Summary
Burada sunulan, insan böbrek podositlerinin yüksek verimli (%>90) ve genetik manipülasyonlardan veya alt popülasyon seçiminden bağımsız olarak indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetülmesi için kimyasal olarak tanımlanmış bir protokoldür. Bu protokol 26 gün içinde istenen hücre tipini üretir ve nefrotoksisite testi ve hastalık modellemesi için yararlı olabilir.
Abstract
Böbrek hastalığı küresel nüfusun % 10'undan fazlasını etkiler ve federal harcamalarda milyarlarca dolara mal olur. Böbrek hastalığının en şiddetli formları ve nihai son aşama böbrek yetmezliği, genellikle endotel hücreleri ve böbreğin filtrasyon bariyerini oluşturmak için glomerüler bodrum zarı ile birlikte çalışan son derece uzmanlaşmış epitel hücreleri olan glomerüler podositlerin hasar görmesinden kaynaklanır. Böbrek tıbbındaki gelişmeler, birincil dokuların sınırlı mevcudiyeti ve podositler gibi fonksiyonel insan böbrek hücrelerinin türemesi için sağlam yöntemlerin bulunmaması nedeniyle engellenmiştir. Kök hücreler gibi yenilenebilir kaynaklardan podosit türetme yeteneği, insan böbrek gelişimi ve hastalığının mekanizmalarının mevcut olarak anlaşılmasına yardımcı olabileceği gibi terapötik keşif için yeni araçlar sağlayabilir. Bu protokolün amacı, insan kaynaklı pluripotent sap (hiPS) hücrelerinden yüksek verimlilik ve özgüllükle ve kimyasal olarak tanımlanmış koşullar altında olgun, post-mitotik podositler elde etmek için bir yöntem geliştirmekti. Bu yöntemle üretilen hiPS hücre türevi podositler, soyuna özgü belirteçleri (nefrin, podokin ve Wilm Tümörü 1 dahil) ifade eder ve olgun ve fonksiyonel podositlerle ilişkili özel morfolojik özellikleri (birincil ve ikincil ayak süreçleri dahil) sergiler. İlginç bir şekilde, bu özel özellikler, alanda yaygın olarak kullanılan ölümsüzleştirilmiş podosit hücre hattında özellikle yoktur, bu da burada açıklanan protokolün, tipik olarak insan böbrek biyolojisini incelemek için kullanılan mevcut podosit hücre çizgilerinden gelişimsel olarak daha olgun bir fenotipe sahip insan böbrek podositleri ürettiğini göstermektedir.
Introduction
İnsan pluripotent kök hücre kültüründeki gelişmeler, araştırmacılara insan vücudundaki hemen hemen her hücre tipini elde etmek için tasarlanmış yenilenebilir, ölçeklenebilir bir biyolojik malzeme kaynağı sağlayarak rejeneratif tıp, hastalık modelleme ve ilaç taramasında devrim yapmayahazırdır 1. Bu strateji, özellikle elde edilmesi zor olan özel ve işlevsel hücre türlerini türetmek için yararlıdır. İnsan kaynaklı pluripotent stem (hiPS) hücreleri2,3,4,5, somatik hücre kökenleri ve kişiselleştirilmiş tıp için temsil ettikleri potansiyel nedeniyle özellikle çekicidir. Bununla birlikte, hiPS hücrelerinden diğer hücre soylarını türetmek için yöntemler geliştirmek, düşük verimliliğe ve spesifik olmayan heterojen hücre popülasyonlarının üretilmesine yol açan kötü tanımlanmış kültür koşullarının sık kullanımı nedeniyle zor olmaya devam etmektedir6,7.
Burada sunulan, kimyasal olarak tanımlanmış koşullar altında spesifiklik ve yüksek verimlilik ile hiPS hücrelerinden olgun böbrek podositlerinin türetilme yöntemidir. Hücresel mikroçevrim içindeki birden fazla faktörün rolleri göz önünde bulundurularak, hücre kültürü ortamında sunulan çözünür faktörlerin yanı sıra hücre dışı matris bileşenleri veya yapışkan substratlar gibi çözünmeyen faktörlerin optimizasyonunu içeren bir kök hücre farklılaşma stratejisi geliştirilmiştir. Podosit gelişiminde ve fonksiyonunda integrin sinyalinin önemi göz önüne alındığında, hücre yüzeyindeki integrin reseptörlerinin ekspresyolü ilk başta incelenmiştir. β1 integrinleri sadece hiPS hücrelerinde değil, mezoderm ve ara mezoderm hücreleri8, 9,10dahil olmak üzere türevlerinde de yüksek oranda ifade edildi. Sonraki deneyler, β1 integrinlerine bağlanan ligandların (laminin 511 veya laminin 511-E8 parçası dahil) aşağıda açıklanan çözünür endüktif ortamla birlikte kullanıldığında hiPS hücrelerinin yapışmasını ve podositlere farklılaştırılmasını desteklediğini doğruladı.
Hücre soyu taahhüdünün indüksiyonu, ilk olarak Activin A, CHIR99021 ve Y27632 Kaya inhibitörü içeren bir ortamın varlığında iki gün boyunca laminin kaplı yüzeylerde kültürlenen hiPS hücrelerinin erken mezoderm belirteçlerini ifade eden hücrelere farklılaşabileceğini doğrulayarak başlatıldı HAND1, kazkötü ve brachyury8,11. Mezoderm hücrelerinin kemik morfogenetik protein 7 (BMP-7) ve CHIR99021 ile desteklenmiş bir ortamla 14 gün boyunca tedavisi, nefi ifade eden ara mezoderm hücrelerinin türetilmesini sağladı kron-progenitör hücre belirteçleri Wilm's Tumor 1 (WT1), tek atlanan ilişkili protein 1 (OSR1)8,11ve eşleştirilmiş kutu gen 2 proteini (PAX2)12. Olgun böbrek glomerüler podositleri türetmek için, ara mezoderm hücreleri BMP-7, Activin A, vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF),all-trans retinoik asit ve CHIR99021'den oluşan yeni bir ortamla 4-5 gün boyunca tedavi edildi. Akış sitometrisi ve immünostaining, elde edilen hücrelerin% > 90'ının olgun böbrek podosit 8 , 11,13'ünmoleküler, morfolojik ve fonksiyonel özelliklerini sergilediğini doğrulamak için kullanılmıştır. Bu özellikler birincil ve ikincil ayak süreçlerinin gelişimini içerir; SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 dahil olmak üzere podosit soyuna özgü genlerin ekspresyolü ve podocin, nefrin ve WT114, 15,16gibi proteinlerin ekspresyolü. Ek olarak, hiPS hücre türevi podositlerin, aşağı akış deneylerinin zamanlamasında ek bir esneklik sağlayan ticari olarak mevcut bir orta8,11 kullanılarak dört haftaya kadar in vitro olarak kültürde tutulabileceği bulunmuştur. HiPS-podositlerin saflığını belirlemek için kullanılan akış sitometri panelleri hakkında daha fazla bilgi için lütfen önceki yayınımıza bakın11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reaktiflerin hazırlanması
- 1x hiPS CCM çözeltisi elde etmek için hiPS hücre kültürü bazal ortamında çözülen 5x hiPS hücre kültürü ortamı (CCM) takviyesini seyreltin.
NOT: Dondurulmuş 5x hiPS CCM takviyesi, bir gecede ideal olarak 4 °C'de yavaş bir çözülme işlemi gerektirir. 1x hiPS CCM'nin aliquots'u -20 °C'de 6 aya kadar saklanabilir. - HiPS hücre kültürü için bodrum membran (BM) matrisi 1 kaplamalı plakaların hazırlanması: BM matrisi 1'i 4 °C'de buz üzerinde bir gecede çözün. Çözdükten sonra, üretici tarafından önerilen uygun seyreltme faktörlerine sahip aliquots hazırlayın.
NOT: Tipik olarak, aliquots, 50 mL konik bir tüpte 25 mL soğuk DMEM / F12'de sonraki seyreltme için hazırlanır ve ardından BM matrisi 1'i tamamen çözmek ve artık kristallerin oluşumunu önlemek için kapsamlı karıştırma. - BM matris 1 çözeltisinin 1 mL'lik kısmını 6 kuyu plakasının her kuyusuna aktarın ve parafin filmine sarılmış 1-2 saat boyunca 37 °C'de veya en az 24 saat boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın. BM matrisi 1 kaplamalı plakalar 2 haftaya kadar 4 °C'de saklanabilir.
- Bodrum membran (BM) matrisi 2 hazırlanması - kaplamalı plakalar: 5 μg / mL'lik son bir konsantrasyon hazırlamak için 9 mL steril damıtılmış suda uygun miktarda BM matrisi 2'yi seyreltin. 12 kuyu plakasının her kuyusuna 700 μL BM matris 2 çözeltisi ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında 2 saat veya gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya bırakın.
- BMP7, Activin A ve VEGF'nin her biri için 100 μg/mL stok çözümlerini aşağıdaki gibi hazırlayın: BMP7'yi %0,1 (wt/vol) BSA içeren steril damıtılmış suda yeniden inşa edin ve %0,1 (wt/vol) BSA içeren steril PBS'de Activin A ve VEGF'yi ayrı ayrı yeniden inşa edin. Sık donma-çözülme döngülerini önlemek için, her stok çözeltisinden 100 μL aliquots hazırlayın ve 6 aya kadar -20 ° C'de saklayın.
- 10 mg Y27632'yi 3.079 mL steril damıtılmış suda eriterek 10 mM'lik bir Y27632 stok çözeltisi hazırlayın. Stoktan Aliquot 100 μL ve 6 aya kadar -20 °C'de saklayın.
- 30 mM stok çözeltisi hazırlamak için 2 mg CHIR99021'i 143,4 μL steril DMSO'da çözün. 5 μL aliquots hazırlayın ve -20 °C'de 1 aya kadar (veya üreticinin tavsiyesine göre) saklayın.
- 3.33 mL steril DMSO'da 10 mgall-trans retinoik asit çözün. 500 μL aliquot hazırlayın ve -20 °C'de 6 aya kadar saklayın.
2. Kültür medyasının hazırlanması
- 100 ng/mL Activin A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632 ve 1x B27 serumsuz takviyenin glutamin takviyesi ile uygun bir DMEM/12 hacminde nihai konsantrasyonuna karşılık gelen stok çözümlerini yeniden oluşturan mezoderm farklılaşma ortamını hazırlayın.
NOT: Mezoderm farklılaşma ortamı, farklılaşma adımlarından önce ve deneyin ölçeğine uygun bir hacimde taze olarak hazırlanmalıdır (tipik olarak, iki 12 kuyu plakası için 50 mL ortam yeterlidir). - DMEM/F12'de 100 ng/mL BMP7, 3 μM CHIR99021 ve 1x B27 serumsuz takviyeye karşılık gelen stok çözümlerini glutamin takviyesi ile yeniden oluşturan ara mezoderm farklılaşma ortamını hazırlayın.
NOT: Gerekirse, ortam% 1 (vol/vol) Penisilin-Streptomisiin ile desteklenebilir. Glutamin takviyesi ile DMEM/F12 kullanarak ortamın hacmini ayarlayın. Bu ortam büyük gruplar halinde hazırlanabilir; bununla birlikte, tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için daha küçük aliquotlarda (örneğin, 50 mL konik tüplerde 45 mL) saklanması önerilir. Bu ortam -20 °C'de 3 aya kadar saklanabilir ve kullanımdan önce bir gecede 4 °C'de çözülebilir. - Podosit indüksiyon ortamını son konsantrasyon 100 ng/mL BMP7'ye yeniden inşa larak hazırlayın, 100 ng/mL activin A, 50 ng/mL VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x B27 serumsuz takviye ve glutamin takviyesi ile DMEM/F12'de 0.1 μM all-trans retinoik asit. Ortamı ışıktan koruyun (örneğin, kabı folyo kağıtla sararak).
NOT: Bu ortam büyük gruplar halinde hazırlanabilir ve karanlıkta -20 °C'de 3 aya kadar saklanabilir. Dondurulmuş aliquots kullanılmadan önce 4 °C'de bir gecede çözülmelidir. - DMEM/F12'ye %10 (vol/vol) ısı inaktive FBS ekleyerek 25 mL tripsin nötralize edici çözelti hazırlayın ve steril koşullarda filtreleyin.
- Kök hücre türevli podositlerin farklılaşma sonrası bakımı için, üreticinin yönergelerine göre bazal ortama takviye ekleyerek podosit bakım ortamı ile Komple Orta hazırlayın ve iki haftaya kadar 4 °C'de saklayın.
3. HiPS hücre kültürü ortamını kullanarak besleyici içermeyen hiPS hücre kültürü
- ÖNCEDEN kaplanmış plakalardan BM matrisi 1'in artık çözeltisini epire edin ve kuyuları 1 ila 2 mL ısıtılmış DMEM / F12 ile 3 kez yıkayın.
- Aspirat hiPS hücrelerinden hiPS CCM harcadı ve hücreleri ısıtılmış DMEM / F12 ile 3 kez durulayın. 1 mL sıcak hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve hücrelerin ayrıştırilmesine yardımcı olmak için 37 °C'de 1 dakika kuluçkaya yatırın. Bir doku kültürü mikroskobu altındaki hücrelerin görsel incelemesini gerçekleştirin ve hücre kolonilerinin kenarlarının yuvarlatılmış göründüğünden emin olun, ardından hücre deklasment çözeltisini hücrelerden hızlı bir şekilde epire edin (hücre kolonilerinin gevşek de olsa hala plakaya bağlı olmasını sağlayın). Hücre ayırma çözümünü çıkarmak için hücreleri DMEM/F12 ile bir kez hafifçe durulayın.
- Hücre müfrezesi çözeltisi ile tedavi edilen hiPS hücrelerine (6 kuyulu bir plakanın her kuyusunda) 3 mL hiPS CCM ekleyin. Bir hücre kaldırıcı kullanarak kolonileri kazıyın ve gevşek yapışmış hücreleri yerinden çıkarmak için hücre süspansiyonu yukarı ve aşağı hafifçe pipet. Tüm hücrelerin toplanır emin olmak için plakayı iyice yıkayın.
NOT: Hücrelerde fazla makası önlemek için 5 mL pipet kullanılması önerilir. - Hücre süspansiyonunun 0,5 mL'lik kısmını, kuyu başına 2 mL hiPS CCM içeren yeni bir BM matrisi 1 kaplamalı 6 kuyu plakasının her kuyusuna aktarın. Hücre kolonilerini kuyulara dağıtmak ve % 5 CO2 inkübatörde 37 °C'de kuluçkaya yatmak için plakayı şekil sekiz şekilde hareket ettinin. Hücreler geçişe hazır olana veya farklılaşma deneyi için kullanılana kadar ortamı günlük olarak yenileyin (yaklaşık % 70 izdiah).
NOT: iPSC'lerin rutin geçişi için ideal koloni boyutu, hiPS CCM (ROCK inhibitörü olmadan) kullanılarak besleyici serbest koşullar altında 200-500 μm arasındadır. Hücreler ayrışma enzimleri veya tamponlar ile tedavi sırasında bireyselleştirilirse, hiPS CCM hücre canlılığını artırmak için ROCK inhibitörü (örneğin, 10 μM Y27632) ile desteklenebilir.
4. HiPS hücrelerinin mezoderm hücrelerine farklılaştırılması (gün 0-2)
- HiPS hücre kültürleri üstel büyüme aşamasındayken (yaklaşık olarak geçtikten sonra kültürden yaklaşık 4 gün sonra ve yaklaşık% 70 izdiah), kolonilerin kenarları içinde ve çevresinde kendiliğinden farklılaşmış hücrelerin varlığını görsel olarak inceleyin. Gerekirse, aseptik olarak farklılaşma alanlarını kazıyın.
- HiPS hücrelerinden hiPS CCM'yi aspire edin ve hücreleri ılık DMEM/F12 ile 3 kez durulayın. Hücreleri 37 °C'de 10 dakika boyunca 1 mL enzimsiz hücre ayrıştırma tamponu ile kuluçkaya yatırın ve mikroskop altında ayrışma olup olmadığını kontrol edin. Farklı hiPS hücre çizgileri arasındaki doğal farklılıklar nedeniyle, belirli bir hücre hattı için hücre ayrıştırma arabelleği için gerçek inkübasyon süresi belirlenmelidir.
- Gevşek yapışmış hücreleri yerinden çıkarmak ve hücre süspansiyonu 15 mL konik bir tüpe aktarmak için kuyuyu bir hücre kaldırıcı ile hafifçe kazıyın, ardından hiPS hücrelerini bireyselleştirmek için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme.
- Hücre süspansiyonu 15 mL ses seviyesine sıcak DMEM/F12 ve santrifüj ile oda sıcaklığında 290 x g'da 5 dakika boyunca getirin.
- Artık BM matrisi 1 ve ayrışma tampon bileşenlerini çıkarmak için hücreleri sıcak DMEM/F12 ile hafifçe emiş ve başka bir santrifüjleme turu için yeniden biriktirin.
- Yukarıda açıklandığı gibi, 1 mL mezoderm indüksiyon ortamında süpernatant ve resuspend hücrelerini aspire edin. 1 x 105 hücre/mL konsantrasyon elde etmek için gerekli olan uygun mezoderm farklılaşma ortamının hacmini belirlemek için hemositometre veya coulter sayacı kullanarak toplam hücre sayısını sayın.
- BM matrisi 2 kaplamalı plakalardan ECM solüsyonu aspire edin ve plakaları ılık DMEM/F12 ile iki kez durulayın. HiPS hücre süspansiyonu birkaç kez pipetleme ile hafifçe karıştırın. Hücre süspansiyonunun 1 mL'lik kısmını BM matrisi 2 kaplamalı 12 kuyu plakalarının her kuyusuna aktarın ve ardından hücreleri daha eşit dağıtmak için plakaları hafifçe sallayın.
- Plakayı %5 CO2 inkübatörde 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Ertesi gün mezoderm indüksiyon ortamını yenileyin.
NOT: 2 gün sonra hiPS hücre türevi mezoderm hücreleri ara mezoderm indüksiyonu için hazır olacaktır.
5. HiPS hücre türevi mezoderm hücrelerinin ara mezoderm haline farklılaşması (gün 2-16)
- Farklılaşma protokolünün 2. gününde mezoderm indüksiyon ortamını aspire edin ve kuyu başına 1 mL ara mezoderm indüksiyon ortamı ile yenilenin.
- Metabolik olarak aktif hücreler için doğru bir büyüme faktörleri ve küçük molekül eşiğini korumak için ortamı her gün yenileyin. Önemli miktarda hücre büyümesi ve medya besin maddelerinin hızlı tükenmesi varsa (ortamın sararması ile gösterilir), ara mezoderm farklılaşma ortamının hacmi 12 kuyu plakasının kuyusu başına 1,3 mL'ye yükseltilebilir.
- Ara mezoderm hücreleri elde etmek için ek 14 gün boyunca kültür hücreleri. 16. güne kadar, bu hücreler daha sonra kullanılmak üzere kriyoprezizasyon yapılabilir.
6. HiPS hücre türevi ara mezoderm hücrelerinin podositlere farklılaştırılması (16 ila 21 gün)
- Ara mezoderm hücrelerini ılık DMEM/F12 ile durulayın ve ardından 37 °C'de 3 dakika boyunca kuyu başına % 0,05 tripsin-EDTA başına 0,5 mL ile hücrelerin inkübasyonu. Hücrelerin ayrışmaya başladığından emin olmak için görsel inceleme gerçekleştirin.
- Hücre kaldırıcı kullanarak hücreleri kazıyın ve hücre süspansiyonunu 1.000 μL pipet ucu kullanarak hücre süspansiyonunu birkaç kez kazıyın ve hücrelerin bireyselleştirilmiş (veya küçük kümelerini) elde edin.
NOT: Bu aşamada, toplanan hücreler protokolün zaman çizelgesi içinde ölümcül olarak farklılaştırılmış bir fenotip elde etmeyebileceğinden hücrelerin tamamen ayrıştığından emin olun. - Tripsin aktivitesini durdurmak için trypsin nötralize edici çözelti kuyusu başına yaklaşık 2 mL ekleyin.
- Hücreleri 50 mL konik bir tüpe aktarın ve DMEM/F12 kullanarak hacmi 50 mL'ye kadar getirin ve ardından hücre süspansiyonu oda sıcaklığında 201 x g'da 5 dakika santrifüjlayın.
- Podosit indüksiyon ortamındaki süpernatant ve resuspend hücrelerini epire edin. En iyi sonuçları elde etmek için, 12 kuyu plakasının yaklaşık 100.000 hücre/kuyusundan oluşan nihai bir tohumlama yoğunluğu sağlayın. Hücre süspansiyonu BM matrisi 2 kaplamalı plakalara ekleyin ve hücrelerin daha eşit dağıtılmasına yardımcı olmak için plakayı hafifçe sallayın.
- Hücreleri 37 °C ve% 5 CO 2'de kuluçkaya yatırın ve21.
NOT: Elde edilen hiPS hücre türevi podositler, podosit bakım ortamı ile tam ortam kullanılarak 2-4 hafta daha kültürde tutulabilir. Podosit bakım ortamına girdikten sonra, hücreler iki günde bir beslenebilir ve sonraki çalışmalar veya aşağı akış analizleri için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolün amacı, olgun insan podositlerinin kimyasal olarak tanımlanmış koşullar altında hiPS hücrelerinden türetilebileceğini göstermekti. Bu yazıda sunulan veriler, ilk kez test edilen ve mikoplazma içermeyen DU11 hiPS hücre hattı17kullanılarak oluşturulmuştır. Kromozomal analiz de yapıldı ve hücrelerin karyotipik olarak normal olduğu tespit edildi. Farklılaşmamış DU11 hiPS hücrelerinden başlayarak, Bu raporda özetlenen farklılaşma stratejisi (Şekil 1) önce kök hücreleri (Şekil 2A) Brachyury (T) ( Şekil 1B ve Şekil2B) ifade eden mezoderm hücresine ayırt etmek için, ardından PAX2-pozitif ara mezoderm hücrelerine (Şekil 2C) ve son olarak olgun böbrek glomerüler podositlerine (Şekil 1B) ayırt etmek için kullanıldı. Şekil 2D, Şekil 3Dve Şekil 4). Farklılaşma protokolünün 2. gününe kadar mezoderm hücreleri, 16. gününe kadar ara mezoderm hücreleri, 21. gününe kadar da olgun podositler elde edildi. Elde edilen podositler, bu deneyde kullanılan laminin kaplı plakalar gibi düz bir doku kültürü yüzeyine yapıştığında yaklaşık 150-200 μm büyüklüğündeydi. HiPS hücre türevi podositler, faz kontrastlı mikroskopi ( Şekil 1 ), immünofluoresan mikroskopi ( Şekil4) ve taramalı elektron mikroskopisi 8,11dahil olmak üzere birden fazla tamamlayıcı teknik kullanılarak görselleştirilen çok sayıda ayak prosesi benzeri uzantılar sergiler. Kök hücre türevli podositler ayrıca WT115 (Şekil 2D) ve soy tanımlama işaretleyicisi nephrin14 ( Şekil 4 ) için pozitif olaraklekelenmiştir. İlginç bir şekilde, nefrin subsellüler lokalizasyonu ağırlıklı olarak podosit ayak süreçlerinde ve hücre sitoplazmasında, olgun bir podosit fenotipi(Şekil 2D ve Şekil 4A,B)ile tutarlıydı. Gelişim sırasında ve podosit fizyolojisinde, nefrin proteini hücre çekirdeği ve sitoplazma arasında mekik dokur, ancak nefrin, podositler olgunlaştıkça ve fonksiyonel bir fenotip elde ettikçe sitoplazma ve ayak süreçlerinde ağırlıklı olarak ifade edilir18. Bu nedenle, burada açıklanan farklılaşma protokolü kullanılarak üretilen podositlerin nefrinleri büyük ölçüde sitoplazma ve ayak proses benzeri yapılarda ifade ettiği gözlemi, bu protokolün daha olgun veya özel podositlerin üretilmesi için faydasının altını çizmektedir. HiPS hücre türevi podositlerin elektron mikrografilerinin taranarak, grubumuz tarafından daha önce bildirildiği gibi hiPS hücre türevi podositlerdeki birincil ve ikincil ayak süreçlerinin dallanması vurgulanır8,11. WT1 tek başına böbrek podositlerinin kesin bir belirteci olmadığından, araştırmacıların podosit ve nefrin gibi podosit spesifik belirteçlerin eşzamanlı ifadesi için hücrelerini karakterize etmeleri de şiddetle tavsiye edilir. Daha önce, bu yöntem kullanılarak elde edilen ölümcül farklılaştırılmış podositlerin podocin, nephrin ve WT1 için pozitif olduğu ve progenitör hücre işaretleyici pax28,11ifadesinde karşılık gelen bir azalma olduğu gösterilmiştir. Birlikte, bu sonuçlar, fonksiyonel bir insan böbreği glomerular podosit için gerektiği gibi, bu protokol kullanılarak elde edilen podositlerin gelişimsel olarak olgun veya özel olduğunu göstermektedir.
Farklılaşma yöntemi için koşulların optimize edilmesinde, ara mezoderm hücrelerinin yetersiz ayrıştığı örnekler gözlenmiştir. 12 kuyu plakasının önerilen yoğunluğunu /kuyuyu önemli ölçüde aşan yoğunluklarda tohumlanan hücreler (son podosit indüksiyon adımından önce), protokolün standart zaman çizelgesinde olgun podositlerin beklenen morfolojik fenotipine sahip olmayan büyük hücre kümeleriyle sonuçlandı (Şekil 3A,B). Bu nedenlerden dolayı, araştırmacıların belirli aşağı akış uygulamaları için istenebilecek diğer koşulları denemeden önce bu protokolde önerilen tohumlama yoğunluklarını(Şekil 3C,D)kullanmaları önerilir. Birlikte, bu sonuçlar, yukarıda açıklanan kimyasal olarak tanımlanmış medya kullanılarak hiPS hücrelerinin üç hafta içinde böbrek glomerüler podositlerine yönlendirilmiş farklılaşmasını temsil eder.
Şekil 1: HiPS hücrelerinin podositlere farklılaşması.
(A) HiPS hücrelerinin podositlere yönlendirilmiş farklılaşması için yöntemin şematik gösterimi. BMP7, kemik morfogenetik protein 7; RA, retinoik asit; VEGF, vasküler endotel büyüme faktörü. Bu şekil11referansından değiştirilmiştir. (B) Farklılaşmanın her aşamasında hiPS hücrelerinin temsili görüntüleri. Soldan sağa, görüntüler 0. günde farklılaşma için ayrışmadan önce karakteristik insan iPS hücre kolonilerini, ardından 2 günlük farklılaşmadan sonra mezoderm hücrelerini, ardından yaklaşık 10 günlük farklılaşmada ara mezoderm hücrelerini ve son olarak 22. günde ölümcül olarak farklılaşmış podositleri göstermektedir. Ölçek çubuğu, tüm görüntüler için 100 μm (B panelinde). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: HiPS hücrelerinin immünofluoresan görüntüleri ve farklılaşma zaman çizelgesi sırasında soyuna özgü belirteçlerin ve nükleer karşıtlıkların ifadesini gösteren farklılaştırılmış türevleri.
(A) Pluripotency işaretleyicisini ifade eden insan iPS hücreleri Oct4; (B) brachyury (T) ifade mezoderm hücreleri; (C) PAX2'yi ifade eden ara mezoderm hücreleri; ve (D) soy tanımlama işaretçisini, nefrin ve ilişkili işaretleyiciyi ifade eden hiPS hücre türevi podositler, WT1. Ölçek Çubuğu, tüm görüntüler için 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Du11 hiPS hücre hattından elde edilen ara mezoderm hücrelerinin farklılaşma potansiyeli üzerinde en uygun tohumlama yoğunluğunun etkileri.
(A) İlk hücre tohumlama yoğunluğu çok yüksek olduğunda (12 kuyu plakasının yaklaşık 500.000 hücresi/kuyusu), hücreler podosit indüksiyon aşamasında yoğun agregalar (B) oluşturabilir. (C) Topaklanmayı önlemek için önerilen tohumlama yoğunlukları (12 kuyu plakasının 100.000 hücresi /kuyusu) ve podosit farklılaşma aşamasında (inset) ayak işlemi benzeri yapıların(D)uzantısını mikroskobik olarak gözlemlemek. Ölçek çubuğu, A-D için 200 μm; ve D'deki giriş için 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: hiPS hücre türevi podositler morfolojik olarak olgun fenotip in vitro.
(A) Nefrin için hiPS hücre türevi podositlerin immünostainingi ve (B) birincil ve ikincil süreçleri (beyaz oklar) gösteren podosit ayak süreçlerinin daha yüksek büyütme görüntüsü ve bu özel hücre yapılarında nefrin ekspresyolü. Ölçek çubuğu, 100 μm (A); 50 μm (B). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu raporda, hiPS hücrelerinden böbrek glomerüler podositlerin üretimi için bir protokol açıklıyoruz. HiPS hücre türevi podositler olgun böbrek podosit fenotipi ile ilişkili morfolojik ve moleküler özellikler sergiler13. Önceki yayınlarda, hiPS hücre türevi podositlerin, perf kullanılabilir bir mikroakışkan organ-on-a-chip cihazında glomerüler mikrovasküler endotel hücreleri ile birlikte kültürlendiğinde böbrek glomerülüsünün yapısını ve seçici filtrasyon işlevini taklit edebildiğimizi gösterdik8,11.
Aşağıdaki kritik adımlar, bu protokolü uyarlamak isteyen araştırmacılar tarafından dikkate alınmalıdır. İlk olarak, mezoderm hücrelerinin indüksiyonu için hiPS hücrelerinin laminin kaplı plakalara tohumlanması çok önemli bir adımdır. 100.000 hücre/kuyudan oluşan bir tohumlama yoğunluğu önerilirken, araştırmacılar çalışma için kullanılan kök hücre hattının replikasyon oranına bağlı olarak ilk hücre tohumlama yoğunluğunu ayarlayabilirler. Gerekirse, bu optimizasyon mezoderm indüksiyon aşamasında yeterli hücre yoğunluğunu sağlayacak ve mezoderm, ara mezoderm veya podosit fenotipinin kalitesini tehlikeye atabilecek hücre agregalarının veya çok büyük kümelerin oluşumunu önleyecektir (Şekil 3). CHIR99021 gibi bazı reaktifler için üretici özelliklerindeki farklılıkların farklılaştırılmış hücrelerin kalitesini etkileyebileceğini de belirtmek önemlidir. Bu nedenle, farklı lot numaralarından veya tedarikçilerden ve satıcılardan reaktiflerin biyolojik faaliyetleri ve bağımsız deneyler arasındaki tutarlılıkları için test etmeleri önerilir. Ayrıca, hiPS hücrelerinin ayrışma enzimlerine aşırı maruz kalmasını önlemek önemlidir, çünkü bu yapışkan matrisinden istenmeyen kopmaya ve orta aspirasyon sırasında hücrelerin olası kaybına yol açabilir. Kayda değer bir diğer önemli adım, foto-inaktivasyonu retinoik asit önlemek için podosit indüksiyon ortamının ışıktan korunmasını sağlamaktır.
İnsan böbrek podositlerinin farklılaşması için önceki yöntemlere kıyasla, burada açıklanan yöntem, böbrek gelişimi ve podosit fonksiyonunda yer alan belirli hücre sinyal yollarını düzenlemek için gerektiğinde kimyasal olarak tanımlanmış faktörleri (küçük moleküller, büyüme faktörleri ve bodrum membran proteinlerinin belirli izoformları dahil) kullanmaktadır. Özellikle, hiPS hücrelerinden mezoderm hücrelerinin üretimi, küçük molekül CHIR9902119kullanılarak etkilenen kurallı Wnt sinyal yolunun aktivasyonunu içeriyordu. Kanonik Wnt sinyal yolunun, doku gelişimi ve örüntasyonu in vivo ile ilgili genlerin transkripsiyonel aktivitesini, ayrıca hücre çoğalmasını ve göçü düzenlediği bilinmektedir20,21. Bu protokolde kullanılan hücre indüksiyon ortamı, iPS hücre türevi ara mezoderm hücrelerinden podositlerin türetilmesini sağlar. Bu podosit indüksiyon ortamı Activin A, BMP7, VEGF, retinoik asit ve CHIR99021'den oluşur. Özellikle, bu podosit indüksiyon ortamı, belirli faktörlerin katkılarını gizleyebilen ve doku gelişimi ve hastalığının mekanistik çalışmaları için diğer hücre farklılaştırma yöntemlerinin uygulamalarını sınırlandırabilen fetal sığır serumu gibi tanımlanmamış serum bileşenleri gerektirmez, bu da onu renal hücre tipleri22üretmek için önceki girişimlerde kullanılanlardan farklı hale getirir. Ek olarak, böbrek podositlerinin hiPS hücrelerinden 6,7,22'den ayırtedilmesi için FGF2 ve FGF9'un gerekli olmadığı gözlenmiştir. Önceki yöntemler embriyoid cisimler ve organoidler gibi çok hücreli agregaların oluşumuna bağlıyken, burada açıklanan yöntem, hem morfolojik olarak hem de nefrin ve podokin dahil olmak üzere soyuna özgü belirteçlerin ekspresyözü ve PAX2 gibi ata hücre belirteçlerinin aşağı regülasyonu ile olgun bir fenotip sergileyen hücreler üretir. Bu protokolde kullanılan kimyasal bileşenlerin bilgisinin gelecekte insan böbrek dokusu gelişimi, podosit soyu spesifikasyonu ve hastalık patogenezinin mekanistik çalışmalarını kolaylaştırabileceği beklenebilir.
HiPS hücre farklılaşması için bu yöntem ayrıca, alt nüfus seçimi, genetik manipülasyonlar veya ksnotransplantasyon olmadan% 90'dan fazla verimlilikle olgun, postmitotik ve fonksiyonel podositlerin üretilmesini sağlar. Bu, yüksek düzeyde hücresel heterojenlik 6 ,7,23'ün çevirisel tıp uygulamaları için kök hücre farklılaştırma yöntemlerinin kullanımını sınırladığı önceki girişimlerden özellikle farklıdır. Bu yöntem ayrıca, birincil dokular veya organoidler gibi diğer kaynaklardan insan böbrek podositlerinin son derece sınırlı mevcudiyeti ile ilgili zorluklar göz önüne alındığında alan için önemli bir ilerleme sürmektedir. Zorluklardan bazıları, embriyoid cisimlerin veya organoidlerin oluşumuna dayanan yöntemler kullanırken% 1'den daha az düşük türetme verimliliklerini içerir6,7.
Bu protokolün bir sınırlaması, kök hücre kültürü ve farklılaşma adımları için gerekli reaktiflerin nispeten yüksek maliyetidir ve bu da bazı laboratuvarlarda veya araştırma gruplarında uygulanmasını engelleyebilir. Ayrıca, hücrenin mikroçevriminde birden fazla faktör için çok fazla optimizasyon (yani, hem çözünür hem de çözünmeyen veya yapışkan ipuçları) söz konusu olduğundan, protokolün açıklandığı gibi takip edilmesi öneririz. Bu podosit farklılaştırma yöntemini kullanmakla ilgilenen diğer kişilerden dikkat çeken yaygın bir hata, BM matrisi 1 veya diğer kötü tanımlanmış hayvansal türev proteinler gibi uygunsuz hücre yapışma matrislerinin kullanımını içeriyordu. Protokol açıklandığı gibi izlendikten sonra, protokoldeki diğer değişikliklerin etkinliğini incelemek için daha fazla deneme yapılabilir. Ayrıca, farklı insan kök hücre çizgileri arasındaki doğal farklılıklar nedeniyle, farklılaşma yönteminin bazı yönlerinin, örneğin, farklılaşma ortamına veya hücre ayrışma ortamına maruz kalma zamanlamasının ve hücre tohumlama yoğunluklarının optimize edilmesi gerekebileceğini belirtmek gerekir. Ancak bugüne kadar test edilen hiPS hücre hatları ve embriyonik kök hücre hatları için bu durumlar değiştirilmedi. Bu podosit farklılaşma yöntemi PGP1, IMR-90–1 ve IISH3i-CB6 ve H9 embriyonik kök hücre hattı8,11dahil olmak üzere birden fazla hiPS hücre hattında çalışır. Bu raporda, du11 hiPS hücre hattının aynı protokolü kullanarak başarılı bir şekilde farklılaştırılmasını da gösteriyoruz (Şekil 1 ve Şekil 2). Bu nedenle, bu yöntemin diğer bağımsız araştırma laboratuvarlarından (yayın öncesi) yayınlanmamış çalışmalardan elde edilen sonuçlar da dahil olmak üzere çeşitli hücre hatlarındaki tutarlılığı göz önüne alındığında, bu farklılaşma protokolünün böbrek podositlerinin çok çeşitli hiPS hücre hatlarından türetilmesi için yararlı olacağını ve bu nedenle bu protokolde kullanılanla sınırlı kalmayacağını umuyoruz.
HiPS hücrelerinin süresiz olarak kendini yenileme kapasitesi göz önüne alındığında, bu farklılaşma yöntemi araştırmacılara hazır bir insan böbrek podosit kaynağı sağlamak için kullanılabilir. Bu, insan böbrek biyolojisi ve hastalığı24'ün mevcut anlayışını ilerletmeye yardımcı olabileceği gibi, insan böbrek fonksiyonlarını ve terapötiklere yanıtları modellemek için yeni in vitro böbrek sistemlerinin geliştirilmesini sağlayabilir. Örneğin, burada açıklanan protokol yakın zamanda insan böbrek glomerüler kılcal duvarının fonksiyonel bir in vitro modelini geliştirmek için mikroakışkan bir çip üzerinde organ sistemi ile entegre edildi. Bu glomerüler çip, kemoterapi ilacına maruz kaldığında dolaşımdaki molekülleri ve rekapitüle edilmiş ilaç kaynaklı nefrotoksisiteyi seçici olarak filtreledi, Adriamycin8. Gelecekte, bu sonuçlar potansiyel olarak insan böbreğinin daha karmaşık in vitro modellerini tasarlamak için 3D biyobaskı teknolojileri ile entegre edilebilir. Bu tür gelişmeler, özellikle glomerüler podositlerin işlev bozukluğundan kaynaklanan böbrek hastalıklarının formlarını hedefleyen ilaç adaylarını değerlendirmek için yeni platformlar sağlayabilir. Bu özellikle hayvan modellerinin türe özgü farklılıkları ve tipik olarak standart doku kültürü yöntemlerinde gözlenen organ düzeyindeki işlevlerin eksikliği, insan böbrek hastalıklarının çeşitli formları için hedeflenen terapötiklerin geliştirilmesini engelleyebileceğinden önemlidir25. Böylece, bu protokol, bir gün, insan böbreğinin gelişiminde yer alan sinyal yollarını ve hastalığın patogenezini çözmek için fırsatlar sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S.M. pluripotent kök hücrelerden böbrek podositlerinin üretimi için yöntemler için bekleyen bir patent üzerine bir yazardır (ABD patent başvurusu 14/950859). Geri kalan yazarlar rakip çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma Duke Üniversitesi Pratt Mühendislik Okulu, Duke Tıp Fakültesi Nefroloji Bölümü, Duke Üniversitesi Tıp Bölümü'nden Bir Sandalye Araştırma Ödülü ve S.M.'ye Burroughs Wellcome Fonu PDEP Kariyer Geçiş Geçici Ödülü tarafından desteklendi. M.B, Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Burs Programı tarafından desteklendi. Bize CÖMERTÇE DU11 kök hücre hattını sağladığı için Bursac Laboratuvarı'na ve Duke Üniversitesi'ndeki Varghese Laboratuvarı'na doku kültürü tesisini grubumuzla geçici olarak paylaştığı için teşekkür ederiz. Bu yayın, Massachusetts Teknoloji Enstitüsü Novartis Kimya Profesörü Prof. Laura L.Kiessling'e 60.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal. | ||
| Growth Factors and Media Supplements | |||
| All-trans retinoic acid (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| B27 serum-free supplement | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | May show lot-to-lot variation |
| Complete Medium Kit with CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Cell Systems | Podocyte maintenance media |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 with glutamine supplement |
| Heat-inactivated FBS | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| Human activin A | PHC9564 | Thermo/Life Technologies | |
| Human BMP7 | PHC9544 | Thermo/Life Technologies | |
| Human VEGF | PHC9394 | Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 medium | 05850 | Stem Cell Technologies | hiPS cell culture media (CCM) |
| Penicillin–streptomycin, liquid (100×) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 ROCK inhibitor | 1254 | Tocris | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T) | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R&D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | N-892012 | Iwai North America | Basement membrane (BM) matrix 2 |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | 354277 | BD Biosciences | Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation |
| Enzymes and Other Reagents | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Cell detachment solution |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood |
| Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | 97065-058 | VWR | Ethanol is flammable and toxic |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyde (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Sterile Distilled Water | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Aspirating pipettes, individually wrapped | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R Centrifuge | B99516 | Beckman Coulter | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | 352097 | Corning | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryoboxes | 3395465 | Thermo/Life Technologies | For storing frozen aliquots |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives |
| Hemocytometer | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | 51030403 | Thermo/Life Technologies | For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives |
| Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | Carl Zeiss Microscopy | Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation |
| Kimberly-Clark nitrile gloves | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, large | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, small | 21905-026 | VWR | |
| P10 precision barrier pipette tips | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 barrier pipette tips | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 barrier pipette tips | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 barrier pipette tips | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 barrier pipette tips | P1122 | Denville Scientific | |
| Serological pipette, 10 mL, individually wrapped | 356551 | Corning | |
| Serological pipette, 25 mL, individually wrapped | 356525 | Corning | |
| Serological pipette, 5 mL, individually wrapped | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0.22 μm, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes | 1138W14 | Thomas Scientific | For aliquoting growth factors |
| Tissue culture–treated 12-well plates | 353043 | Corning | |
| Tissue culture–treated six-well plates | 353046 | Corning | |
| VWR white techuni lab coat | 10141-342 | VWR | |
| Wide-beveled cell lifter | 3008 | Corning |
References
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, 1145 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526, 564-568 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33, 1193-1200 (2015).
- Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13, 1662-1685 (2018).
- Pozzi, A., et al. Beta1 integrin expression by podocytes is required to maintain glomerular structural integrity. Developmental Biology. 316, 288-301 (2008).
- Kanasaki, K., et al. Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus. Developmental Biology. 313, 584-593 (2008).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).
- Torban, E., et al. PAX2 Activates WNT4 Expression during Mammalian Kidney Development. Journal of Biological Chemistry. 281, 12705-12712 (2006).
- Reiser, J., Sever, S. Podocyte biology and pathogenesis of kidney disease. Annual Review of Medicine. 64, 357-366 (2013).
- Kuusniemi, A. M., et al. Tissue Expression of Nephrin in Human and Pig. Pediatric Research. 55, 774-781 (2004).
- Guo, J. K., et al. WT1 is a key regulator of podocyte function: reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis. Human Molecular Genetics. 11, 651-659 (2002).
- Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. American Journal of Pathology. 160, 131-139 (2002).
- Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825 (2017).
- Satoh, D., et al. aPKCλ maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. The Journal of Biochemistry. 156, 115-128 (2014).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
- Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
- Clevers, H., Nusse, R.
- Ciampi, O., et al. Generation of functional podocytes from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 17, 130-139 (2016).
- Fuente Mora, C., et al. Differentiation of Podocyte and Proximal Tubule-Like Cells from a Mouse Kidney-Derived Stem Cell Line. Stem Cells and Development. 21, 296-307 (2011).
- Chuah, J. K. C., Zink, D. Stem cell-derived kidney cells and organoids: Recent breakthroughs and emerging applications. Biotechnology Advances. 35, 150-167 (2017).
- Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).
