Summary
Qui viene presentato un protocollo chimicamente definito per la derivazione di podociti renali umani da cellule staminali pluripotenti indotte ad alta efficienza (>90%) e indipendenti da manipolazioni genetiche o selezione di sottopopolazioni. Questo protocollo produce il tipo di cellula desiderato entro 26 giorni e potrebbe essere utile per i test di nefrotossicità e la modellazione della malattia.
Abstract
La malattia renale colpisce più del 10% della popolazione mondiale e costa miliardi di dollari in spese federali. Le forme più gravi di malattia renale e l'eventuale insufficienza renale allo stadio terminale sono spesso causate dal danno ai podociti glomerulari, che sono le cellule epiteliali altamente specializzate che funzionano insieme alle cellule endoteliali e alla membrana basale glomerulare per formare la barriera di filtrazione del rene. I progressi nella medicina renale sono stati ostacolati dalla limitata disponibilità di tessuti primari e dalla mancanza di metodi robusti per la derivazione di cellule renali umane funzionali, come i podociti. La capacità di derivare podociti da fonti rinnovabili, come le cellule staminali, potrebbe aiutare a far progredire l'attuale comprensione dei meccanismi dello sviluppo e della malattia del rene umano, oltre a fornire nuovi strumenti per la scoperta terapeutica. L'obiettivo di questo protocollo era quello di sviluppare un metodo per derivare podociti maturi e post-mitotici da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPS) con alta efficienza e specificità e in condizioni chimicamente definite. I podociti derivati da cellule hiPS prodotti con questo metodo esprimono marcatori specifici del lignaggio (tra cui nefrina, podocin e tumore di Wilm 1) e mostrano le caratteristiche morfologiche specializzate (compresi i processi primari e secondari del piede) associate ai podociti maturi e funzionali. Curiosamente, queste caratteristiche specializzate sono notevolmente assenti nella linea cellulare di podociti immortalizzati ampiamente utilizzata nel campo, il che suggerisce che il protocollo qui descritto produce podociti renali umani che hanno un fenotipo evolutivamente più maturo rispetto alle linee cellulari podocitarie esistenti tipicamente utilizzate per studiare la biologia renale umana.
Introduction
I progressi nella coltura di cellule staminali pluripotenti umane sono pronti a rivoluzionare la medicina rigenerativa, la modellazione delle malattie e lo screening dei farmaci fornendo ai ricercatori una fonte rinnovabile e scalabile di materiale biologico che può essere progettato per ottenere quasi tutti i tipi di cellule all'interno del corpo umano1. Questa strategia è particolarmente utile per ricavare tipi di cellule specializzate e funzionali che altrimenti sarebbero difficili da ottenere. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPS)2,3,4,5 sono particolarmente attraenti per la loro origine cellulare somatica e il potenziale che rappresentano per la medicina personalizzata. Tuttavia, lo sviluppo di metodi per derivare altre linee cellulari da cellule hiPS rimane difficile a causa dell'uso frequente di condizioni di coltura scarsamente definite che portano a una bassa efficienza e alla generazione non specifica di popolazioni cellulari eterogenee6,7.
Qui viene presentato un metodo per la derivazione di podociti renali maturi da cellule hiPS con specificità e alta efficienza in condizioni chimicamente definite. Considerando i ruoli di molteplici fattori all'interno del microambiente cellulare, è stata sviluppata una strategia di differenziazione delle cellule staminali che ha comportato l'ottimizzazione dei fattori solubili presentati nel terreno di coltura cellulare e dei fattori insolubili, come componenti della matrice extracellulare o substrati adesivi. Data l'importanza della segnalazione dell'integrina nello sviluppo e nella funzione dei podociti, è stata inizialmente esaminata l'espressione dei recettori dell'integrina sulla superficie cellulare. Le integrine β1 erano altamente espresse non solo nelle cellule hiPS, ma anche nei loro derivati tra cui le cellule mesodermiche e mesodermicheintermedie8,9,10. Esperimenti successivi hanno confermato che i ligandi che si legano alle integrine β1 (incluso il frammento di laminina 511 o la laminina 511-E8) supportano l'adesione e la differenziazione delle cellule hiPS in podociti quando usati in combinazione con il mezzo induttivo solubile descritto di seguito.
L'induzione dell'impegno di lignaggio cellulare è stata avviata confermando innanzitutto che le cellule hiPS coltivate sulle superfici rivestite di laminina per due giorni in presenza di un mezzo contenente Activin A, CHIR99021 e Y27632 Rock inibitore possono differenziarsi in cellule che esprimono i primi marcatori del mesoderma HAND1, goosecoid e brachyury8,11. Il trattamento delle cellule del mesoderma per 14 giorni con un mezzo integrato con proteina morfogenetica ossea 7 (BMP-7) e CHIR99021 ha permesso la derivazione di cellule mesodermiche intermedie che esprimevano i marcatori delle cellule nefrone-progenitrici del tumore di Wilm 1 (WT1), della proteina correlata saltata dispari 1 (OSR1)8,11e della proteina 2 del gene 2 accoppiato (PAX2)12. Per ricavare i podociti glomerulari renali maturi, le cellule mesodermiche intermedie sono state trattate per 4-5 giorni con un nuovo mezzo costituito da BMP-7, Activin A, fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), acidoall-trans retinoico e CHIR99021. La citometria a flusso e l'immunostaining sono state utilizzate per confermare che >90% delle cellule risultanti presentava le caratteristiche molecolari, morfologiche e funzionali del podocita renale maturo8,11,13. Queste caratteristiche includono lo sviluppo di processi del piede primario e secondario; l'espressione di geni specifici del lignaggio podocitario tra cui SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 e l'espressione di proteine tra cui podocin, nefrina e WT114,15,16. Inoltre, è stato scoperto che i podociti derivati dalle cellule hiPS possono essere mantenuti in coltura fino a quattro settimane in vitro utilizzando un mezzodisponibilein commercio 8,11 che fornisce un'ulteriore flessibilità nei tempi degli esperimenti a valle. Per ulteriori informazioni sui pannelli di citometria a flusso utilizzati per determinare la purezza degli hiPS-podociti, fare riferimento alla nostra precedente pubblicazione11.
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Protocol
1. Preparazione dei reagenti
- Integratore diluito scongelato 5x hiPS cell culture media (CCM) in terreno basale di coltura cellulare hiPS per ottenere una soluzione 1x di hiPS CCM.
NOTA: L'integratore di CCM 5x hiPS congelato richiede un lento processo di scongelamento, idealmente a 4 °C per la notte. Le aliquote del CCM 1x hiPS possono essere conservate fino a 6 mesi a -20 °C. - Preparazione di piastre a matrice di membrana basale (BM) 1 rivestite per la coltura cellulare hiPS: Scongelare la matrice BM 1 durante la notte su ghiaccio a 4 °C. Una volta scongelate, preparare aliquote con fattori di diluizione appropriati come suggerito dal produttore.
NOTA: Tipicamente, le aliquote vengono preparate per la successiva diluizione in 25 mL di DMEM/F12 freddo in un tubo conico da 50 mL seguito da un'accurata miscelazione per sciogliere completamente la matrice BM 1 ed evitare la formazione di cristalli residui. - Trasferire 1 mL della soluzione bm matrix 1 in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e incubare a 37 °C per 1-2 ore o a 4 °C per un minimo di 24 ore, avvolto in un film di paraffina. Le piastre rivestite con matrice BM 1 possono essere conservate a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
- Preparazione della matrice della membrana basale (BM) 2 - piastre rivestite: diluire quantità appropriate di matrice BM 2 in 9 mL di acqua distillata sterile per preparare una concentrazione finale di 5 μg/mL. Aggiungere 700 μL della soluzione BM matrix 2 a ciascun pozzetti di una piastra da 12 pozzetti e incubare la piastra a temperatura ambiente per 2 ore o durante la notte a 4 °C.
- Preparare soluzioni stock da 100 μg/mL ciascuna di BMP7, Activin A e VEGF come segue: ricostituire BMP7 in acqua distillata sterile contenente lo 0,1% (wt/vol) di BSA e ricostituire Activin A e VEGF separatamente in PBS sterile contenente lo 0,1% (wt/vol) di BSA. Per evitare frequenti cicli di congelamento-disgelo, preparare aliquote da 100 μL da ciascuna soluzione stock e conservare a -20 °C per un massimo di 6 mesi.
- Preparare una soluzione stock da 10 mM di Y27632 sciogliendo 10 mg di Y27632 in 3,079 mL di acqua distillata sterile. Aliquota 100 μL dal magazzino e conservare a -20 °C per un massimo di 6 mesi.
- Sciogliere 2 mg di CHIR99021 in 143,4 μL di DMSO sterile per preparare una soluzione madre da 30 mM. Preparare aliquote da 5 μL e conservare a -20 °C per un massimo di 1 mese (o secondo la raccomandazione del produttore).
- Sciogliere 10 mg di acidoall-trans retinoico in 3,33 mL di DMSO sterile. Preparare aliquote da 500 μL e conservare a -20 °C per un massimo di 6 mesi.
2. Preparazione dei mezzi di coltura
- Preparare il mezzo di differenziazione mesoderma ricostituendo le corrispondenti soluzioni stock a una concentrazione finale di 100 ng/mL Activin A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632 e 1x integratore privo di siero B27 in un volume appropriato di DMEM/12 con integratore di glutammina.
NOTA: Il mezzo di differenziazione del mesoderma deve essere preparato al momento prima delle fasi di differenziazione e ad un volume appropriato per la scala dell'esperimento (in genere, 50 ml di terreno sono adeguati per due piastre da 12 pozzetti). - Preparare il mezzo di differenziazione del mesoderma intermedio ricostituendo le corrispondenti soluzioni stock a una concentrazione finale di 100 ng / mL BMP7, 3 μM CHIR99021 e 1x integratore privo di siero B27 in DMEM / F12 con un integratore di glutammina.
NOTA: Se necessario, il mezzo può essere integrato con 1% (vol / vol) Penicillina-Streptomicina. Regolare il volume del mezzo utilizzando DMEM / F12 con integratore di glutammina. Questo mezzo può essere preparato in grandi lotti; tuttavia, si raccomanda di conservare in aliquote più piccole (ad esempio, 45 mL in tubi conici da 50 mL) per evitare ripetuti cicli di congelamento-disgelo. Questo supporto può essere conservato a -20 °C per un massimo di 3 mesi e può essere scongelato a 4 °C durante la notte prima dell'uso. - Preparare il mezzo di induzione podocitario ricostituendo a una concentrazione finale 100 ng/mL BMP7, 100 ng/mL activina A, 50 ng/mL VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x B27 integratore senza siero e 0,1 μM di acido retinoico all-trans in DMEM/F12 con integratore di glutammina. Proteggere il mezzo dalla luce (ad esempio, avvolgendo il contenitore con carta stagnola).
NOTA: Questo mezzo può essere preparato in grandi lotti e conservato al buio a -20 °C per un massimo di 3 mesi. Le aliquote congelate devono essere scongelate durante la notte a 4 °C prima dell'uso. - Preparare 25 mL di soluzione neutralizzante di tripsina aggiungendo il 10% (vol/vol) di FBS inattivato al calore in DMEM/F12 e filtrare in condizioni sterili.
- Per il mantenimento post-differenziazione dei podociti derivati da cellule staminali, preparare Complete Medium con mezzi di mantenimento podocyte aggiungendo il supplemento al mezzo basale secondo le linee guida del produttore e conservare a 4 °C per un massimo di due settimane.
3. Coltura cellulare hiPS senza alimentatore utilizzando il terreno di coltura cellulare hiPS
- Aspirare la soluzione residua di bm matrix 1 dalle piastre preverniciate e lavare i pozzi 3 volte con 1-2 ml di DMEM/F12 riscaldato.
- Aspirare hiPS CCM dalle cellule hiPS e risciacquare le cellule 3 volte con DMEM / F12 riscaldato. Aggiungere 1 mL di soluzione di distacco a cellule calde e incubare per 1 minuto a 37 °C per aiutare a dissociare le cellule. Eseguire l'ispezione visiva delle cellule al microscopio di coltura tissutale e assicurarsi che i bordi delle colonie cellulari appaiano arrotondati, quindi aspirare rapidamente la soluzione di distacco cellulare dalle cellule (assicurandosi che le colonie cellulari siano ancora attaccate alla piastra, anche se in modo approssimativo). Risciacquare delicatamente le cellule una volta con DMEM/F12 per rimuovere la soluzione di distacco cellulare.
- Aggiungere 3 ml di hiPS CCM alle cellule hiPS (in ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti) che sono state trattate con la soluzione di distacco cellulare. Raschiare le colonie usando un sollevatore di cellule e pipettare delicatamente la sospensione cellulare su e giù per rimuovere le cellule liberamente aderenti. Lavare accuratamente la piastra per assicurarsi che tutte le cellule vengano raccolte.
NOTA: si consiglia l'uso di una pipetta da 5 ml per evitare un eccessivo taglio sulle cellule. - Trasferire 0,5 mL della sospensione cellulare in ciascun pozzetti di una nuova matrice BM a 1 piastra a 6 pozzetti rivestita contenente 2 mL di hiPS CCM per pozzetti. Spostare la piastra in modo figura otto per distribuire le colonie cellulari all'interno dei pozzetti e incubare a 37 °C in un incubatore a CO2 al 5 %. Aggiornare il mezzo ogni giorno fino a quando le cellule sono pronte per essere attraversate o utilizzate per l'esperimento di differenziazione (circa il 70 % di confluenza).
NOTA: La dimensione ideale della colonia per il passaggio di routine delle iPSC è compresa tra 200-500 μm in condizioni di alimentazione libera utilizzando hiPS CCM (senza inibitore ROCK). Se le cellule vengono individualizzate durante il trattamento con enzimi di dissociazione o tamponi, l'hiPS CCM può essere integrato con l'inibitore ROCK (ad esempio, 10 μM Y27632) per migliorare la vitalità cellulare.
4. Differenziazione delle cellule hiPS in cellule mesodermiche (giorni 0-2)
- Mentre le colture cellulari hiPS sono nella fase di crescita esponenziale (approssimativamente entro 4 giorni dalla coltura dopo il passaggio e circa il 70% di confluenza), ispezionare visivamente la presenza di cellule spontaneamente differenziate all'interno e intorno ai bordi delle colonie. Se necessario, raschiare asetticamente le aree di differenziazione.
- Aspirare hiPS CCM da cellule hiPS e risciacquare le cellule 3 volte con DMEM / F12 caldo. Incubare le cellule con 1 mL di tampone di dissociazione cellulare privo di enzimi per 10 minuti a 37 °C e verificare la dissociazione al microscopio. A causa delle differenze intrinseche tra le diverse linee cellulari hiPS, il tempo di incubazione effettivo per il buffer di dissociazione cellulare deve essere determinato per una determinata linea cellulare.
- Raschiare delicatamente il pozzetto con un sollevatore di cellule per rimuovere le cellule liberamente aderenti e trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 ml, seguito da pipettare su e giù più volte per individualizzare le cellule hiPS.
- Portare la sospensione cellulare al volume di 15 ml con DMEM/F12 caldo e centrifugare per 5 minuti a 290 x g a temperatura ambiente.
- Aspirare delicatamente il surnatante e risospenare le cellule con DMEM/F12 caldo per un altro ciclo di centrifugazione per rimuovere la matrice BM residua 1 e i componenti tampone di dissociazione.
- Aspirare le cellule surnatante e ripresa in 1 mL di mezzo di induzione del mesoderma come descritto sopra. Contare il numero totale di cellule utilizzando un emocitometro o un contatore coulter per determinare il volume appropriato del mezzo di differenziazione del mesoderma necessario per raggiungere una concentrazione di 1 x 105 cellule / mL.
- Aspirare la soluzione ECM dalle piastre rivestite a matrice BM 2 e risciacquare le piastre due volte con DMEM/F12 caldo. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare hiPS pipettando un paio di volte. Trasferire 1 mL della sospensione cellulare in ciascun pozzo delle piastre a 12 pozzi rivestite in matrice BM 2 e quindi agitare delicatamente le piastre per distribuire le cellule in modo più uniforme.
- Incubare la piastra a 37 °C in un incubatore a CO2 al 5%. Aggiornare il mezzo di induzione del mesoderma il giorno successivo.
NOTA: dopo 2 giorni, le cellule mesodermiche derivate dalle cellule hiPS sarebbero pronte per l'induzione del mesoderma intermedio.
5. Differenziazione delle cellule mesodermiche derivate dalle cellule hiPS in mesoderma intermedio (giorni 2-16)
- Il giorno 2 del protocollo di differenziazione, aspirare il mezzo di induzione del mesoderma e reintegrare con 1 mL per mezzo di induzione del mesoderma intermedio del pozzo.
- Aggiorna il mezzo ogni giorno per mantenere una soglia accurata di fattori di crescita e piccole molecole per le cellule metabolicamente attive. Se c'è una sostanziale crescita cellulare e un rapido esaurimento dei nutrienti dei media (indicato dall'ingiallimento dei mezzi), il volume del mezzo di differenziazione del mesoderma intermedio può essere aumentato a 1,3 ml per pozzo delle 12 piastre del pozzo.
- Cellule di coltura per ulteriori 14 giorni per ottenere cellule mesodermiche intermedie. Entro il giorno 16, queste cellule possono essere crioconservate per un uso successivo.
6. Differenziazione delle cellule intermedie del mesoderma derivate dalle cellule hiPS in podociti (giorni da 16 a 21)
- Risciacquare le cellule intermedie del mesoderma con DMEM/F12 caldo seguito da incubazione delle cellule con 0,5 mL per pozzet di tripsina-EDTA allo 0,05% per 3 minuti a 37 °C. Eseguire un'ispezione visiva per assicurarsi che le cellule inizino a dissociarsi.
- Raschiare le cellule usando un sollevatore di celle e pipettare la sospensione cellulare più volte usando una punta di pipetta da 1.000 μL per ottenere cellule individualizzate (o piccoli grumi di).
NOTA: In questa fase, assicurarsi che le cellule siano completamente dissociate poiché le cellule aggregate potrebbero non riuscire ad acquisire un fenotipo differenziato terminalmente entro la tempistica del protocollo. - Aggiungere circa 2 ml per pozzet di soluzione neutralizzante di tripsina per fermare l'attività della tripsina.
- Trasferire le celle in un tubo conico da 50 mL e portare il volume fino a 50 mL utilizzando DMEM/F12, quindi centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 201 x g a temperatura ambiente.
- Aspirare le cellule surnatante e risospende nel mezzo di induzione dei podociti. Per risultati ottimali, garantire una densità di semina finale di circa 100.000 cellule/pozzetti di una piastra da 12 pozzetti. Aggiungere la sospensione cellulare alle piastre rivestite in BM matrix 2 e agitare delicatamente la piastra per aiutare a distribuire le cellule in modo più uniforme.
- Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO2 e rinfrescare il mezzo ogni giorno per un massimo di 5 giorni per ottenere podociti entro il giorno 21.
NOTA: I podociti derivati da cellule hiPS risultanti possono essere mantenuti in coltura per 2-4 settimane aggiuntive utilizzando un mezzo completo con mezzi di mantenimento dei podociti. Una volta in mezzi di mantenimento dei podociti, le cellule possono essere alimentate a giorni alterni e possono essere utilizzate per studi successivi o analisi a valle.
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Representative Results
L'obiettivo di questo protocollo era dimostrare che i podociti umani maturi possono essere derivati da cellule hiPS in condizioni chimicamente definite. I dati presentati in questo manoscritto sono stati generati utilizzando la linea cellulare DU11 hiPS17, che è stata testata per la prima volta e si è scoperta priva di micoplasma. È stata eseguita anche l'analisi cromosomica e le cellule sono risultate essere cariotipicamente normali. Partendo dalle cellule hiPS DU11 indifferenziate, la strategia di differenziazione (Figura 1) delineata in questo rapporto è stata impiegata per differenziare prima le cellule staminali (Figura 2A) in cellule mesodermiche che esprimono Brachyury (T) (Figura 1B e Figura 2B), seguita dalla differenziazione in cellule mesodermiche intermedie PAX2-positive (Figura 2C), e infine in podociti glomerulari renali maturi (Figura 1B, Figura 2D, Figura 3De Figura 4). Le cellule del mesoderma sono state ottenute entro il giorno 2 del protocollo di differenziazione, le cellule intermedie del mesoderma sono state generate entro il giorno 16 e i podociti maturi sono stati ottenuti entro il giorno 21 del protocollo di differenziazione. I podociti risultanti avevano una dimensione di circa 150-200 μm quando aderiti a una superficie di coltura tissutale piatta, come le piastre rivestite di laminina utilizzate in questo esperimento. I podociti derivati dalle cellule hiPS presentano numerose estensioni simili a processi del piede che sono state visualizzate utilizzando molteplici tecniche complementari tra cui la microscopia a contrasto di fase(Figura 1),la microscopia immunofluorescente(Figura 4)e la microscopia elettronica a scansione8,11. Anche i podociti derivati da cellule staminali sono risultati positivi per WT115 (Figura 2D) e per il marcatore di identificazione del lignaggio nefrina14 (Figura 4). Curiosamente, la localizzazione subcellulare della nefrina era prevalentemente nei processi del piede podocitario e nel citoplasma cellulare, coerente con un fenotipo podocitario maturo (Figura 2D e Figura 4A,B). Durante lo sviluppo e nella fisiologia dei podociti, la proteina nefrina viene trasloggiata tra il nucleo cellulare e il citoplasma, ma la nefrina diventa prevalentemente espressa nel citoplasma e nei processi del piede man mano che i podociti maturano e acquisiscono un fenotipo funzionale18. Pertanto, l'osservazione che i podociti prodotti utilizzando il protocollo di differenziazione qui descritto esprimono la nefrina in gran parte nel citoplasma e nelle strutture simili al processo del piede sottolinea l'utilità di questo protocollo per la generazione di podociti più maturi o specializzati. Le micrografie elettroniche a scansione di podociti derivati da cellule hiPS evidenziano la ramificazione dei processi del piede primario e secondario nei podociti derivati dalle cellule hiPS come precedentemente riportato dal nostro gruppo8,11. Poiché WT1 non è di per sé un marcatore definitivo dei podociti renali, è altamente raccomandato che i ricercatori caratterizzino anche le loro cellule per l'espressione simultanea di marcatori podocitari specifici come podocin e nefrina. È stato precedentemente dimostrato che i podociti differenziati terminalmente derivavano utilizzando questo metodo immunostain positivi per podocin, nefrina e WT1, con una corrispondente diminuzione dell'espressione del marcatore cellulare progenitore PAX28,11. Insieme, questi risultati indicano che i podociti derivati utilizzando questo protocollo sono maturi o specializzati nello sviluppo, come richiesto per un podocita glomerulare renale umano funzionale.
Nell'ottimizzare le condizioni per il metodo di differenziazione, sono stati osservati casi in cui le cellule del mesoderma intermedio erano inadeguatamente dissociate. Le cellule seminate a densità che superavano significativamente la densità raccomandata di 100.000 cellule/pozzetti di una piastra di 12 pozzetti (prima della fase finale di induzione dei podociti) hanno portato a grandi gruppi di cellule che mancavano del fenotipo morfologico atteso di podociti maturi entro la linea temporale standard del protocollo (Figura 3A, B). Per questi motivi, si raccomanda ai ricercatori di utilizzare le densità di semina raccomandate in questo protocollo (Figura 3C, D) prima di sperimentare altre condizioni che possono essere desiderate per specifiche applicazioni a valle. Insieme, questi risultati rappresentano la differenziazione diretta delle cellule hiPS in podociti glomerulari renali entro tre settimane utilizzando il mezzo chimicamente definito sopra descritto.
Figura 1: Differenziazione delle cellule hiPS in podociti.
(A) Rappresentazione schematica del metodo per la differenziazione diretta delle cellule hiPS in podociti. BMP7, proteina morfogenetica ossea 7; RA, acido retinoico; VEGF, fattore di crescita endoteliale vascolare. Questa cifra è stata modificata dal rif.11. (B) Immagini rappresentative di cellule hiPS in ogni fase della differenziazione. Da sinistra a destra, le immagini mostrano le caratteristiche colonie di cellule iPS umane prima della dissociazione per la differenziazione il giorno 0, seguite dalle cellule del mesoderma dopo 2 giorni di differenziazione, poi dalle cellule mesodermiche intermedie a circa 10 giorni di differenziazione e infine dai podociti differenziati terminalmente al giorno 22. Barra di scala, 100 μm per tutte le immagini (nel pannello B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini immunofluorescenti di cellule hiPS e dei loro derivati differenziati che mostrano l'espressione di marcatori specifici del lignaggio e controstinti nucleari durante la linea temporale di differenziazione.
(A) Cellule iPS umane che esprimono il marcatore di pluripotenza Oct4; (B) cellule mesodermiche che esprimono brachiury (T); (C) cellule mesodermiche intermedie che esprimono PAX2; e (D) i podociti derivati dalle cellule hiPS che esprimono il marcatore di identificazione del lignaggio, la nefrina, e il marcatore associato, WT1. Barra di scala, 100 μm per tutte le immagini. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Effetti della densità di semina sub-ottimale sul potenziale di differenziazione delle cellule mesodermiche intermedie derivate dalla linea cellulare DU11 hiPS.
(A) Quando la densità iniziale di semina cellulare è troppo alta (circa 500.000 cellule/ pozzetti di una piastra a 12 pozzetti), le cellule possono formare aggregati densi (B) durante la fase di induzione dei podociti. (C) Densità di semina raccomandate per prevenire l'aggregazione (100.000 cellule/pozzetti di una piastra a 12 pozzetti) e per osservare al microscopio l'estensione(D)di strutture simili a processi del piede durante la fase di differenziazione dei podociti (inserto). Barra di scala, 200 μm per A-D; e 100 μm per l'inserto in D. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: i podociti derivati da cellule hiPS presentano fenotipo morfologicamente maturo in vitro.
(A) Immunocolorazione di podociti derivati da cellule hiPS per la nefrina e (B) immagine di ingrandimento più elevato dei processi del piede podocitario che mostrano processi primari e secondari (frecce bianche) e l'espressione di nefrina in queste strutture cellulari specializzate. Barra di scala, 100 μm (A); 50 μm (B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo rapporto, descriviamo un protocollo per la generazione di podociti glomerulari renali da cellule hiPS. I podociti derivati da cellule hiPS presentano caratteristiche morfologiche e molecolari associate al fenotipo13del podocita renale maturo. In precedenti pubblicazioni, abbiamo dimostrato che i podociti derivati dalle cellule hiPS possono imitare la struttura e la funzione di filtrazione selettiva del glomerulo renale quando co-coltivati con cellule endoteliali microvascolari glomerulari in un dispositivo microfluidico perfusido organ-on-a-chip8,11.
I seguenti passi critici dovrebbero essere considerati dai ricercatori interessati ad adattare questo protocollo. In primo luogo, la semina di cellule hiPS su piastre rivestite di laminina per l'induzione di cellule mesodermiche è un passo cruciale. Mentre si raccomanda una densità di semina di 100.000 cellule / pozzo, i ricercatori possono regolare la densità iniziale di semina cellulare in base al tasso di replicazione della linea di cellule staminali utilizzata per lo studio. Se necessario, questa ottimizzazione garantirà un'adeguata densità cellulare durante la fase di induzione del mesoderma e impedirà la formazione di aggregati cellulari o grumi molto grandi che potrebbero potenzialmente compromettere la qualità del mesoderma, del mesoderma intermedio o del fenotipo podocitario (Figura 3). È anche importante notare che le differenze nelle specifiche del produttore per alcuni reagenti come CHIR99021 possono influire sulla qualità delle cellule differenziate. Pertanto, è consigliabile testare reagenti di diversi numeri di lotto o fornitori e venditori per la loro attività biologica e la coerenza tra esperimenti indipendenti. Inoltre, è importante evitare un'eccessiva esposizione delle cellule hiPS agli enzimi di dissociazione in quanto ciò potrebbe portare a un distacco indesiderato dalla matrice adesiva e alla possibile perdita di cellule durante l'aspirazione del mezzo. Un altro passo cruciale degno di nota è quello di garantire che il mezzo di induzione dei podociti sia protetto dalla luce per prevenire l'inattivazione fotoindotta dell'acido retinoico.
Rispetto ai metodi precedenti per la differenziazione dei podociti renali umani, il metodo qui descritto impiega fattori chimicamente definiti (tra cui piccole molecole, fattori di crescita e isoforme specifiche di proteine della membrana basale, alle concentrazioni desiderate) secondo necessità per regolare specifiche vie di segnalazione cellulare coinvolte nello sviluppo renale e nella funzione dei podociti. Nello specifico, la generazione di cellule mesodermiche da cellule hiPS ha comportato l'attivazione della via di segnalazione Wnt canonica effettuata utilizzando la piccola molecola CHIR9902119. La via di segnalazione Wnt canonica è nota per regolare l'attività trascrizionale dei geni coinvolti nello sviluppo e nel patterning tissutale in vivo, nonché la proliferazione e la migrazione cellulare20,21. Il mezzo di induzione cellulare utilizzato in questo protocollo consente la derivazione di podociti da cellule mesodermiche intermedie derivate da cellule iPS. Questo mezzo di induzione podocitaria è costituito da Activin A, BMP7, VEGF, acido retinoico e CHIR99021. In particolare, questo mezzo di induzione podocitaria non richiede componenti sierici indefiniti come il siero bovino fetale, che può oscurare i contributi di fattori specifici e limitare le applicazioni di altri metodi di differenziazione cellulare per studi meccanicistici sullo sviluppo e la malattia dei tessuti, rendendolo distinto da quelli impiegati nei precedenti tentativi di generare tipi di cellule renali22. Inoltre, è stato osservato che FGF2 e FGF9 non sono necessari per la differenziazione dei podociti renali dalle cellule hiPS6,7,22. Mentre i metodi precedenti dipendevano dalla formazione di aggregati multicellulari come corpi embrioidi e organoidi, il metodo qui descritto produce cellule che presentano un fenotipo maturo, sia morfologicamente che mediante l'espressione di marcatori specifici del lignaggio tra cui nefrina e podocina, e down-regolazione di marcatori di cellule progenitrici come PAX2. Si prevede che la conoscenza dei componenti chimici impiegati in questo protocollo possa facilitare studi meccanicistici sullo sviluppo del tessuto renale umano, sulle specifiche del lignaggio dei podociti e sulla patogenesi della malattia in futuro.
Questo metodo per la differenziazione cellulare hiPS consente anche la generazione di podociti maturi, postmitotici e funzionali con un'efficienza superiore al 90%, senza selezione della sottopopolazione, manipolazioni genetiche o xenotrapianto. Ciò è notevolmente diverso dai precedenti tentativi in cui alti livelli di eterogeneità cellulare6,7,23 limitano l'uso dei metodi di differenziazione delle cellule staminali per applicazioni di medicina traslazionale. Questo metodo presenta anche un progresso significativo per il campo date le sfide associate alla disponibilità estremamente limitata di podociti renali umani da altre fonti come tessuti primari o organoidi. Alcune delle sfide includono basse efficienze di derivazione inferiori all'1% quando si utilizzano metodi che si basano sulla formazione di corpi embrioidi o organoidi6,7.
Una limitazione a questo protocollo è il costo relativamente elevato dei reagenti necessari per le fasi di coltura e differenziazione delle cellule staminali, che possono ostacolarne l'implementazione in alcuni laboratori o gruppi di ricerca. Inoltre, poiché sono state coinvolte molte ottimizzazioni per molteplici fattori nel microambiente della cellula (cioè sia solubili che insolubili o segnali adesivi), raccomandiamo che il protocollo sia seguito come descritto. Un errore comune notato da altri che erano interessati a utilizzare questo metodo di differenziazione dei podociti includeva l'uso di matrici di adesione cellulare inappropriate come la matrice BM 1 o altre proteine di derivazione animale scarsamente definite. Una volta seguito il protocollo come descritto, è possibile eseguire ulteriori esperimenti per esaminare l'efficacia di altre modifiche al protocollo. Inoltre, a causa delle differenze intrinseche tra le diverse linee di cellule staminali umane, vale la pena notare che alcuni aspetti del metodo di differenziazione, ad esempio i tempi di esposizione al mezzo di differenziazione o al mezzo di dissociazione cellulare e le densità di semina cellulare, potrebbero dover essere ottimizzati. Tuttavia, queste condizioni non sono state alterate per le linee cellulari hiPS e le linee di cellule staminali embrionali testate fino ad oggi. Questo metodo di differenziazione dei podociti funziona su più linee cellulari hiPS tra cui PGP1, IMR-90-1 e IISH3i-CB6, nonché la linea di cellule staminali embrionali H98,11. In questo rapporto, dimostriamo anche il successo della differenziazione della linea cellulare hiPS DU11 utilizzando lo stesso protocollo (Figura 1 e Figura 2). Pertanto, data la coerenza di questo metodo su varie linee cellulari, compresi i risultati di lavori non pubblicati da altri laboratori di ricerca indipendenti (pre-pubblicazione), ci aspettiamo che questo protocollo di differenziazione sarà utile per la derivazione di podociti renali da un'ampia varietà di linee cellulari hiPS e, quindi, non limitato a quello utilizzato in questo protocollo.
Data la capacità delle cellule hiPS di auto-rinnovarsi indefinitamente, questo metodo di differenziazione potrebbe essere utilizzato per fornire ai ricercatori una fonte prontamente disponibile di podociti renali umani. Ciò potrebbe contribuire a far progredire l'attuale comprensione della biologia e della malattia del rene umano24, nonché consentire lo sviluppo di nuovi sistemi renali in vitro per modellare la funzione renale umana e le risposte alle terapie. Ad esempio, il protocollo qui descritto è stato recentemente impiegato e integrato con un sistema microfluidico organ-on-a-chip per sviluppare un modello funzionale in vitro della parete capillare glomerulare del rene umano. Questo chip glomerulare filtrava selettivamente le molecole circolanti e ricapitolava la nefrotossicità indotta da farmaci quando esposto al farmaco chemioterapico, Adriamicina8. In futuro, questi risultati potrebbero potenzialmente essere integrati con le tecnologie di bioprinting 3D per progettare modelli in vitro più complessi del rene umano. Tali progressi potrebbero fornire nuove piattaforme per la valutazione dei farmaci candidati, in particolare quelli che colpiscono le forme di malattie renali derivanti dalla disfunzione dei podociti glomerulari. Ciò è particolarmente importante in quanto le differenze specie-specifiche dei modelli animali e la mancanza di funzionalità a livello di organo tipicamente osservate nei metodi standard di coltura tissutale possono impedire lo sviluppo di terapie mirate per varie forme di malattie renali umane25. Pertanto, questo protocollo potrebbe, un giorno, fornire l'opportunità di svelare le vie di segnalazione coinvolte nello sviluppo del rene umano, nonché la patogenesi della malattia.
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Disclosures
S.M. è autore di un brevetto in attesa di brevetto per metodi per la generazione di podociti renali da cellule staminali pluripotenti (domanda di brevetto USA 14/950859). Gli altri autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla Pratt School of Engineering della Duke University, dalla Division of Nephrology della Duke Medical School, da A Chair's Research Award dal Dipartimento di Medicina della Duke University e da un Burroughs Wellcome Fund PDEP Career Transition Ad Hoc Award a S.M.. M.B è stato supportato dal Graduate Research Fellowship Program della National Science Foundation. Ringraziamo il Bursac Lab per averci generosamente fornito la linea di cellule staminali DU11 e il Varghese Lab della Duke University per aver temporaneamente condiviso la loro struttura di coltura tissutale con il nostro gruppo. Questa pubblicazione è dedicata alla Prof.ssa Laura L. Kiessling, Novartis Professor of Chemistry presso il Massachusetts Institute of Technology, per celebrare il suo 60° compleanno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal. | ||
| Growth Factors and Media Supplements | |||
| All-trans retinoic acid (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| B27 serum-free supplement | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | May show lot-to-lot variation |
| Complete Medium Kit with CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Cell Systems | Podocyte maintenance media |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 with glutamine supplement |
| Heat-inactivated FBS | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| Human activin A | PHC9564 | Thermo/Life Technologies | |
| Human BMP7 | PHC9544 | Thermo/Life Technologies | |
| Human VEGF | PHC9394 | Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 medium | 05850 | Stem Cell Technologies | hiPS cell culture media (CCM) |
| Penicillin–streptomycin, liquid (100×) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 ROCK inhibitor | 1254 | Tocris | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T) | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R&D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | N-892012 | Iwai North America | Basement membrane (BM) matrix 2 |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | 354277 | BD Biosciences | Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation |
| Enzymes and Other Reagents | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Cell detachment solution |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood |
| Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | 97065-058 | VWR | Ethanol is flammable and toxic |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyde (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Sterile Distilled Water | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Aspirating pipettes, individually wrapped | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R Centrifuge | B99516 | Beckman Coulter | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | 352097 | Corning | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryoboxes | 3395465 | Thermo/Life Technologies | For storing frozen aliquots |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives |
| Hemocytometer | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | 51030403 | Thermo/Life Technologies | For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives |
| Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | Carl Zeiss Microscopy | Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation |
| Kimberly-Clark nitrile gloves | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, large | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, small | 21905-026 | VWR | |
| P10 precision barrier pipette tips | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 barrier pipette tips | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 barrier pipette tips | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 barrier pipette tips | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 barrier pipette tips | P1122 | Denville Scientific | |
| Serological pipette, 10 mL, individually wrapped | 356551 | Corning | |
| Serological pipette, 25 mL, individually wrapped | 356525 | Corning | |
| Serological pipette, 5 mL, individually wrapped | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0.22 μm, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes | 1138W14 | Thomas Scientific | For aliquoting growth factors |
| Tissue culture–treated 12-well plates | 353043 | Corning | |
| Tissue culture–treated six-well plates | 353046 | Corning | |
| VWR white techuni lab coat | 10141-342 | VWR | |
| Wide-beveled cell lifter | 3008 | Corning |
References
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