Summary
Hier wordt een chemisch gedefinieerd protocol gepresenteerd voor de afleiding van menselijke nierpodocyten uit geïnduceerde pluripotente stamcellen met een hoge efficiëntie (>90%) en onafhankelijk van genetische manipulaties of subpopulatieselectie. Dit protocol produceert het gewenste celtype binnen 26 dagen en kan nuttig zijn voor nefrotoxiciteitstests en ziektemodellering.
Abstract
Nierziekte treft meer dan 10% van de wereldbevolking en kost miljarden dollars aan federale uitgaven. De meest ernstige vormen van nierziekte en uiteindelijk eindstadium nierfalen worden vaak veroorzaakt door de schade aan de glomerulaire podocyten, de zeer gespecialiseerde epitheelcellen die samen met endotheelcellen en het glomerulaire keldermembraan functioneren om de filtratiebarrière van de nier te vormen. Vooruitgang in de niergeneeskunde is gehinderd door de beperkte beschikbaarheid van primaire weefsels en het gebrek aan robuuste methoden voor de afleiding van functionele menselijke niercellen, zoals podocyten. Het vermogen om podocyten af te leiden uit hernieuwbare bronnen, zoals stamcellen, kan helpen het huidige begrip van de mechanismen van menselijke nierontwikkeling en -ziekte te bevorderen, en nieuwe hulpmiddelen bieden voor therapeutische ontdekking. Het doel van dit protocol was om een methode te ontwikkelen om volwassen, post-mitotische podocyten af te leiden uit door de mens geïnduceerde pluripotente stam (hiPS) cellen met een hoge efficiëntie en specificiteit, en onder chemisch gedefinieerde omstandigheden. De van hiPS-cellen afgeleide podocyten die door deze methode worden geproduceerd, drukken afstammingsspecifieke markers uit (waaronder nefrine, podocine en Wilm's Tumor 1) en vertonen de gespecialiseerde morfologische kenmerken (inclusief primaire en secundaire voetprocessen) geassocieerd met volwassen en functionele podocyten. Intrigerend genoeg zijn deze gespecialiseerde kenmerken met name afwezig in de onsterfelijke podocytencellijn die veel in het veld wordt gebruikt, wat suggereert dat het hierin beschreven protocol menselijke nierpodocyten produceert die een ontwikkelingsrijp fenotype hebben dan de bestaande podocytcellijnen die meestal worden gebruikt om de menselijke nierbiologie te bestuderen.
Introduction
Vooruitgang in menselijke pluripotente stamcelcultuur staat klaar om een revolutie teweeg te brengen in regeneratieve geneeskunde, ziektemodellering en medicijnscreening door onderzoekers een hernieuwbare, schaalbare bron van biologisch materiaal te bieden die kan worden ontworpen om bijna elk celtype in het menselijk lichaam te verkrijgen1. Deze strategie is vooral nuttig voor het afleiden van gespecialiseerde en functionele celtypen die anders moeilijk te verkrijgen zouden zijn. Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPS)2,3,4,5 zijn bijzonder aantrekkelijk vanwege hun somatische celoorsprong en het potentieel dat ze vertegenwoordigen voor gepersonaliseerde geneeskunde. Het ontwikkelen van methoden om andere cellijningen af te leiden uit hiPS-cellen blijft echter een uitdaging vanwege het frequente gebruik van slecht gedefinieerde kweekomstandigheden die leiden tot een lage efficiëntie en niet-specifieke generatie van heterogene celpopulaties6,7.
Hier gepresenteerd is een methode voor de afleiding van volwassen nierpodocyten uit hiPS-cellen met specificiteit en hoge efficiëntie onder chemisch gedefinieerde omstandigheden. Door rekening te houden met de rol van meerdere factoren binnen de cellulaire micro-omgeving, werd een stamceldifferentiatiestrategie ontwikkeld die de optimalisatie van oplosbare factoren in het celkweekmedium omvatte, evenals onoplosbare factoren, zoals extracellulaire matrixcomponenten of kleefsubstraten. Gezien het belang van integrinesignalering in de ontwikkeling en functie van podocyten, werd de expressie van integrinereceptoren op het celoppervlak aanvankelijk onderzocht. β1-integrinen kwamen niet alleen sterk tot expressie in hiPS-cellen, maar ook in hun derivaten, waaronder mesoderm- en intermediaire mesodermcellen8,9,10. Latere experimenten bevestigden dat liganden die binden aan β1-integrinen (inclusief laminine 511 of laminine 511-E8-fragment) de hechting en differentiatie van hiPS-cellen in podocyten ondersteunen bij gebruik in combinatie met de oplosbare inductieve media die hieronder worden beschreven.
Inductie van cellijn commitment werd geïnitieerd door eerst te bevestigen dat hiPS-cellen gekweekt op de laminine-gecoate oppervlakken gedurende twee dagen in aanwezigheid van een medium met Activine A, CHIR99021 en Y27632 Rock-remmer kunnen differentiëren in cellen die de vroege mesodermmarkers HAND1, goosecoid en brachyury tot expressie brengen8,11. Behandeling van de mesodermcellen gedurende 14 dagen met een medium aangevuld met botmorfogenetisch eiwit 7 (BMP-7) en CHIR99021 maakte de afleiding mogelijk van intermediaire mesodermcellen die de nefron-voorlopercelmarkers Wilm's Tumor 1 (WT1), oneven overgeslagen gerelateerd eiwit 1 (OSR1)8,11en gepaard box gen 2-eiwit (PAX2)12tot expressie riepen. Om de rijpe nierglomerulaire podocyten af te leiden, werden de intermediaire mesodermcellen gedurende 4-5 dagen behandeld met een nieuw medium bestaande uit BMP-7, Activine A, vasculaire endotheelgroeifactor (VEGF), transtrans-retinoïnezuur en CHIR99021. Flowcytometrie en immunostaining werden gebruikt om te bevestigen dat >90% van de resulterende cellen de moleculaire, morfologische en functionele kenmerken van de volwassen nierpodocyt8,11,13vertoonden. Deze kenmerken omvatten de ontwikkeling van primaire en secundaire voetprocessen; de expressie van podocytenlijnspecifieke genen, waaronder SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 en de expressie van eiwitten waaronder podocine, nefrine en WT114,15,16. Bovendien bleek dat de van hiPS-cellen afgeleide podocyten tot vier weken in vitro in cultuur kunnen worden gehouden door een commercieel beschikbaar medium8,11 te gebruiken dat een extra flexibiliteit biedt in de timing van downstream-experimenten. Voor meer informatie over de flowcytometriepanelen die worden gebruikt voor het bepalen van de zuiverheid van de hiPS-podocyten, verwijzen wij u naar onze vorige publicatie11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van reagentia
- Verdun ontdooide 5x hiPS celkweek media (CCM) supplement in hiPS cel cultuur basaal medium om een 1x oplossing van hiPS CCM te verkrijgen.
OPMERKING: Bevroren 5x hiPS CCM supplement vereist een langzaam ontdooiproces, idealiter in 4 °C voor een nacht. Aliquots van de 1x hiPS CCM kunnen tot 6 maanden bewaard worden bij -20 °C. - Bereiding van keldermembraan (BM) matrix 1-gecoate platen voor hiPS-celkweek: Ontdooi BM matrix 1 's nachts op ijs bij 4 °C. Na ontdooiing bereidt u aliquots met geschikte verdunningsfactoren zoals voorgesteld door de fabrikant.
OPMERKING: Doorgaans worden aliquots bereid voor daaropvolgende verdunning in 25 ml koude DMEM / F12 in een conische buis van 50 ml, gevolgd door grondig mengen om de BM-matrix 1 volledig op te lossen en de vorming van resterende kristallen te voorkomen. - Breng 1 ml van de BM matrix 1-oplossing over in elke put van een plaat met 6 putten en incubeer bij 37 °C gedurende 1-2 uur of bij 4 °C gedurende ten minste 24 uur, gewikkeld in paraffinefolie. De BM matrix 1 -gecoate platen kunnen maximaal 2 weken bij 4 °C worden bewaard.
- Bereiding van keldermembraan (BM) matrix 2 - gecoate platen: Verdun de juiste hoeveelheden BM-matrix 2 in 9 ml steriel gedestilleerd water om een eindconcentratie van 5 μg / ml te bereiden. Voeg 700 μL van de BM matrix 2-oplossing toe aan elke put van een 12-putplaat en incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 2 uur of 's nachts bij 4 °C.
- Bereid 100 μg/ml stamoplossingen elk van BMP7, Activine A en VEGF als volgt: reconstitueer BMP7 in steriel gedestilleerd water met 0,1% (wt/vol) BSA en reconstitueer Activine A en VEGF afzonderlijk in steriel PBS met 0,1% (wt/vol) BSA. Om frequente vries-dooicycli te voorkomen, bereidt u 100 μL aliquots uit elke stamoplossing en bewaart u deze gedurende maximaal 6 maanden bij -20 °C.
- Bereid een 10 mM stamoplossing van Y27632 door 10 mg Y27632 op te lossen in 3,079 ml steriel gedestilleerd water. Aliquot 100 μL uit de voorraad en bewaar bij -20 °C gedurende maximaal 6 maanden.
- Los 2 mg CHIR99021 op in 143,4 μL steriel DMSO om een 30 mM stamoplossing te bereiden. Bereid 5 μL aliquots en bewaar bij -20 °C gedurende maximaal 1 maand (of volgens de aanbeveling van de fabrikant).
- Los 10 mgtrans-trans retinoïnezuur op in 3,33 ml steriel DMSO. Bereid 500 μL aliquots en bewaar bij -20 °C gedurende maximaal 6 maanden.
2. Voorbereiding van cultuurmedia
- Bereid het mesodermdifferentiatiemedium door overeenkomstige stamoplossingen te reconstitueren tot een eindconcentratie van 100 ng / ml Activine A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632 en 1x B27 serumvrij supplement in een geschikt volume DMEM / 12 met glutaminesupplement.
OPMERKING: Het mesodermdifferentiatiemedium moet vers worden bereid vóór differentiatiestappen en op een volume dat geschikt is voor de schaal van het experiment (doorgaans is 50 ml medium voldoende voor twee 12 putplaten). - Bereid intermediair mesoderm differentiatiemedium voor door overeenkomstige stamoplossingen te reconstitueren tot een eindconcentratie van 100 ng / ml BMP7, 3 μM CHIR99021 en 1x B27 serumvrij supplement in DMEM / F12 met een glutaminesupplement.
OPMERKING: Indien nodig kan het medium worden aangevuld met 1% (vol / vol) Penicilline-Streptomycine. Pas het volume van het medium aan met DMEM / F12 met glutaminesupplement. Dit medium kan in grote partijen worden bereid; het wordt echter aanbevolen om te bewaren in kleinere aliquots (bijv. 45 ml in conische buizen van 50 ml) om herhaalde vries-dooicycli te voorkomen. Dit medium kan tot 3 maanden bij -20 °C worden bewaard en kan voor gebruik een nacht bij 4 °C worden ontdooid. - Bereid het podocyteninductiemedium door reconstitutie tot een eindconcentratie van 100 ng / ml BMP7, 100 ng / ml activine A, 50 ng / ml VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x B27 serumvrij supplement en 0,1 μM all-trans retinoïnezuur in DMEM / F12 met glutaminesupplement. Bescherm het medium tegen licht (bijv. door de verpakking in te pakken met foliepapier).
OPMERKING: Dit medium kan in grote hoeveelheden worden bereid en in het donker bij -20 °C gedurende maximaal 3 maanden worden bewaard. Bevroren aliquots moeten vóór gebruik een nacht bij 4 °C worden ontdooid. - Bereid 25 ml trypsineneutraliserende oplossing door toevoeging van 10% (vol/vol) warmte-geïnactiveerde FBS in DMEM/F12 en filter onder steriele omstandigheden.
- Voor postdifferentiatieonderhoud van de van stamcellen afgeleide podocyten, bereidt u Complete Medium met podocytenonderhoudsmedia door het supplement toe te voegen aan het basale medium volgens de richtlijnen van de fabrikant en bewaart u het bij 4 °C gedurende maximaal twee weken.
3. Feeder-vrije hiPS-celcultuur met behulp van hiPS-celkweekmedium
- Adem de restoplossing van BM matrix 1 uit de voorgecoate platen en was de putten 3 keer met 1 tot 2 ml verwarmd DMEM/F12.
- Aspiraat besteed hiPS CCM uit de hiPS-cellen en spoel de cellen 3 keer met opgewarmde DMEM / F12. Voeg 1 ml loslatingsoplossing voor warme cellen toe en incubeer gedurende 1 minuut bij 37 °C om de cellen te helpen dissociëren. Voer visuele inspectie van cellen uit onder een weefselkweekmicroscoop en zorg ervoor dat de randen van de celkolonies afgerond lijken, en adem vervolgens snel de celonthechtingsoplossing uit de cellen (zorg ervoor dat de celkolonies nog steeds aan de plaat vastzitten, zij het losjes). Spoel de cellen eenmaal voorzichtig met DMEM/F12 om de celdetachementoplossing te verwijderen.
- Voeg 3 ml hiPS CCM toe aan de hiPS-cellen (in elke put van een 6-putplaat) die zijn behandeld met de celdetachementoplossing. Schraap kolonies met behulp van een cellifter en pipetteer voorzichtig celsuspensie op en neer om de losjes gehechte cellen los te maken. Was de plaat grondig om ervoor te zorgen dat alle cellen worden geoogst.
OPMERKING: Het gebruik van een pipet van 5 ml wordt aanbevolen om overmatige afschschuif op de cellen te voorkomen. - Breng 0,5 ml van de celsuspensie over in elke put van een nieuwe BM-matrix 1-gecoate 6-putplaat met 2 ml hiPS CCM per put. Beweeg de plaat in figuur acht om celkolonies in putten te verdelen en incubateer bij 37 °C in een 5 % CO2-incubator. Ververs het medium dagelijks totdat de cellen klaar zijn om te worden doorgenomen of gebruikt voor het differentiatie-experiment (ongeveer 70 % confluentie).
OPMERKING: De ideale koloniegrootte voor routinematige passaging van iPSC's ligt tussen 200-500 μm onder feedervrije omstandigheden met hiPS CCM (zonder ROCK-remmer). Als cellen tijdens de behandeling worden geïndividualiseerd met dissociatie-enzymen of buffers, kan de hiPS CCM worden aangevuld met ROCK-remmer (bijv. 10 μM Y27632) om de levensvatbaarheid van de cel te verbeteren.
4. Differentiatie van hiPS-cellen in mesodermcellen (dag 0-2)
- Terwijl de hiPS-celculturen zich in de exponentiële groeifase bevinden (ongeveer binnen 4 dagen na het verstrijken van de cultuur en ongeveer 70% confluentie), visueel inspecteren op de aanwezigheid van spontaan gedifferentieerde cellen in en rond de randen van de kolonies. Indien nodig, aseptisch afschrapen van differentiatiegebieden.
- Aspirateer hiPS CCM uit hiPS cellen en spoel de cellen 3 keer met warme DMEM/F12. Incubeer de cellen met 1 ml enzymvrije celdissociatiebuffer gedurende 10 minuten bij 37 °C en controleer op de dissociatie onder een microscoop. Vanwege inherente verschillen tussen verschillende hiPS-cellijnen moet de werkelijke incubatietijd voor de celdissociatiebuffer voor een bepaalde cellijn worden bepaald.
- Schraap de put voorzichtig met een cellifter om losjes gehechte cellen losjes los te maken en breng de celsuspensie over naar een conische buis van 15 ml, gevolgd door meerdere keren op en neer te pipetteren om de hiPS-cellen te individualiseren.
- Breng de celsuspensie op het volume van 15 ml met warme DMEM/F12 en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 290 x g bij kamertemperatuur.
- Adem het supernatant voorzichtig op en resuspend de cellen met warme DMEM /F12 voor nog een ronde van centrifugatie om resterende BM-matrix 1 en dissociatiebuffercomponenten te verwijderen.
- Aspirateer de supernatant- en resuspendcellen in 1 ml mesoderm-inductiemedium zoals hierboven beschreven. Tel het totale aantal cellen met behulp van een hemocytometer of coulterteller om het juiste volume mesodermdifferentiatiemedium te bepalen dat nodig is om een concentratie van 1 x 105 cellen / ml te bereiken.
- Aspirateer ECM-oplossing uit de BM matrix 2-gecoate platen en spoel de platen tweemaal met warme DMEM/F12. Meng de hiPS-celsuspensie voorzichtig door een paar keer te pipetteren. Breng 1 ml van de celsuspensie over naar elke put van de BM matrix 2-gecoate 12-well platen en schud vervolgens voorzichtig de platen om de cellen gelijkmatiger te verdelen.
- Incubeer de plaat bij 37 °C in een 5% CO2 incubator. Ververs het mesoderm inductiemedium de volgende dag.
OPMERKING: Na 2 dagen zouden hiPS-cel-afgeleide mesodermcellen klaar zijn voor intermediaire mesoderm-inductie.
5. Differentiatie van hiPS-cel-afgeleide mesodermcellen in intermediair mesoderm (dag 2-16)
- Op dag 2 van het differentiatieprotocol, aspirate mesoderm inductie medium en vul aan met 1 ml per put intermediair mesoderm inductie medium.
- Ververs het medium elke dag om een nauwkeurige drempel van groeifactoren en kleine moleculen voor de metabolisch actieve cellen te behouden. Als er sprake is van aanzienlijke celgroei en snelle uitputting van medianutriënten (aangegeven door de vergeling van de media), kan het volume van het intermediaire mesodermdifferentiatiemedium worden verhoogd tot 1,3 ml per put van de 12 putplaten.
- Kweekcellen gedurende nog eens 14 dagen om intermediaire mesodermcellen te verkrijgen. Op dag 16 kunnen deze cellen worden gecryopreserveerd voor later gebruik.
6. Differentiatie van hiPS-cel-afgeleide intermediaire mesodermcellen in podocyten (dag 16 tot 21)
- Spoel de tussenliggende mesodermcellen met warme DMEM/F12 gevolgd door incubatie van de cellen met 0,5 ml per put van 0,05 % trypsine-EDTA gedurende 3 minuten bij 37 °C. Voer visuele inspectie uit om ervoor te zorgen dat de cellen beginnen te dissociëren.
- Schraap cellen met behulp van een cellifter en pipetteer de celsuspensie meerdere keren met behulp van een pipetpunt van 1.000 μL om geïndividualiseerde (of kleine klonten) cellen te verkrijgen.
OPMERKING: Zorg er in dit stadium voor dat de cellen volledig zijn gedissocieerd, omdat geaggregeerde cellen mogelijk geen terminaal gedifferentieerd fenotype verkrijgen binnen de tijdlijn van het protocol. - Voeg ongeveer 2 ml per put trypsine-neutraliserende oplossing toe om de activiteit van trypsine te stoppen.
- Breng cellen over naar een conische buis van 50 ml en breng het volume tot 50 ml met DMEM / F12 en centrifugeer de celsuspensie vervolgens gedurende 5 minuten bij 201 x g bij kamertemperatuur.
- Aspirateer de supernatant- en resuspendcellen in het podocyteninductiemedium. Zorg voor een optimaal resultaat voor een uiteindelijke zaaidichtheid van ongeveer 100.000 cellen/put van een 12 putplaat. Voeg de celsuspensie toe aan de BM matrix 2-gecoate platen en schud de plaat voorzichtig om de cellen gelijkmatiger te verdelen.
- Incubeer cellen bij 37 °C en 5% CO2 en ververs het medium dagelijks gedurende maximaal 5 dagen om podocyten te verkrijgen op dag 21.
OPMERKING: De resulterende van hiPS-cellen afgeleide podocyten kunnen gedurende 2-4 extra weken in cultuur worden gehouden door gebruik te maken van een volledig medium met podocytenonderhoudsmedia. Eenmaal in de onderhoudsmedia van podocyten kunnen de cellen om de dag worden gevoed en kunnen ze worden gebruikt voor latere onderzoeken of downstream-analyses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het doel van dit protocol was om aan te tonen dat volwassen menselijke podocyten kunnen worden afgeleid van hiPS-cellen onder chemisch gedefinieerde omstandigheden. De gegevens die in dit manuscript worden gepresenteerd, werden gegenereerd met behulp van de DU11 hiPS-cellijn17, die eerst werden getest op en vrij bleken te zijn van mycoplasma. Chromosomale analyse werd ook uitgevoerd en de cellen bleken karyotypisch normaal te zijn. Beginnend met de ongedifferentieerde DU11 hiPS-cellen, werd de differentiatiestrategie (Figuur 1) die in dit rapport wordt geschetst, gebruikt om eerst de stamcellen (Figuur 2A) te differentiëren in mesodermcellen die Brachyury (T) tot expressie brengen (Figuur 1B en Figuur 2B), gevolgd door differentiatie in PAX2-positieve intermediaire mesodermcellen (Figuur 2C) en ten slotte in volwassen nierglomerulaire podocyten (Figuur 1B, Figuur 2D, Figuur 3Den Figuur 4). Mesodermcellen werden verkregen op dag 2 van het differentiatieprotocol, intermediaire mesodermcellen werden gegenereerd op dag 16 en de volwassen podocyten werden verkregen op dag 21 van het differentiatieprotocol. De resulterende podocyten waren ongeveer 150-200 μm groot wanneer ze werden gehecht aan een vlak weefselkweekoppervlak, zoals de laminine-gecoate platen die in dit experiment werden gebruikt. De van hiPS-cellen afgeleide podocyten vertonen talrijke voetprocesachtige uitbreidingen die werden gevisualiseerd met behulp van meerdere complementaire technieken, waaronder fasecontrastmicroscopie (figuur 1), immunofluorescente microscopie (figuur 4) en scanning elektronenmicroscopie8,11. De van stamcellen afgeleide podocyten kleurden ook positief voor WT115 (figuur 2D) en de afstammingsidentificatiemarker nefrine14 (figuur 4). Intrigerend genoeg was de subcellulaire lokalisatie van nefrine voornamelijk in de podocytenvoetprocessen en het celcytoplasma, consistent met een volwassen podocytfenotype (figuur 2D en figuur 4A,B). Tijdens de ontwikkeling en in de podocytenfysiologie wordt het eiwit nefrrine pendeld tussen de celkern en het cytoplasma, maar nefrine komt voornamelijk tot expressie in het cytoplasma en de voetprocessen naarmate podocyten rijpen en een functioneel fenotypekrijgen 18. De observatie dat de podocyten die worden geproduceerd met behulp van het hierin beschreven differentiatieprotocol nefrrine grotendeels tot expressie brengen in het cytoplasma en voetprocesachtige structuren, onderstreept dus het nut van dit protocol voor het genereren van meer volwassen of gespecialiseerde podocyten. Scanning elektronenmicrofoto's van van hiPS-cellen afgeleide podocyten benadrukken de vertakking van de primaire en secundaire voetprocessen in de van hiPS-cellen afgeleide podocyten zoals eerder gerapporteerd door onze groep8,11. Omdat WT1 op zichzelf geen definitieve marker van nierpodocyten is, wordt het ten zeerste aanbevolen dat onderzoekers hun cellen ook karakteriseren voor gelijktijdige expressie van podocytspecifieke markers zoals podocine en nefrine. Eerder werd aangetoond dat terminaal gedifferentieerde podocyten afgeleid met behulp van deze methode immunostain positief zijn voor podocine, nefrine en WT1, met een overeenkomstige afname van de expressie van de voorlopercelmarker PAX28,11. Samen geven deze resultaten aan dat de podocyten die met behulp van dit protocol zijn afgeleid, ontwikkelingsrijp of gespecialiseerd zijn, zoals vereist voor een functionele menselijke nierglomerulaire podocyt.
Bij het optimaliseren van de omstandigheden voor de differentiatiemethode werden gevallen waargenomen waarin de intermediaire mesodermcellen onvoldoende gedissocieerd waren. Cellen gezaaid in dichtheden die de aanbevolen dichtheid van 100.000 cellen / put van een 12-putplaat (vóór de laatste podocyteninductiestap) aanzienlijk overschreden, resulteerden in grote clusters van cellen die het verwachte morfologische fenotype van volwassen podocyten misten binnen de standaardtijdlijn van het protocol (Figuur 3A, B). Om deze redenen wordt aanbevolen dat onderzoekers de in dit protocol aanbevolen zaaidichtheden gebruiken (figuur 3C, D) voordat ze experimenteren met andere aandoeningen die gewenst kunnen zijn voor specifieke downstream-toepassingen. Samen vertegenwoordigen deze resultaten de gerichte differentiatie van hiPS-cellen in nierglomerulaire podocyten binnen drie weken met behulp van de chemisch gedefinieerde media die hierboven zijn beschreven.
Figuur 1: Differentiatie van hiPS-cellen naar podocyten.
ASchematische weergave van de methode voor gerichte differentiatie van hiPS-cellen in podocyten. BMP7, botmorfogenetisch eiwit 7; RA, retinoïnezuur; VEGF, vasculaire endotheel groeifactor. Dit cijfer is gewijzigd van ref.11. (B) Representatieve beelden van hiPS-cellen in elk stadium van differentiatie. Van links naar rechts tonen beelden de karakteristieke menselijke iPS-celkolonies vóór dissociatie voor differentiatie op dag 0, gevolgd door mesodermcellen na 2 dagen differentiatie, vervolgens intermediaire mesodermcellen na ongeveer 10 dagen differentiatie en ten slotte de terminaal gedifferentieerde podocyten op dag 22. Schaalbalk, 100 μm voor alle afbeeldingen (in paneel B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Immunofluorescentiebeelden van hiPS-cellen en hun gedifferentieerde derivaten die de expressie van afstammingsspecifieke markers en nucleaire counterstaining tonen tijdens de differentiatietijdlijn.
(A)Menselijke iPS-cellen die de pluripotentiemarker Oct4 tot expressie brengen; (B) mesoderm cellen die brachyury (T) tot expressie brengen; (C) intermediaire mesodermcellen die PAX2 tot expressie brengen; en (D) de van hiPS-cellen afgeleide podocyten die de afstammingsidentificatiemarker nefrine en de bijbehorende marker WT1 tot expressie brengen. Schaalbalk, 100 μm voor alle afbeeldingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Effecten van suboptimale zaaidichtheid op het differentiatiepotentieel van intermediaire mesodermcellen afgeleid van de DU11 hiPS-cellijn.
(A) Wanneer de initiële celzaaidichtheid te hoog is (ongeveer 500.000 cellen / put van een 12-putplaat), kunnen cellen dichte aggregaten (B) vormen tijdens de podocyteninductiefase. (C) Aanbevolen zaaidichtheden om klonteren te voorkomen (100.000 cellen / put van een 12 putplaat), en om microscopisch de (D) uitbreiding van voetprocesachtige structuren tijdens de podocytendifferentiatiefase (inzet) te observeren. Schaalbalk, 200 μm voor A-D; en 100 μm voor de inzet in D. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: van hiPS-cellen afgeleide podocyten vertonen morfologisch volwassen fenotype in vitro.
(A)Immunostaining van hiPS-cel-afgeleide podocyten voor nefrine, en(B)hogere vergrotingsbeeld van podocytenvoetprocessen die primaire en secundaire processen (witte pijlen) laten zien, evenals de expressie van nefrine in deze gespecialiseerde celstructuren. Schaalbalk, 100 μm (A); 50 μm (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit rapport beschrijven we een protocol voor het genereren van nierglomerulaire podocyten uit hiPS-cellen. De van hiPS-cellen afgeleide podocyten vertonen morfologische en moleculaire kenmerken geassocieerd met het volwassen nierpodocytenfenotype13. In eerdere publicaties toonden we aan dat de van hiPS-cellen afgeleide podocyten de structuur en selectieve filtratiefunctie van de nierglomerulus kunnen nabootsen wanneer ze worden gekweekt met glomerulaire microvasculaire endotheelcellen in een perfuseerbaar microfluïdisch orgaan-op-een-chip-apparaat8,11.
De volgende kritieke stappen moeten worden overwogen door onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het aanpassen van dit protocol. Ten eerste is het zaaien van hiPS-cellen op laminine-gecoate platen voor de inductie van mesodermcellen een cruciale stap. Hoewel een zaaidichtheid van 100.000 cellen / put wordt aanbevolen, kunnen onderzoekers de initiële celzaaidichtheid aanpassen, afhankelijk van de replicatiesnelheid van de stamcellijn die voor de studie wordt gebruikt. Indien nodig zorgt deze optimalisatie voor voldoende celdichtheid tijdens de mesoderm-inductiefase en voorkomt het de vorming van celaggregaten of zeer grote klonten die mogelijk de kwaliteit van het mesoderm, intermediair mesoderm of podocytfenotype in gevaar kunnen brengen(figuur 3). Het is ook belangrijk op te merken dat verschillen in specificaties van de fabrikant voor sommige reagentia zoals CHIR99021 de kwaliteit van gedifferentieerde cellen kunnen beïnvloeden. Het is dus raadzaam om reagentia van verschillende partijnummers of leveranciers en verkopers te testen op hun biologische activiteit en consistentie tussen onafhankelijke experimenten. Ook is het belangrijk om overmatige blootstelling van hiPS-cellen aan dissociatie-enzymen te voorkomen, omdat dit kan leiden tot ongewenste onthechting van de kleefmatrix en mogelijk verlies van cellen tijdens mediumaspiratie. Een andere cruciale stap die het vermelden waard is, is ervoor te zorgen dat het podocyteninductiemedium wordt beschermd tegen licht om foto-geïnduceerde inactivatie van retinoïnezuur te voorkomen.
In vergelijking met eerdere methoden voor de differentiatie van menselijke nierpodocyten, maakt de hier beschreven methode gebruik van chemisch gedefinieerde factoren (waaronder kleine moleculen, groeifactoren en specifieke isovormen van keldermembraaneiwitten, bij gewenste concentraties) indien nodig om specifieke celsignaleringsroutes te reguleren die betrokken zijn bij de ontwikkeling van de nieren en de podocytenfunctie. In het bijzonder omvatte de generatie van mesodermcellen uit hiPS-cellen de activering van de canonieke Wnt-signaleringsroute die werd uitgevoerd met behulp van het kleine molecuul CHIR9902119. Van de canonieke Wnt-signaleringsroute is bekend dat deze de transcriptionele activiteit reguleert van genen die betrokken zijn bij weefselontwikkeling en -patroon in vivo, evenals celproliferatie en migratie20,21. Het celinductiemedium dat in dit protocol wordt gebruikt, maakt de afleiding van podocyten uit iPS-cel-cel-afgeleide intermediaire mesodermcellen mogelijk. Dit podocyteninductiemedium bestaat uit Activine A, BMP7, VEGF, retinoïnezuur en CHIR99021. Met name vereist dit podocyteninductiemedium geen ongedefinieerde serumcomponenten zoals foetaal runderserum, dat de bijdragen van specifieke factoren kan verdoezelen en de toepassingen van andere celdifferentiatiemethoden voor mechanistische studies naar weefselontwikkeling en -ziekte kan beperken, waardoor het verschilt van die welke werden gebruikt in eerdere pogingen om nierceltypen te genereren22. Bovendien werd waargenomen dat FGF2 en FGF9 niet nodig zijn voor de differentiatie van nierpodocyten uit hiPS-cellen6,7,22. Terwijl eerdere methoden afhankelijk waren van de vorming van meercellige aggregaten zoals embryoïde lichamen en organoïden, produceert de hier beschreven methode cellen die een volwassen fenotype vertonen, zowel morfologisch als door de expressie van afstammingsspecifieke markers waaronder nefrine en podocine, en downregulatie van voorloitorcelmarkers zoals PAX2. Verwacht wordt dat de kennis van de chemische componenten die in dit protocol worden gebruikt, in de toekomst mechanistische studies van de ontwikkeling van menselijk nierweefsel, specificatie van podocytenlijn en pathogenese van ziekten kan vergemakkelijken.
Deze methode voor hiPS-celdifferentiatie maakt ook de generatie van volwassen, postmitotische en functionele podocyten mogelijk met meer dan 90% efficiëntie, zonder subpopulatieselectie, genetische manipulaties of xenotransplantatie. Dit verschilt met name van eerdere pogingen waarbij hoge niveaus van cellulaire heterogeniteit6,7,23 het gebruik van de stamceldifferentiatiemethoden voor translationele medische toepassingen beperkten. Deze methode biedt ook een aanzienlijke vooruitgang voor het veld gezien de uitdagingen die gepaard gaan met de extreem beperkte beschikbaarheid van menselijke nierpodocyten uit andere bronnen zoals primaire weefsels of organoïden. Enkele van de uitdagingen zijn lage afleidingsefficiënties van minder dan 1% bij het gebruik van methoden die afhankelijk zijn van de vorming van embryoïde lichamen of organoïden6,7.
Een beperking van dit protocol zijn de relatief hoge kosten van de reagentia die nodig zijn voor de stamcelkweek en differentiatiestappen, die de implementatie ervan in sommige laboratoria of onderzoeksgroepen kunnen belemmeren. Omdat er veel optimalisatie voor meerdere factoren in de micro-omgeving van de cel (d.w.z. zowel oplosbare als onoplosbare of kleefstoffen) bij betrokken was, raden we aan dat het protocol wordt gevolgd zoals beschreven. Een veelgemaakte fout van anderen die geïnteresseerd waren in het gebruik van deze podocytendifferentiatiemethode was het gebruik van ongepaste celadhesiematrices zoals BM-matrix 1 of andere slecht gedefinieerde dierlijke eiwitten. Zodra het protocol is gevolgd zoals beschreven, kunnen verdere experimenten worden uitgevoerd om de werkzaamheid van andere wijzigingen in het protocol te onderzoeken. Bovendien, vanwege de inherente verschillen tussen verschillende menselijke stamcellijnen, is het vermeldenswaard dat sommige aspecten van de differentiatiemethode, bijvoorbeeld de timing van blootstelling aan differentiatiemedium of celdissociatiemedium en celzaaidichtheden, mogelijk moeten worden geoptimaliseerd. Deze omstandigheden werden echter niet gewijzigd voor de hiPS-cellijnen en embryonale stamcellijnen die tot nu toe zijn getest. Deze podocytendifferentiatiemethode werkt over meerdere hiPS-cellijnen, waaronder de PGP1, IMR-90-1 en IISG3i-CB6, evenals de H9 embryonale stamcellijn8,11. In dit rapport tonen we ook de succesvolle differentiatie van de DU11 hiPS-cellijn met behulp van hetzelfde protocol (figuur 1 en figuur 2). Dus, gezien de consistentie van deze methode over verschillende cellijnen, inclusief resultaten van ongepubliceerd werk van andere onafhankelijke onderzoekslaboratoria (pre-publicatie), verwachten we dat dit differentiatieprotocol nuttig zal zijn voor de afleiding van nierpodocyten uit een breed scala aan hiPS-cellijnen, en daarom niet beperkt tot degene die in dit protocol wordt gebruikt.
Gezien het vermogen van hiPS-cellen om zichzelf voor onbepaalde tijd te vernieuwen, kan deze differentiatiemethode worden gebruikt om onderzoekers te voorzien van een gemakkelijk beschikbare bron van menselijke nierpodocyten. Dit zou kunnen helpen het huidige begrip van menselijke nierbiologie en ziekte24 te bevorderen en de ontwikkeling van nieuwe in vitro niersystemen mogelijk te maken voor het modelleren van de menselijke nierfunctie en reacties op therapeutica. Het hierin beschreven protocol werd bijvoorbeeld onlangs gebruikt en geïntegreerd met een microfluïdisch orgaan-op-een-chip-systeem om een functioneel in vitro model van de glomerulaire capillaire wand van de menselijke nier te ontwikkelen. Deze glomerulaire chip filterde selectief circulerende moleculen en recapituleerde geneesmiddel-geïnduceerde nefrotoxiciteit bij blootstelling aan het chemotherapiegeneesmiddel Adriamycine8. In de toekomst kunnen deze resultaten mogelijk worden geïntegreerd met 3D-bioprinttechnologieën om complexere in vitro modellen van de menselijke nier te ontwikkelen. Dergelijke vooruitgang zou nieuwe platforms kunnen bieden voor het evalueren van kandidaat-geneesmiddelen, met name die welke gericht zijn op de vormen van nierziekten die voortvloeien uit de disfunctie van glomerulaire podocyten. Dit is vooral belangrijk omdat de soortspecifieke verschillen tussen diermodellen en het gebrek aan functionaliteiten op orgaanniveau die doorgaans worden waargenomen in standaard weefselkweekmethoden de ontwikkeling van gerichte therapieën voor verschillende vormen van menselijke nierziekten kunnen belemmeren25. Dit protocol zou dus op een dag mogelijkheden kunnen bieden om de signaalroutes te ontrafelen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van de menselijke nier, evenals de pathogenese van ziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S.M. is auteur van een patent dat is aangevraagd voor methoden voor het genereren van nierpodocyten uit pluripotente stamcellen (Amerikaanse octrooiaanvraag 14/950859). De overige auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Pratt School of Engineering aan de Duke University, de afdeling Nefrologie aan de Duke Medical School, A Chair's Research Award van de afdeling Geneeskunde aan de Duke University en een Burroughs Wellcome Fund PDEP Career Transition Ad Hoc Award aan S.M.. M.B werd ondersteund door het Graduate Research Fellowship Program van de National Science Foundation. We bedanken het Bursac Lab voor het genereus verstrekken van de DU11-stamcellijn en het Varghese Lab aan de Duke University voor het tijdelijk delen van hun weefselkweekfaciliteit met onze groep. Deze publicatie is opgedragen aan Prof. Laura L. Kiessling, Novartis Professor of Chemistry aan het Massachusetts Institute of Technology, ter ere van haar 60e verjaardag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal. | ||
| Growth Factors and Media Supplements | |||
| All-trans retinoic acid (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| B27 serum-free supplement | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | May show lot-to-lot variation |
| Complete Medium Kit with CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Cell Systems | Podocyte maintenance media |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 with glutamine supplement |
| Heat-inactivated FBS | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| Human activin A | PHC9564 | Thermo/Life Technologies | |
| Human BMP7 | PHC9544 | Thermo/Life Technologies | |
| Human VEGF | PHC9394 | Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 medium | 05850 | Stem Cell Technologies | hiPS cell culture media (CCM) |
| Penicillin–streptomycin, liquid (100×) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 ROCK inhibitor | 1254 | Tocris | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T) | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R&D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | N-892012 | Iwai North America | Basement membrane (BM) matrix 2 |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | 354277 | BD Biosciences | Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation |
| Enzymes and Other Reagents | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Cell detachment solution |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood |
| Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | 97065-058 | VWR | Ethanol is flammable and toxic |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyde (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Sterile Distilled Water | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Aspirating pipettes, individually wrapped | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R Centrifuge | B99516 | Beckman Coulter | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | 352097 | Corning | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryoboxes | 3395465 | Thermo/Life Technologies | For storing frozen aliquots |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives |
| Hemocytometer | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | 51030403 | Thermo/Life Technologies | For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives |
| Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | Carl Zeiss Microscopy | Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation |
| Kimberly-Clark nitrile gloves | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, large | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, small | 21905-026 | VWR | |
| P10 precision barrier pipette tips | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 barrier pipette tips | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 barrier pipette tips | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 barrier pipette tips | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 barrier pipette tips | P1122 | Denville Scientific | |
| Serological pipette, 10 mL, individually wrapped | 356551 | Corning | |
| Serological pipette, 25 mL, individually wrapped | 356525 | Corning | |
| Serological pipette, 5 mL, individually wrapped | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0.22 μm, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes | 1138W14 | Thomas Scientific | For aliquoting growth factors |
| Tissue culture–treated 12-well plates | 353043 | Corning | |
| Tissue culture–treated six-well plates | 353046 | Corning | |
| VWR white techuni lab coat | 10141-342 | VWR | |
| Wide-beveled cell lifter | 3008 | Corning |
References
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, 1145 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526, 564-568 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33, 1193-1200 (2015).
- Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13, 1662-1685 (2018).
- Pozzi, A., et al. Beta1 integrin expression by podocytes is required to maintain glomerular structural integrity. Developmental Biology. 316, 288-301 (2008).
- Kanasaki, K., et al. Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus. Developmental Biology. 313, 584-593 (2008).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).
- Torban, E., et al. PAX2 Activates WNT4 Expression during Mammalian Kidney Development. Journal of Biological Chemistry. 281, 12705-12712 (2006).
- Reiser, J., Sever, S. Podocyte biology and pathogenesis of kidney disease. Annual Review of Medicine. 64, 357-366 (2013).
- Kuusniemi, A. M., et al. Tissue Expression of Nephrin in Human and Pig. Pediatric Research. 55, 774-781 (2004).
- Guo, J. K., et al. WT1 is a key regulator of podocyte function: reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis. Human Molecular Genetics. 11, 651-659 (2002).
- Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. American Journal of Pathology. 160, 131-139 (2002).
- Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825 (2017).
- Satoh, D., et al. aPKCλ maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. The Journal of Biochemistry. 156, 115-128 (2014).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
- Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
- Clevers, H., Nusse, R.
- Ciampi, O., et al. Generation of functional podocytes from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 17, 130-139 (2016).
- Fuente Mora, C., et al. Differentiation of Podocyte and Proximal Tubule-Like Cells from a Mouse Kidney-Derived Stem Cell Line. Stem Cells and Development. 21, 296-307 (2011).
- Chuah, J. K. C., Zink, D. Stem cell-derived kidney cells and organoids: Recent breakthroughs and emerging applications. Biotechnology Advances. 35, 150-167 (2017).
- Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).
