Summary
ここで提示されるのは、高効率(>90%)を有する誘導多能性幹細胞からのヒト腎臓ポドサイトの誘導のための化学的に定義されたプロトコルであり、遺伝子操作または亜集団選択とは無関係である。このプロトコルは、26日以内に望ましい細胞タイプを生成し、腎毒性試験および疾患モデリングに有用であり得る。
Abstract
腎臓病は世界人口の10%以上に影響を及ぼし、連邦支出に数十億ドルの費用がかかります。腎臓病の最も重篤な形態および最終的な末期腎不全は、しばしば、内皮細胞および糸球体地下膜と一緒に機能する高度に特殊化された上皮細胞である糸球体ポドサイトの損傷によって引き起こされ、腎臓の濾過障壁を形成する。腎医学の進歩は、一次組織の利用が限られており、ポドサイトなどの機能性ヒト腎臓細胞の誘導のための堅牢な方法の欠如によって妨げられてきた。幹細胞などの再生可能な供給源からポドサイトを導き出す能力は、ヒト腎臓の発達と病気のメカニズムに関する現在の理解を進めるだけでなく、治療的発見のための新しいツールを提供するのに役立つ可能性があります。このプロトコルの目的は、高効率かつ特異性のヒト誘導多能性幹細胞(hiPS)細胞から、化学的に定義された条件下で成熟した、後の有糸球体を導き出す方法を開発することであった。この方法で生成されたhiPS細胞由来ポドサイトは、系統特異的マーカー(ネフリン、ポドシン、ウィルム腫瘍1を含む)を発現し、成熟した機能的ポドサイトに関連する特殊な形態学的特徴(一次および二次足プロセスを含む)を示す。興味深いことに、これらの特殊な特徴は、この分野で広く使用されている不死化ポドサイト細胞株には特に存在せず、本明細書に記載されているプロトコルは、ヒト腎臓生物学を研究するために典型的に使用される既存のポドサイト細胞株よりも発達的により成熟した表現型を有するヒト腎臓ポドサイトを産生することを示唆している。
Introduction
ヒト多能性幹細胞培養の進歩は、再生医療、疾患モデリング、および薬物スクリーニングに革命をもたらす準備ができているので、研究者は、人体内のほぼすべての細胞型を得るように設計することができる再生可能でスケーラブルな生物学的材料の供給源を提供する1。この方法は、他の方法では入手が困難な特殊な機能型のセル型を派生する場合に特に役立ちます。ヒト人工多能性幹細胞(hiPS)細胞2、3、4、5は、体細胞起源と個別化医療の可能性から特に魅力的です。しかし、hiPS細胞から他の細胞系統を導き出す方法の開発は、不十分に定義された培養条件を頻繁に使用し、不十分な培養条件を使用し、6,7の異種細胞集団の低効率および非特異的生成を招くため、依然として困難である。
ここで提示される、化学的に定義された条件下で特異性および高効率のhiPS細胞からの成熟した腎臓ポドサイトの導出のための方法である。細胞微小環境内での複数因子の役割を考慮することにより、細胞培養培地に示される可溶性因子の最適化や、細胞外マトリックス成分や接着基材などの不溶性因子の最適化を含む幹細胞分化戦略が開発されました。ポドサイトの発達と機能におけるインテグリンシグナル伝達の重要性を考えると、細胞表面上のインテグリン受容体の発現を最初に検討した。β1インテグリンはhiPS細胞のみならず、中皮細胞及び中間中皮細胞8、9、10を含む誘導体においても高発現した。その後の実験では、β1インテグリン(ラミニン511またはラミニン511-E8フラグメントを含む)に結合するリガンドが、以下に記載の可溶性誘導体と組み合わせて使用した場合に、hiPS細胞のポドサイトへの接着および分化を支持することが確認された。
細胞系統の誘導は、アクチビンA、CHIR99021、およびY27632ロック阻害剤を含む培地の存在下で2日間ラミニンコーティングされた表面上で培養されたhiPS細胞が、初期のメソダームマーカーHAND1、グースコイド、および小頭体8,11を発現する細胞に分化できることを最初に確認することによって開始された。骨形態形成タンパク質7(BMP-7)およびCHIR99021を添加した培地を用いた14日間の中皮細胞の治療は、ニーフロン前駆細胞マーカーウィルム腫瘍1(WT1)を発現する中間中足細胞の誘導を可能にし、奇数スキップ関連タンパク質1(OSR1)8、11、およびペア化したタンパク質22(PAX)を用いた。成熟した腎臓糸球体の細胞を導出するために、中間中期細胞をBMP-7、アクチビンA、血管内皮増殖因子(VEGF)、全トランスレチノイン酸、およびCHIR99021からなる新規培地で4〜5日間処理した。フローサイトメトリーおよび免疫染色は、得られた細胞の90%> が成熟した腎臓ポドサイト8、11、13の分子、形態学的、および機能的特徴を示すことを確認するために使用した。これらの特性には、一次および二次的な足のプロセスの開発が含まれます。SYNPO、PODXL、MAF、EFNB28を含むポドサイト系統特異的遺伝子の発現と、ポドシン、ネフリン、およびWT114、15、16を含むタンパク質の発現。さらに、hiPS細胞由来ポドサイトは、下流実験のタイミングにさらなる柔軟性を提供する市販の培地8、11を用いることによって、最大4週間の培養液中で維持できることが分かった。hiPS-podocytesの純度を決定するために使用されるフローサイトメトリーパネルの詳細については、当社の前の出版物11を参照してください。
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Protocol
1. 試薬の調製
- HiPS細胞培養基底培地で解凍した5x hiPS細胞培養培地(CCM)サプリメントを希釈し、hiPS CCMの1x溶液を得た。
注:冷凍5x hiPS CCMサプリメントは、理想的には一晩4°Cで、ゆっくりと解凍プロセスを必要とします。1x hiPS CCMのアリコートは-20°Cで6ヶ月まで保存することができます。 - hiPS細胞培養用基膜(BM)マトリックス1コーティングプレートの調製:4°Cで氷上でBMマトリックス1を一晩解凍する。解凍したら、メーカーが提案した適切な希釈因子を持つアリコートを準備します。
注:通常、アリコートは、50 mL円錐管内の冷たいDMEM/F12の25 mLで、BMマトリックス1を完全に溶解し、残留結晶の形成を避けるために完全に混合して、その後の希釈のために準備されます。 - BMマトリックス1溶液の1mLを6ウェルプレートのウェルに移し、37°Cで1〜2時間、または4°Cで最低24時間インキュベートし、パラフィンフィルムで包みます。BMマトリックス1-被覆されたプレートは、4°Cで最大2週間保存することができます。
- 基質膜(BM)マトリックス2の調製-コーティングされた版:9 mLの無菌蒸留水のBMマトリックス2の適切な量を希釈して5μg/mLの最終濃度を作製する。BMマトリックス2溶液700μLを12ウェルプレートのウェルに加え、室温でプレートを2時間または4°Cで一晩インキュベートします。
- BMP7、アクティビンA、VEGFの各100 μg/mLストック溶液を次のように準備します:0.1%(wt/vol)BSAを含む無菌蒸留水でBMP7を再構成し、アクチビンAとVEGFを0.1%(wt/vol)BSAを含む無菌PBSで別々に再構成します。頻繁な凍結融解サイクルを避けるために、各ストック溶液から100 μLのアリコートを準備し、-20°Cで最大6ヶ月間保管します。
- 3.079 mLの無菌蒸留水に10mgのY27632を溶解して、Y27632の10mMストック溶液を調製します。アリコート100 μLは、在庫から-20°Cで6ヶ月間保管します。
- 滅菌DMSOの143.4 μLにCHIR99021の2mgを溶解し、30mMストック溶液を調製します。5 μLのアリコートを準備し、-20°Cで最大1ヶ月間保管してください(またはメーカーの推奨に従ってください)。
- 3.33 mL滅菌DMSOでオールトランス レチノイン酸の10mgを溶解する。500 μL アリコートを準備し、-20 °Cで6ヶ月間保管します。
2. 文化メディアの作成
- グルタミンサプリメントを含むDMEM/12の適切な容積で、対応するストック溶液を最終濃度100 ng/mL ActR99021、10 μM Y27632、および1x B27無血清サプリメントに再構成して中皮分化培地を調製します。
注:中皮分化培地は、分化ステップの前に、実験の規模に適したボリュームで新たに調製する必要があります(通常、50 mLの培地は2つの12ウェルプレートに適しています)。 - グルタミンサプリメントを用いて、DMEM/F12の最終濃度100 ng/mL BMP7、3 μM CHIR99021、および1x B27のB27血清フリーサプリメントに対応するストック溶液を再構成することにより、中間中皮分化培地を調製します。
注:必要に応じて、培地は1%(vol/vol)ペニシリンストレプトマイシンで補うことができます。グルタミンサプリメントで DMEM/F12 を使用して、媒体の量を調整します。.この媒体は大きいバッチで準備することができる。しかし、凍結融解サイクルを繰り返さないように、小さなアリコート(例えば、50 mL円錐管で45 mL)に保存することをお勧めします。この培地は-20°Cで3ヶ月間保存でき、使用前に一晩4°Cで解凍することができます。 - 最終濃度100 ng/mL BMP7、100 ng/mLアクチビンA、50 ng/mL VEGF、3 μM CHIR99021、1x B27血清無血清サプリメント、および0.1 μM全トランスレチノイン酸をDMEM/F12型食品で補間して再コンセプトして、ポドサイト誘導培地を調製します。媒体を光から守る(例えば、ホイル紙で容器を包むことで)。
注:この培地は、大きなバッチで調製し、3ヶ月まで-20°Cで暗闇の中に保存することができます。冷凍アリコートは、使用前に4°Cで一晩解凍する必要があります。 - DMEM/F12に10%(vol/vol)熱不活化FBSを加え、滅菌条件下でフィルターを加えて25 mLのトリプシン中和溶液を調製します。
- 幹細胞由来ポドサイトの分化後のメンテナンスのために、製造者のガイドラインに従って基礎培地にサプリメントを添加してポドサイト維持培地でコンプリート培地を準備し、4°Cで最大2週間保存します。
3. ハイプス細胞培養培地を用いたフィーダーフリーHiPS細胞培養
- BMマトリックス1の残留溶液をプレコートされたプレートから吸引し、1〜2mLの加温DMEM/F12でウェルを3回洗浄した。
- 吸引はhiPS細胞からhiPS CCMを使用し、温められたDMEM/F12で細胞を3回すすいでください。1 mLの温細胞剥離液を加え、37°Cで1分間インキュベートして細胞の解離を助けます。組織培養顕微鏡で細胞を目視検査し、細胞コロニーの縁部が丸みを帯びているように見えるようにし、細胞外着液を細胞から素早く吸引する(細胞コロニーがプレートに付着していることを確認する( ゆるやかに見えるが、細胞コロニーがプレートに付着していることを確認する)。DMEM/F12で細胞を1回緩やかにすすいで、細胞剥離液を除去します。
- 3 mLのhiPS CCMを、細胞剥離液で処理したhiPS細胞(6ウェルプレートの各ウェル)に加えます。セルリフターを使用してコロニーを擦り、ピペット細胞懸濁液を上下に静かにして緩やかに接着した細胞を取り除きます。プレートを十分に洗い、すべての細胞が収穫されるようにします。
注:細胞に余分なせん断を避けるために5 mLピペットの使用をお勧めします。 - 1ウェルあたり2 mLのhiPS CCMを含む新しいBMマトリックス1コーティング6ウェルプレートの各ウェルに、細胞懸濁液の0.5 mLを移します。ウェル内の細胞コロニーを分配し、5%CO2インキュベーターで37 °Cでインキュベートするために、図8の方法でプレートを移動します。細胞が分化実験に通過または使用される準備ができるまで、毎日培地をリフレッシュします(約70%の合流率)。
注:iPSCのルーチンパスエージングのための理想的なコロニーサイズはhiPS CCM(ROCK阻害剤なし)を使用してフィーダーフリー条件下で200-500 μmの間です。解離酵素またはバッファーを使用した処理中に細胞を個別化した場合、hiPS CCMをROCK阻害剤(例えば、10 μM Y27632)で補い、細胞の生存率を向上させることができます。
4. 中皮細胞へのhiPS細胞の分化(0-2日目)
- HiPS細胞培養は指数成長段階にあるが(通過後約4日以内、約70%の合流率)、コロニーの縁の内側および周囲に自発的に分化した細胞の存在を視覚的に検査する。必要に応じて、分化の無菌的に擦り落ち領域。
- hiPS細胞からHIPS CCMを吸引し、温かいDMEM/F12で細胞を3回すすます。37°Cで10分間酵素フリー細胞解離バッファーを1 mLで培養し、顕微鏡下で解離を確認します。異なるhiPS細胞株間の固有の違いのために、細胞解離バッファーの実際のインキュベーション時間は、所定の細胞株について決定されなければならない。
- セルリフターでウェルを静かにこすり取り、ゆるやかに接着した細胞を取り除き、細胞懸濁液を15 mL円錐形チューブに移し、続いて数回上下にピペットを作ってHiPS細胞を個体化します。
- セル懸濁液を、温かいDMEM/F12で15mLの体積に、遠心分離機を室温で290 x g で5分間持ちます。
- 優しく上清を吸引し、残存BMマトリックス1および解離緩衝成分を除去するために遠心分離の別のラウンドのために暖かいDMEM / F12で細胞を再懸濁します。
- 上清を吸引し、上述のように中皮誘導培地の1mLで細胞を再懸濁する。1 x 105 細胞/mLの濃度を達成するために必要な中皮分化培地の適切な体積を決定するために、ヘモサイトメーターまたはコールターカウンターを使用して細胞の総数を数えます。
- BMマトリックス2コーティングプレートからのECM溶液を吸引し、温かいDMEM/F12でプレートを2回リンスします。数回ピペットを使用して、hiPS細胞の懸濁液を軽く混ぜます。セル懸濁液1mLをBMマトリックス2コーティング12ウェルプレートのウェルそれぞれに移し、プレートを穏やかに振って細胞をより均等に分配します。
- プレートを37°Cで5%CO2インキュベーターでインキュベートします。翌日中皮誘導培地をリフレッシュします。
注:2日後、hiPS細胞由来の中皮細胞は中間中皮誘導の準備が整いました。
5. 中間中半分へのhiPS細胞由来中皮細胞の分化(2-16日目)
- 分化プロトコルの2日目には、中皮誘導媒体を吸引し、1 mL当たり1mLの中間中期中期誘導媒体で補充する。
- 代謝活性細胞の成長因子と小分子の正確な閾値を維持するために、毎日培地をリフレッシュします。実質的な細胞増殖およびメディア栄養素の急速な枯渇(メディアの黄変によって示される)がある場合、中間中皮分化培地の体積は、12ウェルプレートのウェル当たり1.3mLに増加させることができる。
- 培養細胞は、中間中皮細胞を得るためにさらに14日間を行った。16日目までに、これらの細胞は後で使用するために凍結保存することができる。
6. hiPS細胞由来中間中中軟体細胞のポドサイトへの分化(16日~21日目)
- 中間中皮細胞を温かいDMEM/F12でリンスし、37°Cで3分間0.05%トリプシン-EDTAのウェル当たり0.5 mLで細胞をインキュベートします。細胞の解教が始まっていることを確認するために目視検査を行います。
- 細胞リフターを使用して細胞をスクレープし、1,000 μLピペットチップを使用して細胞懸濁液を数回使用して、個別化された(または小さな塊の)細胞を得る。
注: この段階では、集約されたセルがプロトコルのタイムライン内で末端に分化された表現型を取得できない可能性があるため、セルが完全に解約されていることを確認してください。 - トリプシン中和溶液のウェルあたり約2 mLを加えてトリプシンの活性を停止する。
- 細胞を50 mL円錐形チューブに移し、DMEM/F12を使用して体積を最大50 mLにし、室温で201 x g で5分間細胞懸濁液を遠心分離します。
- 上清を吸引し、ポドサイト誘導培地中の細胞を再懸濁する。最適な結果を得るには、12ウェルプレートの約100,000個の細胞/ウェルの最終播種密度を確保してください。セル懸濁液をBMマトリックス2コーティングプレートに加え、プレートを穏やかに振って細胞をより均等に分配します。
- 細胞を37°Cおよび5%CO2でインキュベートし、培地を毎日5日間までリフレッシュし、21日目までにポドサイトを得た。
注:得られたhiPS細胞由来ポドサイトは、ポドサイト維持培地を含む完全な培地を使用することにより、培養で2〜4週間維持することができます。一度ポドサイト維持培地に入ると、細胞は1日おきに供給することができ、その後の研究や下流の分析に使用することができます。
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Representative Results
このプロトコルの目的は、成熟したヒトポドサイトが化学的に定義された条件下でhiPS細胞から誘導できることを実証することであった。この原稿に記載されたデータは、DU11 hiPS細胞株17を用いて生成され、最初に試験され、マイコプラズマが含まれなかったことが判明した。染色体分析も行われ、細胞はカルヨタイプ正常であることが判明した。未分化DU11 hiPS細胞から、この報告書に概説されている分化戦略(図1)を用いて、まず、小子状(T)を発現する中皮細胞(図1Bおよび図2B)に幹細胞を分化し、続いてPAX2陽性の中間中間メソダーム細胞(図2C)に分化し、最終的に成熟した腎細胞に分化した。 図 2D、図 3D、図4)。分化プロトコルの2日目までにメソダーム細胞を得て、中間中皮細胞を16日目までに生成し、そして成熟したポドサイトを分化プロトコルの21日目までに得た。得られたポドサイトは、この実験で使用したラミニンコーティングされたプレートのような平らな組織培養表面に接着した場合、約150〜200μmの大きさであった。hiPS細胞由来ポドサイトは、位相対視法(図1)、免疫蛍光顕微鏡(図4)、走査型電子顕微鏡8、11を含む複数の相補的手法を用いて可視化された多数の足のプロセス状の拡張を示す。幹細胞由来ポドサイトもWT1115(図2D)と系統識別マーカーネフリン14(図4)に対して陽性に染色された。興味深いことに、ニーフリンの細胞内局在化は、主にポドサイトの足のプロセスおよび細胞細胞質において、成熟したポドサイト表現型と一致した(図2Dおよび図4A、B)。開発中およびポドサイト生理学において、タンパク質ネフリンは細胞核と細胞質の間で往復されるが、細胞質および足の過程において、主に細胞質および足の過程で、ピドサイトが成熟して機能的表現型18を獲得する。したがって、本明細書に記載の分化プロトコルを用いて作製されたポドサイトが細胞質および足状構造におけるネフリンを主に発現させることによって生成される観察は、より成熟した又は特殊なポドサイトの生成に対するこのプロトコルの有用性を強調する。hiPS細胞由来ポドサイトの走査型電子顕微鏡写真は、我々のグループ8,11で以前に報告されたhiPS細胞由来ポドサイトにおける一次および二次足プロセスの分岐を強調する。WT1は腎臓ポドサイトの決定的なマーカーではないので、ポドシンやネフリンなどのポドサイト特異的マーカーの同時発現のために細胞を特徴付けることを強くお勧めします。以前に、この方法を用いて得られた末端分化されたポドサイトがポドシン、ネフリン、およびWT1に対する免疫染色剤陽性であり、前駆細胞マーカーPAX28,11の発現量が相当に低下することを示した。これらの結果は、このプロトコルを用いて導き出されたポドサイトが、機能的なヒト腎臓糸球体ポドサイトに必要な発達的に成熟しているか、または特殊化されていることを示す。
分化法の最適化条件では、中間中皮細胞が不十分に解震された場合が観察された。12ウェルプレート(最終的なポドサイト誘導ステップの前)の推奨密度を大幅に超えた密度で播種した細胞は、プロトコルの標準的なタイムライン内で成熟したポドサイトの予想される形態表現型を欠いた細胞の大きなクラスターをもたらした(図3A,B)。これらの理由から、特定の下流アプリケーションに必要な他の条件を試す前に、このプロトコルで推奨されているシード密度 (図 3C,D)を使用することをお勧めします。これらの結果は、上記の化学的に定義された培地を用いて3週間以内に、hiPS細胞の腎臓糸球体ポドサイトへの誘導分化を表す。
図1:高細胞からポドサイトへの分化
(A)hiPS細胞をポドサイトに誘導分化する方法の概略図BMP7, 骨形態形成タンパク質 7;RA、 レチノイン酸;VEGFは、血管内皮増殖因子である。この図は ref.11から変更されています。(B)分化の各段階におけるhiPS細胞の代表的な画像。左から右に、画像は、0日目に分化のための解離前の特徴的なヒトiPS細胞コロニーを示し、その後、2日間分化した後に中皮細胞、次いで約10日間の分化で中間中皮細胞、そして最後に22日目に終末分化したポドサイトを示す。スケールバー、すべての画像(パネルB内)に対して100 μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:分化タイムライン中の系統特異的マーカーおよび核逆染色の発現を示すhiPS細胞及びそれらの分化誘導体の免疫蛍光画像。
(A) 多能性マーカー10月4日を発現するヒトiPS細胞(B) 小線を発現する中皮細胞 (T);(C) PAX2を発現する中間中皮細胞;(D)線系識別マーカーを発現するhiPS細胞由来ポドサイト、ネフリン、および関連マーカーWT1を示す。スケールバー、すべての画像のための100 μm。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:DU11 hiPS細胞株由来の中間中皮細胞の分化ポテンシャルに及ぼす最適でない播種密度の影響
(A)細胞の初期播種密度が高すぎると(12ウェルプレートの約50万個の細胞/ウェル)、細胞はポドサイト誘導段階で密な凝集体(B)を形成する。(C)推奨シード密度(12ウェルプレートの100,000細胞/ウェル)を防ぎ、ポドサイト分化段階(インセット)中の足のプロセス状構造の拡張(D)を顕微鏡的に観察する。スケールバー、A-D用200 μm;D.の差し込み用100μmは、この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:hiPS細胞由来ポドサイトは、形態学的に成熟した表現型を インビトロで示す。
(A)ネフリンに対するhiPS細胞由来ポドサイトの免疫染色、および(B)これらの特殊な細胞構造におけるネフリンの発現と同様に、一次および二次的なプロセス(白矢印)を示すポドサイト足のプロセスの高い拡大画像。スケールバー、100 μm(A);50 μm(B)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本報告では、hiPS細胞からの腎臓糸球体ポドサイトの生成プロトコルについて述べている。hiPS細胞由来ポドサイトは、成熟した腎臓ポドサイト表現型13に関連する形態学的および分子的特徴を示す。これまでの刊行物では、hiPS細胞由来ポドサイトが、透過性マイクロ流体臓器オンチップ装置8,11で糸球体微小血管内皮細胞と共培養した場合に腎臓糸球体の構造および選択的濾過機能を模倣できることを示した。
このプロトコルの適応に関心のある研究者は、次の重要なステップを考慮する必要があります。まず、中皮細胞の誘導のためのラミニンコーティングプレートへのhiPS細胞の播種が重要なステップです。100,000個の細胞/ウェルの播種密度が推奨されますが、研究者は研究に使用される幹細胞ラインの複製速度に応じて、初期細胞播種密度を調整することができます。必要に応じて、この最適化により、メソダーム誘導段階で十分な細胞密度が確保され、メソダーム、中間メソダーム、またはポドサイト表現型の品質を損なう可能性のある細胞凝集体または非常に大きな塊の形成を防ぐことができます(図3)。また、CHIR99021などの一部の試薬のメーカー仕様の違いが、分化した細胞の品質に影響を与える可能性があることにも注意してください。したがって、独立した実験間の生物学的活性と一貫性について、異なるロット番号またはサプライヤーおよびベンダーの試薬をテストすることをお勧めします。また、解離酵素へのhiPS細胞の過度の暴露は、粘着マトリックスからの望ましくない剥離および中程度の吸引中の細胞の損失につながる可能性があるため、重要です。注目すべきもう一つの重要なステップは、ポドサイト誘導媒体が光から保護され、レチノイン酸の光誘導不活性化を防ぐことです。
ヒト腎臓ポドサイトの分化に関する以前の方法と比較して、ここで説明する方法は、腎臓の発達およびポドサイト機能に関与する特定の細胞シグナル伝達経路を調節するために必要な場合に、化学的に定義された因子(低分子、成長因子、および基基膜タンパク質の特異的同種、所望の濃度を含む)を採用する。具体的には、hiPS細胞からの中皮細胞の生成は、CHIR9902119の小分子を用いて影響を及ぼす正規Wntシグナル伝達経路の活性化を伴った。この正規Wntシグナル伝達経路は、生体内での組織の発達およびパターニングに関与する遺伝子の転写活性を調節するとともに、細胞増殖および移行20,21を調節することが知られている。このプロトコルで使用される細胞誘導媒体は、iPS細胞由来の中間中中質中質細胞からのポドサイトの誘導を可能にする。このポドサイト誘導培地は、アクチビンA、BMP7、VEGF、レチノイン酸、およびCHIR99021から構成される。特に、このポドサイト誘導培地は、胎児ウシ血清などの未定義の血清成分を必要とせず、特定の因子の寄与をあいまいにし、組織発達および疾患の機械学的研究のための他の細胞分化方法の適用を制限することができ、腎細胞タイプ22を生成する以前の試みで採用されたものとは異なる。さらに、HiPS細胞6,7,22からの腎臓ポドサイトの分化にはFGF2及びFGF9が必要とされないことが観察された。胚体やオルガノイドなどの多細胞集合体の形成に依存する以前の方法では、ここで説明した方法は、形態学的およびネフリンおよびポドシンを含む系統特異的マーカーの発現、およびPAX2などの前駆細胞マーカーのダウンレギュレーションによって、成熟表現型を示す細胞を産生する。このプロトコルで用いられる化学成分の知識は、ヒトの腎臓組織の発達、ポドサイト系統の仕様、および疾患病態の将来の病態の機械化研究を促進することが期待される。
hiPS細胞分化のためのこの方法はまた、サブ集団選択、遺伝子操作、または異種移植なしで、90%以上の効率を有する成熟した、後味および機能的なポドサイトの生成を可能にする。これは、高レベルの細胞異質性6、7、23が翻訳医療用途のための幹細胞分化方法の使用を制限した以前の試みとは著しく異なる。この方法はまた、一次組織またはオルガノイドなどの他の供給源からのヒト腎臓ポドサイトの非常に限られた入手可能性に関連する課題を考えると、分野にとって大きな進歩を提示する。いくつかの課題は、胚体またはオルガノイド6、7の形成に依存する方法を使用する場合、1%未満の低導出効率を含む。
このプロトコルの1つの制限は、幹細胞培養と分化ステップに必要な試薬の比較的高いコストであり、一部の研究室や研究グループでの実施を妨げる可能性があります。また、細胞の微小環境における複数の因子(すなわち、可溶性および不溶性または粘着性の手がかり)に対する多くの最適化が関与したため、プロトコルが記載されているように従うことを推奨する。このポドサイト分化方法の使用に興味を持っていた他の人から指摘された一般的な間違いには、BMマトリックス1または他の不十分に定義された動物由来タンパク質などの不適切な細胞接着マトリックスの使用が含まれていました。プロトコルが記載された通りに従えば、プロトコルに対する他の変更の有効性を調べるために更なる実験を行うことができる。さらに、ヒト幹細胞株の違いが異なるので、分化方法のいくつかの側面、例えば、分化媒体または細胞解離媒体への曝露のタイミング、および細胞播種密度を最適化する必要があることは注目に値する。しかし、これらの条件は、これまでにテストされたhiPS細胞株および胚性幹細胞株について変更されなかった。このポドサイト分化法は、PGP1、IMR-90–1、IISH3i-CB6、ならびにH9胚性幹細胞株8,11を含む複数のhiPS細胞株にわたって作用する。このレポートでは、同じプロトコルを使用してDU11 hiPSセルラインの正常な分化を示しています(図1と図2)。したがって、他の独立した研究所(出版前)の未発表の研究結果を含む様々な細胞株間でこの方法の一貫性を考えると、この分化プロトコルは、多種多様なhiPS細胞株からの腎臓ポドサイトの誘導に有用であり、したがって、このプロトコルで使用されるものに限定されないことを期待する。
hiPS細胞が無期限に自己更新する能力を考えると、この分化方法は、研究者にヒト腎臓ポドサイトの容易に入手可能な供給源を提供するために使用することができる。これは、ヒト腎臓生物学と疾患24 の現在の理解を進めるだけでなく、ヒト腎臓機能と治療への応答をモデル化するための新しいインビトロ腎臓システムの開発を可能にする可能性がある。例えば、本明細書に記載されたプロトコルは、最近採用され、ヒト腎臓糸状毛細血管壁の機能的なインビトロモデルを開発するためにマイクロ流体臓器オンチップシステムと統合された。この糸球体チップは、化学療法薬Adriamycin8に曝露された場合に循環分子を選択的に濾過し、薬物誘発性腎毒性を再現した。将来的には、これらの結果は、人間の腎臓のより複雑なインビトロモデルを設計するために、3Dバイオプリンティング技術と統合される可能性があります。このような進歩は、薬物候補、特に糸球体ポドサイトの機能不全から生じる腎臓病の形態を標的とする薬物候補を評価するための新しいプラットフォームを提供することができる。これは、標準的な組織培養法で一般的に観察される動物モデルの種固有の差異および臓器レベルの機能性の欠如が、ヒト腎臓病の様々な形態に対する標的治療の開発を妨げる可能性がある25の形態として特に重要である。したがって、このプロトコルは、いつか、人間の腎臓の発達に関与するシグナル伝達経路および疾患の病因を解明する機会を提供する可能性がある。
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Disclosures
S.Mは、多能性幹細胞からの腎臓ポドサイトの生成方法の特許出願中の著者です(米国特許出願14/950859)。残りの著者は、彼らが競合する利益を持っていないと宣言します。
Acknowledgments
この研究は、デューク大学のプラット工学部、デューク医科大学腎臓学科、デューク大学医学部の椅子研究賞、バロウズウェルカム基金PDEPキャリア移行 アドホック 賞によって支援されました.M。M.Bは、国立科学財団大学院研究フェローシッププログラムの支援を受けています。DU11幹細胞ラインを寛大に提供してくれたBursac Labと、デューク大学のヴァルゲーゼラボが組織培養施設を一時的に共有してくれたことに感謝します。この出版物は、60歳の誕生日 を祝って、マサチューセッツ工科大学のノバルティス化学教授ローラ・L・キースリング教授に捧げられています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal. | ||
| Growth Factors and Media Supplements | |||
| All-trans retinoic acid (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| B27 serum-free supplement | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | May show lot-to-lot variation |
| Complete Medium Kit with CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Cell Systems | Podocyte maintenance media |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 with glutamine supplement |
| Heat-inactivated FBS | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| Human activin A | PHC9564 | Thermo/Life Technologies | |
| Human BMP7 | PHC9544 | Thermo/Life Technologies | |
| Human VEGF | PHC9394 | Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 medium | 05850 | Stem Cell Technologies | hiPS cell culture media (CCM) |
| Penicillin–streptomycin, liquid (100×) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 ROCK inhibitor | 1254 | Tocris | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T) | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R&D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | N-892012 | Iwai North America | Basement membrane (BM) matrix 2 |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | 354277 | BD Biosciences | Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation |
| Enzymes and Other Reagents | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Cell detachment solution |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood |
| Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | 97065-058 | VWR | Ethanol is flammable and toxic |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyde (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Sterile Distilled Water | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Aspirating pipettes, individually wrapped | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R Centrifuge | B99516 | Beckman Coulter | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | 352097 | Corning | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryoboxes | 3395465 | Thermo/Life Technologies | For storing frozen aliquots |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives |
| Hemocytometer | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | 51030403 | Thermo/Life Technologies | For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives |
| Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | Carl Zeiss Microscopy | Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation |
| Kimberly-Clark nitrile gloves | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, large | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, small | 21905-026 | VWR | |
| P10 precision barrier pipette tips | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 barrier pipette tips | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 barrier pipette tips | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 barrier pipette tips | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 barrier pipette tips | P1122 | Denville Scientific | |
| Serological pipette, 10 mL, individually wrapped | 356551 | Corning | |
| Serological pipette, 25 mL, individually wrapped | 356525 | Corning | |
| Serological pipette, 5 mL, individually wrapped | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0.22 μm, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes | 1138W14 | Thomas Scientific | For aliquoting growth factors |
| Tissue culture–treated 12-well plates | 353043 | Corning | |
| Tissue culture–treated six-well plates | 353046 | Corning | |
| VWR white techuni lab coat | 10141-342 | VWR | |
| Wide-beveled cell lifter | 3008 | Corning |
References
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