Summary
Здесь представлен химически определенный протокол для получения почек-подоцитов человека из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с высокой эффективностью (>90%) и независимо от генетических манипуляций или отбора субпопуляций. Этот протокол производит желаемый тип клеток в течение 26 дней и может быть полезен для тестирования нефротоксичности и моделирования заболеваний.
Abstract
Заболевание почек поражает более 10% мирового населения и обходится в миллиарды долларов федеральных расходов. Наиболее тяжелые формы заболевания почек и возможная конечная стадия почечной недостаточности часто вызваны повреждением клубочковых подоцитов, которые являются высокоспециализированными эпителиальными клетками, которые функционируют вместе с эндотелиальными клетками и клубочковой базальной мембраной для формирования фильтрационного барьера почки. Достижения в почечной медицине были затруднены ограниченной доступностью первичных тканей и отсутствием надежных методов получения функциональных клеток почек человека, таких как подоциты. Способность извлекать подоциты из возобновляемых источников, таких как стволовые клетки, может помочь продвинуть современное понимание механизмов развития и заболеваний почек человека, а также предоставить новые инструменты для терапевтических открытий. Целью этого протокола была разработка метода получения зрелых, постмитотических подоцитов из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPS) с высокой эффективностью и специфичностью и в химически определенных условиях. Подоциты, полученные из клеток hiPS, продуцируемые этим методом, экспрессируют специфические для линии маркеры (включая нефрин, подоцин и опухоль Вильма 1) и проявляют специализированные морфологические характеристики (включая первичные и вторичные процессы стопы), связанные со зрелыми и функциональными подоцитами. Интересно, что эти специализированные особенности заметно отсутствуют в увековеченной клеточной линии подоцитов, широко используемой в этой области, что говорит о том, что протокол, описанный в настоящем описании, производит почки человека, которые имеют более зрелый фенотип, чем существующие клеточные линии подоцитов, обычно используемые для изучения биологии почек человека.
Introduction
Достижения в области культуры плюрипотентных стволовых клеток человека готовы революционизировать регенеративную медицину, моделирование заболеваний и скрининг лекарств, предоставляя исследователям возобновляемый, масштабируемый источник биологического материала, который может быть спроектирован для получения практически любого типа клеток в организме человека1. Эта стратегия особенно полезна для получения специализированных и функциональных типов клеток, которые в противном случае было бы трудно получить. Индуцированные человеком плюрипотентные стволовые (hiPS) клетки2,3,4,5 особенно привлекательны из-за их соматического клеточного происхождения и потенциала, который они представляют для персонализированной медицины. Однако разработка методов получения других клеточных линий из hiPS-клеток остается сложной задачей из-за частого использования плохо определенных условий культивирования, что приводит к низкой эффективности и неспецифической генерации гетерогенных клеточных популяций6,7.
Здесь представлен способ получения зрелых почечных подоцитов из hiPS-клеток со специфичностью и высокой эффективностью в химически определенных условиях. Рассматривая роль нескольких факторов в клеточной микросреде, была разработана стратегия дифференцировки стволовых клеток, которая включала оптимизацию растворимых факторов, представленных в среде клеточной культуры, а также нерастворимых факторов, таких как компоненты внеклеточного матрикса или адгезивные субстраты. Учитывая важность передачи сигналов интегрина в развитии и функции подоцитов, первоначально исследовалась экспрессия рецепторов интегрина на поверхности клетки. Интегрины β1 были высоко экспрессированы не только в hiPS-клетках, но и в их производных, включая мезодерму и промежуточные клетки мезодермы8,9,10. Последующие эксперименты подтвердили, что лиганды, которые связываются с интегринами β1 (включая ламинин 511 или фрагмент ламинина 511-E8), поддерживают адгезию и дифференцировку hiPS-клеток в подоциты при использовании в сочетании с растворимыми индуктивными средами, описанными ниже.
Индукция приверженности клеточной линии была инициирована первым подтверждением того, что hiPS-клетки, культивируемые на поверхностях, покрытых ламинином, в течение двух дней в присутствии среды, содержащей Activin A, CHIR99021 и ингибитор породы Y27632, могут дифференцироваться в клетки, которые экспрессируют ранние маркеры мезодермы HAND1, гусыневые и брахиуры8,11. Лечение клеток мезодермы в течение 14 дней средой, дополненной костным морфогенетическим белком 7 (BMP-7) и CHIR99021, позволило получить промежуточные клетки мезодермы, которые экспрессировали нефрон-прогениторные клеточные маркеры опухоли Вильма 1 (WT1), нечетно пропущенный родственный белок 1 (OSR1)8,11и парный белок бокс-гена 2 (PAX2)12. Чтобы получить зрелые почечные клубочковые подоциты, промежуточные клетки мезодермы обрабатывали в течение 4-5 дней новой средой, состоящей из BMP-7, активина А, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), полностьютранс-ретиноевой кислоты и CHIR99021. Проточная цитометрия и иммуноокрашивание были использованы для подтверждения того, что >90% полученных клеток проявляли молекулярные, морфологические и функциональные характеристики зрелых подоцитов почек8,11,13. К таким характеристикам относятся развитие первичных и вторичных процессов стопы; экспрессия специфических для линии подоцитов генов, включая SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 и экспрессию белков, включая подоцин, нефрин и WT114,15,16. Кроме того, было обнаружено, что подоциты, полученные из клеток hiPS, могут поддерживаться в культуре до четырех недель in vitro с использованием коммерчески доступной среды8,11, которая обеспечивает дополнительную гибкость в сроках последующих экспериментов. Для получения дополнительной информации о панелях проточной цитометрии, используемых для определения чистоты hiPS-подоцитов, пожалуйста, обратитесь к нашей предыдущей публикации11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка реагентов
- Разбавляйте размороженные 5x hiPS клеточные культуральные среды (CCM) добавки в базальной среде культуры клеток hiPS для получения 1x раствора hiPS CCM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженная добавка 5x hiPS CCM требует медленного процесса оттаивания, в идеале при 4 °C в течение ночи. Аликвоты 1x hiPS CCM могут храниться до 6 месяцев при -20 °C. - Приготовление пластин с покрытием 1-слойной матрицы базальной мембраны (БМ) для культуры клеток hiPS: Оттаивать BM матрицу 1 на ночь на льду при 4 °C. После размораживания приготовьте аликвоты с соответствующими коэффициентами разбавления, как это предлагает производитель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, аликвоты готовят для последующего разбавления в 25 мл холодного DMEM/F12 в конической трубке 50 мл с последующим тщательным перемешиванием для полного растворения матрицы BM 1 и предотвращения образования остаточных кристаллов. - Переложить 1 мл раствора BM matrix 1 в каждую скважину из 6-й пластины скважины и инкубировать при 37 °C в течение 1-2 ч или при 4 °C в течение не менее 24 ч, обернутый парафиновой пленкой. Пластины с покрытием BM matrix 1 можно хранить при 4 °C до 2 недель.
- Получение матрицы 2 с покрытием из фундаментной мембраны (БМ): Разбавить соответствующие количества матрицы BM 2 в 9 мл стерильной дистиллированной воды для получения конечной концентрации 5 мкг/мл. Добавляют 700 мкл раствора матрицы BM 2 в каждую скважину из 12-й скважинной пластины и инкубируют пластину при комнатной температуре в течение 2 ч или на ночь при 4°С.
- Готовят по 100 мкг/мл растворов BMP7, Activin A и VEGF следующим образом: повторно воссоздают BMP7 в стерильной дистиллированной воде, содержащей 0,1% (мас./об.) BSA, и повторно воссоздают активин A и VEGF отдельно в стерильных PBS, содержащих 0,1% (мас./об.) BSA. Чтобы избежать частых циклов замораживания-оттаивания, приготовьте 100 мкл аликвот из каждого запасного раствора и храните при -20 °C до 6 месяцев.
- Приготовьте 10 мМ раствора Y27632, растворив 10 мг Y27632 в 3,079 мл стерильной дистиллированной воды. Аликвот 100 мкл со склада и хранить при -20 °C до 6 месяцев.
- Растворить 2 мг CHIR99021 в 143,4 мкл стерильного ДМСО для приготовления 30 мМ запасного раствора. Приготовьте 5 мкл аликвот и храните при -20 °C до 1 месяца (или по рекомендации производителя).
- Растворить 10 мг алл-транс-ретиноевой кислоты в 3,33 мл стерильного ДМСО. Приготовьте 500 мкл аликвоты и храните при -20 °C до 6 месяцев.
2. Подготовка питающих сред
- Готовят мезодермную дифференцированную среду путем восстановления соответствующих исходных растворов до конечной концентрации 100 нг/мл активина А, 3 мкМ CHIR99021, 10 мкМ Y27632 и 1x B27 без сыворотки добавки в соответствующем объеме DMEM/12 с добавкой глутамина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Среду дифференцировки мезодермы следует предварительно подготовить перед этапами дифференцировки и в объеме, соответствующем масштабу эксперимента (как правило, 50 мл среды достаточно для двух плит скважины по 12 скважин). - Готовят промежуточную среду дифференцировки мезодермы путем восстановления соответствующих растворов до конечной концентрации 100 нг/мл BMP7, 3 мкМ CHIR99021 и 1x B27 без сыворотки добавки в DMEM/F12 с добавкой глутамина.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости среду можно дополнить 1% (об/об)пенициллин-стрептомицин. Отрегулируйте объем среды с помощью DMEM/F12 с добавкой глутамина. Эта среда может быть приготовлена большими партиями; однако рекомендуется хранить в меньших аликвотах (например, 45 мл в конических трубках по 50 мл), чтобы избежать повторных циклов замораживания-оттаивания. Эти носители могут храниться при -20 °C в течение 3 месяцев и могут быть разморожено при 4 °C в течение ночи перед использованием. - Подготавливают среду индукции подоцитов путем повторного введения в конечную концентрацию 100 нг/мл BMP7, 100 нг/мл активина А, 50 нг/мл VEGF, 3 мкМ CHIR99021, 1x B27 без сыворотки добавки и 0,1 мкМ полностью транс-ретиноевой кислоты в DMEM/F12 с добавкой глутамина. Защитите среду от света (например, обернув контейнер фольгой).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта среда может быть приготовлена большими партиями и храниться в темноте при -20 °C в течение 3 месяцев. Замороженные аликвоты следует разморозить на ночь при 4 °C перед использованием. - Готовят 25 мл нейтрализующего трипсина раствора, добавляя 10% (об/об)инактивированный теплом FBS в DMEM/F12 и фильтруют в стерильных условиях.
- Для постдифференциационного поддержания подоцитов, полученных из стволовых клеток, подготовьте полную среду с поддерживающей средой подоцитов, добавив добавку в базальную среду в соответствии с рекомендациями производителя, и храните при 4 °C в течение двух недель.
3. Культура клеток hiPS без кормителя с использованием среды культуры клеток hiPS
- Аспирировать остаточный раствор BM матрицы 1 из предварительно покрытых пластин и промыть скважины 3 раза 1-2 мл нагретого DMEM/F12.
- Аспират проводят hiPS CCM из hiPS клеток и промывают клетки 3 раза с подогретым DMEM/F12. Добавьте 1 мл теплого раствора для отслоения клеток и инкубируют в течение 1 мин при 37 °C, чтобы помочь диссоциировать клетки. Выполните визуальный осмотр клеток под микроскопом культуры тканей и убедитесь, что края клеточных колоний кажутся округлыми, затем быстро аспирируют раствор отслоения клеток из клеток (гарантируя, что колонии клеток все еще прикреплены к пластине, хотя и свободно). Осторожно промыть клетки один раз DMEM/F12, чтобы удалить раствор для отсоединения клеток.
- Добавьте 3 мл hiPS CCM к ячейкам hiPS (в каждой скважине 6-скважинной пластины), которые были обработаны раствором для отсоединения клеток. Соскребайте колонии с помощью клеточного лифтера и осторожно суспензируйте клетки пипетки вверх и вниз, чтобы выбить слабо приклеенные клетки. Тщательно вымойте пластину, чтобы убедиться, что все клетки собраны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать пипетку 5 мл, чтобы избежать избыточного сдвига на клетках. - Перенесите 0,5 мл клеточной суспензии в каждую скважину новой 6-скважинной пластины с 6-м покрытием матрицы БМ, содержащей 2 мл hiPS CCM на скважину. Переместите пластину в виде восьмерки, чтобы распределить колонии клеток внутри колодцев и инкубировать при 37 °C в инкубаторе CO2 с 5%. Обновляйте среду ежедневно до тех пор, пока клетки не будут готовы к прохождению или использованию для эксперимента по дифференцировке (примерно 70% конфлюзии).
ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальный размер колонии для рутинного прохождения иПСК составляет от 200 до 500 мкм в условиях без фидеров с использованием hiPS CCM (без ингибитора ROCK). Если клетки индивидуализированы во время лечения ферментами диссоциации или буферами, hiPS CCM может быть дополнен ингибитором ROCK (например, 10 мкМ Y27632) для улучшения жизнеспособности клеток.
4. Дифференцировка hiPS-клеток в клетки мезодермы (дни 0-2)
- В то время как культуры клеток hiPS находятся в фазе экспоненциального роста (примерно в течение 4 дней после посева и около 70% слияния), визуально осмотрите наличие спонтанно дифференцированных клеток внутри и вокруг краев колоний. При необходимости асептически соскребают участки дифференциации.
- Аспирировать hiPS CCM из hiPS клеток и промыть клетки 3 раза теплым DMEM/F12. Инкубируйте клетки с 1 мл буфера диссоциации клеток без ферментов в течение 10 мин при 37 °C и проверьте диссоциацию под микроскопом. Из-за внутренних различий между различными клеточными линиями hiPS фактическое время инкубации для буфера диссоциации клеток должно быть определено для данной клеточной линии.
- Осторожно соскоблите колодец с помощью клеточного лифтера, чтобы выбить слабо приклееные клетки и перенести клеточную суспензию в коническую трубку 15 мл, а затем несколько раз пипетировать вверх и вниз для индивидуализации клеток hiPS.
- Доведите клеточную суспензию до объема 15 мл с теплым DMEM/F12 и центрифугой в течение 5 мин при 290 х г при комнатной температуре.
- Осторожно аспирируют супернатант и повторно суспендируют ячейки теплым DMEM/F12 для еще одного раунда центрифугирования для удаления остаточной матрицы BM 1 и компонентов буфера диссоциации.
- Аспирировать надотворные и повторноуспендные клетки в 1 мл индукционной среды мезодермы, как описано выше. Подсчитайте общее количество клеток с помощью гемоцитометра или счетчика сошника для определения соответствующего объема мезодермной дифференцированной среды, необходимой для достижения концентрации 1 х 105 клеток/мл.
- Аспирировать раствор ECM из пластин с 2-м покрытием BM matrix и дважды промыть пластины теплым DMEM/F12. Осторожно перемешайте суспензию клеток hiPS, несколько раз пипеткой. Переложите 1 мл клеточной суспензии в каждую скважину 12-скважинных пластин матрицы BM, покрытой 2, а затем осторожно встряхните пластины, чтобы распределить ячейки более равномерно.
- Инкубировать пластину при 37 °C в 5% CO2 инкубаторе. Освежите среду индукции мезодермы на следующий день.
ПРИМЕЧАНИЕ: Через 2 дня клетки мезодермы, полученные из hiPS, будут готовы к промежуточной индукции мезодермы.
5. Дифференцировка мезодермных клеток hiPS-клеток в промежуточные мезодермы (дни 2-16)
- На 2 день протокола дифференцировки аспирируют мезодерму индукционной средой и пополняют 1 мл на скважину промежуточную мезодерму индукционной среды.
- Обновляйте среду каждый день, чтобы поддерживать точный порог факторов роста и малых молекул для метаболически активных клеток. При значительном росте клеток и быстром истощении питательных веществ среды (на что указывает пожелтение среды) объем промежуточной мезодермной дифференцировочной среды может быть увеличен до 1,3 мл на скважину из 12 пластин скважины.
- Культивировать клетки дополнительно 14 дней для получения промежуточных клеток мезодермы. К 16-му дню эти клетки могут быть криоконсервы для последующего использования.
6. Дифференцировка промежуточных клеток мезодермы hiPS в подоциты (дни с 16 по 21)
- Промежуточные клетки мезодермы промыть теплым DMEM/F12 с последующим инкубацией клеток с 0,5 мл на скважину 0,05 % трипсина-ЭДТА в течение 3 мин при 37 °C. Провести визуальный осмотр, чтобы убедиться, что клетки начинают диссоциировать.
- Соскребайте ячейки с помощью клеточного лифтера и пипетки клеточной суспензии несколько раз, используя наконечник пипетки 1000 мкл для получения индивидуализированных (или небольших скоплений) клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе убедитесь, что клетки полностью диссоциированы, поскольку агрегированные клетки могут не приобрести терминально дифференцированный фенотип в течение временной шкалы протокола. - Добавьте около 2 мл на скважину трипсина, чтобы остановить активность трипсина.
- Перенесите ячейки в коническую трубку объемом 50 мл и доведите объем до 50 мл с помощью DMEM/F12, а затем центрифугируют клеточную суспензию в течение 5 мин при 201 х г при комнатной температуре.
- Аспирировать надпомнивные и повторно суспендировать клетки в среде индукции подоцитов. Для достижения оптимальных результатов обеспечьте окончательную плотность посева примерно 100 000 клеток/скважину плиты из 12 скважин. Добавьте клеточную суспензию к пластинам с 2-м покрытием BM-матрицы и осторожно встряхните пластину, чтобы помочь распределить клетки более равномерно.
- Инкубировать клетки при 37 °C и 5% CO 2 и обновлятьсреду ежедневно в течение 5 дней для получения подоцитов к 21-му дню.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полученные в результате hiPS-клеточные подоциты могут поддерживаться в культуре в течение 2-4 дополнительных недель с использованием полной среды с поддерживающей средой подоцитов. Попав в поддерживающую питательную жиму подоцитов, клетки можно кормить через день и могут использовать для последующих исследований или последующих анализов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Цель этого протокола состояла в том, чтобы продемонстрировать, что зрелые человеческие подоциты могут быть получены из hiPS-клеток в химически определенных условиях. Данные, представленные в этой рукописи, были сгенерированы с использованием клеточной линии DU11 hiPS17,которые были впервые протестированы и оказались свободными от микоплазмы. Также был проведен хромосомный анализ, и было обнаружено, что клетки являются кариотипически нормальными. Начиная с недифференцированных hiPS-клеток DU11, стратегия дифференцировки(рисунок 1),описанная в этом отчете, была использована для сначала дифференцировки стволовых клеток(рисунок 2A)в клетку мезодермы, которая экспрессирует Брахиурию (T)(Рисунок 1B и Рисунок 2B),за которой последовала дифференцировка в PAX2-положительные промежуточные мезодермные клетки(Рисунок 2C)и, наконец, в зрелые клубочковые подоциты почек(Рисунок 1B, Рисунок 2D, Рисунок 3Dи Рисунок 4). Клетки мезодермы были получены ко 2-му дню протокола дифференцировки, промежуточные клетки мезодермы были сгенерированы к 16-му дню, а зрелые подоциты были получены к 21-му дню протокола дифференцировки. Полученные подоциты были размером около 150-200 мкм при прилипании к плоской поверхности культуры ткани, такой как пластины с ламининовым покрытием, используемые в этом эксперименте. Подоциты, полученные из клеток hiPS, демонстрируют многочисленные расширения, подобные процессу стопы, которые были визуализированы с использованием нескольких дополнительных методов, включая фазово-контрастную микроскопию(Рисунок 1),иммунофлуоресцентную микроскопию(Рисунок 4)и сканирующую электронную микроскопию8,11. Подоциты, полученные из стволовых клеток, также окрашены положительно для WT115 (рисунок 2D),а также для маркера идентификации линии нефрина14 (рисунок 4). Интересно, что субклеточная локализация нефрина была преимущественно в процессах стопы подоцитов и цитоплазме клеток, что согласуется со зрелым фенотипом подоцитов(Рисунок 2D и Рисунок 4A,B). Во время развития и в физиологии подоцитов белок нефрин курсирует между ядром клетки и цитоплазмой, но нефрин становится преимущественно выраженным в цитоплазме и ножных процессах по мере созревания подоцитов и приобретения функционального фенотипа18. Таким образом, наблюдение за тем, что подоциты, полученные с помощью протокола дифференцировки, описанного в настоящем описании, экспрессируют нефрин в основном в цитоплазме и ножных процессоподобных структурах, подчеркивает полезность этого протокола для генерации более зрелых или специализированных подоцитов. Сканируя электронные микроснимки подоцитов, полученных из клеток hiPS, подчеркивают разветвление первичных и вторичных процессов стопы в подоцитах, полученных из клеток hiPS, как ранее сообщалось в нашей группе8,11. Поскольку WT1 сам по себе не является окончательным маркером почечных подоцитов, настоятельно рекомендуется, чтобы исследователи также характеризовали их клетки для одновременной экспрессии специфических для подоцитов маркеров, таких как подоцин и нефрин. Ранее было показано, что терминально дифференцированные подоциты, полученные с помощью этого метода, иммунопятничали положительно на подоцин, нефрин и WT1, с соответствующим снижением экспрессии клеточного маркера-прародителя PAX28,11. Вместе эти результаты указывают на то, что подоциты, полученные с использованием этого протокола, являются зрелыми или специализированными, как это требуется для функционального клубочкового подоцита почки человека.
При оптимизации условий для метода дифференцировки наблюдались случаи, когда промежуточные клетки мезодермы были неадекватно диссоциированы. Клетки, посеянные при плотности, которая значительно превышала рекомендуемую плотность 100 000 клеток / колодец 12-хорошей пластины (до конечной ступени индукции подоцитов), приводили к большим кластерам клеток, которые не имели ожидаемого морфологического фенотипа зрелых подоцитов в пределах стандартной временной шкалы протокола(рисунок 3A, B). По этим причинам рекомендуется, чтобы исследователи использовали плотности посева, рекомендованные в этом протоколе(рисунок 3C, D),прежде чем экспериментировать с другими условиями, которые могут быть желаемы для конкретных последующих применений. Вместе эти результаты представляют собой направленную дифференцировку hiPS-клеток в клубочковые подоциты почек в течение трех недель с использованием химически определенных сред, описанных выше.
Рисунок 1: Дифференцировка hiPS-клеток в подоциты.
(A)Схематическое представление способа направленной дифференцировки hiPS-клеток в подоциты. BMP7, костный морфогенетический белок 7; РА, ретиноевая кислота; VEGF, фактор роста эндотелия сосудов. Эта цифра была изменена по сравнению со ссылкой11. (B) Репрезентативные изображения hiPS-клеток на каждой стадии дифференцировки. Слева направо изображения показывают характерные колонии iPS-клеток человека до диссоциации для дифференцировки на 0-й день, за которыми следуют клетки мезодермы после 2 дней дифференцировки, затем промежуточные клетки мезодермы примерно через 10 дней дифференцировки и, наконец, терминально дифференцированные подоциты на 22-й день. Шкала, 100 мкм для всех изображений (на панели B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Иммунофлуоресцентные изображения hiPS-клеток и их дифференцированных производных, показывающие экспрессию специфических для линии маркеров и ядерное контрокрашивание во время временной шкалы дифференцировки.
(A)Человеческие iPS-клетки, экспрессирующие маркер плюрипотентности Oct4; (В)клетки мезодермы, экспрессирующие брахиуры (Т); (C)промежуточные клетки мезодермы, экспрессирующие PAX2; и(D)подоциты, полученные из клеток hiPS, экспрессирующие маркер идентификации линии, нефрин, и связанный с ним маркер WT1. Шкала, 100 мкм для всех изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Влияние неоптимальной плотности посева на дифференцировочный потенциал промежуточных клеток мезодермы, полученных из клеточной линии DU11 hiPS.
(A)Когда начальная плотность посева клеток слишком высока (приблизительно 500 000 клеток / скважина 12-хорошей пластины), клетки могут образовывать плотные агрегаты(B)на стадии индукции подоцитов. (C)Рекомендуемая плотность посева для предотвращения слипания (100 000 клеток / колодец 12-колодезной пластины) и для микроскопического наблюдения(D)расширения структур, подобных процессу стопы, во время фазы дифференцировки подоцитов (вставка). Шкала стержня, 200 мкм для A-D; и 100 мкм для вставки в D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: подоциты, полученные из клеток hiPS, демонстрируют морфологически зрелый фенотип in vitro.
(A)Иммуноокрашивание подоцитов, полученных из клеток hiPS, для нефрина и(B)более высокое увеличение изображений процессов стопы подоцитов, показывающих первичные и вторичные процессы (белые стрелки), а также экспрессию нефрина в этих специализированных клеточных структурах. Шкала стержня, 100 мкм (А); 50 мкм (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом отчете мы описываем протокол генерации клубочковых подоцитов почек из hiPS-клеток. Подоциты, полученные из клеток hiPS, демонстрируют морфологические и молекулярные особенности, связанные со зрелым фенотипом подоцитов почек13. В предыдущих публикациях мы показали, что подоциты, полученные из клеток hiPS, могут имитировать структуру и селективную фильтрационную функцию клубочка почки при совместной культивировании с клубочковыми микрососудистыми эндотелиальными клетками в перфузируемом микрофлюидном устройстве8,11.
Следующие критические шаги должны быть рассмотрены исследователями, заинтересованными в адаптации этого протокола. Во-первых, посев hiPS-клеток на пластины, покрытые ламинином, для индукции клеток мезодермы является решающим шагом. Хотя рекомендуется плотность посева 100 000 клеток / колодец, исследователи могут скорректировать начальную плотность посева клеток в зависимости от скорости репликации линии стволовых клеток, используемой для исследования. При необходимости эта оптимизация обеспечит адекватную плотность клеток на стадии индукции мезодермы и предотвратит образование клеточных агрегатов или очень больших сгустков, которые потенциально могут поставить под угрозу качество мезодермы, промежуточной мезодермы или фенотипа подоцитов(рисунок 3). Также важно отметить, что различия в спецификациях производителя для некоторых реагентов, таких как CHIR99021, могут влиять на качество дифференцированных клеток. Таким образом, целесообразно тестировать реагенты из разных номеров партий или поставщиков и продавцов на их биологическую активность и согласованность между независимыми экспериментами. Кроме того, важно избегать чрезмерного воздействия ферментов диссоциации на hiPS-клетки, поскольку это может привести к нежелательной отслойку от адгезивной матрицы и возможной потере клеток во время аспирации среды. Другим важным шагом, заслуживающим внимания, является обеспечение защиты среды индукции подоцитов от света для предотвращения фотоиндуцированной инактивации ретиноевой кислоты.
По сравнению с предыдущими методами дифференцировки почечных подоцитов человека, способ, описанный здесь, использует химически определенные факторы (включая малые молекулы, факторы роста и специфические изоформы белков базальной мембраны в желаемых концентрациях) по мере необходимости для регулирования специфических клеточных сигнальных путей, участвующих в развитии почек и функции подоцитов. В частности, генерация клеток мезодермы из hiPS-клеток включала активацию канонического сигнального пути Wnt, осуществляемого с помощью малой молекулы CHIR9902119. Известно, что канонический сигнальный путь Wnt регулирует транскрипционную активность генов, участвующих в развитии тканей и паттернинге in vivo, а также пролиферацию и миграцию клеток20,21. Клеточная индукционная среда, используемая в этом протоколе, позволяет получать подоциты из промежуточных мезодермных клеток iPS-клеток. Эта индукционная среда подоцитов состоит из активина А, BMP7, VEGF, ретиноевой кислоты и CHIR99021. Примечательно, что эта среда индукции подоцитов не требует неопределенных компонентов сыворотки, таких как фетальная бытовая сыворотка, которые могут скрывать вклад конкретных факторов и ограничивать применение других методов дифференцировки клеток для механистических исследований развития тканей и заболеваний, что делает ее отличной от тех, которые использовались в предыдущих попытках генерации почечных клеток типов22. Дополнительно было отмечено, что FGF2 и FGF9 не требуются для дифференцировки почечных подоцитов из hiPS-клеток6,7,22. В то время как предыдущие методы зависели от образования многоклеточных агрегатов, таких как эмбриоидные тела и органоиды, описанный здесь способ продуцирует клетки, которые демонстрируют зрелый фенотип, как морфологически, так и путем экспрессии специфических маркеров линии, включая нефрин и подоцин, и понижающей регуляции клеточных маркеров-прародителей, таких как PAX2. Ожидается, что знание химических компонентов, используемых в этом протоколе, может облегчить механистические исследования развития почечной ткани человека, спецификации линии подоцитов и патогенеза заболевания в будущем.
Этот метод дифференцировки клеток hiPS также позволяет генерацию зрелых, постмитотических и функциональных подоцитов с эффективностью более 90% без субпопуляционного отбора, генетических манипуляций или ксенотрансплантации. Это заметно отличается от предыдущих попыток, когда высокие уровни клеточной гетерогенности6,7,23 ограничивали использование методов дифференцировки стволовых клеток для применения в трансляционной медицине. Этот метод также представляет собой значительный прогресс для этой области, учитывая проблемы, связанные с чрезвычайно ограниченной доступностью почек человека из других источников, таких как первичные ткани или органоиды. Некоторые из проблем включают низкую эффективность деривации менее 1% при использовании методов, которые полагаются на формирование эмбриональных тел или органоидов6,7.
Одним из ограничений этого протокола является относительно высокая стоимость реагентов, необходимых для культуры стволовых клеток и этапов дифференцировки, что может препятствовать его внедрению в некоторых лабораториях или исследовательских группах. Кроме того, поскольку было задействовано много оптимизации для нескольких факторов в микроокружении клетки (т. Е. Как растворимых, так и нерастворимых или адгезивных сигналов), мы рекомендуем, чтобы протокол соблюдал описанный. Распространенная ошибка, отмеченная другими, кто был заинтересован в использовании этого метода дифференцировки подоцитов, включала использование неподходящих матриц клеточной адгезии, таких как матрица BM 1 или другие плохо определенные белки животного происхождения. Как только протокол соблюдается, как описано, могут быть проведены дальнейшие эксперименты для изучения эффективности других модификаций протокола. Кроме того, из-за присущих различий между различными линиями стволовых клеток человека стоит отметить, что некоторые аспекты метода дифференцировки, например, сроки воздействия среды дифференцировки или среды диссоциации клеток и плотности посева клеток, возможно, нуждаются в оптимизации. Однако эти условия не были изменены для линий клеток hiPS и эмбриональных стволовых клеток, протестированных на сегодняшний день. Этот метод дифференцировки подоцитов работает на нескольких клеточных линиях hiPS, включая PGP1, IMR-90-1 и IISH3i-CB6, а также линию эмбриональных стволовых клеток H98,11. В этом отчете мы также демонстрируем успешную дифференциацию клеточной линии DU11 hiPS с использованием одного и того же протокола(рисунок 1 и рисунок 2). Таким образом, учитывая согласованность этого метода по различным клеточным линиям, включая результаты неопубликованной работы других независимых исследовательских лабораторий (предварительная публикация), мы ожидаем, что этот протокол дифференцировки будет полезен для получения почечных подоцитов из широкого спектра клеточных линий hiPS, и, следовательно, не ограничивается тем, который используется в этом протоколе.
Учитывая способность hiPS-клеток к самообновлению на неопределенный срок, этот метод дифференцировки может быть использован для предоставления исследователям легкодоступного источника подоцитов почек человека. Это может помочь продвинуть текущее понимание биологии почек человека и болезни24, а также позволить разработать новые системы почек in vitro для моделирования функции почек человека и реакций на терапию. Например, протокол, описанный в настоящем описании, был недавно использован и интегрирован с микрофлюидной системой «орган на чипе» для разработки функциональной модели in vitro стенки клубочкового капилляра почки человека. Этот клубочковый чип избирательно фильтровал циркулирующие молекулы и рекапитулировал нефротоксичность, вызванную лекарственными средствами, при воздействии химиотерапевтического препарата Адриамицин8. В будущем эти результаты потенциально могут быть интегрированы с технологиями 3D-биопечати для разработки более сложных моделей почек человека in vitro. Такие достижения могут обеспечить новые платформы для оценки кандидатов на лекарства, особенно те, которые нацелены на формы заболеваний почек, возникающих из-за дисфункции клубочковых подоцитов. Это особенно важно, поскольку видоспецифические различия животных моделей и отсутствие функциональных возможностей на уровне органов, обычно наблюдаемых в стандартных методах культивирования тканей, могут препятствовать разработке таргетных терапевтических средств для различных форм заболеваний почекчеловека25. Таким образом, этот протокол может, когда-нибудь, предоставить возможности для разгадки сигнальных путей, участвующих в развитии почек человека, а также патогенеза заболевания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
С.M. является автором патента на способы генерации почечных подоцитов из плюрипотентных стволовых клеток (заявка на патент США 14/950859). Остальные авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Инженерной школой Пратта в Университете Дьюка, Отделом нефрологии в Медицинской школе Дьюка, Премией за исследования кафедры от Департамента медицины в Университете Дьюка и Специальной премией Фонда Берроуза Wellcome FUND PDEP Career Transition Ad Hoc Award для S.M.. M.B была поддержана Программой стипендий для аспирантов Национального научного фонда. Мы благодарим лабораторию Bursac за щедрое предоставление нам линии стволовых клеток DU11 и лабораторию Варгезе в Университете Дьюка за временное совместное использование своего центра культивирование тканей с нашей группой. Эта публикация посвящена профессору Лауре Л. Кисслинг, профессору химии Novartis в Массачусетском технологическом институте, в честь празднования ее60-летия.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal. | ||
| Growth Factors and Media Supplements | |||
| All-trans retinoic acid (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| B27 serum-free supplement | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | May show lot-to-lot variation |
| Complete Medium Kit with CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Cell Systems | Podocyte maintenance media |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 with glutamine supplement |
| Heat-inactivated FBS | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| Human activin A | PHC9564 | Thermo/Life Technologies | |
| Human BMP7 | PHC9544 | Thermo/Life Technologies | |
| Human VEGF | PHC9394 | Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 medium | 05850 | Stem Cell Technologies | hiPS cell culture media (CCM) |
| Penicillin–streptomycin, liquid (100×) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 ROCK inhibitor | 1254 | Tocris | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T) | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R&D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | N-892012 | Iwai North America | Basement membrane (BM) matrix 2 |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | 354277 | BD Biosciences | Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation |
| Enzymes and Other Reagents | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Cell detachment solution |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood |
| Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | 97065-058 | VWR | Ethanol is flammable and toxic |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyde (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Sterile Distilled Water | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Aspirating pipettes, individually wrapped | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R Centrifuge | B99516 | Beckman Coulter | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | 352097 | Corning | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryoboxes | 3395465 | Thermo/Life Technologies | For storing frozen aliquots |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives |
| Hemocytometer | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | 51030403 | Thermo/Life Technologies | For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives |
| Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | Carl Zeiss Microscopy | Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation |
| Kimberly-Clark nitrile gloves | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, large | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, small | 21905-026 | VWR | |
| P10 precision barrier pipette tips | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 barrier pipette tips | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 barrier pipette tips | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 barrier pipette tips | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 barrier pipette tips | P1122 | Denville Scientific | |
| Serological pipette, 10 mL, individually wrapped | 356551 | Corning | |
| Serological pipette, 25 mL, individually wrapped | 356525 | Corning | |
| Serological pipette, 5 mL, individually wrapped | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0.22 μm, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes | 1138W14 | Thomas Scientific | For aliquoting growth factors |
| Tissue culture–treated 12-well plates | 353043 | Corning | |
| Tissue culture–treated six-well plates | 353046 | Corning | |
| VWR white techuni lab coat | 10141-342 | VWR | |
| Wide-beveled cell lifter | 3008 | Corning |
References
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, 1145 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526, 564-568 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33, 1193-1200 (2015).
- Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13, 1662-1685 (2018).
- Pozzi, A., et al. Beta1 integrin expression by podocytes is required to maintain glomerular structural integrity. Developmental Biology. 316, 288-301 (2008).
- Kanasaki, K., et al. Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus. Developmental Biology. 313, 584-593 (2008).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).
- Torban, E., et al. PAX2 Activates WNT4 Expression during Mammalian Kidney Development. Journal of Biological Chemistry. 281, 12705-12712 (2006).
- Reiser, J., Sever, S. Podocyte biology and pathogenesis of kidney disease. Annual Review of Medicine. 64, 357-366 (2013).
- Kuusniemi, A. M., et al. Tissue Expression of Nephrin in Human and Pig. Pediatric Research. 55, 774-781 (2004).
- Guo, J. K., et al. WT1 is a key regulator of podocyte function: reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis. Human Molecular Genetics. 11, 651-659 (2002).
- Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. American Journal of Pathology. 160, 131-139 (2002).
- Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825 (2017).
- Satoh, D., et al. aPKCλ maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. The Journal of Biochemistry. 156, 115-128 (2014).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
- Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
- Clevers, H., Nusse, R. Wntβ-Catenin Signaling and Disease. Cell. 149, 1192-1205 (2012).
- Ciampi, O., et al. Generation of functional podocytes from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 17, 130-139 (2016).
- Fuente Mora, C., et al. Differentiation of Podocyte and Proximal Tubule-Like Cells from a Mouse Kidney-Derived Stem Cell Line. Stem Cells and Development. 21, 296-307 (2011).
- Chuah, J. K. C., Zink, D. Stem cell-derived kidney cells and organoids: Recent breakthroughs and emerging applications. Biotechnology Advances. 35, 150-167 (2017).
- Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).
