Summary
يقدم هنا بروتوكول محدد كيميائيا اشتات خلايا الكلى البشرية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ذات الكفاءة العالية (>90٪) ومستقلة عن التلاعب الجيني أو اختيار السكان الفرعيين. ينتج هذا البروتوكول نوع الخلية المطلوب في غضون 26 يوما ويمكن أن يكون مفيدا لاختبار السمية الكلوية ونمذجة المرض.
Abstract
أمراض الكلى تؤثر على أكثر من 10٪ من سكان العالم ويكلف مليارات الدولارات في النفقات الاتحادية. غالبا ما تحدث أشد أشكال أمراض الكلى والفشل الكلوي في المرحلة النهائية بسبب الأضرار التي لحقت بالخلايا الكبيبية ، وهي الخلايا الظهارية المتخصصة للغاية التي تعمل جنبا إلى جنب مع الخلايا البطانية وغشاء الطابق السفلي الكبيبي لتشكيل حاجز ترشيح الكلى. وقد أعاقت التقدم في الطب الكلوي بسبب محدودية توافر الأنسجة الأولية وعدم وجود طرق قوية لاستخلاص خلايا الكلى البشرية الوظيفية، مثل podocytes. ويمكن أن تساعد القدرة على اشتقاق الخلايا الجذعية من مصادر متجددة، مثل الخلايا الجذعية، على تعزيز الفهم الحالي لآليات نمو الكلى البشرية والمرض، فضلا عن توفير أدوات جديدة للاكتشاف العلاجي. كان الهدف من هذا البروتوكول هو تطوير طريقة لاشتقاق الخلايا الجذعية الناضجة بعد الميتوتية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريا بكفاءة عالية وخصوصية عالية ، وفي ظل ظروف محددة كيميائيا. الخلايا المشتقة من الخلايا hiPS التي تنتجها هذه الطريقة تعبر عن علامات النسب محددة (بما في ذلك الكليفرين، بودوسين، والورم ويلم 1) ويحمل الخصائص المورفولوجية المتخصصة (بما في ذلك عمليات القدم الأولية والثانوية) المرتبطة podocytes ناضجة والوظيفية. ومن المثير للاهتمام أن هذه الميزات المتخصصة غائبة بشكل ملحوظ في خط خلايا البودوسيت الخالد المستخدم على نطاق واسع في هذا المجال ، مما يشير إلى أن البروتوكول الموصوف هنا ينتج خلايا الكلى البشرية التي لها نمط الظاهري أكثر نضجا من خطوط خلايا podocyte الموجودة المستخدمة عادة لدراسة بيولوجيا الكلى البشرية.
Introduction
ومن المتوقع أن يؤدي التقدم في زراعة الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات إلى إحداث ثورة في الطب التجديدي، ونمذجة الأمراض، وفحص الأدوية من خلال تزويد الباحثين بمصدر متجدد وقابل للتطوير للمواد البيولوجية التي يمكن هندستها للحصول على أي نوع من الخلايا تقريبا داخل جسم الإنسان1. هذه الاستراتيجية مفيدة بشكل خاص لاستخلاص أنواع الخلايا المتخصصة والوظيفية التي سيكون من الصعب الحصول عليها. الإنسان المستحثة متعدد القدرات الجذعية (hiPS) خلايا2،3،4،5 جذابة بشكل خاص بسبب أصل الخلايا الجسدية والإمكانات التي تمثلها للطب الشخصي. ومع ذلك، تطوير أساليب لاشتقاق أنساب الخلايا الأخرى من خلايا hiPS لا تزال صعبة بسبب الاستخدام المتكرر لظروف الثقافة سيئة التحديد مما يؤدي إلى انخفاض الكفاءة وتوليد غير محددة من مجموعات الخلايا غير المتجانسة6،7.
هنا هو وسيلة لاستخلاص podocytes الكلى ناضجة من خلايا hiPS مع خصوصية وكفاءة عالية في ظل ظروف محددة كيميائيا. من خلال النظر في أدوار عوامل متعددة داخل البيئة الخلوية الدقيقة ، تم تطوير استراتيجية تمايز الخلايا الجذعية التي تنطوي على تحسين العوامل القابلة للذوبان المقدمة في وسط ثقافة الخلية وكذلك العوامل غير القابلة للحل ، مثل مكونات المصفوفة خارج الخلية أو الركائز اللاصقة. ونظرا لأهمية إشارات integrin في تطوير podocyte ووظيفة، تم فحص التعبير عن مستقبلات integrin على سطح الخلية في البداية. β1 integrins وأعرب عنه للغاية ليس فقط في خلايا hiPS، ولكن أيضا في مشتقاتها بما في ذلك mesoderm والمتوسطة mesoderm الخلايا8،9،10. أكدت التجارب اللاحقة أن الليغندس التي ترتبط ب β1 integrins (بما في ذلك اللامينين 511 أو جزء laminin 511-E8) تدعم التصاق وتمايز خلايا hiPS إلى خلايا بودسيتس عند استخدامها بالتزامن مع الوسائط الاستقرائية القابلة للذوبان الموضحة أدناه.
بدأ تحريض التزام نسب الخلية من خلال التأكيد أولا على أن خلايا hiPS المستزرعة على الأسطح المغلفة باللمينين لمدة يومين في وجود وسيط يحتوي على Activin A وCHIR99021 وY27632 يمكن أن يفرق مثبط Rock إلى خلايا تعبر عن علامات mesoderm المبكرة HAND1 وgoosecoid وbrachyury8و11. علاج خلايا mesoderm لمدة 14 يوما مع المتوسطة تستكمل مع البروتين مورفوجيني العظام 7 (BMP-7) وCHIR99021 مكن اشتقاق الخلايا المتوسطة المتوسطة التي أعربت عن علامات الخلية nephron السلف ورم ويلم 1 (WT1), الغريب تخطي البروتين ذات الصلة 1 (OSR1)8,11, ويقترن مربع جين 2 البروتين (PAX2)12. لاشتقاق الخلايا الكبيبية الكلى ناضجة، عولجت الخلايا المتوسطة لمدة 4-5 أيام مع وسيطة جديدة تتكون من BMP-7، أكتيفين A، عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF)، جميع حمض الريتينويكعبر، وCHIR99021. تم استخدام قياس التدفق الخلوي والتلطخ المناعي للتأكد من أن >90٪ من الخلايا الناتجة أظهرت الخصائص الجزيئية والمورفولوجية والوظيفية لخلايا الكلى الناضجة8و11و13. وتشمل هذه الخصائص تطوير عمليات القدم الأولية والثانوية؛ التعبير عن الجينات podocyte النسب محددة بما في ذلك SYNPO، PODXL، MAF، EFNB28 والتعبير عن البروتينات بما في ذلك بودوسين، النيفرين، وWT114،15،16. بالإضافة إلى ذلك ، وجد أنه يمكن الحفاظ على الخلايا المشتقة من hiPS في الثقافة لمدة تصل إلى أربعة أسابيع في المختبر باستخدام وسيط متاح تجاريا8،11 مما يوفر مرونة إضافية في توقيت تجارب المصب. لمزيد من المعلومات حول لوحات قياس التدفق الخلوي المستخدمة لتحديد نقاء hiPS-podocytes، يرجى الرجوع إلى منشورنا السابق11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الكواشف
- تمييع thawed 5x hiPS الخلية الثقافة وسائل الإعلام (CCM) الملحق في hiPS الخلية ثقافة المتوسط القاعدي للحصول على حل 1x من HIPS CCM.
ملاحظة: المجمدة 5x hiPS CCM الملحق يتطلب عملية ذوبان بطيئة, من الناحية المثالية في 4 °C لليلة واحدة. يمكن تخزين الاقتباسات من 1x hiPS CCM لمدة تصل إلى 6 أشهر عند -20 درجة مئوية. - إعداد مصفوفة غشاء الطابق السفلي (BM) 1-المغلفة لوحات لثقافة الخلية hiPS: Thaw BM مصفوفة 1 بين عشية وضحاها على الجليد في 4 °C. مرة واحدة إذابة، وإعداد aliquots مع عوامل التخفيف المناسبة كما اقترح من قبل الشركة المصنعة.
ملاحظة: عادة، يتم إعداد aliquots لتخفيف لاحقة في 25 مل من DMEM/F12 الباردة في أنبوب مخروطي 50 مل تليها خلط شامل لإذابة تماما مصفوفة BM 1 وتجنب تشكيل بلورات المتبقية. - نقل 1 مل من BM مصفوفة 1 حل لكل بئر من لوحة بئر 6 واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة أو في 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة، ملفوفة في فيلم البارافين. يمكن تخزين مصفوفة BM 1 -المغلفة لوحات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
- إعداد مصفوفة غشاء الطابق السفلي (BM) 2 - لوحات مغلفة: تمييع الكميات المناسبة من مصفوفة BM 2 في 9 مل من الماء المقطر العقيم لإعداد تركيز نهائي قدره 5 ميكروغرام / مل. إضافة 700 ميكرولتر من BM مصفوفة 2 حل لكل بئر من لوحة بئر 12 واحتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
- إعداد حلول الأسهم 100 ميكروغرام / مل كل من BMP7، Activin A، و VEGF على النحو التالي: إعادة تشكيل BMP7 في الماء المقطر العقيمة التي تحتوي على 0.1٪ (wt/vol) BSA وإعادة تشكيل Activin A و VEGF بشكل منفصل في برنامج تلفزيوني معقم يحتوي على 0.1٪ (wt/vol) BSA. لتجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة، قم بإعداد 100 ميكرولتر من كل محلول مخزون وتخزينها عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
- إعداد محلول مخزون 10 mM من Y27632 عن طريق حل 10 ملغ من Y27632 في 3.079 مل من الماء المقطر العقيم. Aliquot 100 ميكرولتر من المخزون وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
- حل 2 ملغ من CHIR99021 في 143.4 ميكرولتر من DMSO المعقمة لإعداد محلول الأسهم 30 mM. إعداد 5 ميكرولتر aliquots وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر (أو وفقا لتوصية الشركة المصنعة).
- حل 10 ملغ من حمض الريتينويكعبر جميع في 3.33 مل DMSO المعقمة. إعداد 500 ميكرولتر aliquots وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
2. إعداد وسائل الإعلام الثقافية
- إعداد المتوسطة التمايز mesoderm عن طريق إعادة تشكيل حلول الأسهم المقابلة لتركيز النهائي من 100 نانوغرام / مل أكتيفين A, 3 μM CHIR99021, 10 ميكرومتر Y27632, و1x B27 تكملة خالية من المصل في حجم مناسب من DMEM/12 مع ملحق الجلوتامين.
ملاحظة: يجب أن تكون متوسطة التمايز mesoderm معدة حديثا قبل خطوات التمايز وفي حجم مناسب لحجم التجربة (عادة ، 50 مل من المتوسطة كافية لاثنين من لوحات الآبار 12). - إعداد المتوسطة المتوسطة التمايز mesoderm عن طريق إعادة تشكيل حلول الأسهم المقابلة لتركيز النهائي من 100 نانوغرام / مل BMP7, 3 μM CHIR99021, و1x B27 تكملة خالية من المصل في DMEM/F12 مع ملحق الجلوتامين.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن أن تستكمل المتوسطة مع 1٪ (فول / فول) البنسلين-ستريبتوميسين. ضبط حجم المتوسط باستخدام DMEM/F12 مع الملحق الجلوتامين. يمكن إعداد هذه الوسيطة على دفعات كبيرة؛ ومع ذلك، فمن المستحسن لتخزين في aliquots أصغر (على سبيل المثال، 45 مل في أنابيب مخروطية 50 مل) لتجنب تكرار تجميد ذوبان الدورات. يمكن تخزين هذه الوسائط عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر ويمكن إذابتها عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها قبل الاستخدام. - إعداد وسيط تحريض podocyte عن طريق إعادة تشكيل إلى تركيز النهائي 100 نانوغرام / مل BMP7، 100 نانوغرام/مل أكتيفين A، 50 نانوغرام/مل VEGF، 3 ميكرومتر CHIR99021، ملحق خال من مصل B27 1x، و0.1 ميكرومتر حمض الريتينويك المتحول بالكامل في DMEM/F12 مع ملحق الجلوتامين. حماية متوسطة من الضوء (على سبيل المثال، عن طريق التفاف الحاوية بورق احباط).
ملاحظة: يمكن إعداد هذه الوسيلة على دفعات كبيرة وتخزينها في الظلام عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر. يجب إذابة المغذيات المجمدة بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية قبل الاستخدام. - إعداد 25 مل من حل تحييد التريبسين بإضافة 10٪ (vol/vol) الحرارة المعطل FBS في DMEM/F12 ومرشح في ظل ظروف معقمة.
- لصيانة ما بعد التمايز من podocytes المستمدة من الخلايا الجذعية، وإعداد المتوسطة كاملة مع وسائط الصيانة podocyte بإضافة الملحق إلى الوسط القاعدي وفقا للمبادئ التوجيهية للشركة المصنعة، وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
3. المغذية خالية hiPS ثقافة الخلية باستخدام hiPS خلية الثقافة المتوسطة
- يستنشق الحل المتبقي من مصفوفة BM 1 من الصفائح المغلفة مسبقا ويغسل الآبار 3 مرات مع 1 إلى 2 مل من DMEM/F12 الدافئ.
- قضى أسبيرات HIPS CCM من خلايا hiPS وشطف الخلايا 3 مرات مع DMEM/F12 الدافئة. أضف 1 مل من محلول مفرزة الخلايا الدافئة واحتضن لمدة دقيقة واحدة عند 37 درجة مئوية للمساعدة في فصل الخلايا. إجراء الفحص البصري للخلايا تحت مجهر زراعة الأنسجة والتأكد من أن حواف مستعمرات الخلية تبدو مستديرة ، ثم تستنشق بسرعة محلول انفصال الخلية عن الخلايا (ضمان أن مستعمرات الخلية لا تزال متصلة بالطبق ، وإن كان بشكل فضفاض). شطف الخلايا بلطف مرة واحدة مع DMEM/F12 لإزالة محلول مفرزة الخلية.
- إضافة 3 مل من HIPS CCM إلى خلايا hiPS (في كل بئر من لوحة 6-جيدا) التي تم علاجها مع حل مفرزة الخلية. كشط المستعمرات باستخدام رافع الخلية، وتعليق الخلية ماصة بلطف صعودا وهبوطا لطرد الخلايا التمسك فضفاضة. غسل لوحة جيدا لضمان حصاد جميع الخلايا.
ملاحظة: ينصح باستخدام ماصة 5 مل لتجنب القص الزائد على الخلايا. - نقل 0.5 مل من تعليق الخلية في كل بئر من مصفوفة BM جديدة 1 المغلفة 6-جيدا لوحة تحتوي على 2 مل من CCM hiPS لكل بئر. نقل لوحة في الشكل ثمانية أزياء لتوزيع مستعمرات الخلايا داخل الآبار واحتضان في 37 درجة مئوية في حاضنة 5 ٪ CO2. تحديث متوسط يوميا حتى تكون الخلايا جاهزة للمرور أو استخدامها لتجربة التمايز (حوالي 70 ٪ التقاء).
ملاحظة: حجم مستعمرة مثالية لتمرير الروتينية من iPSCs بين 200-500 ميكرومتر تحت ظروف التغذية الحرة باستخدام HIPS CCM (دون مثبط ROCK). إذا تم تفرد الخلايا أثناء العلاج بإنزيمات أو مخازن فصام، يمكن استكمال HIPS CCM بمثبط ROCK (على سبيل المثال، 10 ميكرومتر Y27632) لتحسين صلاحية الخلية.
4. تمايز خلايا hiPS في خلايا mesoderm (أيام 0-2)
- في حين أن ثقافات خلايا hiPS في مرحلة النمو الأسي (تقريبا في غضون 4 أيام من الثقافة بعد التمرير ، وحوالي 70٪ التقاء) ، تفقد بصريا لوجود خلايا متمايزة تلقائيا داخل وحول حواف المستعمرات. إذا لزم الأمر، كشط بشكل مطهر قبالة مناطق التمايز.
- أسبيرات HIPS CCM من خلايا hiPS وشطف الخلايا 3 مرات مع DMEM/F12 الدافئة. احتضان الخلايا مع 1 مل من العازلة فصيلة الخلايا الخالية من الانزيم لمدة 10 دقيقة في 37 درجة مئوية والتحقق من الانفصال تحت المجهر. بسبب الاختلافات المتأصلة بين خطوط الخلية hiPS مختلفة، يجب تحديد وقت الحضانة الفعلي لحاجز فصافر الخلية لخط الخلية معين.
- كشط بلطف البئر مع رافع الخلية لطرد الخلايا المرتبطة فضفاضة ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل، تليها pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات لفرد خلايا hiPS.
- جلب تعليق الخلية إلى حجم 15 مل مع DMEM/F12 الدافئة والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 290 × ز في درجة حرارة الغرفة.
- يستنشق بلطف supernatant وإعادة تثبيت الخلايا مع DMEM/F12 دافئة لجولة أخرى من الطرد المركزي لإزالة المتبقية مصفوفة BM 1 ومكونات العازلة التفكك.
- أسبيرات الخلايا الفائقة وإعادة الإنفاق في 1 مل من المتوسط التعريفي mesoderm كما هو موضح في أعلاه. عد العدد الإجمالي للخلايا باستخدام عداد الخلايا الهيموسيط أو كولتر لتحديد الحجم المناسب من المتوسط التمايز mesoderm اللازمة لتحقيق تركيز 1 × 105 خلايا / مل.
- أسبيرات ECM الحل من مصفوفة BM 2 المغلفة لوحات وشطف لوحات مرتين مع DMEM/F12 الحارة. خلط تعليق الخلية hiPS بلطف عن طريق pipetting عدة مرات. نقل 1 مل من تعليق الخلية إلى كل بئر من مصفوفة BM 2 المغلفة 12-جيدا لوحات ومن ثم يهز بلطف لوحات لتوزيع الخلايا بشكل أكثر بالتساوي.
- احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية فيحاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪. تحديث المتوسطة التعريفي mesoderm في اليوم التالي.
ملاحظة: بعد 2 أيام، خلايا mesoderm المشتقة من الخلية hiPS ستكون جاهزة للتحريض المتوسط mesoderm.
5. التمايز من خلايا mesoderm hiPS المستمدة من الخلية إلى mesoderm المتوسطة (أيام 2-16)
- في اليوم 2 من بروتوكول التمايز، يستنشق المتوسط التعريفي ميسودرم وتجديد مع 1 مل لكل المتوسطة المتوسطة جيدا المتوسطة التعريفي mesoderm.
- تحديث المتوسطة كل يوم للحفاظ على عتبة دقيقة من عوامل النمو والجزيئات الصغيرة للخلايا النشطة الأيضية. إذا كان هناك نمو كبير في الخلايا والاستنفاد السريع لمغذيات الوسائط (المشار إليها باصفرار الوسائط) ، يمكن زيادة حجم وسيط التمايز المتوسط المتوسط إلى 1.3 مل لكل بئر من لوحات الآبار ال 12.
- خلايا الثقافة لمدة 14 يوما إضافية للحصول على خلايا mesoderm المتوسطة. بحلول اليوم 16، يمكن لهذه الخلايا أن تكون cryopreserved لاستخدامها في وقت لاحق.
6. التفريق بين خلايا الوسيطة المشتقة من الخلايا hiPS إلى خلايا بودوسيتي (أيام 16 إلى 21)
- شطف الخلايا المتوسطة mesoderm مع DMEM/F12 الحارة تليها حضانة الخلايا مع 0.5 مل لكل بئر من 0.05 ٪ تريبسين-EDTA لمدة 3 دقائق في 37 درجة مئوية. إجراء الفحص البصري للتأكد من أن الخلايا بدأت في الانفصال.
- كشط الخلايا باستخدام رافع الخلية وماصة تعليق الخلية عدة مرات باستخدام تلميح ماصة 1000 ميكرولتر للحصول على خلايا فردية (أو كتل صغيرة من).
ملاحظة: في هذه المرحلة، تأكد من أن الخلايا فصل تماما كخلايا مجمعة قد تفشل في الحصول على النمط الظاهري المميز بشكل نهائي ضمن الجدول الزمني للبروتوكول. - إضافة حوالي 2 مل لكل بئر من حل تحييد التريبسين لوقف نشاط التريبسين.
- نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 50 مل وبذلك يصل حجم إلى 50 مل باستخدام DMEM/F12، ومن ثم الطرد المركزي تعليق الخلية لمدة 5 دقائق في 201 × ز في درجة حرارة الغرفة.
- يستنشق الخلايا الفائقة وإعادة الإنفاق في وسيط تحريض podocyte. للحصول على أفضل النتائج، تأكد من كثافة البذر النهائية التي تبلغ حوالي 100,000 خلية/بئر من لوحة بئر 12. أضف تعليق الخلية إلى مصفوفة BM 2-المغلفة لوحات وهز بلطف لوحة للمساعدة في توزيع الخلايا بشكل أكثر بالتساوي.
- احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 وتحديث المتوسطة يوميا لمدة تصل إلى 5 أيام للحصول على podocytes بحلول اليوم 21.
ملاحظة: يمكن الحفاظ على الخلايا المشتقة من خلايا hiPS الناتجة في الثقافة لمدة 2-4 أسابيع إضافية باستخدام وسيط كامل مع وسائط صيانة podocyte. مرة واحدة في وسائط الصيانة podocyte، يمكن تغذية الخلايا كل يومين، ويمكن استخدامها للدراسات اللاحقة أو التحليلات المصب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كان الهدف من هذا البروتوكول هو إثبات أن الخلايا البشرية الناضجة يمكن اشتقاقها من خلايا hiPS في ظل ظروف محددة كيميائيا. تم إنشاء البيانات المعروضة في هذه المخطوطة باستخدام خط الخلية17من DU11 hiPS ، والتي تم اختبارها لأول مرة ، ووجدت أنها خالية من الميكوبلازما. كما تم إجراء تحليل كروموسومي، وتبين أن الخلايا طبيعية بشكل كاريوتيبيكي. بدءا من خلايا DU11 hiPS غير المتمايزة، استراتيجية التمايز (الشكل 1) المبينة في هذا التقرير تم استخدامها للتمييز أولا الخلايا الجذعية (الشكل 2A) في الخلية المتوسطة التي تعبر عن Brachyury (T) (الشكل 1B والشكل 2B), تليها التمايز في الخلايا المتوسطة MESoderm PAX2 إيجابية (الشكل 2C), وأخيرا في podocytes الكلى الكبيبي ناضجة (الشكل 1B, الشكل 2D، الشكل 3D، والشكل 4). تم الحصول على خلايا Mesoderm بحلول اليوم 2 من بروتوكول التمايز ، وتم إنشاء خلايا الوسيطة الوسيطة بحلول اليوم 16 ، وتم الحصول على podocytes ناضجة بحلول اليوم 21 من بروتوكول التمايز. كانت الخلايا البودوسيتية الناتجة حوالي 150-200 ميكرومتر في الحجم عند الالتزام بسطح زراعة الأنسجة المسطحة ، مثل الصفائح المغلفة باللحن المستخدمة في هذه التجربة. تظهر الخلايا المشتقة من خلايا hiPS العديد من الامتدادات الشبيهة بعملية القدم التي تم تصورها باستخدام تقنيات تكميلية متعددة بما في ذلك المجهر التبايني للمرحلة (الشكل 1) ، المجهر المناعي(الشكل 4)ومسح المجهر الإلكتروني8،11. الخلايا الجذعية المشتقة podocytes أيضا ملطخة إيجابية لWT115 (الشكل 2D) ، فضلا عن تحديد النسب علامة nephrin14 (الشكل 4). ومن المثير للاهتمام، كان توطين شبه الخلوية من الكليفرين في الغالب في عمليات القدم podocyte والخلايا السيتوبلازم، بما يتفق مع النمط الظاهري podocyte ناضجة (الشكل 2D والشكل 4A،B). أثناء التنمية وفي فسيولوجيا podocyte ، يتم نقل البروتين الكليبين بين نواة الخلية والسيتوبلازم ، ولكن الكليفرين يصبح في الغالب في عمليات السيتوبلازم والقدم مع نضج podocytes واكتساب النمط الظاهري الوظيفي18. وهكذا، فإن ملاحظة أن podocytes المنتجة باستخدام بروتوكول التمايز الموصوفة هنا التعبير عن الكليفرين إلى حد كبير في السيتوبلازم والقدم عملية تشبه هياكل يؤكد فائدة هذا البروتوكول لتوليد الخلايا بودوسيتس أكثر نضجا أو المتخصصة. المسح المجهري الإلكتروني من الخلايا المشتقة من الخلايا hiPS podocytes تسليط الضوء على تفريع عمليات القدم الأولية والثانوية في podocytes هيبس المستمدة من الخلية كما ذكرت سابقا من قبل مجموعتنا8،11. لأن WT1 ليست في حد ذاتها علامة نهائية من podocytes الكلى، فمن المستحسن جدا أن الباحثين أيضا توصيف خلاياهم للتعبير في وقت واحد من علامات podocyte محددة مثل بودوسين والنيفرين. وقد تبين سابقا أن podocytes متفاوتة بشكل ميؤوس منه المستمدة باستخدام هذه الطريقة المناعيةالإيجابية لبوبودوسين, كليفيرين, وWT1, مع انخفاض المقابلة في التعبير عن علامة الخلية السلف PAX28,11. معا، تشير هذه النتائج إلى أن podocytes المستمدة باستخدام هذا البروتوكول ناضجة تنمويا أو المتخصصة، كما هو مطلوب لpodocyte الكلى البشرية وظيفية.
وفي تحسين الظروف لطريقة التمايز، لوحظت حالات لم تكن فيها خلايا الوسيطة المتفرقة غير مرتبطة بشكل كاف. الخلايا المصنفة في كثافات التي تجاوزت إلى حد كبير الكثافة الموصى بها من 100،000 خلية / بئر من لوحة بئر 12 (قبل الخطوة التعريفي podocyte النهائي) أدى إلى مجموعات كبيرة من الخلايا التي تفتقر إلى النمط الظاهري المورفولوجي المتوقع من podocytes ناضجة ضمن الجدول الزمني القياسي للبروتوكول(الشكل 3A، B). لهذه الأسباب، فمن المستحسن أن الباحثين استخدام كثافات البذر الموصى بها في هذا البروتوكول(الشكل 3C،D)قبل تجربة مع الشروط الأخرى التي قد تكون مرغوبة لتطبيقات المصب محددة. معا، تمثل هذه النتائج التمايز الموجه لخلايا hiPS إلى خلايا جرابية كبيبات الكلى في غضون ثلاثة أسابيع باستخدام الوسائط المحددة كيميائيا الموضحة أعلاه.
الشكل 1: تمايز خلايا hiPS إلى الخلايا podocytes.
(أ) تمثيل تخطيطي لطريقة التمايز الموجه لخلايا hiPS إلى خلايا بودوسيت. BMP7, بروتين مورفوجينيتي العظام 7; RA, حمض الريتينويك; VEGF، عامل نمو البطانية الوعائية. وقد تم تعديل هذا الرقم من المرجع11. (ب) صور تمثيلية لخلايا hiPS في كل مرحلة من مراحل التمايز. من اليسار إلى اليمين ، تظهر الصور مستعمرات خلايا iPS البشرية المميزة قبل الانفصال عن التمايز في اليوم 0 ، تليها خلايا mesoderm بعد يومين من التمايز ، ثم خلايا mesoderm المتوسطة في حوالي 10 أيام من التمايز ، وأخيرا الخلايا البودوسية المتمايزة بشكل نهائي في اليوم 22. شريط المقياس، 100 ميكرومتر لكل الصور (في اللوحة B). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور مناعة لخلايا hiPS ومشتقاتها المتمايزة تظهر التعبير عن علامات النسب المحددة ومكافحة الانتشار النووي خلال الجدول الزمني للتمايز.
(أ)خلايا iPS الإنسان التعبير عن علامة متعددة الخلايا Oct4; (ب) خلايا ميسودرم تعبر عن brachyury (T)؛ (C) خلايا الوسيطة mesoderm التعبير عن PAX2; و (D) الخلايا المشتقة من الخلايا hiPS الخلايا التي تعبر عن علامة تحديد النسب، والنيفرين، وعلامة المرتبطة بها، WT1. شريط المقياس، 100 ميكرومتر لكل الصور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: آثار كثافة البذر دون المستوى الأمثل على إمكانات التمايز لخلايا المتوسطة المتوسطة المستمدة من خط الخلية DU11 hiPS.
(أ)عندما تكون كثافة بذر الخلايا الأولية عالية جدا (حوالي 500000 خلية / بئر من لوحة بئر 12) ، يمكن أن تشكل الخلايا مجاميع كثيفة(B)خلال مرحلة التعريفي podocyte. (ج)كثافات البذر الموصى بها لمنع تكتل (100،000 خلية / بئر من لوحة بئر 12) ، ومراقبة مجهريا(D)تمديد هياكل تشبه عملية القدم خلال مرحلة التمايز podocyte (inset). شريط المقياس، 200 ميكرومتر للمقياس A-D؛ و 100 ميكرومتر لل inset في D. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: hiPS الخلايا المشتقة من podocytes المعرض الظاهري ناضجة شكليا في المختبر.
(أ) Immunostaining من الخلايا hiPS المستمدة podocytes للكفرين ، و (ب) صورة تكبير أعلى من عمليات القدم podocyte تظهر العمليات الأولية والثانوية (السهام البيضاء) ، فضلا عن التعبير عن الكليفرين في هذه الهياكل الخلية المتخصصة. شريط المقياس، 100 ميكرومتر (A)؛ 50 ميكرومتر (ب). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا التقرير، ونحن نصف بروتوكول لتوليد الخلايا الكبيبية الكلى من خلايا hiPS. وs podocytes hiPS المستمدة من الخلية معرض السمات المورفولوجية والجزيئية المرتبطة بالنمط الظاهري podocyte الكلي ناضجة13. في المنشورات السابقة، أظهرنا أن الخلايا البودوسيات المشتقة من خلية hiPS يمكن أن تحاكي بنية ووظيفة الترشيح الانتقائية لكبيبي الكلى عندما تشارك في زراعة الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الكبيبية في جهاز الفلوريد الدقيق القابل للتشويه على رقاقة8،11.
وينبغي للباحثين المهتمين بتكييف هذا البروتوكول النظر في الخطوات الحاسمة التالية. أولا، بذر خلايا hiPS على لوحات مغلفة بالنعناع لتحريض خلايا ميسودرم هو خطوة حاسمة. في حين يوصى بكثافة بذر 100,000 خلية/بئر، يمكن للباحثين ضبط كثافة بذر الخلايا الأولية اعتمادا على معدل تكرار خط الخلايا الجذعية المستخدم في الدراسة. إذا لزم الأمر، فإن هذا التحسين ضمان كثافة الخلايا الكافية خلال مرحلة التعريفي mesoderm ومنع تشكيل المجاميع الخلية أو كتل كبيرة جدا التي يمكن أن تهدد نوعية mesoderm، المتوسطة mesoderm، أو النمط الظاهري podocyte(الشكل 3). من المهم أيضا ملاحظة أن الاختلافات في مواصفات الشركة المصنعة لبعض الكواشف مثل CHIR99021 قد تؤثر على جودة الخلايا المتمايزة. ومن ثم، فمن المستحسن اختبار الكواشف من مختلف أعداد اللوت أو الموردين والبائعين لنشاطهم البيولوجي والاتساق بين التجارب المستقلة. أيضا، من المهم تجنب التعرض المفرط للخلايا hiPS لانزيمات الانفصال لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى انفصال غير مرغوب فيه من مصفوفة لاصقة وفقدان محتمل للخلايا خلال الطموح المتوسط. خطوة أخرى حاسمة جديرة بالملاحظة هي ضمان حماية وسيط تحريض podocyte من الضوء لمنع تعطيل حمض الريتينويك الناجم عن الصور.
بالمقارنة مع الطرق السابقة لتمايز الخلايا الحبيبية للكلى البشرية ، تستخدم الطريقة الموصوفة هنا عوامل محددة كيميائيا (بما في ذلك الجزيئات الصغيرة وعوامل النمو ونظائر محددة من بروتينات غشاء الطابق السفلي ، بتركيزات مرغوب فيها) حسب الحاجة لتنظيم مسارات إشارات الخلايا المحددة المشاركة في تطوير الكلى ووظيفة podocyte. على وجه التحديد، فإن توليد خلايا mesoderm من خلايا hiPS ينطوي على تفعيل مسار إشارات WNT الكنسي الذي تم تنفيذه باستخدام الجزيء الصغير CHIR9902119. ومن المعروف أن مسار إشارات WNT الكنسي لتنظيم النشاط النسخي للجينات المشاركة في تطوير الأنسجة والنقش في الجسم الحي، فضلا عن انتشار الخلايا والهجرة20،21. تتيح وسيلة تحريض الخلية المستخدمة في هذا البروتوكول اشتقاق الخلايا podocytes من خلايا الوسيطة المشتقة من الخلية iPS. يتكون هذا وسيط التعريفي podocyte من Activin A، BMP7، VEGF، حمض الريتينويك، وCHIR99021. وتجدر الإشارة إلى أن هذا الوسيط التعريفي podocyte لا يتطلب مكونات مصل غير محددة مثل مصل الأبقار الجنينية، والتي يمكن أن تحجب مساهمات عوامل محددة وتحد من تطبيقات طرق تمايز الخلايا الأخرى للدراسات الميكانيكية لتطوير الأنسجة والمرض، مما يجعلها متميزة عن تلك المستخدمة في المحاولات السابقة لتوليد أنواع الخلايا الكلوية22. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ أن FGF2 و FGF9 غير مطلوبين لتمايز خلايا الكلى من خلايا hiPS6و7و22. في حين أن الأساليب السابقة تعتمد على تكوين مجاميع متعددة الخلايا مثل الأجسام الجنينية والأعضاء ، فإن الطريقة الموصوفة هنا تنتج خلايا تظهر نمطا ظاهريا ناضجا ، سواء بشكل مورفولوجي أو من خلال التعبير عن علامات محددة للنسب بما في ذلك الكليفرين والبودوسين ، والتنظيم لأسفل لعلامات الخلايا السلف مثل PAX2. ومن المتوقع أن المعرفة من المكونات الكيميائية المستخدمة في هذا البروتوكول يمكن أن تسهل الدراسات الميكانيكية لتطوير أنسجة الكلى البشرية، ومواصفات النسب podocyte، ومسببات الأمراض في المستقبل.
هذه الطريقة لتمايز الخلايا hiPS تمكن أيضا من توليد الخلايا الناضجة، ما بعد الدييتوتيكية والوظيفية مع أكثر من 90٪ كفاءة، دون اختيار السكان الفرعية، والتلاعب الجيني، أو xenotransplantation. هذا يختلف بشكل ملحوظ عن المحاولات السابقة حيث مستويات عالية من التغايرية الخلوية6،7،23 حدت من استخدام أساليب تمايز الخلايا الجذعية لتطبيقات الطب التحويلي. تقدم هذه الطريقة أيضا تقدما كبيرا في هذا المجال نظرا للتحديات المرتبطة بالتوافر المحدود للغاية لخلايا الكلى البشرية من مصادر أخرى مثل الأنسجة الأولية أو الأعضاء العضوية. وتشمل بعض التحديات انخفاض كفاءة الاشتقاق أقل من 1٪ عند استخدام الأساليب التي تعتمد على تكوين أجسام جنينية أو عضويات6،7.
ومن القيود المفروضة على هذا البروتوكول التكلفة المرتفعة نسبيا للكواشف اللازمة زراعة الخلايا الجذعية وخطوات التفريق، مما قد يعوق تنفيذها في بعض المختبرات أو مجموعات البحوث. أيضا ، لأن الكثير من التحسين لعوامل متعددة في البيئة الدقيقة للخلية (أي الإشارات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان أو اللاصقة) كانت متورطة ، نوصي باتباع البروتوكول على النحو الموصوف. خطأ شائع لوحظ من الآخرين الذين كانوا مهتمين باستخدام هذه الطريقة التمايز podocyte شملت استخدام المصفوفات الالتصاق الخلايا غير لائق مثل مصفوفة BM 1 أو غيرها من البروتينات المشتقة من الحيوانات سيئة التعريف. وبمجرد اتباع البروتوكول كما هو موضح، يمكن إجراء المزيد من التجارب لدراسة فعالية التعديلات الأخرى على البروتوكول. وعلاوة على ذلك، ونظرا للاختلافات المتأصلة بين مختلف خطوط الخلايا الجذعية البشرية، تجدر الإشارة إلى أن بعض جوانب طريقة التمايز، مثل توقيت التعرض للتمايز المتوسط أو المتوسط فص الخلايا، وكثافات بذر الخلايا، قد تحتاج إلى تحسين. ومع ذلك، لم يتم تغيير هذه الشروط لخطوط خلايا hiPS وخطوط الخلايا الجذعية الجنينية التي تم اختبارها حتى الآن. هذه الطريقة التمايز podocyte يعمل عبر خطوط الخلايا hiPS متعددة بما في ذلك PGP1، IMR-90-1، وIISH3i-CB6، فضلا عن خط الخلايا الجذعية الجنينية H98،11. في هذا التقرير، ونحن أيضا إظهار التمايز الناجح للخط الخلية هبس DU11 باستخدام نفس البروتوكول(الشكل 1 والشكل 2). وبالتالي ، نظرا لاتساق هذه الطريقة عبر خطوط الخلايا المختلفة بما في ذلك نتائج العمل غير المنشور من مختبرات البحوث المستقلة الأخرى (قبل النشر) ، نتوقع أن يكون بروتوكول التمايز هذا مفيدا لتمييز خلايا الكلى من مجموعة واسعة من خطوط خلايا hiPS ، وبالتالي ، لا يقتصر على البروتوكول المستخدم في هذا البروتوكول.
وبالنظر إلى قدرة خلايا hiPS على التجديد الذاتي إلى أجل غير مسمى ، يمكن استخدام طريقة التمايز هذه لتزويد الباحثين بمصدر متاح بسهولة لخلايا الكلى البشرية. وهذا يمكن أن يساعد على تعزيز الفهم الحالي لبيولوجيا الكلى البشرية والمرض24 وكذلك تمكين تطوير نظم جديدة للكلى في المختبر لنمذجة وظائف الكلى البشرية والاستجابات للعلاجات. على سبيل المثال، تم مؤخرا استخدام البروتوكول الموصوف هنا ودمجه مع نظام الجهاز على رقاقة microfluidic لتطوير نموذج وظيفي في المختبر من جدار الشعيرات الدموية الكبيبي الكلى البشرية. هذه الشريحة الكبيبة تصفية انتقائية الجزيئات المتداولة وتلخيص السمية الكلوية الناجمة عن المخدرات عندما تتعرض لدواء العلاج الكيميائي, أدرياميسين8. وفي المستقبل، يمكن دمج هذه النتائج مع تقنيات الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد لهندسة نماذج أكثر تعقيدا في المختبر للكلى البشرية. ويمكن أن توفر هذه التطورات منصات جديدة لتقييم المرشحين للأدوية، ولا سيما تلك التي تستهدف أشكال أمراض الكلى الناجمة عن خلل الخلايا الكبيبية. وهذا مهم بشكل خاص لأن الاختلافات الخاصة بالأنواع من النماذج الحيوانية وعدم وجود وظائف على مستوى الأعضاء لوحظت عادة في أساليب زراعة الأنسجة القياسية يمكن أن تعوق تطوير العلاجات المستهدفة لمختلف أشكال أمراض الكلى البشرية25. وبالتالي، يمكن لهذا البروتوكول، في يوم من الأيام، توفير الفرص لكشف مسارات الإشارات المشاركة في تطوير الكلى البشرية، فضلا عن مسببات الأمراض للمرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S.M. هو مؤلف على براءة اختراع معلقة لأساليب توليد podocytes الكلى من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (طلب براءة الاختراع في الولايات المتحدة 14/950859). ويعلن المؤلفون الباقون أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من قبل كلية برات للهندسة في جامعة ديوك، وشعبة أمراض الكلى في كلية الطب ديوك، وجائزة أبحاث كرسي من قسم الطب في جامعة ديوك، وجائزة مخصصة الانتقال الوظيفي PDEP صندوق بوروز ويلكوم لS.M.. M.B تحظى بدعم برنامج زمالة أبحاث الدراسات العليا التابع للمؤسسة الوطنية للعلوم. نشكر مختبر بورساك على تزويدنا بسخاء بخط الخلايا الجذعية DU11، ومختبر فارغيز في جامعة ديوك لمشاركته مؤقتا منشأة زراعة الأنسجة الخاصة بهم مع مجموعتنا. هذا المنشور مخصص للبروفيسورة لورا ل. كيسلينغ، أستاذة الكيمياء في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا، احتفالا بعيدميلادها الستين.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal. | ||
| Growth Factors and Media Supplements | |||
| All-trans retinoic acid (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| B27 serum-free supplement | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | May show lot-to-lot variation |
| Complete Medium Kit with CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Cell Systems | Podocyte maintenance media |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 with glutamine supplement |
| Heat-inactivated FBS | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| Human activin A | PHC9564 | Thermo/Life Technologies | |
| Human BMP7 | PHC9544 | Thermo/Life Technologies | |
| Human VEGF | PHC9394 | Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 medium | 05850 | Stem Cell Technologies | hiPS cell culture media (CCM) |
| Penicillin–streptomycin, liquid (100×) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 ROCK inhibitor | 1254 | Tocris | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T) | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R&D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | N-892012 | Iwai North America | Basement membrane (BM) matrix 2 |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | 354277 | BD Biosciences | Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation |
| Enzymes and Other Reagents | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Cell detachment solution |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood |
| Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | 97065-058 | VWR | Ethanol is flammable and toxic |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyde (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Sterile Distilled Water | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Aspirating pipettes, individually wrapped | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R Centrifuge | B99516 | Beckman Coulter | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | 352097 | Corning | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryoboxes | 3395465 | Thermo/Life Technologies | For storing frozen aliquots |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives |
| Hemocytometer | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | 51030403 | Thermo/Life Technologies | For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives |
| Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | Carl Zeiss Microscopy | Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation |
| Kimberly-Clark nitrile gloves | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, large | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, small | 21905-026 | VWR | |
| P10 precision barrier pipette tips | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 barrier pipette tips | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 barrier pipette tips | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 barrier pipette tips | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 barrier pipette tips | P1122 | Denville Scientific | |
| Serological pipette, 10 mL, individually wrapped | 356551 | Corning | |
| Serological pipette, 25 mL, individually wrapped | 356525 | Corning | |
| Serological pipette, 5 mL, individually wrapped | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0.22 μm, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes | 1138W14 | Thomas Scientific | For aliquoting growth factors |
| Tissue culture–treated 12-well plates | 353043 | Corning | |
| Tissue culture–treated six-well plates | 353046 | Corning | |
| VWR white techuni lab coat | 10141-342 | VWR | |
| Wide-beveled cell lifter | 3008 | Corning |
References
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, 1145 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526, 564-568 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33, 1193-1200 (2015).
- Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13, 1662-1685 (2018).
- Pozzi, A., et al. Beta1 integrin expression by podocytes is required to maintain glomerular structural integrity. Developmental Biology. 316, 288-301 (2008).
- Kanasaki, K., et al. Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus. Developmental Biology. 313, 584-593 (2008).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).
- Torban, E., et al. PAX2 Activates WNT4 Expression during Mammalian Kidney Development. Journal of Biological Chemistry. 281, 12705-12712 (2006).
- Reiser, J., Sever, S. Podocyte biology and pathogenesis of kidney disease. Annual Review of Medicine. 64, 357-366 (2013).
- Kuusniemi, A. M., et al. Tissue Expression of Nephrin in Human and Pig. Pediatric Research. 55, 774-781 (2004).
- Guo, J. K., et al. WT1 is a key regulator of podocyte function: reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis. Human Molecular Genetics. 11, 651-659 (2002).
- Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. American Journal of Pathology. 160, 131-139 (2002).
- Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825 (2017).
- Satoh, D., et al. aPKCλ maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. The Journal of Biochemistry. 156, 115-128 (2014).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
- Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
- Clevers, H., Nusse, R.
- Ciampi, O., et al. Generation of functional podocytes from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 17, 130-139 (2016).
- Fuente Mora, C., et al. Differentiation of Podocyte and Proximal Tubule-Like Cells from a Mouse Kidney-Derived Stem Cell Line. Stem Cells and Development. 21, 296-307 (2011).
- Chuah, J. K. C., Zink, D. Stem cell-derived kidney cells and organoids: Recent breakthroughs and emerging applications. Biotechnology Advances. 35, 150-167 (2017).
- Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).
