Summary
Présenté ici est un protocole chimiquement défini pour la dérivation des podocytes rénaux humains à partir de cellules souches pluripotentes induites avec une efficacité élevée (>90%) et indépendant des manipulations génétiques ou de la sélection de sous-populations. Ce protocole produit le type de cellule souhaité dans les 26 jours et pourrait être utile pour les tests de néphrotoxicité et la modélisation de la maladie.
Abstract
Les maladies rénales touchent plus de 10 % de la population mondiale et coûtent des milliards de dollars en dépenses fédérales. Les formes les plus graves de maladie rénale et éventuellement d’insuffisance rénale terminale sont souvent causées par les dommages aux podocytes glomérulaires, qui sont les cellules épithéliales hautement spécialisées qui fonctionnent avec les cellules endothéliales et la membrane basale glomérulaire pour former la barrière de filtration du rein. Les progrès de la médecine rénale ont été entravés par la disponibilité limitée de tissus primaires et le manque de méthodes robustes pour la dérivation de cellules rénales humaines fonctionnelles, telles que les podocytes. La capacité de dériver des podocytes à partir de sources renouvelables, telles que les cellules souches, pourrait aider à faire progresser la compréhension actuelle des mécanismes du développement et de la maladie des reins humains, ainsi que fournir de nouveaux outils pour la découverte thérapeutique. L’objectif de ce protocole était de développer une méthode pour dériver des podocytes post-mitotiques matures à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPS) avec une efficacité et une spécificité élevées, et dans des conditions chimiquement définies. Les podocytes dérivés des cellules hiPS produits par cette méthode expriment des marqueurs spécifiques à la lignée (y compris la néphrine, la podocine et la tumeur de Wilm 1) et présentent les caractéristiques morphologiques spécialisées (y compris les processus primaires et secondaires du pied) associés aux podocytes matures et fonctionnels. Curieusement, ces caractéristiques spécialisées sont notamment absentes dans la lignée cellulaire podocytaire immortalisée largement utilisée dans le domaine, ce qui suggère que le protocole décrit ici produit des podocytes rénaux humains qui ont un phénotype plus mature sur le plan du développement que les lignées cellulaires podocytaires existantes généralement utilisées pour étudier la biologie rénale humaine.
Introduction
Les progrès de la culture de cellules souches pluripotentes humaines sont sur le point de révolutionner la médecine régénérative, la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments en fournissant aux chercheurs une source renouvelable et évolutive de matériel biologique qui peut être conçue pour obtenir presque n’importe quel type de cellule dans le corps humain1. Cette stratégie est particulièrement utile pour dériver des types de cellules spécialisées et fonctionnelles qui seraient autrement difficiles à obtenir. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPS)2,3,4,5 sont particulièrement attrayantes en raison de leur origine cellulaire somatique et du potentiel qu’elles représentent pour la médecine personnalisée. Cependant, le développement de méthodes pour dériver d’autres lignées cellulaires à partir de cellules hiPS reste difficile en raison de l’utilisation fréquente de conditions de culture mal définies, ce qui conduit à une faible efficacité et à une génération non spécifique de populations cellulaires hétérogènes6,7.
Présenté ici est une méthode pour la dérivation de podocytes rénaux matures à partir de cellules hiPS avec spécificité et haute efficacité dans des conditions chimiquement définies. En tenant compte des rôles de multiples facteurs dans le microenvironnement cellulaire, une stratégie de différenciation des cellules souches a été développée qui impliquait l’optimisation des facteurs solubles présentés dans le milieu de culture cellulaire ainsi que des facteurs insolubles, tels que les composants de la matrice extracellulaire ou les substrats adhésifs. Compte tenu de l’importance de la signalisation de l’intégrine dans le développement et la fonction des podocytes, l’expression des récepteurs de l’intégrine à la surface de la cellule a été initialement examinée. Les intégrines β1 étaient fortement exprimées non seulement dans les cellules hiPS, mais aussi dans leurs dérivés, y compris les cellules mésodermiques et les cellules mésodermiques intermédiaires8,9,10. Des expériences ultérieures ont confirmé que les ligands qui se lient aux intégrines β1 (y compris la laminine 511 ou le fragment de laminine 511-E8) soutiennent l’adhésion et la différenciation des cellules hiPS en podocytes lorsqu’ils sont utilisés en conjonction avec les milieux inductifs solubles décrits ci-dessous.
L’induction de l’engagement de la lignée cellulaire a été initiée en confirmant d’abord que les cellules hiPS cultivées sur les surfaces recouvertes de laminine pendant deux jours en présence d’un milieu contenant de l’activine A, chir99021 et Y27632 Inhibiteur de roche peuvent se différencier en cellules qui expriment les marqueurs mésodermiques précoces HAND1, goosecoid et brachyury8,11. Le traitement des cellules du mésoderme pendant 14 jours avec un milieu complété par la protéine morphogénétique osseuse 7 (BMP-7) et CHIR99021 a permis la dérivation de cellules mésodermiques intermédiaires qui exprimaient les marqueurs cellulaires néphron-progéniteurs de la tumeur de Wilm 1 (WT1), la protéine apparentée impaire 1 (OSR1)8,11et la protéine 2 du gène de boîte appariée (PAX2)12. Pour obtenir les podocytes glomérulaires rénaux matures, les cellules intermédiaires du mésoderme ont été traitées pendant 4 à 5 jours avec un nouveau milieu composé de BMP-7, d’activine A, de facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF), d’acide rétinoïque touttrans et de CHIR99021. La cytométrie en flux et l’immunocoloration ont été utilisées pour confirmer que >90% des cellules résultantes présentaient les caractéristiques moléculaires, morphologiques et fonctionnelles du podocyte rénal mature8,11,13. Ces caractéristiques comprennent le développement de processus de pied primaire et secondaire; l’expression de gènes spécifiques à la lignée podocytaire, y compris SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 et l’expression de protéines telles que la podocine, la néphrine et WT114,15,16. En outre, il a été constaté que les podocytes dérivés des cellules hiPS peuvent être maintenus en culture jusqu’à quatre semaines in vitro en utilisant un milieu8,11 disponible dans le commerce qui offre une flexibilité supplémentaire dans le calendrier des expériences en aval. Pour plus d’informations concernant les panels de cytométrie en flux utilisés pour déterminer la pureté des podocytes hiPS, veuillez vous référer à notre publication précédente11.
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Protocol
1. Préparation des réactifs
- Diluer le supplément de milieux de culture cellulaire (CCM) 5x hiPS décongelé dans un milieu basal de culture cellulaire hiPS pour obtenir une solution 1x de CCM hiPS.
REMARQUE: Le supplément de CCM surgelé 5x hiPS nécessite un processus de décongélation lent, idéalement à 4 ° C pour la nuit. Les aliquotes du CCM 1x hiPS peuvent être conservées jusqu’à 6 mois à -20 °C. - Préparation de plaques à membrane basale (BM) matricielle 1 pour la culture cellulaire hiPS : Décongeler la matrice BM 1 pendant la nuit sur de la glace à 4 °C. Une fois décongelés, préparer les aliquotes avec les facteurs de dilution appropriés, comme suggéré par le fabricant.
REMARQUE: En règle générale, les aliquotes sont préparées pour dilution ultérieure dans 25 mL de DMEM/F12 froid dans un tube conique de 50 mL suivi d’un mélange approfondi pour dissoudre complètement la matrice BM 1 et éviter la formation de cristaux résiduels. - Transférer 1 mL de la solution BM matrix 1 dans chaque puits d’une plaque de 6 puits et incuber à 37 °C pendant 1-2 h ou à 4 °C pendant au moins 24 h, enveloppé dans un film de paraffine. Les plaques revêtues de la matrice BM 1 peuvent être conservées à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
- Préparation de la matrice à membrane basale (BM) 2 - plaques revêtues : Diluer des quantités appropriées de matrice BM 2 dans 9 mL d’eau distillée stérile pour préparer une concentration finale de 5 μg/mL. Ajouter 700 μL de la solution BM matrix 2 à chaque puits d’une plaque de 12 puits et incuber la plaque à température ambiante pendant 2 h ou pendant la nuit à 4 °C.
- Préparer des solutions sous forme de BMP7, d’Activine A et de VEGF à 100 μg/mL comme suit : reconstituer le BMP7 dans de l’eau distillée stérile contenant 0,1 % (p/vol) de BSA et reconstituer séparément l’activine A et le VEGF dans du PBS stérile contenant 0,1 % (p/vol) de BSA. Pour éviter les cycles fréquents de congélation-décongélation, préparez des aliquotes de 100 μL à partir de chaque solution d’élevage et conservez-les à -20 °C jusqu’à 6 mois.
- Préparer une solution mère de 10 mM de Y27632 en dissolvant 10 mg de Y27632 dans 3,079 mL d’eau distillée stérile. Aliquote 100 μL du stock et conserver à -20 °C jusqu’à 6 mois.
- Dissoudre 2 mg de CHIR99021 dans 143,4 μL de DMSO stérile pour préparer une solution mère de 30 mM. Préparer des aliquotes de 5 μL et conserver à -20 °C jusqu’à 1 mois (ou selon la recommandation du fabricant).
- Dissoudre 10 mg d’acide rétinoïque touttrans dans 3,33 mL de DMSO stérile. Préparer des aliquotes de 500 μL et conserver à -20 °C jusqu’à 6 mois.
2. Préparation des milieux de culture
- Préparer le milieu de différenciation du mésoderme en reconstituant les solutions mères correspondantes à une concentration finale de 100 ng/mL d’Activine A, de 3 μM CHIR99021, de 10 μM Y27632 et de 1x supplément sans sérum B27 dans un volume approprié de DMEM/12 avec un supplément de glutamine.
REMARQUE: Le milieu de différenciation du mésoderme doit être fraîchement préparé avant les étapes de différenciation et à un volume approprié à l’échelle de l’expérience (généralement, 50 mL de milieu sont suffisants pour deux plaques de 12 puits). - Préparer le milieu intermédiaire de différenciation du mésoderme en reconstituant les solutions mères correspondantes à une concentration finale de 100 ng/mL BMP7, 3 μM CHIR99021 et 1x supplément sans sérum B27 dans DMEM/F12 avec un supplément de glutamine.
REMARQUE: Si nécessaire, le milieu peut être complété par 1% (vol / vol) de pénicilline-streptomycine. Réglez le volume du milieu en utilisant DMEM/F12 avec un supplément de glutamine. Ce milieu peut être préparé en grandes quantités; toutefois, il est recommandé de les conserver dans des aliquotes plus petites (p. ex., 45 mL dans des tubes coniques de 50 mL) pour éviter les cycles répétés de gel-dégel. Ce milieu peut être conservé à -20 °C jusqu’à 3 mois et peut être décongelé à 4 °C pendant la nuit avant utilisation. - Préparer le milieu d’induction des podocytes en reconstituant à une concentration finale de 100 ng/mL de BMP7, 100 ng/mL d’activine A, de 50 ng/mL de VEGF, de 3 μM de CHIR99021, de 1x supplément sans sérum B27 et d’acide rétinoïque tout-trans de 0,1 μM dans du DMEM/F12 avec un supplément de glutamine. Protéger le milieu de la lumière (p. ex., en enveloppant le contenant avec du papier d’aluminium).
REMARQUE: Ce milieu peut être préparé en grandes quantités et stocké dans l’obscurité à -20 ° C pendant 3 mois. Les aliquotes congelées doivent être décongelées pendant la nuit à 4 °C avant utilisation. - Préparer 25 mL de solution neutralisante de trypsine en ajoutant 10 % (vol/vol) de FBS inactivé par la chaleur dans le DMEM/F12 et filtrer dans des conditions stériles.
- Pour le maintien post-différenciation des podocytes dérivés de cellules souches, préparer le milieu complet avec un milieu d’entretien des podocytes en ajoutant le supplément au milieu basal conformément aux directives du fabricant et conserver à 4 ° C jusqu’à deux semaines.
3. Culture cellulaire hiPS sans mangeoire utilisant un milieu de culture cellulaire hiPS
- Aspirer la solution résiduelle de la matrice BM 1 des plaques pré-enduites et laver les puits 3 fois avec 1 à 2 mL de DMEM/F12 réchauffé.
- Aspirer le CCM hiPS des cellules hiPS et rincer les cellules 3 fois avec du DMEM/F12 réchauffé. Ajouter 1 mL de solution chaude de détachement cellulaire et incuber pendant 1 min à 37 °C pour aider à dissocier les cellules. Effectuez une inspection visuelle des cellules sous un microscope de culture tissulaire et assurez-vous que les bords des colonies cellulaires semblent arrondis, puis aspirez rapidement la solution de détachement cellulaire des cellules (en veillant à ce que les colonies cellulaires soient toujours attachées à la plaque, bien que lâchement). Rincez doucement les cellules une fois avec DMEM/F12 pour éliminer la solution de détachement cellulaire.
- Ajouter 3 mL de CCM hiPS aux cellules hiPS (dans chaque puits d’une plaque de 6 puits) qui ont été traitées avec la solution de détachement cellulaire. Grattez les colonies à l’aide d’un élévateur de cellules et pipettez doucement la suspension de cellules de haut en bas pour déloger les cellules faiblement adhérentes. Lavez soigneusement la plaque pour vous assurer que toutes les cellules sont récoltées.
REMARQUE: L’utilisation d’une pipette de 5 mL est recommandée pour éviter un cisaillement excessif sur les cellules. - Transférer 0,5 mL de la suspension cellulaire dans chaque puits d’une nouvelle plaque de 6 puits revêtue de matrice BM 1 contenant 2 mL de CCM hiPS par puits. Déplacez la plaque en figure huit pour répartir les colonies cellulaires dans les puits et incuber à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2. Rafraîchissez le milieu tous les jours jusqu’à ce que les cellules soient prêtes à être passées ou utilisées pour l’expérience de différenciation (environ 70 % de confluence).
REMARQUE: La taille idéale de la colonie pour le passage de routine des CS IPS se situe entre 200 et 500 μm dans des conditions sans mangeoire en utilisant hiPS CCM (sans inhibiteur de ROCK). Si les cellules sont individualisées pendant le traitement avec des enzymes de dissociation ou des tampons, le CCM hiPS peut être complété par un inhibiteur de ROCK (par exemple, 10 μM Y27632) pour améliorer la viabilité cellulaire.
4. Différenciation des cellules hiPS en cellules mésodermiques (jours 0-2)
- Alors que les cultures cellulaires hiPS sont en phase de croissance exponentielle (environ dans les 4 jours suivant la culture après le passage, et environ 70% de confluence), inspectez visuellement la présence de cellules spontanément différenciées à l’intérieur et autour des bords des colonies. Si nécessaire, grattez de manière aseptique les zones de différenciation.
- Aspirer hiPS CCM à partir de cellules hiPS et rincer les cellules 3 fois avec du DMEM/F12 chaud. Incuber les cellules avec 1 mL de tampon de dissociation cellulaire sans enzyme pendant 10 min à 37 °C et vérifier la dissociation au microscope. En raison des différences inhérentes entre les différentes lignées cellulaires hiPS, le temps d’incubation réel du tampon de dissociation cellulaire doit être déterminé pour une lignée cellulaire donnée.
- Grattez doucement le puits avec un élévateur de cellules pour déloger les cellules faiblement adhérentes et transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL, puis pipetez plusieurs fois pour individualiser les cellules hiPS.
- Porter la suspension cellulaire au volume de 15 mL avec du DMEM/F12 chaud et centrifuger pendant 5 min à 290 x g à température ambiante.
- Aspirer doucement le surnageant et resuspendez les cellules avec du DMEM/F12 chaud pour une autre série de centrifugation afin d’éliminer les composants résiduels de la matrice BM 1 et du tampon de dissociation.
- Aspirer les cellules surnageantes et les réaporer dans 1 mL de milieu d’induction du mésoderme comme décrit ci-dessus. Compter le nombre total de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de coulter pour déterminer le volume approprié de milieu de différenciation du mésoderme nécessaire pour atteindre une concentration de 1 x10 5 cellules/mL.
- Aspirer la solution ECM à partir des plaques enduites de la matrice BM 2 et rincer les plaques deux fois avec du DMEM/F12 chaud. Mélangez doucement la suspension de la cellule hiPS en pipetant plusieurs fois. Transférer 1 mL de la suspension cellulaire dans chaque puits des plaques de 12 puits revêtues de la matrice BM à 2, puis secouer doucement les plaques pour répartir les cellules plus uniformément.
- Incuber la plaque à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2. Rafraîchissez le milieu d’induction du mésoderme le lendemain.
REMARQUE: Après 2 jours, les cellules mésodermiques dérivées des cellules hiPS seraient prêtes pour l’induction intermédiaire du mésoderme.
5. Différenciation des cellules mésodermiques dérivées des cellules hiPS en mésoderme intermédiaire (jours 2-16)
- Au jour 2 du protocole de différenciation, aspirer le milieu d’induction du mésoderme et reconstituer avec 1 mL par milieu d’induction du mésoderme intermédiaire.
- Rafraîchissez le milieu tous les jours pour maintenir un seuil précis de facteurs de croissance et de petites molécules pour les cellules métaboliquement actives. S’il y a une croissance cellulaire importante et un épuisement rapide des nutriments des milieux (indiqué par le jaunissement des milieux), le volume du milieu intermédiaire de différenciation du mésoderme peut être augmenté à 1,3 mL par puits des 12 plaques de puits.
- Culturez des cellules pendant 14 jours supplémentaires pour obtenir des cellules de mésoderme intermédiaires. Au jour 16, ces cellules peuvent être cryoconservées pour une utilisation ultérieure.
6. Différenciation des cellules mésodermiques intermédiaires dérivées des cellules hiPS en podocytes (jours 16 à 21)
- Rincer les cellules du mésoderme intermédiaire avec du DMEM/F12 chaud suivi d’une incubation des cellules avec 0,5 mL par puits de trypsine-EDTA à 0,05 % pendant 3 min à 37 °C. Effectuez une inspection visuelle pour vous assurer que les cellules commencent à se dissocier.
- Gratter les cellules à l’aide d’un élévateur de cellules et pipeter la suspension cellulaire plusieurs fois à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 μL pour obtenir des cellules individualisées (ou de petits amas).
REMARQUE: À ce stade, assurez-vous que les cellules sont complètement dissociées car les cellules agrégées peuvent ne pas acquérir un phénotype différencié en phase terminale dans la chronologie du protocole. - Ajouter environ 2 mL par puits de solution neutralisante de trypsine pour arrêter l’activité de la trypsine.
- Transférer les cellules dans un tube conique de 50 mL et porter le volume à 50 mL en utilisant DMEM/F12, puis centrifuger la suspension de la cellule pendant 5 min à 201 x g à température ambiante.
- Aspirer les cellules surnageantes et les réaporer dans le milieu d’induction des podocytes. Pour des résultats optimaux, assurez-vous d’une densité d’ensemencement finale d’environ 100 000 cellules/puits d’une plaque de 12 puits. Ajoutez la suspension cellulaire aux plaques à 2 couches de la matrice BM et secouez doucement la plaque pour aider à répartir les cellules plus uniformément.
- Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO2 et rafraîchir le milieu quotidiennement jusqu’à 5 jours pour obtenir des podocytes au jour 21.
REMARQUE: Les podocytes dérivés de cellules hiPS résultants peuvent être maintenus en culture pendant 2 à 4 semaines supplémentaires en utilisant un milieu complet avec un milieu d’entretien des podocytes. Une fois dans un milieu d’entretien des podocytes, les cellules peuvent être nourries tous les deux jours et peuvent être utilisées pour des études ultérieures ou des analyses en aval.
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Representative Results
L’objectif de ce protocole était de démontrer que les podocytes humains matures peuvent être dérivés de cellules hiPS dans des conditions chimiquement définies. Les données présentées dans ce manuscrit ont été générées en utilisant la lignée cellulaire DU11 hiPS17, qui a d’abord été testée et s’est avérée exempte de mycoplasmes. Une analyse chromosomique a également été effectuée et les cellules se sont avérées normales sur le plan caryotypique. En commençant par les cellules hiPS DU11 indifférenciées, la stratégie de différenciation (Figure 1) décrite dans ce rapport a été utilisée pour différencier d’abord les cellules souches (Figure 2A) en cellules mésodermiques qui expriment la brachyury (T) (Figure 1B et Figure 2B), suivie d’une différenciation en cellules mésodermiques intermédiaires PAX2 positives (Figure 2C), et enfin en podocytes glomérulaires rénaux matures (Figure 1B, Figure 2D, Figure 3Det Figure 4). Les cellules mésodermiques ont été obtenues au jour 2 du protocole de différenciation, les cellules mésodermiques intermédiaires ont été générées au jour 16 et les podocytes matures ont été obtenus au jour 21 du protocole de différenciation. Les podocytes résultants avaient une taille d’environ 150 à 200 μm lorsqu’ils étaient collés à une surface de culture tissulaire plane, telle que les plaques recouvertes de laminine utilisées dans cette expérience. Les podocytes dérivés des cellules hiPS présentent de nombreuses extensions de type processus du pied qui ont été visualisées à l’aide de plusieurs techniques complémentaires, notamment la microscopie à contraste de phase (Figure 1), la microscopie immunofluorescente (Figure 4) et la microscopie électronique à balayage8,11. Les podocytes dérivés de cellules souches ont également été colorés positivement pour WT115 (Figure 2D) ainsique le marqueur d’identification de la lignée néphrine14 (Figure 4). Curieusement, la localisation subcellulaire de la néphrine était principalement dans les processus du pied podocytaire et le cytoplasme cellulaire, ce qui correspond à un phénotype de podocyte mature(Figure 2D et Figure 4A,B). Au cours du développement et dans la physiologie des podocytes, la protéine néphrine est transportée entre le noyau cellulaire et le cytoplasme, mais la néphrine devient principalement exprimée dans les processus du cytoplasme et du pied à mesure que les podocytes mûrissent et acquièrent un phénotype fonctionnel18. Ainsi, l’observation que les podocytes produits en utilisant le protocole de différenciation décrit ici expriment la néphrine en grande partie dans le cytoplasme et les structures de type processus du pied souligne l’utilité de ce protocole pour la génération de podocytes plus matures ou spécialisés. Les micrographies électroniques à balayage des podocytes dérivés des cellules hiPS mettent en évidence la ramification des processus du pied primaire et secondaire dans les podocytes dérivés des cellules hiPS, comme indiqué précédemment par notre groupe8,11. Parce que WT1 n’est pas en soi un marqueur définitif des podocytes rénaux, il est fortement recommandé que les chercheurs caractérisent également leurs cellules pour l’expression simultanée de marqueurs spécifiques aux podocytes tels que la podocine et la néphrine. Il a déjà été démontré que les podocytes différenciés en phase terminale dérivés en utilisant cette méthode immunostain positif pour la podocine, la néphrine et WT1, avec une diminution correspondante de l’expression du marqueur cellulaire progéniteur PAX28,11. Ensemble, ces résultats indiquent que les podocytes dérivés à l’aide de ce protocole sont matures sur le plan du développement ou spécialisés, comme requis pour un podocyte glomérulaire rénal humain fonctionnel.
En optimisant les conditions de la méthode de différenciation, des cas où les cellules intermédiaires du mésoderme étaient insuffisamment dissociées ont été observés. Les cellules ensemencées à des densités qui dépassaient significativement la densité recommandée de 100 000 cellules/puits d’une plaque de 12 puits (avant l’étape finale d’induction des podocytes) ont donné lieu à de grands groupes de cellules qui n’avaient pas le phénotype morphologique attendu de podocytes matures dans la chronologie standard du protocole(Figure 3A, B). Pour ces raisons, il est recommandé aux chercheurs d’utiliser les densités d’ensemencement recommandées dans ce protocole(Figure 3C,D)avant d’expérimenter d’autres conditions qui peuvent être souhaitées pour des applications en aval spécifiques. Ensemble, ces résultats représentent la différenciation dirigée des cellules hiPS en podocytes glomérulaires rénaux en trois semaines en utilisant les milieux chimiquement définis décrits ci-dessus.
Figure 1 : Différenciation des cellules hiPS en podocytes.
(A) Représentation schématique de la méthode de différenciation dirigée des cellules hiPS en podocytes. BMP7, protéine morphogénétique osseuse 7; RA, acide rétinoïque; VEGF, facteur de croissance de l’endothélium vasculaire. Ce chiffre a été modifié à partir de la réf.11. (B) Images représentatives des cellules hiPS à chaque étape de la différenciation. De gauche à droite, les images montrent les colonies de cellules iPS humaines caractéristiques avant la dissociation pour la différenciation le jour 0, suivies des cellules du mésoderme après 2 jours de différenciation, puis des cellules mésodermiques intermédiaires à environ 10 jours de différenciation, et enfin des podocytes différenciés en phase terminale au jour 22. Barre d’échelle, 100 μm pour toutes les images (dans le panneau B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Images immunofluorescentes des cellules hiPS et de leurs dérivés différenciés montrant l’expression de marqueurs spécifiques à la lignée et de contre-colorations nucléaires pendant la chronologie de différenciation.
(A) Cellules iPS humaines exprimant le marqueur de pluripotence Oct4; (B) cellules mésodermiques exprimant la brachyrie (T); C)les cellules mésodermiques intermédiaires exprimant PAX2; et (D) les podocytes dérivés de cellules hiPS exprimant le marqueur d’identification de la lignée, la néphrine, et le marqueur associé, WT1. Barre d’échelle, 100 μm pour toutes les images. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Effets de la densité d’ensemencement sous-optimale sur le potentiel de différenciation des cellules mésodermiques intermédiaires dérivées de la lignée cellulaire DU11 hiPS.
(A) Lorsque la densité initiale d’ensemencement cellulaire est trop élevée (environ 500 000 cellules/puits d’une plaque de 12 puits), les cellules peuvent former des agrégats denses (B) au cours de la phase d’induction des podocytes. (C) Densités d’ensemencement recommandées pour prévenir l’agglutination (100 000 cellules/puits d’une plaque de 12 puits) et pour observer au microscope l’extension(D)des structures semblables au processus du pied pendant la phase de différenciation des podocytes (encart). Barre d’échelle, 200 μm pour A-D; et 100 μm pour l’encart en D. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Les podocytes dérivés des cellules hiPS présentent un phénotype morphologiquement mature in vitro.
(A) Immunocoloration des podocytes dérivés des cellules hiPS pour la néphrine, et (B) image de grossissement plus élevé des processus du pied podocytaire montrant les processus primaires et secondaires (flèches blanches) ainsi que l’expression de la néphrine dans ces structures cellulaires spécialisées. Barre d’échelle, 100 μm (A); 50 μm (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans ce rapport, nous décrivons un protocole pour la génération de podocytes glomérulaires rénaux à partir de cellules hiPS. Les podocytes dérivés des cellules hiPS présentent des caractéristiques morphologiques et moléculaires associées au phénotype13du podocyte rénal mature. Dans des publications antérieures, nous avons montré que les podocytes dérivés des cellules hiPS peuvent imiter la structure et la fonction de filtration sélective du glomérule rénal lorsqu’ils sont co-cultivés avec des cellules endothéliales microvasculaires glomérulaires dans un dispositif microfluidique perfusable d’organe sur puce8,11.
Les étapes critiques suivantes devraient être envisagées par les chercheurs intéressés à adapter ce protocole. Tout d’abord, l’ensemencement des cellules hiPS sur des plaques recouvertes de laminine pour l’induction de cellules mésodermiques est une étape cruciale. Bien qu’une densité d’ensemencement de 100 000 cellules/puits soit recommandée, les chercheurs peuvent ajuster la densité initiale d’ensemencement cellulaire en fonction du taux de réplication de la lignée de cellules souches utilisée pour l’étude. Si nécessaire, cette optimisation assurera une densité cellulaire adéquate pendant la phase d’induction du mésoderme et empêchera la formation d’agrégats cellulaires ou de très gros amas qui pourraient potentiellement compromettre la qualité du mésoderme, du mésoderme intermédiaire ou du phénotype podocytaire(Figure 3). Il est également important de noter que les différences dans les spécifications du fabricant pour certains réactifs tels que CHIR99021 peuvent affecter la qualité des cellules différenciées. Ainsi, il est conseillé de tester les réactifs de différents numéros de lot ou fournisseurs et vendeurs pour leur activité biologique et leur cohérence entre des expériences indépendantes. En outre, il est important d’éviter une exposition excessive des cellules hiPS aux enzymes de dissociation, car cela pourrait entraîner un détachement indésirable de la matrice adhésive et une perte possible de cellules lors de l’aspiration du milieu. Une autre étape cruciale à noter est de s’assurer que le milieu d’induction des podocytes est protégé de la lumière pour empêcher l’inactivation photo-induite de l’acide rétinoïque.
Par rapport aux méthodes précédentes de différenciation des podocytes rénaux humains, la méthode décrite ici utilise des facteurs chimiquement définis (y compris de petites molécules, des facteurs de croissance et des isoformes spécifiques de protéines de la membrane basale, aux concentrations souhaitées) au besoin pour réguler les voies de signalisation cellulaire spécifiques impliquées dans le développement rénal et la fonction des podocytes. Plus précisément, la génération de cellules mésodermiques à partir de cellules hiPS impliquait l’activation de la voie de signalisation canonique Wnt effectuée en utilisant la petite molécule CHIR9902119. La voie de signalisation canonique Wnt est connue pour réguler l’activité transcriptionnelle des gènes impliqués dans le développement tissulaire et le modelage in vivo, ainsi que la prolifération et la migrationcellulaires 20,21. Le milieu d’induction cellulaire utilisé dans ce protocole permet la dérivation de podocytes à partir de cellules mésodermiques intermédiaires dérivées de cellules iPS. Ce milieu d’induction des podocytes se compose d’Activine A, BMP7, VEGF, acide rétinoïque et CHIR99021. Notamment, ce milieu d’induction des podocytes ne nécessite pas de composants sériques indéfinis tels que le sérum bovin fœtal, ce qui peut masquer les contributions de facteurs spécifiques et limiter les applications d’autres méthodes de différenciation cellulaire pour les études mécanistes du développement tissulaire et de la maladie, ce qui le distingue de ceux utilisés dans les tentatives précédentes de génération de types de cellules rénales22. De plus, il a été observé que FGF2 et FGF9 ne sont pas nécessaires pour la différenciation des podocytes rénaux des cellules hiPS6,7,22. Alors que les méthodes précédentes dépendaient de la formation d’agrégats multicellulaires tels que les corps embryoïdes et les organoïdes, la méthode décrite ici produit des cellules qui présentent un phénotype mature, à la fois morphologiquement et par l’expression de marqueurs spécifiques à la lignée, y compris la néphrine et la podocine, et la régulation à la baisse des marqueurs de cellules progénitaires tels que PAX2. On s’attend à ce que la connaissance des composants chimiques utilisés dans ce protocole puisse faciliter les études mécanistes du développement du tissu rénal humain, de la spécification de la lignée des podocytes et de la pathogenèse de la maladie à l’avenir.
Cette méthode de différenciation cellulaire hiPS permet également la génération de podocytes matures, postmitotiques et fonctionnels avec une efficacité de plus de 90%, sans sélection de sous-population, manipulations génétiques ou xénotransplantation. Ceci est particulièrement différent des tentatives précédentes où des niveaux élevés d’hétérogénéité cellulaire6,7,23 limitaient l’utilisation des méthodes de différenciation des cellules souches pour les applications de médecine translationnelle. Cette méthode représente également une avancée significative pour le domaine compte tenu des défis associés à la disponibilité extrêmement limitée de podocytes rénaux humains provenant d’autres sources telles que les tissus primaires ou les organoïdes. Certains des défis comprennent de faibles efficacités de dérivation de moins de 1% lors de l’utilisation de méthodes qui reposent sur la formation de corps embryonnaires ou d’organoïdes6,7.
L’une des limites de ce protocole est le coût relativement élevé des réactifs requis pour les étapes de culture et de différenciation des cellules souches, ce qui peut entraver sa mise en œuvre dans certains laboratoires ou groupes de recherche. De plus, étant donné qu’il y avait beaucoup d’optimisation pour de multiples facteurs dans le microenvironnement de la cellule (c.-à-d. des indices solubles et insolubles ou adhésifs), nous recommandons que le protocole soit suivi tel que décrit. Une erreur courante notée par d’autres personnes intéressées par l’utilisation de cette méthode de différenciation des podocytes comprenait l’utilisation de matrices d’adhésion cellulaire inappropriées telles que la matrice BM 1 ou d’autres protéines animales mal définies. Une fois que le protocole est suivi comme décrit, d’autres expériences peuvent être effectuées pour examiner l’efficacité d’autres modifications apportées au protocole. En outre, en raison des différences inhérentes entre les différentes lignées de cellules souches humaines, il convient de noter que certains aspects de la méthode de différenciation, par exemple le moment de l’exposition au milieu de différenciation ou au milieu de dissociation cellulaire, et les densités d’ensemencement cellulaire, peuvent devoir être optimisés. Cependant, ces conditions n’ont pas été modifiées pour les lignées cellulaires hiPS et les lignées de cellules souches embryonnaires testées à ce jour. Cette méthode de différenciation des podocytes fonctionne sur plusieurs lignées cellulaires hiPS, y compris le PGP1, l’IMR-90-1 et l’IISH3i-CB6 ainsi que la lignée de cellules souches embryonnaires H98,11. Dans ce rapport, nous démontrons également la différenciation réussie de la lignée cellulaire DU11 hiPS en utilisant le même protocole(Figure 1 et Figure 2). Ainsi, étant donné la cohérence de cette méthode à travers diverses lignées cellulaires, y compris les résultats de travaux non publiés d’autres laboratoires de recherche indépendants (pré-publication), nous nous attendons à ce que ce protocole de différenciation soit utile pour la dérivation de podocytes rénaux à partir d’une grande variété de lignées cellulaires hiPS, et donc, pas limité à celui utilisé dans ce protocole.
Compte tenu de la capacité des cellules hiPS à s’auto-renouveler indéfiniment, cette méthode de différenciation pourrait être utilisée pour fournir aux chercheurs une source facilement disponible de podocytes rénaux humains. Cela pourrait aider à faire progresser la compréhension actuelle de la biologie rénale humaine et de la maladie24 ainsi que permettre le développement de nouveaux systèmes rénaux in vitro pour modéliser la fonction rénale humaine et les réponses aux thérapies. Par exemple, le protocole décrit ici a récemment été utilisé et intégré à un système microfluidique d’organe sur puce pour développer un modèle fonctionnel in vitro de la paroi capillaire glomérulaire rénale humaine. Cette puce glomérulaire a filtré sélectivement les molécules circulantes et récapitulé la néphrotoxicité induite par le médicament lorsqu’elle était exposée au médicament de chimiothérapie, Adriamycin8. À l’avenir, ces résultats pourraient potentiellement être intégrés aux technologies de bio-impression 3D pour concevoir des modèles in vitro plus complexes du rein humain. De telles avancées pourraient fournir de nouvelles plates-formes pour évaluer les candidats médicaments, en particulier ceux qui ciblent les formes de maladies rénales résultant du dysfonctionnement des podocytes glomérulaires. Ceci est particulièrement important car les différences spécifiques à l’espèce des modèles animaux et le manque de fonctionnalités au niveau des organes généralement observées dans les méthodes de culture tissulaire standard peuvent entraver le développement de thérapies ciblées pour diverses formes de maladies rénales humaines25. Ainsi, ce protocole pourrait, un jour, fournir des opportunités de démêler les voies de signalisation impliquées dans le développement du rein humain, ainsi que la pathogenèse de la maladie.
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Disclosures
S.M. est l’auteur d’un brevet en instance pour des méthodes de génération de podocytes rénaux à partir de cellules souches pluripotentes (demande de brevet américain 14/950859). Les autres auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l’école d’ingénierie Pratt de l’Université Duke, la Division de néphrologie de la Duke Medical School, un prix de recherche de chaire du département de médecine de l’Université Duke et un prix spécial de transition de carrière PDEP du Burroughs Wellcome Fund à S.M.. M.B a été soutenu par le programme de bourses de recherche pour diplômés de la National Science Foundation. Nous remercions le laboratoire Bursac de nous avoir généreusement fourni la lignée de cellules souches DU11 et le laboratoire Varghese de l’Université Duke d’avoir temporairement partagé leur installation de culture tissulaire avec notre groupe. Cette publication est dédiée à la professeure Laura L. Kiessling, professeure Novartis de chimie au Massachusetts Institute of Technology, à l’époque de son 60e anniversaire.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal. | ||
| Growth Factors and Media Supplements | |||
| All-trans retinoic acid (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| B27 serum-free supplement | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | May show lot-to-lot variation |
| Complete Medium Kit with CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Cell Systems | Podocyte maintenance media |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 with glutamine supplement |
| Heat-inactivated FBS | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| Human activin A | PHC9564 | Thermo/Life Technologies | |
| Human BMP7 | PHC9544 | Thermo/Life Technologies | |
| Human VEGF | PHC9394 | Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 medium | 05850 | Stem Cell Technologies | hiPS cell culture media (CCM) |
| Penicillin–streptomycin, liquid (100×) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 ROCK inhibitor | 1254 | Tocris | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T) | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R&D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | N-892012 | Iwai North America | Basement membrane (BM) matrix 2 |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | 354277 | BD Biosciences | Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation |
| Enzymes and Other Reagents | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Cell detachment solution |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood |
| Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | 97065-058 | VWR | Ethanol is flammable and toxic |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyde (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Sterile Distilled Water | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Aspirating pipettes, individually wrapped | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R Centrifuge | B99516 | Beckman Coulter | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | 352097 | Corning | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryoboxes | 3395465 | Thermo/Life Technologies | For storing frozen aliquots |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives |
| Hemocytometer | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | 51030403 | Thermo/Life Technologies | For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives |
| Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | Carl Zeiss Microscopy | Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation |
| Kimberly-Clark nitrile gloves | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, large | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, small | 21905-026 | VWR | |
| P10 precision barrier pipette tips | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 barrier pipette tips | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 barrier pipette tips | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 barrier pipette tips | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 barrier pipette tips | P1122 | Denville Scientific | |
| Serological pipette, 10 mL, individually wrapped | 356551 | Corning | |
| Serological pipette, 25 mL, individually wrapped | 356525 | Corning | |
| Serological pipette, 5 mL, individually wrapped | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0.22 μm, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes | 1138W14 | Thomas Scientific | For aliquoting growth factors |
| Tissue culture–treated 12-well plates | 353043 | Corning | |
| Tissue culture–treated six-well plates | 353046 | Corning | |
| VWR white techuni lab coat | 10141-342 | VWR | |
| Wide-beveled cell lifter | 3008 | Corning |
References
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, 1145 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526, 564-568 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33, 1193-1200 (2015).
- Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13, 1662-1685 (2018).
- Pozzi, A., et al. Beta1 integrin expression by podocytes is required to maintain glomerular structural integrity. Developmental Biology. 316, 288-301 (2008).
- Kanasaki, K., et al. Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus. Developmental Biology. 313, 584-593 (2008).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).
- Torban, E., et al. PAX2 Activates WNT4 Expression during Mammalian Kidney Development. Journal of Biological Chemistry. 281, 12705-12712 (2006).
- Reiser, J., Sever, S. Podocyte biology and pathogenesis of kidney disease. Annual Review of Medicine. 64, 357-366 (2013).
- Kuusniemi, A. M., et al. Tissue Expression of Nephrin in Human and Pig. Pediatric Research. 55, 774-781 (2004).
- Guo, J. K., et al. WT1 is a key regulator of podocyte function: reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis. Human Molecular Genetics. 11, 651-659 (2002).
- Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. American Journal of Pathology. 160, 131-139 (2002).
- Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825 (2017).
- Satoh, D., et al. aPKCλ maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. The Journal of Biochemistry. 156, 115-128 (2014).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
- Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
- Clevers, H., Nusse, R.
- Ciampi, O., et al. Generation of functional podocytes from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 17, 130-139 (2016).
- Fuente Mora, C., et al. Differentiation of Podocyte and Proximal Tubule-Like Cells from a Mouse Kidney-Derived Stem Cell Line. Stem Cells and Development. 21, 296-307 (2011).
- Chuah, J. K. C., Zink, D. Stem cell-derived kidney cells and organoids: Recent breakthroughs and emerging applications. Biotechnology Advances. 35, 150-167 (2017).
- Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).
