Summary
Præsenteret her er en kemisk defineret protokol til afledning af menneskelige nyre podocytter fra inducerede pluripotente stamceller med høj effektivitet (>90%) og uafhængig af genetiske manipulationer eller subpopulation udvælgelse. Denne protokol producerer den ønskede celletype inden for 26 dage og kan være nyttig til nefrotoksicitetstest og sygdomsmodellering.
Abstract
Nyresygdom påvirker mere end 10% af den globale befolkning og koster milliarder af dollars i føderale udgifter. De mest alvorlige former for nyresygdom og eventuel nyresvigt i slutstadiet er ofte forårsaget af skaderne på de glomerulære podocytter, som er de højt specialiserede epitelceller, der fungerer sammen med endotelceller og den glomerulære kældermembran for at danne nyrernes filtreringsbarriere. Fremskridt inden for nyremedicin er blevet hæmmet af den begrænsede tilgængelighed af primære væv og manglen på robuste metoder til afledning af funktionelle menneskelige nyreceller, såsom podocytter. Evnen til at udlede podocytter fra vedvarende energikilder, såsom stamceller, kan bidrage til at fremme den nuværende forståelse af mekanismerne for menneskelig nyreudvikling og sygdom samt give nye værktøjer til terapeutisk opdagelse. Målet med denne protokol var at udvikle en metode til at udlede modne, post-mitotiske podocytter fra human induceret pluripotente stamceller (hiPS) celler med høj effektivitet og specificitet, og under kemisk definerede betingelser. HiPS celle-afledte podocytter produceret af denne metode ekspres afstamning-specifikke markører (herunder nephrin, podocin, og Wilm's Tumor 1) og udviser de specialiserede morfologiske egenskaber (herunder primære og sekundære fod processer) forbundet med modne og funktionelle podocytter. Interessant, disse specialiserede funktioner er især fraværende i den udødeliggjorte podocyte celle linje udbredt i marken, hvilket tyder på, at protokollen beskrevet heri producerer menneskelige nyre podocytter, der har en udviklingsmæssigt mere moden fænotype end de eksisterende podocyte cellelinjer typisk bruges til at studere menneskelige nyrebiologi.
Introduction
Fremskridt inden for human pluripotente stamcellekultur er klar til at revolutionere regenerativ medicin, sygdom modellering, og lægemiddelscreening ved at give forskerne en vedvarende, skalerbar kilde til biologisk materiale, der kan manipuleres til at opnå næsten enhver celletype i den menneskelige krop1. Denne strategi er især nyttig til at udlede specialiserede og funktionelle celletyper, der ellers ville være vanskelige at opnå. Human induceret pluripotente stamceller (hiPS) celler2,3,4,5 er særligt attraktive på grund af deres somatiske celle oprindelse og det potentiale, de repræsenterer for personlig medicin. Udviklingsmetoder til at udlede andre celleledere fra hiPS-celler er dog fortsat udfordrende på grund af den hyppige brug af dårligt definerede kulturforhold , hvilket fører til lav effektivitet og ikke-specifik generering af heterogene cellepopulationer6,7.
Præsenteret her er en metode til afledning af modne nyre podocytter fra hiPS-celler med specificitet og høj effektivitet under kemisk definerede forhold. Ved at overveje rollerne af flere faktorer inden for det cellulære mikromiljø blev der udviklet en stamcelledifferentieringsstrategi, der involverede optimering af opløselige faktorer, der præsenteres i cellekulturmediet samt uopløselige faktorer, såsom ekstracellulære matrixkomponenter eller klæbende substrater. I betragtning af betydningen af integrin signalering i podocyt udvikling og funktion, udtrykket af integrin receptorer på celleoverfladen blev oprindeligt undersøgt. β1 integrins blev stærkt udtrykt ikke kun i hiPS-celler, men også i deres derivater, herunder mesoderm og mellemliggende mesoderm celler8,9,10. Efterfølgende forsøg bekræftede, at ligander, der binder sig til β1 integrins (herunder laminin 511 eller laminin 511-E8 fragment) understøtter vedhæftning og differentiering af hiPS-celler i podocytter, når de anvendes sammen med de opløselige induktive medier, der er beskrevet nedenfor.
Induktion af celle afstamning engagement blev indledt ved først at bekræfte, at hiPS celler dyrkes på laminin-coatede overflader i to dage i overværelse af et medium, der indeholder Activin A, CHIR99021, og Y27632 Rock hæmmer kan differentiere sig til celler, der udtrykker de tidlige mesoderm markører HAND1, gåsehud, og brachyury8,11. Behandling af mesodermcellerne i 14 dage med et medium suppleret med knoglemorfogenetisk protein 7 (BMP-7) og CHIR99021 muliggjorde afledning af mellemliggende mesodermceller, der udtrykte nephron-progenitorcellemarkørerne Wilms tumor 1 (WT1), ulige sprunget relateret protein 1 (OSR1)8,11og parret kassegen 2 protein (PAX2)12. For at udlede de modne nyre glomerulære podocytter blev de mellemliggende mesodermceller behandlet i 4-5 dage med et nyt medium bestående af BMP-7, Activin A, vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF), transretinosyre og CHIR99021. Flowcytometri og immunostaining blev brugt til at bekræfte, at >90 % af de resulterende celler udviste molekylære, morfologiske og funktionelle egenskaber ved den modne nyrekapocyt8,11,13. Disse egenskaber omfatter udvikling af primære og sekundære fodprocesser; udtrykket af podocyte afstamning-specifikke gener, herunder SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 og udtryk for proteiner, herunder podocin, nephrin, og WT114,15,16. Derudover blev det konstateret, at hiPS celle-afledt podocytter kan opretholdes i kulturen i op til fire uger in vitro ved hjælp af en kommercielt tilgængelige medium8,11, som giver en ekstra fleksibilitet i timingen af downstream eksperimenter. For mere information om flowcytometripaneler, der bruges til at bestemme renheden af hiPS-podocytterne, henvises til vores tidligere publikation11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tilberedning af reagenser
- Fortynd optøet 5x hiPS celle kultur medier (CCM) supplement i hiPS celle kultur basal medium for at opnå en 1x opløsning af hiPS CCM.
BEMÆRK: Frosset 5x hiPS CCM-tillæg kræver en langsom optøningsproces, ideelt i 4 °C for natten over. Aliquots af 1x hiPS CCM kan opbevares i op til 6 måneder ved -20 °C. - Forberedelse af kældermembran (BM) matrix 1-coatede plader til hiPS cellekultur: Optø BM matrix 1 natten over på is ved 4 °C. Når optøet, forberede aliquots med passende fortynding faktorer som foreslået af producenten.
BEMÆRK: Aliquots fremstilles typisk til efterfølgende fortynding i 25 mL kold DMEM/F12 i et 50 mL konisk rør efterfulgt af grundig blanding for helt at opløse BM matrix 1 og undgå dannelsen af resterende krystaller. - 1 mL af BM matrix 1 opløsningen til hver brønd på en 6 brøndplade og inkuberes ved 37 °C i 1-2 timer eller ved 4 °C i mindst 24 timer, indpakket i paraffinfilm. BM matrix 1-coatede plader kan opbevares ved 4 °C i op til 2 uger.
- Fremstilling af kældermembran (BM) matrix 2 - coatede plader: Fortynd passende mængder BM matrix 2 i 9 mL sterilt destilleret vand til at forberede en endelig koncentration på 5 μg/mL. Der tilsættes 700 μL af BM matrix 2-opløsningen til hver brønd på en 12 brøndplade, og pladen inkuberes ved stuetemperatur i 2 timer eller natten over ved 4 °C.
- Klargør 100 μg/mL lageropløsninger hver af BMP7, Activin A og VEGF som følger: rekonstrueret BMP7 i sterilt destilleret vand indeholdende 0,1% (wt/vol) BSA og rekonstituere Activin A og VEGF separat i steril PBS indeholdende 0,1% (wt/vol) BSA. For at undgå hyppige fryse-optøningscyklusser skal der forberedes 100 μL aliquots fra hver lageropløsning og opbevares ved -20 °C i op til 6 måneder.
- Klargør en 10 mM lageropløsning af Y27632 ved opløsning af 10 mg Y27632 i 3,079 mL sterilt destilleret vand. Aliquot 100 μL fra lageret og opbevares ved -20 °C i op til 6 måneder.
- 2 mg CHIR99021 opløses i 143,4 μL steril DMSO for at forberede en 30 mM lageropløsning. 5 μL aliquots og opbevares ved -20 °C i op til 1 måned (eller i henhold til fabrikantens anbefaling).
- 10 mg trans retinoinsyre opløses i 3,33 mL steril DMSO. Der fremstilles 500 μL aliquots, og opbevares ved -20 °C i op til 6 måneder.
2. Forberedelse af kulturmedier
- Forbered mesodermdifferentieringsmediet ved at rekonstituere tilsvarende lagerløsninger til en endelig koncentration på 100 ng/mL Activin A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632 og 1x B27 serumfrit supplement i et passende volumen af DMEM/12 med glutamintilskud.
BEMÆRK: Mesoderm differentiering medium bør være frisklavet før differentiering trin og ved et volumen, der passer til omfanget af eksperimentet (typisk, 50 mL medium er tilstrækkelig til to 12 brønd plader). - Forbered mellemliggende mesodermdifferentiering medium ved at rekonstituere tilsvarende lagerløsninger til en endelig koncentration på 100 ng/mL BMP7, 3 μM CHIR99021 og 1x B27 serumfrit supplement i DMEM/F12 med et glutamintilskud.
BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, kan mediet suppleres med 1% (vol/vol) Penicillin-Streptomycin. Juster mediets volumen ved hjælp af DMEM/F12 med glutamintilskud. Dette medium kan fremstilles i store partier; Det anbefales dog at opbevare mindre aliquots (f.eks. 45 mL i 50 mL koniske rør) for at undgå gentagne fryse-optøningscyklusser. Dette medie kan opbevares ved -20 °C i op til 3 måneder og kan optøs ved 4 °C natten over før brug. - Podocytinduktionsmediet forberedes ved at rekonstruere til en endelig koncentration på 100 ng/mL BMP7, 100 ng/mL-aktivi A, 50 ng/mL VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x B27 serumfrit supplement og 0,1 μM all-trans retinoinsyre i DMEM/F12 med glutamintilskud. Beskyt medium mod lys (f.eks. ved at pakke beholderen med foliepapir).
BEMÆRK: Dette medium kan fremstilles i store partier og opbevares i mørke ved -20 °C i op til 3 måneder. Frosne aliquots skal optøs natten over ved 4 °C før brug. - Der fremstilles 25 mL trypsinneutraliseringsopløsning ved at tilsætte 10% (vol/vol) varmeinaktiveret FBS i DMEM/F12 og filtrere under sterile forhold.
- For postdifferentiering vedligeholdelse af stamcelle-afledte podocytter, forberede Complete Medium med podocyte vedligeholdelse medier ved at tilføje tillægget til det basale medium i henhold til producentens retningslinjer, og opbevares ved 4 ° C i op til to uger.
3. Feeder-fri hiPS cellekultur ved hjælp af hiPS celle kultur medium
- Aspirer den resterende opløsning af BM matrix 1 fra de forlagte plader og vask brøndene 3 gange med 1 til 2 mL opvarmet DMEM/F12.
- Aspirat brugt hiPS CCM fra hiPS celler og skyl cellerne 3 gange med opvarmet DMEM /F12. Der tilsættes 1 mL varm celleløsning og inkuberes i 1 min ved 37 °C for at hjælpe med at adskille cellerne. Udfør visuel inspektion af celler under et vævskulturmikroskop og sørg for, at cellekoloniernes kanter vises afrundede, og aspirer derefter hurtigt celleløsningen fra cellerne (sørg for, at cellekolonierne stadig er fastgjort til pladen, omend løst). Skyl forsigtigt cellerne én gang med DMEM/F12 for at fjerne celleløsningen.
- Tilsæt 3 mL hiPS CCM til hiPS-cellerne (i hver brønd af en 6-brønds plade), der blev behandlet med celleløsningen. Skrab kolonier ved hjælp af en celleløfter, og rør forsigtigt celleaffjedring op og ned for at løsne de løst klæbede celler. Vask pladen grundigt for at sikre, at alle cellerne høstes.
BEMÆRK: Det anbefales at bruge en 5 mL-pipette for at undgå overskydende forskydning på cellerne. - Overfør 0,5 mL af celleaffjedringen til hver brønd af en ny BM matrix 1-belagt 6-brønds plade, der indeholder 2 mL hiPS CCM pr. Brønd. Flyt pladen på figur otte-måde for at fordele cellekolonier i brønde og inkubere ved 37 °C i en CO 2-inkubator på 5 %. Opdater medium dagligt, indtil cellerne er klar til at blive passager eller brugt til differentieringsforsøget (ca. 70 % sammenløb).
BEMÆRK: Den ideelle kolonistørrelse til rutinemæssig passaging af iPSC'er er mellem 200-500 μm under feeder frie forhold ved hjælp af hiPS CCM (uden ROCK-hæmmer). Hvis cellerne individualiseres under behandlingen med dissociationsenzymer eller buffere, kan hiPS CCM suppleres med ROCK-hæmmer (f.eks. 10 μM Y27632) for at forbedre celle levedygtigheden.
4. Differentiering af hiPS-celler i mesodermceller (dag 0-2)
- Mens hiPS cellekulturer er i den eksponentielle vækstfase (ca. inden for 4 dage efter kultur efter passaging, og omkring 70% sammenløb), visuelt inspicere for tilstedeværelsen af spontant differentierede celler i og omkring kanterne af kolonierne. Om nødvendigt, aseptisk skrabe-off områder af differentiering.
- Aspirere hiPS CCM fra hiPS celler og skyl cellerne 3 gange med varm DMEM/F12. Inkuber cellerne med 1 mL enzymfri celle dissociationsbuffer i 10 min ved 37 °C og kontrolleres for dissociation under et mikroskop. På grund af iboende forskelle mellem forskellige hiPS-cellelinjer skal den faktiske inkubationstid for celleafkoblingsbufferen bestemmes for en given cellelinje.
- Skrab forsigtigt brønden med en celleløfter for at løsne løst klæbede celler og overføre celleaffjedringen til et 15 mL konisk rør, efterfulgt af pipetter op og ned flere gange for at individualisere hiPS-cellerne.
- Bring celleaffjedring til 15 mL volumen med varm DMEM /F12 og centrifuge i 5 min ved 290 x g ved stuetemperatur.
- Sy forsigtigt supernatanten og resuspend cellerne med varm DMEM/F12 til endnu en centrifugeringsrunde for at fjerne resterende BM matrix 1 og dissociationsbufferkomponenter.
- Aspirere supernatant og resuspend celler i 1 mL af mesoderm induktion medium som beskrevet ovenfor. Tæl det samlede antal celler ved hjælp af et hæmocytometer eller skærtæller for at bestemme den passende mængde mesodermdifferentieringsmedium, der er nødvendigt for at opnå en koncentration på 1 x 105 celler/mL.
- Aspirat ECM opløsning fra BM matrix 2-coatede plader og skyl pladerne to gange med varm DMEM/F12. Bland hiPS celleaffjedringen forsigtigt ved at pipetter et par gange. Overfør 1 mL af celleaffjedringen til hver brønd i BM-matrixen 2-belagt 12-brøndsplader og ryst derefter forsigtigt pladerne for at fordele cellerne mere jævnt.
- Inkuberes pladen ved 37 °C i en 5% CO 2-inkubator. Opdater mesoderm induktionsmediet den næste dag.
BEMÆRK: Efter 2 dage, hiPS celle-afledte mesoderm celler ville være klar til mellemliggende mesoderm induktion.
5. Differentiering af hiPS celle-afledte mesoderm celler i mellemliggende mesoderm (dage 2-16)
- På dag 2 i differentiering protokol, aspirere mesoderm induktion medium og genopbygge med 1 mL pr godt mellemliggende mesoderm induktion medium.
- Opdater medium hver dag for at opretholde en nøjagtig tærskel for vækstfaktorer og små molekyler til de metabolisk aktive celler. Hvis der er betydelig cellevækst og hurtig udtømning af medienæringsstoffer (angivet ved gulning af medierne), kan mængden af det mellemliggende mesodermdifferentieringsmedium øges til 1,3 mL pr. brønd af de 12 brøndplader.
- Kulturceller i yderligere 14 dage for at opnå mellemliggende mesodermceller. Ved dag 16 kan disse celler cryopreserved til senere brug.
6. Differentiering af hiPS celle-afledte mellemliggende mesoderm celler i podocytter (dag 16 til 21)
- Skyl de mellemliggende mesodermceller med varme DMEM/F12 efterfulgt af inkubation af cellerne med 0,5 mL pr. brønd på 0,05 % trypsin-EDTA i 3 min ved 37 °C. Udfør visuel inspektion for at sikre, at cellerne begynder at adskille.
- Skrab celler ved hjælp af en celleløfter og pipette celleaffjedringen flere gange ved hjælp af en 1.000 μL pipettespids for at opnå individualiserede (eller små klumper af) celler.
BEMÆRK: På dette stadium skal du sikre dig, at cellerne er fuldt adskilt som aggregerede celler kan undlade at erhverve en terminalt differentieret fænotype inden for tidslinjen for protokollen. - Tilføj omkring 2 mL pr brønd af trypsin neutraliserende løsning for at stoppe aktiviteten af trypsin.
- Overfør celler til et 50 mL konisk rør, og bring diskenheden op til 50 mL ved hjælp af DMEM/F12, og centrifuger derefter celleaffjedringen i 5 min ved 201 x g ved stuetemperatur.
- Aspirere supernatant og resuspend celler i podocyte induktion medium. For optimale resultater, sikre en endelig såning tæthed på ca 100.000 celler / brønd af en 12 brønd plade. Tilsæt celleaffjedringen til BM matrix 2-coatede plader og ryst forsigtigt pladen for at hjælpe med at fordele cellerne mere jævnt.
- Inkuber celler ved 37 °C og 5% CO2 og opfrisk medium dagligt i op til 5 dage for at opnå podocytter inden dag 21.
BEMÆRK: De resulterende hiPS-celleafledte podocytter kan opretholdes i kulturen i 2-4 ekstra uger ved hjælp af komplet medium med podocyte vedligeholdelsesmedier. En gang i podocyt vedligeholdelse medier, cellerne kan fodres hver anden dag og kan bruges til efterfølgende undersøgelser eller downstream analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet med denne protokol var at påvise, at modne menneskelige podocytter kan udledes af hiPS-celler under kemisk definerede forhold. De data, der præsenteres i dette manuskript blev genereret ved hjælp af DU11 hiPS celle linje17, som først blev testet for, og viste sig at være fri for mycoplasma. Kromosomanalyse blev også udført, og cellerne viste sig at være karyotypisk normale. Begyndende med de udifferentierede DU11 hiPS-celler blev den differentieringsstrategi (figur 1), der er skitseret i denne rapport, anvendt til først at differentiere stamcellerne (figur 2A) i mesodermcelle, der udtrykker Brachyury (T) (figur 1B og figur 2B), efterfulgt af differentiering i PAX2-positive mellemliggende mesodermceller (Figur 2C) og endelig i modne nyrepolymerære podocytter (figur 1B, Figur 2D, Figur 3Dog figur 4. Mesodermceller blev opnået på dag 2 i differentieringsprotokollen, mellemliggende mesodermceller blev genereret af dag 16, og de modne podocytter blev opnået ved dag 21 i differentieringsprotokollen. De resulterende podocytter var omkring 150-200 μm i størrelse, når de klæbede til en flad vævskulturoverflade, såsom de lamininbelagte plader, der blev brugt i dette eksperiment. HiPS-celleafledte podocytter udviser adskillige fodproceslignende udvidelser, der blev visualiseret ved hjælp af flere komplementæreteknikker,herunder fasekontrastmikroskopi (figur 1), immunofluorescentmikroskopi (figur 4) og scanning af elektronmikroskopi8,11. De stamcellebaserede podocytter farves også positivt for WT115 (Figur 2D) samt slægtsidentifikationsmarkøren nephrin14 (Figur 4). Interessant, den subcellulære lokalisering af nephrin var overvejende i podocyte fod processer og celle cytoplasma, i overensstemmelse med en moden podocyt fænotype (Figur 2D og figur 4A,B). Under udvikling og i podocytfysiologi transporteres proteinettafrin mellem cellekernen og cytoplasmaet, men nephrin kommer overvejende til udtryk i cytoplasma- og fodprocesserne, efterhånden som podocytter modnes og erhverver en funktionel fænotype18. Således understreger den observation, at podocytterne produceret ved hjælp af differentieringsprotokollen, der er beskrevet heri express nephrin, stort set i cytoplasma- og fodproceslignende strukturer nytten af denne protokol til generering af mere modne eller specialiserede podocytter. Scanning elektron mikrografer af hiPS celle-afledte podocytter fremhæve forgrening af den primære og sekundære fod processer i hiPS celle-afledte podocytter som tidligere rapporteret af vores gruppe8,11. Fordi WT1 ikke i sig selv er en endelig markør for nyre podocytter, Det anbefales stærkt, at forskerne også karakterisere deres celler for samtidig udtryk for podocyte-specifikke markører såsom podocin og nephrin. Det blev tidligere vist, at uhelbredeligt differentierede podocytter afledt ved hjælp af denne metode immunostain positiv for podocin, nephrin, og WT1, med et tilsvarende fald i udtrykket af stamcellemarkør pax28,11. Sammen indikerer disse resultater, at podocytterne, der er afledt ved hjælp af denne protokol, er udviklingsmæssigt modne eller specialiserede, som kræves til en funktionel menneskelig nyreglomerær podocyt.
Ved optimering af betingelserne for differentieringsmetoden blev der observeret tilfælde, hvor de mellemliggende mesodermceller var utilstrækkeligt dissocierede. Celler seedet ved tætheder, der væsentligt oversteg den anbefalede tæthed af 100.000 celler / brønd af en 12 brøndplade (før det endelige podocyt induktionstrin) resulterede i store klynger af celler, der manglede den forventede morfologiske fænotype af modne podocytter inden for protokollens standardtid (figur 3A, B). Af disse grunde anbefales det, at forskere bruger de såningstætheder, der anbefales i denne protokol (Figur 3C,D), før de eksperimenterer med andre betingelser, der kan ønskes til specifikke downstream-applikationer. Tilsammen repræsenterer disse resultater den målrettede differentiering af hiPS-celler i nyreglomerulære podocytter inden for tre uger ved hjælp af de kemisk definerede medier, der er beskrevet ovenfor.
Figur 1: Differentiering af hiPS-celler til podocytter.
(A) Skematisk gengivelse af metoden til målrettet differentiering af hiPS-celler i podocytter. BMP7, knoglemorfogenetisk protein 7; RA, retinsyre; VEGF, vaskulær endotelvækstfaktor. Dette tal er ændret fra ref.11. (B) Repræsentative billeder af hiPS-celler på hvert trin i differentiering. Fra venstre mod højre viser billeder de karakteristiske menneskelige iPS-cellekolonier før dissociation for differentiering på dag 0, efterfulgt af mesodermceller efter 2 dages differentiering, derefter mellemliggende mesodermceller på omkring 10 dages differentiering og endelig de terminalt differentierede podocytter på dag 22. Skalastang, 100 μm for alle billeder (i panel B). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Immunofluorescent billeder af hiPS-celler og deres differentierede derivater, der viser udtrykket af slægtsspecifikke markører og nukleare modstæmning under differentiering tidslinjen.
(A) Menneskelige iPS-celler, der udtrykker pluripotency markør Oct4; (B) mesoderm celler udtrykker brachyury (T); (C) mellemliggende mesodermceller, der udtrykker PAX2; og (D) de hiPS-celleafledte podocytter, der udtrykker markør for slægtsidentifikation, nephrin og den tilknyttede markør, WT1. Skalalinje, 100 μm for alle billeder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Virkninger af suboptimal såtæthed på differentieringspotentialet for mellemliggende mesodermceller, der er afledt af DU11 hiPS-cellelinjen.
(A) Når den oprindelige celle såningstæthed er for høj (ca. 500.000 celler/brønd af en 12 brøndplade), kan cellerne danne tætte aggregater (B) i podocytinduktionsfasen. (C) Anbefalede såningstætheder for at forhindre klumpning (100.000 celler/brønd af en 12 brøndplade) og for mikroskopisk at observere (D)udvidelse af fodproceslignende strukturer under podocytdifferentieringsfasen (indsat). Vægtstang, 200 μm for A-D; og 100 μm for indsat i D. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: hiPS celle-afledte podocytter udviser morfologisk moden fænotype in vitro.
(A) Immunstaining af hiPS celle-afledte podocytter til nephrin, og (B) højere forstørrelse billede af podocyte fod processer, der viser primære og sekundære processer (hvide pile) samt udtryk for nephrin i disse specialiserede cellestrukturer. Vægtstang, 100 μm (A); 50 μm (B). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne rapport beskriver vi en protokol for generering af nyre glomerulære podocytter fra hiPS-celler. HiPS-celleafledte podocytter udviser morfologiske og molekylære træk forbundet med den modne nyre podocyt fænotype13. I tidligere publikationer viste vi, at hiPS-celle-afledte podocytter kan efterligne strukturen og selektiv filtrering funktion af nyrerne glomerulus når co-kulturret med glomerulære mikrovaskulære endotelceller i en perfusable mikrofluidiske organ-on-a-chip enhed8,11.
Følgende kritiske skridt bør overvejes af forskere, der er interesseret i at tilpasse denne protokol. For det første er såning af hiPS-celler på lamininbelagte plader til induktion af mesodermceller et afgørende skridt. Mens en såningstæthed på 100.000 celler / brønd anbefales, kan forskerne justere den oprindelige celle såningstæthed afhængigt af replikeringshastigheden af stamcellelinjen, der bruges til undersøgelsen. Hvis det er nødvendigt, vil denne optimering sikre tilstrækkelig celletæthed i løbet af mesoderm induktion fase og forhindre dannelse af celle aggregater eller meget store klumper, der potentielt kunne kompromittere kvaliteten af mesoderm, mellemliggende mesoderm, eller podocyte fænotype (Figur 3). Det er også vigtigt at bemærke, at forskelle i producentens specifikationer for visse reagenser såsom CHIR99021 kan påvirke kvaliteten af differentierede celler. Det er således tilrådeligt at teste reagenser fra forskellige lotnumre eller leverandører og leverandører for deres biologiske aktivitet og konsistens mellem uafhængige eksperimenter. Det er også vigtigt at undgå overdreven eksponering af hiPS-celler for dissociationenzymer, da dette kan føre til uønsket løsrivelse fra klæbematrixen og muligt tab af celler under medium aspiration. Et andet vigtigt skridt værd at bemærke er at sikre, at podocyte induktion medium er beskyttet mod lys for at forhindre foto-induceret inaktivering af retinosyre.
I forhold til tidligere metoder til differentiering af menneskelige nyre podocytter anvender den metode, der er beskrevet her, kemisk definerede faktorer (herunder små molekyler, vækstfaktorer og specifikke isoformer af kældermembranproteiner ved ønskede koncentrationer) efter behov for at regulere specifikke cellesignaleringsveje involveret i nyreudvikling og podocytfunktion. Specifikt involverede generering af mesodermceller fra hiPS-celler aktiveringen af den kanoniske Wnt-signalvej, der blev udført ved hjælp af det lille molekyle CHIR9902119. Den kanoniske Wnt-signalvej er kendt for at regulere transskriptionens aktivitet af gener, der er involveret i vævsudvikling og mønstre in vivo, samt cellespredning og migration20,21. Det celle induktionsmedium, der bruges i denne protokol, muliggør afledning af podocytter fra iPS-celleafledte mellemliggende mesodermceller. Dette podocyte induktionsmedium består af Activin A, BMP7, VEGF, retinsyre og CHIR99021. Dette podocytinduktionsmedium kræver navnlig ikke udefinerede serumkomponenter som f.eks. føtalt kvægserum, som kan tilsløre bidragene fra specifikke faktorer og begrænse anvendelsen af andre celledifferentieringsmetoder til mekanistiske undersøgelser af vævsudvikling og -sygdom, hvilket adskiller sig fra dem, der er anvendt i tidligere forsøg på at generere nyrecelletyper22. Derudover blev det bemærket, at FGF2 og FGF9 ikke er nødvendige for differentiering af nyre podocytter fra hiPS-cellerne6,7,22. Mens tidligere metoder afhængig af dannelsen af flercellede aggregater såsom embryonale organer og organoider, den metode, der er beskrevet her producerer celler, der udviser en moden fænotype, både morfologisk og ved udtryk for afstamning specifikke markører, herunder nefros og podocin, og nedregulering af stamcelle markører såsom PAX2. Det forventes, at kendskabet til de kemiske komponenter, der anvendes i denne protokol kan lette mekanistiske undersøgelser af human nyrevæv udvikling, podocyte afstamning specifikation, og sygdom patogenese i fremtiden.
Denne metode til hiPS celledifferentiering muliggør også generering af modne, postmitotiske og funktionelle podocytter med mere end 90% effektivitet uden subpopulation udvælgelse, genetiske manipulationer, eller xenotransplantation. Dette adskiller sig især fra tidligere forsøg, hvor høje niveauer af cellulær heterogenitet6,7,23 begrænsede brugen af stamcelledifferentieringsmetoderne til translationelle lægemidler. Denne metode udgør også et betydeligt fremskridt for området i betragtning af de udfordringer, der er forbundet med den ekstremt begrænsede tilgængelighed af menneskelige nyre podocytter fra andre kilder såsom primære væv eller organoider. Nogle af udfordringerne omfatter lav afledningseffektivitet på mindre end 1 %, når der bruges metoder , der er afhængige af dannelse af embryonale organer eller organoider6,7.
En begrænsning af denne protokol er de relativt høje omkostninger ved de reagenser, der er nødvendige for stamcellekulturen og differentieringstrinene, hvilket kan hindre dens gennemførelse i nogle laboratorier eller forskningsgrupper. Også, fordi en masse optimering for flere faktorer i cellens mikromiljø (dvs. både opløselige og uopløselige eller klæbende signaler) var involveret, anbefaler vi, at protokollen følges som beskrevet. En almindelig fejl bemærket fra andre, der var interesseret i at bruge denne podocyte differentiering metode omfattede brugen af uhensigtsmæssige celle vedhæftning matricer såsom BM matrix 1 eller andre dårligt definerede animalske proteiner. Når protokollen er fulgt som beskrevet, yderligere eksperimenter kan udføres for at undersøge effekten af andre ændringer af protokollen. På grund af de iboende forskelle mellem forskellige menneskelige stamcellelinjer er det desuden værd at bemærke, at visse aspekter af differentieringsmetoden, f.eks. tidspunktet for eksponering for differentieringsmedium eller celle dissociationsmedium og cellesåningstætheder, muligvis skal optimeres. Disse betingelser blev dog ikke ændret for de hiPS-cellelinjer og embryonale stamcellelinjer, der hidtil er blevet testet. Denne podocyte differentiering metode virker på tværs af flere hiPS cellelinjer, herunder PGP1, IMR-90-1, og IISH3i-CB6 samt H9 embryonale stamcelle linje8,11. I denne rapport viser vi også en vellykket differentiering af DU11 hiPS-cellelinjen ved hjælp af den samme protokol (figur 1 og figur 2). I betragtning af sammenhængen i denne metode på tværs af forskellige cellelinjer, herunder resultater fra ikke-offentliggjort arbejde fra andre uafhængige forskningslaboratorier (før offentliggørelsen), forventer vi således, at denne differentieringsprotokol vil være nyttig til afledning af nyrekapocytter fra en lang række hiPS-cellelinjer og derfor ikke begrænset til den, der anvendes i denne protokol.
I betragtning af hiPS-cellernes evne til selvfornytende på ubestemt tid kan denne differentieringsmetode bruges til at give forskerne en let tilgængelig kilde til menneskelige nyrekapocytter. Dette kan bidrage til at fremme den nuværende forståelse af human nyrebiologi og sygdom24 samt muliggøre udviklingen af nye in vitro nyresystemer til modellering af menneskers nyrefunktion og reaktioner på terapi. For eksempel blev den protokol, der er beskrevet heri, for nylig ansat og integreret med et mikrofluidisk organ-on-a-chip-system for at udvikle en funktionel in vitro-model af den menneskelige nyreglomerulære kapillærvæg. Denne glomerulære chip filtrerede selektivt cirkulerende molekyler og rekapitulerede lægemiddelinducerede nefrotoksicitet, når de blev udsat for kemoterapimidlet Adriamycin8. I fremtiden kan disse resultater potentielt integreres med 3D bioprinting teknologier til at konstruere mere komplekse in vitro modeller af den menneskelige nyre. Sådanne fremskridt kunne give nye platforme til evaluering af lægemiddelkandidater, især dem, der er rettet mod de former for nyresygdomme, der opstår som følge af dysfunktion af glomerulære podocytter. Dette er især vigtigt, da de artsspecifikke forskelle i dyremodeller og manglende organniveaufunktionaliteter, der typisk observeres i standardvævskulturmetoder, kan hæmme udviklingen af målrettede terapier for forskellige former for menneskelige nyresygdomme25. Således kan denne protokol, nogle dage, give mulighed for at optrævle signalvejene involveret i udviklingen af den menneskelige nyre, samt sygdomspatogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S.M. er en forfatter på et patent verserende for metoder til generering af nyre podocytter fra pluripotente stamceller (amerikanske patentansøgning 14/950859). De resterende forfattere erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Pratt School of Engineering på Duke University, Division of Nephrology på Duke Medical School, A Chair's Research Award fra Institut for Medicin på Duke University, og en Burroughs Wellcome Fund PDEP Career Transition Ad Hoc Award til S.M.. M.B blev støttet af National Science Foundation's Graduate Research Fellowship Program. Vi takker Bursac Lab for generøst at give os DU11 stamcelle linje, og Varghese Lab på Duke University for midlertidigt at dele deres væv kultur facilitet med vores gruppe. Denne publikation er dedikeret til Prof. Laura L. Kiessling, Novartis professor i kemi ved Massachusetts Institute of Technology, i anledning af hendes 60års fødselsdag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal. | ||
| Growth Factors and Media Supplements | |||
| All-trans retinoic acid (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| B27 serum-free supplement | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | May show lot-to-lot variation |
| Complete Medium Kit with CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Cell Systems | Podocyte maintenance media |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 with glutamine supplement |
| Heat-inactivated FBS | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| Human activin A | PHC9564 | Thermo/Life Technologies | |
| Human BMP7 | PHC9544 | Thermo/Life Technologies | |
| Human VEGF | PHC9394 | Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 medium | 05850 | Stem Cell Technologies | hiPS cell culture media (CCM) |
| Penicillin–streptomycin, liquid (100×) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 ROCK inhibitor | 1254 | Tocris | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T) | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R&D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | N-892012 | Iwai North America | Basement membrane (BM) matrix 2 |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | 354277 | BD Biosciences | Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation |
| Enzymes and Other Reagents | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Cell detachment solution |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood |
| Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | 97065-058 | VWR | Ethanol is flammable and toxic |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyde (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Sterile Distilled Water | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Aspirating pipettes, individually wrapped | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R Centrifuge | B99516 | Beckman Coulter | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | 352097 | Corning | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryoboxes | 3395465 | Thermo/Life Technologies | For storing frozen aliquots |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives |
| Hemocytometer | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | 51030403 | Thermo/Life Technologies | For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives |
| Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | Carl Zeiss Microscopy | Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation |
| Kimberly-Clark nitrile gloves | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, large | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, small | 21905-026 | VWR | |
| P10 precision barrier pipette tips | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 barrier pipette tips | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 barrier pipette tips | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 barrier pipette tips | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 barrier pipette tips | P1122 | Denville Scientific | |
| Serological pipette, 10 mL, individually wrapped | 356551 | Corning | |
| Serological pipette, 25 mL, individually wrapped | 356525 | Corning | |
| Serological pipette, 5 mL, individually wrapped | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0.22 μm, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes | 1138W14 | Thomas Scientific | For aliquoting growth factors |
| Tissue culture–treated 12-well plates | 353043 | Corning | |
| Tissue culture–treated six-well plates | 353046 | Corning | |
| VWR white techuni lab coat | 10141-342 | VWR | |
| Wide-beveled cell lifter | 3008 | Corning |
References
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, 1145 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526, 564-568 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33, 1193-1200 (2015).
- Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13, 1662-1685 (2018).
- Pozzi, A., et al. Beta1 integrin expression by podocytes is required to maintain glomerular structural integrity. Developmental Biology. 316, 288-301 (2008).
- Kanasaki, K., et al. Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus. Developmental Biology. 313, 584-593 (2008).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).
- Torban, E., et al. PAX2 Activates WNT4 Expression during Mammalian Kidney Development. Journal of Biological Chemistry. 281, 12705-12712 (2006).
- Reiser, J., Sever, S. Podocyte biology and pathogenesis of kidney disease. Annual Review of Medicine. 64, 357-366 (2013).
- Kuusniemi, A. M., et al. Tissue Expression of Nephrin in Human and Pig. Pediatric Research. 55, 774-781 (2004).
- Guo, J. K., et al. WT1 is a key regulator of podocyte function: reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis. Human Molecular Genetics. 11, 651-659 (2002).
- Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. American Journal of Pathology. 160, 131-139 (2002).
- Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825 (2017).
- Satoh, D., et al. aPKCλ maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. The Journal of Biochemistry. 156, 115-128 (2014).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
- Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
- Clevers, H., Nusse, R. Wntβ-Catenin Signaling and Disease. Cell. 149, 1192-1205 (2012).
- Ciampi, O., et al. Generation of functional podocytes from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 17, 130-139 (2016).
- Fuente Mora, C., et al. Differentiation of Podocyte and Proximal Tubule-Like Cells from a Mouse Kidney-Derived Stem Cell Line. Stem Cells and Development. 21, 296-307 (2011).
- Chuah, J. K. C., Zink, D. Stem cell-derived kidney cells and organoids: Recent breakthroughs and emerging applications. Biotechnology Advances. 35, 150-167 (2017).
- Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).
