Summary
Aquí se presenta un protocolo definido químicamente para la derivación de podocitos renales humanos a partir de células madre pluripotentes inducidas con alta eficiencia (>90%) e independiente de manipulaciones genéticas o selección de subpoblaciones. Este protocolo produce el tipo de célula deseado dentro de los 26 días y podría ser útil para las pruebas de nefrotoxicidad y el modelado de enfermedades.
Abstract
La enfermedad renal afecta a más del 10% de la población mundial y cuesta miles de millones de dólares en gastos federales. Las formas más graves de enfermedad renal y eventual insuficiencia renal en etapa terminal a menudo son causadas por el daño a los podocitos glomerulares, que son las células epiteliales altamente especializadas que funcionan junto con las células endoteliales y la membrana basal glomerular para formar la barrera de filtración del riñón. Los avances en medicina renal se han visto obstaculizados por la limitada disponibilidad de tejidos primarios y la falta de métodos robustos para la derivación de células renales humanas funcionales, como los podocitos. La capacidad de derivar podocitos de fuentes renovables, como las células madre, podría ayudar a avanzar en la comprensión actual de los mecanismos del desarrollo y la enfermedad renal humana, así como proporcionar nuevas herramientas para el descubrimiento terapéutico. El objetivo de este protocolo era desarrollar un método para derivar podocitos maduros postmitóticos a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPS) con alta eficiencia y especificidad, y en condiciones químicamente definidas. Los podocitos derivados de células hiPS producidos por este método expresan marcadores específicos del linaje (incluyendo nefrina, podocina y tumor de Wilm 1) y exhiben las características morfológicas especializadas (incluidos los procesos primarios y secundarios del pie) asociadas con podocitos maduros y funcionales. Curiosamente, estas características especializadas están notablemente ausentes en la línea celular de podocitos inmortalizados ampliamente utilizada en el campo, lo que sugiere que el protocolo descrito aquí produce podocitos renales humanos que tienen un fenotipo de desarrollo más maduro que las líneas celulares de podocitos existentes típicamente utilizadas para estudiar la biología del riñón humano.
Introduction
Los avances en el cultivo de células madre pluripotentes humanas están a punto de revolucionar la medicina regenerativa, el modelado de enfermedades y la detección de fármacos al proporcionar a los investigadores una fuente renovable y escalable de material biológico que puede diseñarse para obtener casi cualquier tipo de célula dentro del cuerpo humano1. Esta estrategia es especialmente útil para derivar tipos de células especializadas y funcionales que de otro modo serían difíciles de obtener. Las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPS)2,3,4,5 son particularmente atractivas debido a su origen celular somático y al potencial que representan para la medicina personalizada. Sin embargo, el desarrollo de métodos para derivar otros linajes celulares a partir de células hiPS sigue siendo un desafío debido al uso frecuente de condiciones de cultivo mal definidas que conducen a una baja eficiencia y a la generación inespecífico de poblaciones de células heterogéneas6,7.
Aquí se presenta un método para la derivación de podocitos renales maduros a partir de células hiPS con especificidad y alta eficiencia en condiciones químicamente definidas. Al considerar los roles de múltiples factores dentro del microambiente celular, se desarrolló una estrategia de diferenciación de células madre que implicó la optimización de factores solubles presentados en el medio de cultivo celular, así como factores insolubles, como componentes de matriz extracelular o sustratos adhesivos. Dada la importancia de la señalización de la integrina en el desarrollo y la función de los podocitos, se examinó inicialmente la expresión de los receptores de integrina en la superficie celular. Las integrinas β1 se expresaron altamente no solo en las células hiPS, sino también en sus derivados, incluidas las células mesodermo y mesodermointermedias 8,9,10. Experimentos posteriores confirmaron que los ligandos que se unen a las integrinas β1 (incluyendo laminina 511 o el fragmento de laminina 511-E8) apoyan la adhesión y diferenciación de las células hiPS en podocitos cuando se usan junto con los medios inductivos solubles que se describen a continuación.
La inducción del compromiso de linaje celular se inició confirmando primero que las células hiPS cultivadas en las superficies recubiertas de laminina durante dos días en presencia de un medio que contiene Activina A, CHIR99021 e Y27632 El inhibidor de roca puede diferenciarse en células que expresan los marcadores tempranos del mesodermo HAND1, goosecoid y brachyury8,11. El tratamiento de las células mesodérmicas durante 14 días con un medio suplementado con proteína morfogenética ósea 7 (BMP-7) y CHIR99021 permitió la derivación de células mesodérmicas intermedias que expresaban los marcadores de células progenitoras de nefrona Tumor de Wilm 1 (WT1), proteína relacionada extrañamente omitida 1 (OSR1)8,11y proteína pareada del gen 2 de la caja (PAX2)12. Para derivar los podocitos glomerulares renales maduros, las células mesodérmicas intermedias se trataron durante 4-5 días con un nuevo medio que consiste en BMP-7, activina A, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), ácido retinoicoall-trans y CHIR99021. Se utilizó la citometría de flujo y la inmunotinción para confirmar que >90% de las células resultantes exhibían las características moleculares, morfológicas y funcionales del podocito renal maduro8,11,13. Estas características incluyen el desarrollo de procesos primarios y secundarios del pie; la expresión de genes específicos del linaje de podocitos, incluidos SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 y la expresión de proteínas como podocina, nefrina y WT114,15,16. Además, se encontró que los podocitos derivados de células hiPS se pueden mantener en cultivo durante un máximo de cuatro semanas in vitromedianteel uso de un medio disponible comercialmente 8,11 que proporciona una flexibilidad adicional en el momento de los experimentos posteriores. Para obtener más información sobre los paneles de citometría de flujo utilizados para determinar la pureza de los hiPS-podocitos, consulte nuestra publicación anterior11.
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Protocol
1. Preparación de reactivos
- Suplemento diluido de medios de cultivo celular hiPS (CCM) descongelado en medio basal de cultivo celular hiPS para obtener una solución 1x de hiPS CCM.
NOTA: El suplemento congelado 5x hiPS CCM requiere un proceso de descongelación lento, idealmente en 4 ° C durante la noche. Las alícuotas del 1x hiPS CCM se pueden almacenar hasta 6 meses a -20 °C. - Preparación de placas recubiertas de matriz de membrana basal (BM) 1 para cultivo celular hiPS: Descongelar la matriz BM 1 durante la noche sobre hielo a 4 °C. Una vez descongeladas, prepare las alícuotas con los factores de dilución apropiados según lo sugerido por el fabricante.
NOTA: Por lo general, las alícuotas se preparan para su posterior dilución en 25 ml de DMEM / F12 frío en un tubo cónico de 50 ml seguido de una mezcla completa para disolver completamente la matriz BM 1 y evitar la formación de cristales residuales. - Transfiera 1 ml de la solución de matriz BM 1 a cada pozo de una placa de 6 pozos e incube a 37 °C durante 1-2 h o a 4 °C durante un mínimo de 24 h, envuelto en película de parafina. Las placas recubiertas de matriz BM 1 se pueden almacenar a 4 °C durante un tiempo de hasta 2 semanas.
- Preparación de la matriz 2 de la membrana basal (BM) - placas recubiertas: Diluya las cantidades apropiadas de la matriz BM 2 en agua destilada estéril de 9 ml para preparar una concentración final de 5 μg / ml. Añadir 700 μL de la solución de matriz BM 2 a cada pozo de una placa de 12 pozos e incubar la placa a temperatura ambiente durante 2 h o durante la noche a 4 °C.
- Preparar soluciones de 100 μg/ml de BSA cada una de BMP7, Activina A y VEGF de la siguiente manera: reconstituir BMP7 en agua destilada estéril que contenga 0,1% (wt/vol) de BSA y reconstituir Activina A y VEGF por separado en PBS estériles que contengan 0,1% (wt/vol) de BSA. Para evitar ciclos frecuentes de congelación-descongelación, prepare alícuotas de 100 μL de cada solución de stock y guárdelo a -20 °C durante un plazo de hasta 6 meses.
- Preparar una solución de 10 mM de Y27632 disolviendo 10 mg de Y27632 en 3.079 mL de agua destilada estéril. Alícuota 100 μL del stock y conservar a -20 °C durante un plazo de hasta 6 meses.
- Disolver 2 mg de CHIR99021 en 143,4 μL de DMSO estéril para preparar una solución de 30 mM. Preparar alícuotas de 5 μL y conservar a -20 °C durante un plazo de hasta 1 mes (o según la recomendación del fabricante).
- Disolver 10 mg de ácidotodo-trans retinoico en 3,33 ml de DMSO estéril. Preparar alícuotas de 500 μL y conservar a -20 °C durante un plazo de hasta 6 meses.
2. Preparación de medios culturales
- Preparar el medio de diferenciación del mesodermo reconstituyendo las soluciones madre correspondientes a una concentración final de 100 ng/mL de Activina A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632 y 1x suplemento libre de suero B27 en un volumen apropiado de DMEM/12 con suplemento de glutamina.
NOTA: El medio de diferenciación del mesodermo debe estar recién preparado antes de los pasos de diferenciación y a un volumen apropiado para la escala del experimento (típicamente, 50 ml de medio es adecuado para dos placas de 12 pozos). - Preparar el medio intermedio de diferenciación del mesodermo reconstituyendo las soluciones madre correspondientes a una concentración final de 100 ng/mL BMP7, 3 μM CHIR99021 y 1x suplemento libre de suero B27 en DMEM/F12 con un suplemento de glutamina.
NOTA: Si es necesario, el medio se puede complementar con 1% (vol/vol) de penicilina-estreptomicina. Ajuste el volumen del medio usando DMEM / F12 con suplemento de glutamina. Este medio se puede preparar en grandes lotes; sin embargo, se recomienda almacenar en alícuotas más pequeñas (por ejemplo, 45 ml en tubos cónicos de 50 ml) para evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación. Este medio se puede almacenar a -20 °C durante un plazo de hasta 3 meses y se puede descongelar a 4 °C durante la noche antes de su uso. - Preparar el medio de inducción de poocitos reconstituyendo a una concentración final 100 ng/mL BMP7, 100 ng/mL de activina A, 50 ng/mL VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x suplemento libre de suero B27 y 0,1 μM de ácido todo-trans retinoico en DMEM/F12 con suplemento de glutamina. Proteja el medio de la luz (por ejemplo, envolviendo el recipiente con papel de aluminio).
NOTA: Este medio se puede preparar en grandes lotes y almacenar en la oscuridad a -20 °C durante un plazo de hasta 3 meses. Las alícuotas congeladas deben descongelarse durante la noche a 4 °C antes de su uso. - Preparar 25 ml de solución neutralizante de tripsina añadiendo fbs inactivado por calor al 10% (vol/vol) en DMEM/F12 y filtrar en condiciones estériles.
- Para el mantenimiento posterior a la diferenciación de los podocitos derivados de células madre, prepare complete Medium con medios de mantenimiento de podocitos agregando el suplemento al medio basal según las pautas del fabricante y guárdelo a 4 ° C durante un total de dos semanas.
3. Cultivo celular hiPS sin alimentador utilizando medio de cultivo celular hiPS
- Aspire la solución residual de la matriz BM 1 de las placas pre-recubiertas y lave los pozos 3 veces con 1 a 2 ml de DMEM/F12 calentado.
- Aspire el CCM hiPS gastado de las células hiPS y enjuague las células 3 veces con DMEM / F12 calentado. Agregue 1 ml de solución de desprendimiento de células calientes e incube durante 1 min a 37 ° C para ayudar a disociar las células. Realice una inspección visual de las células bajo un microscopio de cultivo de tejidos y asegúrese de que los bordes de las colonias celulares parezcan redondeados, luego aspire rápidamente la solución de desprendimiento celular de las células (asegurando que las colonias celulares todavía estén unidas a la placa, aunque sea libremente). Enjuague suavemente las células una vez con DMEM/F12 para eliminar la solución de desprendimiento celular.
- Agregue 3 ml de hiPS CCM a las células hiPS (en cada podo de una placa de 6 pomos) que se trataron con la solución de desprendimiento celular. Raspe las colonias usando un elevador de células y pipete suavemente la suspensión de celdas hacia arriba y hacia abajo para desalojar las celdas adheridas. Lave bien el plato para asegurarse de que todas las células se cosechan.
NOTA: Se recomienda el uso de una pipeta de 5 ml para evitar el exceso de cizalla en las células. - Transfiera 0,5 ml de la suspensión celular a cada pozo de una nueva placa de 6 pomos recubierta de matriz BM de 1 que contiene 2 ml de HIPS CCM por pozo. Mueva la placa de la figura ocho para distribuir colonias celulares dentro de los pozos e incube a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5 %. Refrescar el medio diariamente hasta que las células estén listas para ser pasadas o utilizadas para el experimento de diferenciación (aproximadamente 70 % de confluencia).
NOTA: El tamaño ideal de la colonia para el paso rutinario de iPSCs es de entre 200-500 μm en condiciones libres de alimentador utilizando hiPS CCM (sin inhibidor de ROCK). Si las células se individualizan durante el tratamiento con enzimas de disociación o tampones, el HIPS CCM se puede complementar con un inhibidor de ROCK (por ejemplo, 10 μM Y27632) para mejorar la viabilidad celular.
4. Diferenciación de células hiPS en células mesodérmicas (días 0-2)
- Mientras que los cultivos celulares hiPS se encuentran en la fase de crecimiento exponencial (aproximadamente dentro de los 4 días posteriores al cultivo después del paso, y alrededor del 70% de confluencia), inspeccione visualmente la presencia de células diferenciadas espontáneamente dentro y alrededor de los bordes de las colonias. Si es necesario, raspe asépticamente las áreas de diferenciación.
- Aspire hiPS CCM de células hiPS y enjuague las células 3 veces con DMEM / F12 caliente. Incubar las células con 1 ml de tampón de disociación celular libre de enzimas durante 10 min a 37 °C y comprobar la disociación bajo un microscopio. Debido a las diferencias inherentes entre las diferentes líneas celulares hiPS, el tiempo de incubación real para el tampón de disociación celular debe determinarse para una línea celular determinada.
- Raspe suavemente el pozo con un elevador de células para desalojar las células adheridas y transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml, seguido de pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para individualizar las células hiPS.
- Lleve la suspensión celular al volumen de 15 ml con DMEM/F12 caliente y centrífuga durante 5 min a 290 x g a temperatura ambiente.
- Aspire suavemente el sobrenadante y resuspónda las células con DMEM / F12 caliente para otra ronda de centrifugación para eliminar los componentes residuales de la matriz BM 1 y el tampón de disociación.
- Aspirar las células sobrenadantes y resuspend en 1 ml de medio de inducción del mesodermo como se describe anteriormente. Contar el número total de células utilizando un hemocitómetro o un contador de coulter para determinar el volumen apropiado del medio de diferenciación del mesodermo necesario para lograr una concentración de 1 x 105 células/ml.
- Aspire la solución de ECM de las placas recubiertas de 2 matrices BM y enjuague las placas dos veces con DMEM / F12 caliente. Mezcle la suspensión de la celda hiPS suavemente pipeteando varias veces. Transfiera 1 ml de la suspensión celular a cada pozo de las placas de 12 pozos recubiertas de 2 matriz BM y luego agite suavemente las placas para distribuir las células de manera más uniforme.
- Incubar la placa a 37 °C en una incubadora de 5% de CO2. Refresque el medio de inducción del mesodermo al día siguiente.
NOTA: Después de 2 días, las células mesodérmicas derivadas de células hiPS estarían listas para la inducción intermedia del mesodermo.
5. Diferenciación de células mesodérmicas derivadas de células hiPS en mesodermo intermedio (días 2-16)
- En el día 2 del protocolo de diferenciación, aspirar el medio de inducción del mesodermo y reponer con 1 mL por medio de inducción del mesodermo intermedio del pozo.
- Refrescar el medio todos los días para mantener un umbral preciso de factores de crecimiento y moléculas pequeñas para las células metabólicamente activas. Si hay un crecimiento celular sustancial y un rápido agotamiento de los nutrientes de los medios (indicado por el amarilleo de los medios), el volumen del medio de diferenciación del mesodermo intermedio se puede aumentar a 1,3 ml por podo de las placas de 12 pomos.
- Células de cultivo durante 14 días adicionales para obtener células mesodérmicas intermedias. Para el día 16, estas células se pueden criopreservarse para su uso posterior.
6. Diferenciación de células mesodérmicas intermedias derivadas de células hiPS en podocitos (días 16 a 21)
- Enjuague las células mesodérmicas intermedias con DMEM/F12 caliente seguido de incubación de las células con 0,5 ml por podo de tripsina-EDTA al 0,05 % durante 3 min a 37 °C. Realice una inspección visual para asegurarse de que las células están comenzando a disociarse.
- Raspar las células usando un elevador celular y pipetear la suspensión celular varias veces usando una punta de pipeta de 1,000 μL para obtener células individualizadas (o pequeños grupos de).
NOTA: En esta etapa, asegúrese de que las células estén completamente disociadas, ya que las células agregadas pueden no adquirir un fenotipo diferenciado terminalmente dentro de la línea de tiempo del protocolo. - Agregue aproximadamente 2 ml por pozo de solución neutralizante de tripsina para detener la actividad de la tripsina.
- Transfiera las células a un tubo cónico de 50 ml y lleve el volumen hasta 50 ml utilizando DMEM / F12, y luego centrífuga la suspensión de la celda durante 5 minutos a 201 x g a temperatura ambiente.
- Aspirar las células sobrenadantes y resuspend en el medio de inducción de poocitos. Para obtener resultados óptimos, asegure una densidad de siembra final de aproximadamente 100,000 células / pozo de una placa de 12 pozos. Agregue la suspensión celular a las placas recubiertas de 2 matrices BM y agite suavemente la placa para ayudar a distribuir las células de manera más uniforme.
- Incubar las células a 37 °C y 5% de CO2 y refrescar el medio diariamente durante un total de 5 días para obtener podocitos para el día 21.
NOTA: Los podocitos derivados de células hiPS resultantes se pueden mantener en cultivo durante 2-4 semanas adicionales mediante el uso de medio completo con medios de mantenimiento de podocitos. Una vez en los medios de mantenimiento de podocitos, las células se pueden alimentar cada dos días y se pueden utilizar para estudios posteriores o análisis posteriores.
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Representative Results
El objetivo de este protocolo era demostrar que los podocitos humanos maduros pueden derivarse de células hiPS en condiciones químicamente definidas. Los datos presentados en este manuscrito se generaron mediante el uso de la línea celular DU11 hiPS17,que se probó por primera vez y se encontró que estaba libre de micoplasma. También se realizó un análisis cromosómico, y se encontró que las células eran cariotípicamente normales. Comenzando con las células hiPS DU11 indiferenciadas, la estrategia de diferenciación(Figura 1)descrita en este informe se empleó para diferenciar primero las células madre(Figura 2A)en células mesodérmicas que expresan Braquiuria (T)(Figura 1B y Figura 2B),seguida de la diferenciación en células mesodérmicas intermedias PAX2 positivas(Figura 2C),y finalmente en podocitos glomerulares renales maduros (Figura 1B, Figura 2D, Figura 3Dy Figura 4). Las células mesodérmicas se obtuvieron en el día 2 del protocolo de diferenciación, las células mesodérmicas intermedias se generaron en el día 16 y los podocitos maduros se obtuvieron en el día 21 del protocolo de diferenciación. Los podocitos resultantes tenían un tamaño de aproximadamente 150-200 μm cuando se adherían a una superficie de cultivo de tejido plano, como las placas recubiertas de laminina utilizadas en este experimento. Los podocitos derivados de células hiPS exhiben numerosas extensiones similares a procesos del pie que se visualizaron utilizando múltiples técnicas complementarias, incluida la microscopía de contraste de fase(Figura 1),la microscopía inmunofluorescente(Figura 4)y la microscopía electrónica de barrido8,11. Los podocitos derivados de células madre también se tiñeron de positivo para WT115 (Figura 2D),así como el marcador de identificación de linaje nefrona14 (Figura 4). Curiosamente, la localización subcelular de la nefronina fue predominantemente en los procesos del pie de podocito y el citoplasma celular, consistente con un fenotipo de podocito maduro(Figura 2D y Figura 4A,B). Durante el desarrollo y en la fisiología de los podocitos, la proteína nefrina se transporta entre el núcleo celular y el citoplasma, pero la nefrona se expresa predominantemente en los procesos del citoplasma y el pie a medida que los podocitos maduran y adquieren un fenotipo funcional18. Por lo tanto, la observación de que los podocitos producidos mediante el uso del protocolo de diferenciación descrito aquí expresan nefrina en gran medida en el citoplasma y las estructuras similares al proceso del pie subraya la utilidad de este protocolo para la generación de podocitos más maduros o especializados. Las micrografías electrónicas de barrido de podocitos derivados de células hiPS resaltan la ramificación de los procesos primarios y secundarios del pie en los podocitos derivados de células hiPS como lo informó previamente nuestro grupo8,11. Debido a que WT1 no es por sí mismo un marcador definitivo de podocitos renales, es muy recomendable que los investigadores también caractericen sus células para la expresión simultánea de marcadores específicos de podocitos como la podocina y la nefrina. Anteriormente se demostró que los podocitos diferenciados terminalmente derivaron mediante el uso de este método inmunotintas positivos para podocina, nefrina y WT1, con una disminución correspondiente en la expresión del marcador de células progenitoras PAX28,11. En conjunto, estos resultados indican que los podocitos derivados utilizando este protocolo son maduros o especializados en el desarrollo, como se requiere para un podocito glomerular renal humano funcional.
En la optimización de las condiciones para el método de diferenciación, se observaron casos en los que las células mesodérmicas intermedias estaban inadecuadamente disociadas. Las células secuestas a densidades que excedieron significativamente la densidad recomendada de 100,000 células / pozo de una placa de 12 potos (antes del paso final de inducción de podocitos) dieron como resultado grandes grupos de células que carecían del fenotipo morfológico esperado de podocitos maduros dentro de la línea de tiempo estándar del protocolo(Figura 3A, B). Por estas razones, se recomienda que los investigadores utilicen las densidades de siembra recomendadas en este protocolo(Figura 3C, D)antes de experimentar con otras condiciones que puedan ser deseadas para aplicaciones específicas aguas abajo. Juntos, estos resultados representan la diferenciación dirigida de las células hiPS en podocitos glomerulares renales dentro de las tres semanas utilizando los medios químicamente definidos descritos anteriormente.
Figura 1: Diferenciación de células hiPS a podocitos.
(A) Representación esquemática del método para la diferenciación dirigida de células hiPS en podocitos. BMP7, proteína morfogenética ósea 7; AR: ácido retinoico; VEGF: factor de crecimiento endotelial vascular. Esta cifra ha sido modificada a partir de la ref.11. (B) Imágenes representativas de células hiPS en cada etapa de diferenciación. De izquierda a derecha, las imágenes muestran las colonias características de células iPS humanas antes de la disociación para la diferenciación en el día 0, seguidas de las células mesodérmicas después de 2 días de diferenciación, luego las células mesodérmicas intermedias alrededor de los 10 días de diferenciación y, finalmente, los podocitos diferenciados terminalmente en el día 22. Barra de escala, 100 μm para todas las imágenes (en el panel B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes inmunofluorescentes de células hiPS y sus derivados diferenciados que muestran la expresión de marcadores específicos del linaje y contratinción nuclear durante la línea de tiempo de diferenciación.
(A) Células iPS humanas que expresan el marcador de pluripotencia Oct4; (B) células mesodérmicas que expresan braquiuria (T); (C) células mesodérmicas intermedias que expresan PAX2; y (D) los podocitos derivados de células hiPS que expresan el marcador de identificación de linaje, nefronina, y el marcador asociado, WT1. Barra de escala, 100 μm para todas las imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Efectos de la densidad de siembra subóptima sobre el potencial de diferenciación de las células mesodérmicas intermedias derivadas de la línea celular DU11 hiPS.
(A) Cuando la densidad inicial de siembra celular es demasiado alta (aproximadamente 500.000 células/pomo de una placa de 12 pomos), las células pueden formar agregados densos (B) durante la etapa de inducción de podocitos. (C) Se recomiendan las densidades de siembra para evitar la aglomeración (100.000 células/pozo de una placa de 12 pomos), y para observar microscópicamente la extensión (D) de las estructuras similares al proceso del pie durante la fase de diferenciación de poocitos (recuadro). Barra de escala, 200 μm para A-D; y 100 μm para el recuadro en D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Los podocitos derivados de células hiPS exhiben fenotipo morfológicamente maduro in vitro.
(A) Inmunotinción de podocitos derivados de células hiPS para nefrina, y (B) imagen de mayor aumento de los procesos del pie de podocitos que muestran procesos primarios y secundarios (flechas blancas), así como la expresión de nefrina en estas estructuras celulares especializadas. Barra de escala, 100 μm (A); 50 μm (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este informe, describimos un protocolo para la generación de podocitos glomerulares renales a partir de células hiPS. Los podocitos derivados de células hiPS exhiben características morfológicas y moleculares asociadas con el fenotipo13de podocitos renales maduros. En publicaciones anteriores, demostramos que los podocitos derivados de células hiPS pueden imitar la estructura y la función de filtración selectiva del glomérulo renal cuando se cocultivan con células endoteliales microvasculares glomerulares en un dispositivo de órgano en chip microfluídico perfusible8,11.
Los siguientes pasos críticos deben ser considerados por los investigadores interesados en adaptar este protocolo. En primer lugar, la siembra de células hiPS en placas recubiertas de laminina para la inducción de células mesodérmicas es un paso crucial. Si bien se recomienda una densidad de siembra de 100,000 células / pozo, los investigadores pueden ajustar la densidad inicial de siembra celular dependiendo de la tasa de replicación de la línea de células madre utilizada para el estudio. Si es necesario, esta optimización asegurará una densidad celular adecuada durante la etapa de inducción del mesodermo y evitará la formación de agregados celulares o grupos muy grandes que podrían comprometer potencialmente la calidad del mesodermo, el mesodermo intermedio o el fenotipo de podocitos(Figura 3). También es importante tener en cuenta que las diferencias en las especificaciones del fabricante para algunos reactivos como CHIR99021 pueden afectar la calidad de las células diferenciadas. Por lo tanto, es aconsejable probar reactivos de diferentes números de lote o proveedores y vendedores por su actividad biológica y consistencia entre experimentos independientes. Además, es importante evitar la exposición excesiva de las células hiPS a las enzimas de disociación, ya que esto podría conducir a un desprendimiento no deseado de la matriz adhesiva y una posible pérdida de células durante la aspiración media. Otro paso crucial digno de mención es asegurar que el medio de inducción de poocitos esté protegido de la luz para evitar la inactivación fotoinducida del ácido retinoico.
En comparación con los métodos anteriores para la diferenciación de podocitos renales humanos, el método descrito aquí emplea factores químicamente definidos (incluidas moléculas pequeñas, factores de crecimiento e isoformas específicas de proteínas de membrana basal, a concentraciones deseadas) según sea necesario para regular vías de señalización celular específicas involucradas en el desarrollo renal y la función de los podocitos. Específicamente, la generación de células mesodérmicas a partir de células hiPS implicó la activación de la vía de señalización Wnt canónica efectuada mediante el uso de la pequeña molécula CHIR9902119. Se sabe que la vía canónica de señalización Wnt regula la actividad transcripcional de los genes implicados en el desarrollo y patronaje tisular in vivo, así como la proliferación y migración celular20,21. El medio de inducción celular utilizado en este protocolo permite la derivación de podocitos a partir de células mesodérmicas intermedias derivadas de células iPS. Este medio de inducción de poocitos consiste en Activina A, BMP7, VEGF, ácido retinoico y CHIR99021. Cabe destacar que este medio de inducción de podocitos no requiere componentes séricos indefinidos como el suero fetal bovino, lo que puede oscurecer las contribuciones de factores específicos y limitar las aplicaciones de otros métodos de diferenciación celular para estudios mecanicistas del desarrollo y la enfermedad tisular, haciéndolo distinto de los empleados en intentos anteriores de generar tipos de células renales22. Adicionalmente, se observó que FGF2 y FGF9 no son necesarios para la diferenciación de podocitos renales a partir de células hiPS6,7,22. Mientras que los métodos anteriores dependían de la formación de agregados multicelulares como cuerpos embrioides y organoides, el método descrito aquí produce células que exhiben un fenotipo maduro, tanto morfológicamente como por la expresión de marcadores específicos del linaje, incluidas la nefrina y la podocina, y la regulación a la baja de marcadores de células progenitoras como PAX2. Se espera que el conocimiento de los componentes químicos empleados en este protocolo pueda facilitar los estudios mecanicistas del desarrollo del tejido renal humano, la especificación del linaje de podocitos y la patogénesis de enfermedades en el futuro.
Este método para la diferenciación celular hiPS también permite la generación de podocitos maduros, postmitóticos y funcionales con más del 90% de eficiencia, sin selección de subpoblaciones, manipulaciones genéticas o xenotrasplante. Esto es notablemente diferente de los intentos anteriores donde los altos niveles de heterogeneidad celular 6,7,23 limitaron el uso de los métodos de diferenciación de células madre para aplicaciones de medicina traslacional. Este método también presenta un avance significativo para el campo dados los desafíos asociados con la disponibilidad extremadamente limitada de podocitos renales humanos de otras fuentes, como tejidos primarios u organoides. Algunos de los desafíos incluyen bajas eficiencias de derivación de menos del 1% cuando se utilizan métodos que se basan en la formación de cuerpos embrionarios u organoides6,7.
Una limitación de este protocolo es el costo relativamente alto de los reactivos requeridos para el cultivo de células madre y los pasos de diferenciación, lo que puede dificultar su implementación en algunos laboratorios o grupos de investigación. Además, debido a que se involucró una gran cantidad de optimización para múltiples factores en el microambiente de la célula (es decir, señales solubles e insolubles o adhesivas), recomendamos que se siga el protocolo como se describe. Un error común observado por otros que estaban interesados en usar este método de diferenciación de pocitos incluyó el uso de matrices de adhesión celular inapropiadas como la matriz BM 1 u otras proteínas derivadas de animales mal definidas. Una vez que se sigue el protocolo como se describe, se pueden realizar más experimentos para examinar la eficacia de otras modificaciones al protocolo. Además, debido a las diferencias inherentes entre las diferentes líneas de células madre humanas, vale la pena señalar que algunos aspectos del método de diferenciación, por ejemplo, el momento de la exposición al medio de diferenciación o al medio de disociación celular, y las densidades de siembra celular, pueden necesitar ser optimizados. Sin embargo, estas condiciones no se alteraron para las líneas celulares hiPS y las líneas de células madre embrionarias probadas hasta la fecha. Este método de diferenciación de podocitos funciona en múltiples líneas celulares hiPS, incluidas PGP1, IMR-90-1 e IISH3i-CB6, así como la línea de células madre embrionarias H98,11. En este informe, también demostramos la diferenciación exitosa de la línea celular DU11 hiPS utilizando el mismo protocolo(Figura 1 y Figura 2). Por lo tanto, dada la consistencia de este método a través de varias líneas celulares, incluidos los resultados de trabajos no publicados de otros laboratorios de investigación independientes (prepublicación), esperamos que este protocolo de diferenciación sea útil para la derivación de podocitos renales de una amplia variedad de líneas celulares hiPS y, por lo tanto, no se limite al utilizado en este protocolo.
Dada la capacidad de las células hiPS para autorrenovarse indefinidamente, este método de diferenciación podría usarse para proporcionar a los investigadores una fuente fácilmente disponible de podocitos renales humanos. Esto podría ayudar a avanzar en la comprensión actual de la biología y la enfermedad del riñón humano24, así como permitir el desarrollo de nuevos sistemas renales in vitro para modelar la función renal humana y las respuestas a la terapéutica. Por ejemplo, el protocolo descrito en este documento se empleó recientemente y se integró con un sistema microfluídico de órganos en un chip para desarrollar un modelo funcional in vitro de la pared capilar glomerular del riñón humano. Este chip glomerular filtró selectivamente las moléculas circulantes y recapituló la nefrotoxicidad inducida por el fármaco cuando se expuso al fármaco de quimioterapia, Adriamicina8. En el futuro, estos resultados podrían integrarse potencialmente con tecnologías de bioimpresión 3D para diseñar modelos in vitro más complejos del riñón humano. Tales avances podrían proporcionar nuevas plataformas para evaluar candidatos a fármacos, particularmente aquellos que se dirigen a las formas de enfermedades renales derivadas de la disfunción de los podocitos glomerulares. Esto es especialmente importante ya que las diferencias específicas de la especie de los modelos animales y la falta de funcionalidades a nivel de órgano típicamente observadas en los métodos estándar de cultivo de tejidos pueden impedir el desarrollo de terapias dirigidas para diversas formas de enfermedades renales humanas25. Por lo tanto, este protocolo podría, algún día, proporcionar oportunidades para desentrañar las vías de señalización involucradas en el desarrollo del riñón humano, así como la patogénesis de la enfermedad.
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Disclosures
S.M. es autor de una patente pendiente para métodos para la generación de podocitos renales a partir de células madre pluripotentes (solicitud de patente estadounidense 14/950859). Los autores restantes declaran que no tienen intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Escuela de Ingeniería Pratt de la Universidad de Duke, la División de Nefrología de la Escuela de Medicina de Duke, el Premio de Investigación de una Cátedra del Departamento de Medicina de la Universidad de Duke y un Premio Ad Hoc de Transición de Carrera PDEP del Fondo Burroughs Wellcome a S.M. M.B fue apoyado por el Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias. Agradecemos al Laboratorio Bursac por proporcionarnos generosamente la línea de células madre DU11, y al Laboratorio Varghese de la Universidad de Duke por compartir temporalmente sus instalaciones de cultivo de tejidos con nuestro grupo. Esta publicación está dedicada a la Prof. Laura L. Kiessling, Profesora de Química de Novartis en el Instituto de Tecnología de Massachusetts, en celebración de su 60cumpleaños.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal. | ||
| Growth Factors and Media Supplements | |||
| All-trans retinoic acid (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| B27 serum-free supplement | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | May show lot-to-lot variation |
| Complete Medium Kit with CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Cell Systems | Podocyte maintenance media |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 with glutamine supplement |
| Heat-inactivated FBS | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| Human activin A | PHC9564 | Thermo/Life Technologies | |
| Human BMP7 | PHC9544 | Thermo/Life Technologies | |
| Human VEGF | PHC9394 | Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 medium | 05850 | Stem Cell Technologies | hiPS cell culture media (CCM) |
| Penicillin–streptomycin, liquid (100×) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 ROCK inhibitor | 1254 | Tocris | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T) | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R&D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | N-892012 | Iwai North America | Basement membrane (BM) matrix 2 |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | 354277 | BD Biosciences | Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation |
| Enzymes and Other Reagents | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Cell detachment solution |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood |
| Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | 97065-058 | VWR | Ethanol is flammable and toxic |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyde (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Sterile Distilled Water | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Aspirating pipettes, individually wrapped | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R Centrifuge | B99516 | Beckman Coulter | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | 352097 | Corning | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryoboxes | 3395465 | Thermo/Life Technologies | For storing frozen aliquots |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives |
| Hemocytometer | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | 51030403 | Thermo/Life Technologies | For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives |
| Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | Carl Zeiss Microscopy | Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation |
| Kimberly-Clark nitrile gloves | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, large | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, small | 21905-026 | VWR | |
| P10 precision barrier pipette tips | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 barrier pipette tips | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 barrier pipette tips | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 barrier pipette tips | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 barrier pipette tips | P1122 | Denville Scientific | |
| Serological pipette, 10 mL, individually wrapped | 356551 | Corning | |
| Serological pipette, 25 mL, individually wrapped | 356525 | Corning | |
| Serological pipette, 5 mL, individually wrapped | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0.22 μm, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes | 1138W14 | Thomas Scientific | For aliquoting growth factors |
| Tissue culture–treated 12-well plates | 353043 | Corning | |
| Tissue culture–treated six-well plates | 353046 | Corning | |
| VWR white techuni lab coat | 10141-342 | VWR | |
| Wide-beveled cell lifter | 3008 | Corning |
References
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