировать смесь при температуре 30 градусов в духовке гибридизации на 1 ч. Смешайте содержимое с помощью инверсии трубки каждые 15 мин.
    4. Добавьте тот же объем ATP и BirA, что и в шаге 2.1.2 и повторите шаг 2.1.3.
    5. Хранить при -80 градусов по Цельсию для будущих анализов или держать на льду для немедленного использования (например, биотиниляция контроля качества).
  2. Анализ биотинилирования
    1. Блок 30 МЛ стрептавидин магнитных бусин на образец BDNF в 1 мл блокирующего буфера. Инкубировать при комнатной температуре в течение 1 ч в ротаторе трубки микроцентрифуги.
    2. Осаждать магнитные бусы с помощью магнитного разделения стойки в течение 3 до 5 минут или до тех пор, пока буфер появляется полностью очищен от бисера и отбросить блокирующий буфер.
    3. Добавьте 50 МЛ свежего блокирующего буфера и 80 нг моно-биотинилированного образца BDNFAvi (mbtBDNF) в бисер, убедившись, что полностью их можно восстановить путем пиппетинга.
    4. Инкубировать при 4 градусах по Цельсию в микроцентрифуге ротатор трубки спиннинг примерно 20 об/мин.
    5. Соберите бусы с помощью магнитной стойки разделения в течение 3 до 5 минут, и собрать супернатант, сохраняя 30 l aliquot для анализа.
    6. Вымойте бисер один раз с 500 МЛ PBS, а затем собрать их с помощью магнитного разделения стойки в течение 3 до 5 минут. Восстановите супернатант и сохраните 30-l aliquot для анализа.
    7. Добавьте 10 мл 4-х буфера загрузки в бисер.
    8. Нагрейте образцы до 97 градусов по Цельсию в течение 7 минут, чтобы отвести mbtBDNF.
    9. Обнаружить mbtBDNF с помощью анти-BDNF специфические антитела19.

3. Проверка биологической активности mbtBDNF

  1. Обнаружение pTrkB и pERK по западному помарке.
    1. Семя 2 миллиона крыс корковых нейронов в 60 мм культуры блюда.
    2. Культура нейронов в течение 7 дней (DIV7). Затем, изменить средний на не-дополненный нейробасальный mediun при запуске эксперимента.
    3. Через час после изменения среды добавьте mbtBDNF к окончательной концентрации 50 нг/мл. Инкубировать в течение 30 мин при 37 oC. Держите отрицательный контроль блюдо (не стимулировали с BDNF) и положительный контроль блюдо (обработано с 50 нг / мЛ коммерчески доступны BDNF).
    4. Соберите среднюю и аккуратно мыть каждое блюдо с 1x PBS. Соберите и отбросьте 1x PBS.
    5. Поместите блюда на лед и добавьте 50-80 мл буфера лизиса к каждому блюду. Используйте скребок клеток для лизы клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лизис шаг должен быть выполнен как можно быстрее, чтобы избежать дефосфорилирования белка и деградации. 1-2 минут энергичного выскабливание достаточно, чтобы визуализировать белки, представляющие интерес для западных blotting.
    6. Соберите буфер лизиса и перемешайте в вихревом миксере на самой высокой скорости в течение 5 с.
    7. Центрифуга буфера лизиса на 14000 х г (4 градуса по Цельсию) в течение 10 мин. Соберите супернатант.
    8. Количественная оценка содержания белка супернатанта по протоколу количественной оценки белка BCA20.
    9. Добавьте погрузочный буфер в аликоту, содержащий 30-50 мкг белка на состояние, и загрузите его в 12% полиакриламидный гель для западного пятна. Обнаружение pTrkB и pERK с помощью специфических фосфо-антител для проверки биологической активности BDNFAvi.
  2. Проверка биологической активности БДНФ-ЗД с помощью иммунофлуоресценции pCREB.
    1. Семя 40000 крыс корковых нейронов в 10 мм coverslips, ранее autoclaved и лечение поли-L-лизин, как описано ранее21.
    2. Культура нейронов в течение 7-8 дней в буфере поддержания нейронов (см. дополнительные материалы) при 37 oC.
    3. Чтобы начать эксперимент, измените среду на неосуществленную нейробазальную среду и инкубировать при 37 oC на 1 ч.
    4. Подготовьте mbtBDNF сопряжены с квантовыми точками (BDNF-ЗД), добавив к mbtBDNF aliquot, необходимый объем квантовой точки streptavidin конъюгации (стрептавидин-ЗД) для достижения 1:1 BDNF-D молярного соотношения. Затем разбавить до 20 мл нейробазальной средой. Оберните трубку в алюминиевую фольгу, чтобы защитить ее от света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте еще одну трубку с тем же объемом квантовой точки streptavidin спряжения и разбавить его до 20 мл с нейробазальной среды в качестве отрицательного контроля.
    5. Инкубировать смесь mbtBDNF/streptavidin-ЗД в течение 30 минут при комнатной температуре в рокере.
    6. Разбавить БДФ-ЗД до желаемой конечной концентрации (200 пМ и 2 нМ) в нейробазальной среде.
    7. После 1 ч инкубации с неполированной нейробазальной средой, стимулировать нейроны с BDNF-ЗД или стрептавидин-ЗД (контроль) до конечной концентрации 200 pM и 2 nM BDNF в течение 30 мин при 37 градусов по Цельсию.
    8. Вымойте крышки 3 раза с 1x PBS (37 градусов по Цельсию) и исправить клетки в течение 15 мин, рассматривая крышки с 4% параформальдегида раствор, содержащий ингибиторы фосфатазы.
    9. Вымойте клетки 3 раза с PBS, а затем инкубировать с блокированием / пермеабилизации буфера (BSA 5%, Тритон X-100 0,5%, 1x ингибитор фосфатазы) в течение 1 ч.
    10. Инкубировать анти-pCREB антитела 1:500 (в 3% BSA, 0,1% Тритон X-100) ночь на 4 градуса по Цельсию.
    11. На следующий день мыть 3 раза с 1x PBS, и инкубировать на 1 ч со вторичным антителом 1:500 (3% BSA, 0,1% Тритон X-100).
    12. Вымойте 3 раза с 1x PBS. Добавьте раствор ядерного пятна Hoechst (5 мкг/мл) в течение 7 минут.
    13. Вымойте 3 раза с 1x PBS и смонтировать.
  3. Визуализация ретроградного аксонального переноса БДНФ-ЗД в живых нейронах
    1. Подготовка микрофлюидных камер и семенных нейронов, как описано ранее16.
    2. После 7-8 дней в культуре, изменить среднюю на неполную нейробазальную среду.
    3. Подготовьте mbtBDNF сопряжены с квантовыми точками (BDNF-ЗД), добавив к mbtBDNF aliquot, необходимый объем квантовой точки streptavidin конъюгации (стрептавидин-ЗД) для достижения 1:1 BDNF-D молярного соотношения. Затем разбавить до 20 мл нейробазальной средой. Оберните трубку в алюминиевую фольгу, чтобы защитить ее от света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте еще одну трубку с тем же объемом квантовой точки streptavidin сопряжения и разбавить его до 20 мл с нейробасальной среды в качестве контроля.
    4. Инкубировать смесь mbtBDNF/streptavidin-ЗД в течение 30 минут при комнатной температуре в рокере.
    5. Разбавить BDNF-ЗД до желаемой конечной концентрации (2 nM).
    6. После 1 ч инкубации с неполированной нейробазальной средой добавляем BDNF-ЗД или контрольную смесь в аксональные отсеки микрофлюидной камеры. Инкубировать в течение 210 мин при 37 градусов по Цельсию, чтобы обеспечить чистый ретроградный транспорт BDNF-ЗД.
    7. Для изображения живых клеток, визуализировать аксональный ретроградный транспорт в сегменте микрогрововы, который проксимальный к отсеку тела клетки с помощью 100x цели с помощью микроскопа подходит для этих целей (37 градусов по Цельсию и 5% CO2). Приобретайте изображения по 1 рамке/с.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Использование протокола на основе хроматографической колонки позволяет обрабатывать значительные объемы кондиционированных носителей HEK293. На рисунке 1показаны результаты очистки БДНФАВИ от 500 мЛ условных носителей. Последовательные elutions BDNFAvi из бусы Ni-NTA агарозы дают снижение концентрации BDNFAvi (Рисунок 1A). После четырех последовательных elutions (каждый продолжительностью 15 мин), большинство BDNF захватили бисера восстанавливается. Концентрации элуатов варьируются от 6 до 28 нг/л, а общая урожайность составила примерно 60 мкг БДНФАВИ(таблица 1). Произведенный BDNFAvi был затем эффективно биотинилируется в пробирке реакции при посредничестве BirA-GST, о чем свидетельствует отсутствие не-биотинилированных BDNFAvi в супернатант (Рисунок 1B). Обратите внимание, что биотиниляция, представленная на рисунке 1B, соответствует аликоту общего производимого BDNF, но реакция может быть масштабирована для больших объемов.

Затем биологическая активность mbtBDNF оценивалась с использованием 2 различных экспериментальных подходов. Сначала корковые нейроны, посеянные в 60 мм пластинах (2 млн нейронов, DIV7), стимулировали 50 нг/мЛ mbtBDNF в течение 30 мин, а затем белки были подготовлены для западного анализа пятен. Биологическая активность mbtBDNF была количественно определена путем обнаружения pTrkB (Y515) и pERK (T202/Y204). Связывание BDNF к TrkB вызывает активацию рецептора через реакцию аутофосфорилирования в его внутриклеточном домене, и ERK является известной целью сигнального путиBDNF 22. Полосы для обоих фосфорилированных белков имели аналогичную интенсивность в нейронах, обработанных коммерческими BDNF и mbtBDNF, и оба показали более сильный сигнал, чем состояние контроля(Рисунок 2A). Затем была оценена биологическая активность mbtBDNF в сочетании со стрептавидином-ЗД, чтобы продемонстрировать, что они могут быть использованы в живых экспериментах с визуализацией. Кортикальные нейроны были посеяны в 10 мм крышки (40000 клеток на крышку, DIV7) и лечение с окончательной концентрацией 200 pM или 2 nM BDNF-D в течение 30 мин до фиксации и окрашивания для pCREB. CREB является транскрипционный фактор, который ориентирован на активированный ERK1'2 в корковых нейронов22,23. Стимулирующие нейроны с увеличением концентрации BDNF-ЗД привели к доза-зависимого увеличения фосфорилирования CREB и наличие частиц ЗД, окружающих ядро (Рисунок 2B), что указывает на то, что частицы BDNF-ЗД были эндоцитоз и вызвал активацию сигнальных путей, связанных с BDNF-опосредованной активацией TrkB. Двукратное увеличение сигнала pCREB было обнаружено при стимулировании нейронов с низкой концентрацией BDNF-ЗД (200 пМ), в то время как стимулирование с 2 нМ привело к 3,5-кратному увеличению сигнала pCREB(рисунок 2C). Эти результаты показывают, что биотинилированный BDNFAvi является биологически активным, и что он не теряет свою активность, когда в сочетании с стрептавидином-ЗД, что делает его пригодным для иммунофлуоресценции и живой клеточной визуализации.

Наконец, потенциал визуализации BDNF-ЗД был оценен в разрозненных культурах с использованием микрофлюидных камер. Кортикальные нейроны были посеяны в микрофлюидных камерах (15 мм крышки, 50 000 нейронов на микрофлюидную камеру, DIV7) для разделения аксональных и соматодендритных отсеков и были стимулированы с помощью 2 nM BDNF-ЗД на 3,5 ч. Была выполнена живая клеточная микроскопия, а полученные кимографы использовались для количественной оценки скорости БДНФ-ЗД, содержащих органеллы(рисунок 3A). Средняя скорость движения 0,91 мкм /с была обнаружена(рисунок 3B), что соответствует предыдущим анализам цитоплазмической динеин-опосредованной транспорта7,16. Микрофлюидные камеры, обработанные 2 nM streptavidin-ЗД, не показали движущихся ЗД в микрогроов, как показано на кымографе(рисунок 3A). Клетки, выращенные в тех же условиях, стимулировались с помощью 500 pM или 2 nM BDNF-ЗД в течение 210 мин, а затем были зафиксированы и маркированы ядерным окрашиванием. Как показано на рисунке 3C, нейроны показывают, что доза-зависимое накопление BDNF-ЗД во всех анализируемых подсезах, включая проксимальные и дистальные части микрогровы и соматодендритного отсека. В отличие от этого, контрольные нейроны не показали почти никакого сигнала по всей камере. Таким образом, BDNF-ЗД может быть обнаружен в живых и фиксированных клетках в микрофлюидных камерах.

Figure 1
Рисунок 1: Производство и моно-биотинирование BDNFAvi в клетках HEK293. HEK293 клетки были трансфицированы с помощью реагента PEI и BDNFAvi кодирования плазмиды и условные средства массовой информации был собран после 48 h. BDNFAvi содержит 6x Histidine теги позволяет очистки с использованием никеля нитрилотриацетической кислоты (Ni-NTA) хроматографии. Коммерчески доступный рекомбинантный человеческий BDNF имеет ожидаемый молекулярный вес в 13 кДа, в то время как BDNFAvi отображает молекулярный вес в 18 кДа. BDNFAvi, привязанный к смоле, был полностью eluted с четырьмя последовательными шагами elution. () Западнаяпомарка с использованием анти-BDNF антител для обнаружения в доме подготовлены рекомбинантные BDNF и коммерческих BDNF. Aliquots, содержащие известные количества коммерчески доступных человека BDNF и 5 МЛ каждого элуата были загружены в SDS-PAGE гель для обнаружения BDNFAvi с помощью антитела против BDNF. В таблице 1 указывается концентрация BDNFAvi, присутствуют в каждом элуате. Количество и концентрация BDNF в каждом эльуате было получено путем денситометрического анализа и интерполяции от кривой концентрации коммерчески доступных BDNF. (B)Проверка биотинилирования BDNFAvi. Восемьдесят нанограмм биотинилированных BDNFAvi (mbtBDNF) были инкубированы с 30 МЛ стрептавидина в сочетании с магнитными бусинами (20% шлама) в течение 1 часа при 4 градусов по Цельсию. Затем магнитные бусы были изолированы с помощью магнитного сепаратора. Стрептавидин бусы нагревались с погрузочным буфером, чтобы улиться биотинилированный BDNFAvi (бисерная дорожка). Супернатант (SN lane) также обгостил буфером погрузки, нагревали и загружали в гель (SN lane). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Проверка биологической активности mbtBDNF. (A) DIV7 корковых нейронов были сыворотки голодали в течение 1 ч, а затем стимулировали с 50 нг/мл коммерчески доступных BDNF или mbtBDNF в течение 30 мин. Белки были извлечены и загружены в SDS-PAGE гель для анализа TrkB и ERK1/2 фосфорилирования с использованием фосфо-специфических антител и по сравнению с общим уровнем белка антитела с использованием общих TrkB и ERK1/2. (B) ДИВ7 корковых нейронов сыворотки голодали в течение 1 ч, а затем стимулировали с окончательной концентрацией 200 pM или 2 nM mbtBDNF в сочетании с стрептавидином-ЗД (BDNF-D) в течение 30 мин. Затем клетки были зафиксированы и pCREB был помечен для анализа флуоресценции микроскопии. (C) Количественная оценка интенсивности ядерной флуоресценции pCREB. Результаты соответствуют 90 нейронов, объединенных вместе из 3 независимых экспериментов, показанных как среднее й SEM. Статистический анализ соответствует односторонней ANOVA с несколькими сравнениями теста Туки (P q lt; 0.0001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Визуализация BDNF-ЗД в живых и фиксированных клетках. ()ДИВ7 корковых нейронов, выращенных в микрофлюидных камерах, стимулировались в аксональном отсеке с конечной концентрацией 2 nM BDNF-ЗД в течение 3,5 часов, а затем проксимическая часть микрогроов была изображена с помощью живой клеточной микроскопии. Представительные кимографы для контроля состояния (обработаны стрептавидином-ЗД) и при лечении СДНФ-ЗД показаны. (B) Количественная оценка скорости перемещения BDNF-ЗД. Мобильные пунктуты были определены как те, которые переехали более 10 мкм в 120 с записи. (C) КОРКовые нейроны DIV7, выращенные в микрофлюидных камерах, стимулировались в аксональном отсеке с конечной концентрацией BDNF-ЗД 500 pM или 2 nM в течение 3,5 часов, а затем были зафиксированы и помечены Hoechst для визуализации ядер. Показаны репрезентативные изображения соматодендритного отсека и дистальной и проксимальной части микрогроов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Элуате БДНФ (нг) в 5 мл (нг/зл) Всего БДНФ (юг)
E1 142.2 28.4 28.4
E2 101.2 20.2 20.2
E3 65.6 13.1 13.1
E4 30.4 6.1 6.1
67.8

Таблица 1: Количественная оценка урожайности BDNFAvi (связана с рисом. 1А). Клетки HEK293 были трансфицированы плазмидой, движущей экспрессией BDNFAvi, и белок был очищен хроматографией сродства Ni-NTA. Концентрация белка и конечный урожай были рассчитаны путем денситометрического анализа и интерполяции в известной кривой концентрации коммерчески доступного рекомбинантного человеческого БДФ.

Дополнительный файл 1: Культура средств массовой информации и буферных компонентов Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой статье описана оптимизированная методология производства и очистки mbtBDNF в процедуре на основе хроматографии сродства, основанной на работе Сунга и сотрудников17. Оптимизация включает в себя использование экономически эффективного трансфекционного реагента (PEI) при сохранении эффективности более дорогих методов трансфекты, таких как липофектамин. Эта оптимизация приводит к значительному сокращению затрат в протоколе, что позволяет масштабировать при сохранении высокой рентабельности. Протокол также включает в себя простоту использования соображений, в том числе замораживание условных средств массовой информации на срок до 2 месяцев. Эти оптимизации делают процедуру адаптируемой к потребностям каждой лаборатории, повышают рентабельность и дают однородный и биологически активный рекомбинантный BDNF. Протокол также может быть адаптирован к производству меньшего масштаба, заменив использование хроматографического аппарата гравитационным осадком бисера в конических трубках. Это является жизнеспособной методологией, но ее менее эффективной по времени и привела к снижению урожайности в нашем опыте. Биотин помечены BDNF затем может быть соединен с различными стрептавидин связанных зондов, в том числе фторфоров и парамагнитных наночастиц, что делает его ценным инструментом для выполнения различных типов экспериментов для анализа BDNF пост-эндоцитарный оборот. Поэтому оптимизированный и простой протокол производства этого белка очень полезен лабораториям, работающим в этой области.

Производство рекомбинантных белков со сложными постпереводными модификациями, такими как BDNF24,в прокариотических системах часто приводит к белкам, которые неправильно сложены и, таким образом, имеют плохую биологическую активность25. Поэтому экспрессия в клетках млекопитающих необходима для получения биоактивного белка. Использование PEI было описано ранее в качестве жизнеспособной альтернативы для крупномасштабного производства рекомбинантных белков в трансинфицированных клетках млекопитающих25,,26, и его эффективность в трансфекции клеток HEK293 в контексте академических лабораторий была выделена27. Таким образом, использование этой клеточной линии представляет собой допустимый вариант для производства BDNFAvi в масштабе, который может управляться академической лабораторией. Предлагаемый протокол может быть дополнительно оптимизирован за счет генерации клеточной линии HEK293, стабильно трансфицированной BDNFAvi, что позволит устранить переходный этап трансфекции, тем самым экономя время и ресурсы. Другим потенциальным источником оптимизации является использование клеток в суспензии вместо клеток-адептов. КЛЕТКи HEK293 могут поддерживаться в подвеске, генерируя значительное количество рекомбинантного белка в диапазоне граммов на литр28.

Еще одним улучшением в протоколе является биотинирование белка BDNFAvi с использованием стратегии in vitro, заменив предыдущий протокол котранслекации in vivo. Переходная котрансфекция может иметь неожиданные результаты с точки зрения выражения конструкций, как было продемонстрировано в нескольких клеточных линиях и с несколькими трансфекционными реагентами29. Различные факторы могут влиять на экспрессию трансфицированных белков в контексте сотрансфекционной системы, включая векторы, типы клеток и концентрацию плазмид. Такое множество факторов делает оптимизацию и воспроизводимость сложной задачей. С другой стороны, методология in vitro позволяет лучше контролировать условия, в которых происходит реакция биотинилирования. Эта методология приводит к воспроизводимой и однородной маркировке рекомбинантного BDNF.

Как показали эксперименты по проверке биологической активности, mbtBDNF, произведенный с использованием этого протокола, сопоставим с коммерчески доступным рекомбинантным человеческим БДФФ с точки зрения активации сигнального пути BDNF-TrkB. Данные также показывают, что соединение BDNF с стрептавидином-ЗД не мешает сигнализации BDNF-TrkB. Кроме того, мы показали, что BDNF-ЗД может быть обнаружена с помощью микроскопии эпифлюоресценции в живых и фиксированных клетках. Таким образом, mbtBDNF представляет собой ценный инструмент для изучения ретроградной аксональной торговли и представляет значительные преимущества перед альтернативными зондами, такими как BDNF-GFP16. Протокол, описанный в этой статье, обеспечивает надежную и последовательную методологию производства mbtBDNF, которая затем может быть использована в пост-эндоцитных исследованиях динамики в различных нейронных моделях, выражающих TrkB или p75. BDNF сигнализации имеет мощное воздействие на нейрональной морфологии и функции3,4,21, и недавно был предложен в качестве потенциального терапевтического инструмента для повышения регенерации нейронов30,31, что делает его исследование актуальным в области клеточной биологии и биомедицины. Изучение последствий сигнализации и оборота BDNF будет способствовать дальнейшему развитию нашего понимания биологии нейронных клеток и может позволить использовать его регенеративный потенциал в клинических условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы с благодарностью признают финансовую поддержку fondecyt (1171137) (FCB), Базального центра передового опыта в области науки и техники (AFB 170005) (FCB), Millenium-Nucleus (P 07/011-F) (FCB), Премия старшего следователя Wellcome Trust (107116//15/з) (GS) и премия Фонда Фонда Британского института деменции (GS). Эта работа была поддержана Unidad де Микроскопия Аванзада UC (УМА UC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 way stopcock BioRad 7328102 Chromatography apparatus component
2-mercaptoethanol Sigma M6250 BDNF elution buffer
Acrylamide/Bisacrylamide BioRad 1610154 SDS-PAGE gel preparation
Amicon Ultra-15 10K Millipore UFC901024 BDNF concentration
Ammonium Persulfate Sigma A9164 SDS-PAGE gel preparation
anti B-III-Tubulin antibody Sigma T8578 Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti BDNF antibody Alomone AGP-021 Western blot assays for BDNF quantification
anti BDNF antibody Alomone ANT-010 Western blot assays for BDNF quantification
Anti ERK antibody Cell Signaling 9102 Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pCREB antibody (S133) Cell Signaling 9198 Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pERK antibody (T202, Y204) Cell Signaling 4370 Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pTrkB antibody (Y515) Abcam ab109684 Western blot assays for BDNF biological activity detection
Antibiotic/Antimycotic Gibco 15240-062 HEK293 maintenance
ATP Sigma A26209 BDNF monobiotinylation buffer
B-27 Supplement Gibco 17504-044 Neuron maintenance
Bicine Sigma B3876 BDNF monobiotinylation buffer
BirA-GST BPS Bioscience 70031 Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation
Bovine Fetal Serum HyClone HC.SH30396.02 HEK293 maintenance
Bovine Serum Albumin Jackson ImmunoResearch 001-000-162 BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence
D-Biotin Sigma B4639 BDNF monobiotinylation buffer
DMEM High Glucose Medium Gibco 11965-092 Neuron seeding
DMEM Medium Gibco 11995-081 HEK293 maintenance
Econo Column Funnel BioRad 7310003 Chromatography apparatus component
EDTA Merck 108418
EZ-ECL Kit Biological Industries 1633664 Protein detection by western blotting
Glutamax Gibco 35050-061 Neuron and HEK293 maintenance
Glycerol Merck 104094 BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays
Hettich Rotina 46R Centrifuge Hettich Discontinued Centrifuge used for clearing the medium of debris
Hettich Universal 32R Centrifuge Hettich Discontinued Centrifuge used for protein concentrator centrifugation
Horse Serum Gibco 16050-122 Neuron seeding
ImageQuant LAS 500 GE Healthcare Life Sciences 29005063 Western blot image acquisition
Imidazole Sigma I55513 BDNF buffer modification component
KCl Winkler BM-1370 PBS component
KH2PO4 Merck 104873 PBS component
Laminin Invitrogen 23017-015 Cover coating for compartmentalized neurons
Luer Tubing Adaptor BioRad 7323245 Chromatography apparatus component
Luminata™ Forte Western HRP Substrate Millipore WBLUF0100 Protein detection by western blotting
Mg(CH3COO)2 Merck 105819 BDNF monobiotinylation buffer
Mowiol 4-88 Calbiochem 475904 Mounting reagent for immunofluorescence assays
MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads Invitrogen 65001 Biotinylation verification
Na2HPO4 Merck 106586 BDNF buffer modification component
NaCl Winkler BM-1630 PBS component, BDNF buffer modification component
NaH2PO4 Merck 106346 BDNF buffer modification component
Neurobasal Medium Gibco 21103-049 Neuron maintenance
Ni-NTA Agarose Beads Qiagen 30210 BDNF AviTag purification
Nikon Ti2-E Nikon Microscope for fluorescence imaging
Nitrocellulose Membrane BioRad 1620115 Protein transfer for western blotting
ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera Hamamatsu C13440-20CU Camera for epifluorescence imaging
P8340 Protease Inhibitor Cocktail Sigma P8340 BDNF buffer modification component
Paraformaldehyde Merck 104005 Fixative for immunofluorescence assays
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122 Neuron maintenance
Poli-D-Lysine Corning DLW354210 Cover coating for compartmentalized neurons
Poli-L-Lysine Millipore P2363 Cover coating for non-compartmentalized neurons
Poly-Prep Chromatography Column BioRad 7311550 Chromatography apparatus component
Polyethyleneimine 25K Polysciences Inc. PLY-0296 HEK293 transfection
Quantum Dots 655 streptavidin conjugate Invitrogen Q10121MP Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments
Saponin Sigma S4521 Detergent for immunofluorescence assays
Syldgard 184 silicone elastomer base Poirot 4019862 Microfluidic chamber preparation
TEMED Sigma T9281 SDS-PAGE gel preparation
Tris Winkler BM-2000 Lysis buffer component
Triton X100 Merck 108603 Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays
Trypsin-EDTA 0.5% Gibco 15400-054 HEK293 passaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
  2. Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
  3. Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
  4. Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1 (2010).
  5. Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. Lewin, G., Carter, B. 220, Springer. Berlin, Heidelberg. (2014).
  6. Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
  7. Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293 (2006).
  8. Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070 (2019).
  9. Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, Suppl 1 11-14 (2007).
  10. Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
  11. Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
  12. Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
  13. Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684 (2015).
  14. Biocompare: The Buyer's Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important. , Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012).
  15. Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
  16. Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899 (2014).
  17. Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
  18. Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  19. Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. Neuroscience. 154 (3), 978-993 (2008).
  20. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
  21. Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493 (2018).
  22. Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
  23. Gonzalez, A., Lazo, O. M., Bronfman, F. C. The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons. , Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019).
  24. Mowla,, et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
  25. Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
  26. Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L'Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
  27. Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
  28. Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77 (2019).
  29. Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
  30. Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
  31. Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).

Tags

Нейронаука Выпуск 161 БДНФ моно-биотинилирование кватные точки аксональный оборот очистка белка эндосомная динамика отслеживание in vivo
Улучшенный протокол для очищения и непосредственно моно-биотинилат рекомбинантный BDNF в трубе для клеточного исследования торговли в нейронах
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stuardo, N., Moya-Alvarado, G.,… More

Stuardo, N., Moya-Alvarado, G., Ramírez, C., Schiavo, G., Bronfman, F. C. An Improved Protocol to Purify and Directly Mono-Biotinylate Recombinant BDNF in a Tube for Cellular Trafficking Studies in Neurons. J. Vis. Exp. (161), e61262, doi:10.3791/61262 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter