Summary

Nöronlarda Hücresel İnsan Ticareti Çalışmaları Için Bir Tüpte Doğrudan Mono-Biyotinylate Rekombinant BDNF'yi Arındırmak ve Doğrudan Bir Protokol

Published: July 11, 2020
doi:

Summary

Avi dizisi (BDNFAvi) içeren rekombinant BDNF, HEK293 hücrelerinde uygun maliyetli bir şekilde üretilir ve afinite kromatografisi ile saflaştırılır. BDNFavi daha sonra doğrudan mono-biyotinylated enzim BirA ile bir tüp içinde. BDNFavi ve mono-biyotinylated BDNFavi ticari olarak kullanılabilir BDNF ile karşılaştırıldığında kendi biyolojik aktivitelerini korumak.

Abstract

Avi dizisi (BDNFAvi) içeren rekombinant BDNF HEK293 hücrelerinde üretilir ve daha sonra afinite kromatografisi ile uygun maliyetli bir şekilde saflaştırılır. Bir tüpte BirA enzimi ile Doğrudan mono-biyotinylate BDNFAvi için tekrarlanabilir bir protokol geliştirilmiştir. Bu reaksiyonda, mono-biyotinylated BDNFAvi biyolojik aktivitesini korur.

Nörotrofinler nöronal gelişim ve bakımda rol oynayan hedef kaynaklı büyüme faktörleridir. Onlar farklı nöronal bölmeleri arasında uzun mesafe sinyal izin vermek için endositik yol boyunca hızlı taşıma mekanizmaları gerektirir. Nörotrofin lerin ticaretini incelemek için moleküler araçların geliştirilmesi, in vivo kayıt kullanarak hücredeki bu proteinlerin kesin olarak izlenmesini sağlamıştır. Bu protokolde, mono-biyotinylated BDNF üretimi için optimize edilmiş ve uygun maliyetli bir prosedür geliştirdik. Biyotentojen avi dizisi (BDNFAvi) içeren bir rekombinant BDNF varyantı mikrogram aralığındaki HEK293 hücrelerinde üretilir ve daha sonra afinite kromatografisi kullanılarak kolayca ölçeklenebilir bir işlemle saflaştırılır. Saflaştırılmış BDNF daha sonra homojen bir tüp içinde enzim BirA ile doğrudan in vitro reaksiyon ile mono-biyotinylated olabilir. Mono-biyotinylated BDNF biyolojik aktivitesi (mbtBDNF) farklı floroforlara streptavidin-konjuge konjuge olabilir. BDNFAvi ve mbtBDNF, sırasıyla batı blotunu kullanarak aşağı fosforile hedeflerin tespiti ve transkripsiyon faktörü CREB’nin aktivasyonu yoluyla gösterdikleri biyolojik aktivitelerini korumaktadırlar. Streptavidin-kuantum noktalarını kullanarak, fosfo-CREB spesifik antikor ile tespit edilen CREB aktivasyonu ile birlikte mbtBDNF içselleştirmeyi görselleştirebildik. Buna ek olarak, kontrtavidin-kuantum noktalarına konjuge mbtBDNF mikroakışkan odalarda yetişen kortikal nöronlarda retrograd taşıma analizi için uygundu. Bu nedenle, tüp üretilen mbtBDNF fizyolojik sinyal endozom dinamikleri ve nöronlarda ticareti incelemek için güvenilir bir araçtır.

Introduction

Nöronlar sinaptik iletişim sağlayan karmaşık ve özel morfolojisahip sinir sisteminin fonksiyonel birimleri, ve böylece, çeşitli uyaranlara yanıt olarak koordine ve karmaşık davranış nesil. Dendritler ve aksonlar gibi nöronal projeksiyonlar nöronal iletişimde yer alan kritik yapısal özelliklerdir ve nörotrofinler morfolojilerini ve fonksiyonlarını belirlemede önemli oyunculardır1. Nörotrofinler NGF, NT-3, NT-4 ve beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF)2dahil salgılanan büyüme faktörleri bir ailedir. Merkezi sinir sisteminde (CNS), BDNF nörotransmisyon, dendritik arborization, dendritik dikenlerin olgunlaşması, uzun vadeli potentiation, diğerleri arasında 3 dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçlere katılır3,4. Bu nedenle, BDNF nöronal fonksiyonudüzenleyen kritik bir rol oynar.

Farklı hücresel süreçler BDNF dinamiklerini ve işlevini düzenler. Nöronal yüzeyde, BDNF tropomiyozin reseptörü kiazaz B (TrkB) ve / veya p75 nörotrofin reseptörü (p75) bağlanır. BDNF-TrkB ve BDNF-p75 kompleksleri endositonve farklı endositik organeller5,6,6,7,8sıralanır. Farklı nöronal devrelerde uygun BDNF sinyalizasyonu için BDNF/TrkB kompleksinin doğru hücre içi ticareti9,10,11′dir. Bu nedenle, BDNF kaçakçılık dinamiklerinin ve patofizyolojik süreçlerde bulunan değişikliklerin derinlemesine anlaşılması, sağlık ve hastalıkta BDNF sinyalinin anlaşılması esastır. Bu süreci izlemek için yeni ve özel moleküler araçların geliştirilmesi bu alanın ilerlemesine yardımcı olacak ve ilgili düzenleyici mekanizmaların daha iyi kavranmasını sağlayacaktır.

Nöronlarda BDNF ticareti çalışmaları için çeşitli araçlar mevcuttur. Yaygın olarak kullanılan bir metodoloji, yeşil floresan protein (GFP) veya GFP mCherry12monomerikfloresan kırmızı-shifted varyantı gibi floresan molekülleri ile etiketlenmiş rekombinant BDNF transfeksiyon içerir ,13. Ancak, BDNF aşırı ekspresyon önemli bir eksiklik bu nörotrofin bilinen konsantrasyonları teslim olasılığını ortadan kaldırır olmasıdır. Ayrıca, hücresel toksisite neden olabilir, sonuçların yorumlanması gizleme14. Alternatif bir strateji flag-TrkB gibi epitop etiketli TrkB, transfeksiyon olduğunu. Bu metodoloji TrkB içselleştirme dinamiklerinin incelenmesine izin verir15, ama aynı zamanda transfeksiyon içerir, hangi değişmiş TrkB fonksiyonu ve hücresel toksisite neden olabilir. Bu metodolojik engelleri aşmak için, biotin-ligaz enzimi BirA tarafından mono-biyotinylated olabilir bir Avi dizisi (BDNFAvi) içeren NGF ve BDNF rekombinant varyantları geliştirilmiştir16,17. Biyotinylated rekombinant BDNF farklı streptavidin bağlı araçlar, hangi floroforlar dahil birleştiğinde olabilir, boncuklar, algılama için diğerleri arasında paramanyetik nano tanecikleri. Canlı hücre görüntüleme açısından, kuantum nokta (QD) sık kullanılan floroforlar haline gelmiştir, onlar tek parçacık izleme için arzu özellikleri var gibi, küçük molekül floroforlar ile karşılaştırıldığında artan parlaklık ve fotobeyazrlama direnci gibi18.

Mono-biyotinylated BDNF üretimi (mbtBDNF) BDNFAvi kullanarak plazmidlerin co-transfection BDNFAvi ve BirA ifade sürüş elde edilmiştir, affinet kromatografi si ile rekombinant protein saflaştırma takip 20 mL başına BDNF 20 mL HEK293-koşullu kültür medya17. Burada, manipülasyon kolaylığı için kromatografi sütununa dayalı bir protokolde protein iyileşmesini en üst düzeye çıkarmayı amaçlayan 500 mL HEK293 şartlı ortamdan BDNFAvi arınmasını sağlayan bu protokolün bir modifikasyonunu öneriyoruz. Kullanılan transfeksiyon maddesi olan polietilenin (PEI), transfeksiyon veriminden ödün vermeden uygun maliyetli bir yöntem sağlar. Mono-biyotinylasyon adımı, ko-transfeksiyonlarla ilişkili komplikasyonları önlemek ve BDNF’nin homojen etiketlemesini sağlamak için in vitro reaksiyona uyarlanmıştır. MbtBDNF’nin biyolojik aktivitesi batı leke ve floresan mikroskopi deneyleri ile gösterilmiştir, pCREB aktivasyonu ve canlı hücre görüntülemesi de dahil olmak üzere mikroakışkan odalarda BDNF’nin retrograd aksonal naklini incelemek için. Bu protokolün kullanımı homojen mono-biyotinylated ve biyolojik olarak aktif BDNF optimize, yüksek verimli üretim sağlar.

Protocol

Tüm deneyler CONICYT (Şili Ulusal Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Komisyonu) onaylı yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan protokoller Papalık Üniversitesi Biyogüvenlik ve Biyoetik ve Hayvan Refahı Komiteleri tarafından onaylanmıştır. Omurgalılarla ilgili deneyler Papalık Universidad Católica de Chile Biyoetik ve Hayvan Refahı Komitesi tarafından onaylandı. NOT: Aşağıdaki protokol, BDNFAvi’yi HEK293 hücrelerinde üretilen toplam…

Representative Results

Kromatografik sütun tabanlı bir protokolün kullanılması, önemli hacimlerde HEK293 koşullu ortamın işlenmesine olanak tanır. Şekil1’de, 500 mL koşullu ortamdan BDNFAvi arınma sonuçları gösterilmiştir. Ni-NTA agarose boncuklardan BDNFAvi ardışık elutions BDNFAvi konsantrasyonları azalan verim (Şekil 1A). Art arda dört elutions sonra (her kalıcı 15 dk), Boncuklar tarafından yakalanan BDNF çoğunluğu kurtarılır. Eluatların konsantrasyo…

Discussion

Bu makalede, sung veişbirlikçilerininçalışmalarına dayalı olarak mbtBDNF’nin bir yakınlık kromatografisi tabanlı prosedüründe üretimi ve arınması için optimize edilmiş bir metodoloji tanımlanmıştır. Optimizasyonlar, lipofektamin gibi daha pahalı transfeksiyon yöntemlerinin verimliliğini korurken uygun maliyetli bir transfeksiyon reaktifi (PEI) kullanımını içerir. Bu optimizasyon, yüksek maliyet etkinliğini korurken ölçeklenebilirlik sağlayan protokolde önemli bir …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar fondecyt (1171137) (FCB), Bazal Center of Excellence in Science and Technology (AFB 170005) (FCB), Millenium-Nucleus (P07/011-F) (FCB), Wellcome Trust Senior Investigator Award (107116/Z/15/Z) (GS) ve İngiltere Araştırma Enstitüsü (GS) tarafından mali destek kabul eder. Bu çalışma Unidad de Microscopía Avanzada UC (UMA UC) tarafından desteklenmiştir.

Materials

2 way stopcock BioRad 7328102 Chromatography apparatus component
2-mercaptoethanol Sigma M6250 BDNF elution buffer
Acrylamide/Bisacrylamide BioRad 1610154 SDS-PAGE gel preparation
Amicon Ultra-15 10K Millipore UFC901024 BDNF concentration
Ammonium Persulfate Sigma A9164 SDS-PAGE gel preparation
anti B-III-Tubulin antibody Sigma T8578 Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti BDNF antibody Alomone AGP-021 Western blot assays for BDNF quantification
anti BDNF antibody Alomone ANT-010 Western blot assays for BDNF quantification
Anti ERK antibody Cell Signaling 9102 Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pCREB antibody (S133) Cell Signaling 9198 Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pERK antibody (T202, Y204) Cell Signaling 4370 Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pTrkB antibody (Y515) Abcam ab109684 Western blot assays for BDNF biological activity detection
Antibiotic/Antimycotic Gibco 15240-062 HEK293 maintenance
ATP Sigma A26209 BDNF monobiotinylation buffer
B-27 Supplement Gibco 17504-044 Neuron maintenance
Bicine Sigma B3876 BDNF monobiotinylation buffer
BirA-GST BPS Bioscience 70031 Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation
Bovine Fetal Serum HyClone HC.SH30396.02 HEK293 maintenance
Bovine Serum Albumin Jackson ImmunoResearch 001-000-162 BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence
D-Biotin Sigma B4639 BDNF monobiotinylation buffer
Dithiothreitol Invitrogen 15508-013
DMEM High Glucose Medium Gibco 11965-092 Neuron seeding
DMEM Medium Gibco 11995-081 HEK293 maintenance
Econo Column Funnel BioRad 7310003 Chromatography apparatus component
EDTA Merck 108418
EZ-ECL Kit Biological Industries 1633664 Protein detection by western blotting
Glutamax Gibco 35050-061 Neuron and HEK293 maintenance
Glycerol Merck 104094 BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays
Hettich Rotina 46R Centrifuge Hettich Discontinued Centrifuge used for clearing the medium of debris
Hettich Universal 32R Centrifuge Hettich Discontinued Centrifuge used for protein concentrator centrifugation
Horse Serum Gibco 16050-122 Neuron seeding
ImageQuant LAS 500 GE Healthcare Life Sciences 29005063 Western blot image acquisition
Imidazole Sigma I55513 BDNF buffer modification component
KCl Winkler BM-1370 PBS component
KH2PO4 Merck 104873 PBS component
Laminin Invitrogen 23017-015 Cover coating for compartmentalized neurons
Luer Tubing Adaptor BioRad 7323245 Chromatography apparatus component
Luminata™ Forte Western HRP Substrate Millipore WBLUF0100 Protein detection by western blotting
Mg(CH3COO)2 Merck 105819 BDNF monobiotinylation buffer
Mowiol 4-88 Calbiochem 475904 Mounting reagent for immunofluorescence assays
MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads Invitrogen 65001 Biotinylation verification
Na2HPO4 Merck 106586 BDNF buffer modification component
NaCl Winkler BM-1630 PBS component, BDNF buffer modification component
NaH2PO4 Merck 106346 BDNF buffer modification component
Neurobasal Medium Gibco 21103-049 Neuron maintenance
Ni-NTA Agarose Beads Qiagen 30210 BDNF AviTag purification
Nikon Ti2-E Nikon Microscope for fluorescence imaging
Nitrocellulose Membrane BioRad 1620115 Protein transfer for western blotting
ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera Hamamatsu C13440-20CU Camera for epifluorescence imaging
P8340 Protease Inhibitor Cocktail Sigma P8340 BDNF buffer modification component
Paraformaldehyde Merck 104005 Fixative for immunofluorescence assays
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122 Neuron maintenance
Poli-D-Lysine Corning DLW354210 Cover coating for compartmentalized neurons
Poli-L-Lysine Millipore P2363 Cover coating for non-compartmentalized neurons
Poly-Prep Chromatography Column BioRad 7311550 Chromatography apparatus component
Polyethyleneimine 25K Polysciences Inc. PLY-0296 HEK293 transfection
Quantum Dots 655 streptavidin conjugate Invitrogen Q10121MP Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments
Saponin Sigma S4521 Detergent for immunofluorescence assays
Sucrose Merck 107687
Syldgard 184 silicone elastomer base Poirot 4019862 Microfluidic chamber preparation
TEMED Sigma T9281 SDS-PAGE gel preparation
Tris Winkler BM-2000 Lysis buffer component
Triton X100 Merck 108603 Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays
Trypsin-EDTA 0.5% Gibco 15400-054 HEK293 passaging

References

  1. Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
  2. Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
  3. Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
  4. Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1 (2010).
  5. Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A., Lewin, G., Carter, B. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. 220, (2014).
  6. Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
  7. Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293 (2006).
  8. Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070 (2019).
  9. Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, 11-14 (2007).
  10. Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
  11. Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
  12. Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
  13. Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684 (2015).
  14. Biocompare: The Buyer’s Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012)
  15. Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
  16. Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899 (2014).
  17. Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
  18. Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  19. Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. Neuroscience. 154 (3), 978-993 (2008).
  20. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
  21. Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493 (2018).
  22. Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
  23. . The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019)
  24. Mowla, , et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
  25. Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
  26. Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L’Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
  27. Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
  28. Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77 (2019).
  29. Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
  30. Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
  31. Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).

Play Video

Cite This Article
Stuardo, N., Moya-Alvarado, G., Ramírez, C., Schiavo, G., Bronfman, F. C. An Improved Protocol to Purify and Directly Mono-Biotinylate Recombinant BDNF in a Tube for Cellular Trafficking Studies in Neurons. J. Vis. Exp. (161), e61262, doi:10.3791/61262 (2020).

View Video