Summary
Apresentado aqui é um protocolo quimicamente definido para a derivação de podocitos renais humanos de células-tronco pluripotentes induzidas com alta eficiência (>90%) e independente de manipulações genéticas ou seleção de subpopulação. Este protocolo produz o tipo de célula desejada dentro de 26 dias e pode ser útil para testes de nefrocoxicidade e modelagem de doenças.
Abstract
A doença renal afeta mais de 10% da população global e custa bilhões de dólares em gastos federais. As formas mais graves de doença renal e eventual insuficiência renal em estágio terminal são frequentemente causadas pelo dano aos podocitos glomerulares, que são as células epiteliais altamente especializadas que funcionam junto com células endoteliais e a membrana do porão glomerular para formar a barreira de filtragem do rim. Os avanços na medicina renal têm sido dificultados pela limitada disponibilidade de tecidos primários e pela falta de métodos robustos para a derivação de células renais humanas funcionais, como os podocitos. A capacidade de derivar podocitos de fontes renováveis, como células-tronco, poderia ajudar a avançar a compreensão atual dos mecanismos de desenvolvimento renal humano e doenças, bem como fornecer novas ferramentas para a descoberta terapêutica. O objetivo deste protocolo foi desenvolver um método para derivar podocitos maduros e pós-mitóticos de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPS) com alta eficiência e especificidade, e sob condições quimicamente definidas. Os podócitos derivados de células hiPS produzidos por este método expressam marcadores específicos de linhagem (incluindo nefrina, podocina e tumor 1 de Wilm) e exibem as características morfológicas especializadas (incluindo processos de pé primário e secundário) associadas a podocitos maduros e funcionais. Curiosamente, essas características especializadas estão notavelmente ausentes na linha celular podocito imortalizada amplamente utilizada no campo, o que sugere que o protocolo descrito aqui produz podocitos renais humanos que têm um fenótipo de desenvolvimento mais maduro do que as linhas celulares podocyte existentes normalmente usadas para estudar biologia renal humana.
Introduction
Os avanços na cultura das células-tronco pluripotentes humanas estão prontos para revolucionar a medicina regenerativa, a modelagem de doenças e o rastreamento de medicamentos, fornecendo aos pesquisadores uma fonte renovável e escalável de material biológico que pode ser projetado para obter quase qualquer tipo de célula dentro do corpo humano1. Essa estratégia é especialmente útil para o derivado de tipos de células especializadas e funcionais que, de outra forma, seriam difíceis de obter. As células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPS)células 2,3,4,5 são particularmente atraentes devido à sua origem celular somática e ao potencial que representam para a medicina personalizada. No entanto, o desenvolvimento de métodos para derivar outras linhagens celulares de células hiPS permanece desafiador devido ao uso frequente de condições culturais mal definidas que levam à baixa eficiência e geração não específica de populações de células heterogênios6,7.
Apresentado aqui é um método para a derivação de podocitos renais maduros de células hiPS com especificidade e alta eficiência em condições quimicamente definidas. Ao considerar os papéis de múltiplos fatores dentro do microambiente celular, desenvolveu-se uma estratégia de diferenciação de células-tronco que envolveu a otimização de fatores solúveis apresentados no meio da cultura celular, bem como fatores insolúveis, como componentes da matriz extracelular ou substratos adesivos. Dada a importância da sinalização integrin no desenvolvimento e função podocyte, a expressão de receptores integrin na superfície celular foi inicialmente examinada. β1 integrins foram altamente expressos não apenas em células hiPS, mas também em seus derivados, incluindo mesoderme e células intermediárias de mesoderme8,9,10. Experimentos subsequentes confirmaram que ligantes que se ligam a β1 integrinos (incluindo laminina 511 ou fragmento de laminina 511-E8) suportam a adesão e diferenciação das células hiPS em podocitos quando usados em conjunto com a mídia indutiva solúvel descrita abaixo.
A indução do compromisso de linhagem celular foi iniciada pela primeira vez confirmando que as células hiPS cultivadas nas superfícies revestidas de laminina por dois dias na presença de um meio contendo Activin A, CHIR99021 e Y27632 O inibidor de rocha pode se diferenciar em células que expressam os primeiros marcadores de mesoderme HAND1, goosecoid e brachyury8,11. O tratamento das células de mesoderme por 14 dias com um meio suplementado com proteína morfogenética óssea 7 (BMP-7) e CHIR99021 possibilitou a derivação de células intermediárias de mesoderme que expressavam os marcadores celulares nefrão-progenitor do Tumor 1 (WT1), proteína relacionada 1 (OSR1)8,11, e gene de caixa emparelhada 2 proteína (PAX2)12. Para derivar os podocitos glomerulares renais maduros, as células mesoderm intermediárias foram tratadas por 4-5 dias com um novo meio composto por BMP-7, Activin A, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), ácido retinóicototalmente trans e CHIR99021. A citometria de fluxo e a imunossuagem foram utilizadas para confirmar que >90% das células resultantes apresentavam as características moleculares, morfológicas e funcionais do podocito renal maduro8,11,13. Essas características incluem o desenvolvimento de processos de pé primário e secundário; a expressão de genes específicos de linhagem podocyte, incluindo SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 e a expressão de proteínas incluindo podocina, nefrina e WT114,15,16. Além disso, verificou-se que os podocitos derivados de células hiPS podem ser mantidos na cultura por até quatro semanas in vitro usando um meiocomercialmentedisponível 8,11 que fornece uma flexibilidade adicional no tempo de experimentos a jusante. Para obter mais informações sobre os painéis de citometria de fluxo utilizados para determinar a pureza dos hiPS-podocytes, consulte nossa publicação anterior11.
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Protocol
1. Preparação de reagentes
- Diluir o suplemento de mídia de cultura celular hiPS (CCM) descontou em meio basal de cultura celular hiPS para obter uma solução 1x de hiPS CCM.
NOTA: O suplemento CCM de 5x congelado requer um processo de descongelamento lento, idealmente em 4 °C durante a noite. As alíquotas do CCM 1x hiPS podem ser armazenadas por até 6 meses a -20 °C. - Preparação da matriz de membrana de porão (BM) placas revestidas de 1 para a cultura celular hiPS: Descongelar matriz BM 1 durante a noite no gelo a 4 °C. Uma vez descongelado, prepare alíquotas com fatores de diluição adequados, conforme sugerido pelo fabricante.
NOTA: Normalmente, as alíquotas são preparadas para diluição subsequente em 25 mL de DMEM/F12 frio em um tubo cônico de 50 mL seguido de mistura completa para dissolver completamente a matriz BM 1 e evitar a formação de cristais residuais. - Transfira 1 mL da solução BM matrix 1 para cada poço de uma placa de 6 poços e incubar a 37 °C por 1-2 h ou a 4 °C pelo mínimo de 24h, envolto em filme de parafina. As placas revestidas da matriz BM 1 podem ser armazenadas a 4 °C por até 2 semanas.
- Preparação da matriz de membrana de porão (BM) 2 - placas revestidas: Diluir quantidades apropriadas de matriz BM 2 em 9 mL destilada estéril para preparar uma concentração final de 5 μg/mL. Adicione 700 μL da solução BM matrix 2 a cada poço de uma placa de 12 poços e incubar a placa em temperatura ambiente por 2h ou durante a noite a 4 °C.
- Prepare 100 soluções de estoque μg/mL cada uma de BMP7, Activin A e VEGF da seguinte forma: reconstitua bmp7 em água destilada estéril contendo 0,1% (wt/vol) BSA e reconstituir Activin A e VEGF separadamente em PBS estéril contendo 0,1% (wt/vol) BSA. Para evitar ciclos frequentes de congelamento, prepare 100 alíquotas de μL de cada solução de estoque e armazene a -20 °C por até 6 meses.
- Prepare uma solução de estoque de 10 mM de Y27632 dissolvendo 10 mg de Y27632 em 3,079 mL de água destilada estéril. Alíquota de 100 μL do estoque e loja a -20 °C por até 6 meses.
- Dissolver 2 mg de CHIR99021 em 143,4 μL de DMSO estéril para preparar uma solução de estoque de 30 mM. Prepare 5 alíquotas de μL e armazene a -20 °C por até 1 mês (ou de acordo com a recomendação do fabricante).
- Dissolva 10 mg de ácido retinóicotrans em DMSO estéril de 3,33 mL. Prepare 500 alíquotas de μL e armazene a -20 °C por até 6 meses.
2. Preparação de meios de comunicação culturais
- Prepare o meio de diferenciação de mesoderm reconstituindo soluções de estoque correspondentes para uma concentração final de 100 ng/mL Activin A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632 e 1x suplemento sem soro B27 em um volume apropriado de DMEM/12 com suplemento de glutamina.
NOTA: O meio de diferenciação de mesoderm deve ser recém-preparado antes das etapas de diferenciação e em um volume apropriado para a escala do experimento (normalmente, 50 mL de meio é adequado para duas placas de 12 poços). - Prepare o meio de diferenciação de mesoderme intermediário, reconstituindo soluções de estoque correspondentes para uma concentração final de 100 ng/mL BMP7, 3 μM CHIR99021 e 1x suplemento sem soro B27 no DMEM/F12 com suplemento de glutamina.
NOTA: Se necessário, o meio pode ser suplementado com penicilina-estreptomicina de 1% (vol/vol). Ajuste o volume do meio usando DMEM/F12 com suplemento de glutamina. Este meio pode ser preparado em grandes lotes; no entanto, recomenda-se armazenar em alíquotas menores (por exemplo, 45 mL em tubos cônicos de 50 mL) para evitar ciclos repetidos de congelamento. Esta mídia pode ser armazenada a -20 °C por até 3 meses e pode ser descongelada a 4 °C durante a noite antes de ser usada. - Prepare o meio de indução de podocito reconstituindo-se a uma concentração final de 100 ng/mL BMP7, 100 ng/mL activin A, 50 ng/mL VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x suplemento sem soro B27 e 0,1 μM de ácido retinóico totalmente trans em DMEM/F12 com suplemento de glutamina. Proteger o meio da luz (por exemplo, embrulhando recipiente com papel alumínio).
NOTA: Este meio pode ser preparado em lotes grandes e armazenado no escuro a -20 °C por até 3 meses. As alíquotas congeladas devem ser descongeladas durante a noite a 4 °C antes de serem usada. - Prepare 25 mL de solução neutralizante de trippsina adicionando FBS inativados de calor de 10% (vol/vol) em DMEM/F12 e filtro em condições estéreis.
- Para manutenção pós-diferenciação dos podocitos derivados de células-tronco, prepare o Meio Completo com mídia de manutenção de podocyte adicionando o suplemento ao meio basal de acordo com as diretrizes do fabricante e armazene a 4 °C por até duas semanas.
3. Cultura celular hiPS livre de alimentadores usando meio de cultura de células hiPS
- Aspire a solução residual da matriz BM 1 das placas pré-revestidas e lave os poços 3 vezes com 1 a 2 mL de DMEM/F12 aquecidos.
- Aspirado passou hiPS CCM das células hiPS e enxaguar as células 3 vezes com DMEM/F12 aquecido. Adicione 1 mL de solução de descolamento de células quentes e incubar por 1 min a 37 °C para ajudar a dissociar as células. Realizar a inspeção visual das células sob um microscópio de cultura tecidual e garantir que as bordas das colônias celulares apareçam arredondadas, em seguida, aspire rapidamente a solução de descolamento celular das células (garantindo que as colônias celulares ainda estejam presas à placa, embora vagamente). Enxágue suavemente as células uma vez com DMEM/F12 para remover a solução de descolamento celular.
- Adicione 3 mL de hiPS CCM às células hiPS (em cada poço de uma placa de 6 poços) que foram tratadas com a solução de desapego celular. Raspe colônias usando um levantador de células, e suavemente suspensão de células pipetas para cima e para baixo para desalojar as células frouxamente aderidas. Lave bem a placa para garantir que todas as células sejam colhidas.
NOTA: Recomenda-se o uso de uma pipeta de 5 mL para evitar o excesso de tesoura nas células. - Transfira 0,5 mL da suspensão da célula para cada poço de uma nova placa de 6 poços revestidos de matriz BM com 1 poço contendo 2 mL de ccm hips por poço. Mova a placa na forma de figura oito para distribuir colônias de células dentro de poços e incubar a 37 °C em uma incubadora de 5 % de CO2. Atualize o meio diariamente até que as células estejam prontas para serem passagem ou usadas para o experimento de diferenciação (aproximadamente 70 % de confluência).
NOTA: O tamanho ideal da colônia para a passagem de rotina de iPSCs é entre 200-500 μm em condições livres de alimentador usando hiPS CCM (sem inibidor de ROCHA). Se as células forem individualizadas durante o tratamento com enzimas ou tampões de dissociação, o hiPS CCM pode ser suplementado com inibidor de ROCHA (por exemplo, 10 μM Y27632) para melhorar a viabilidade celular.
4. Diferenciação de células hiPS em células de mesoderme (dias 0-2)
- Enquanto as culturas celulares hiPS estão em fase de crescimento exponencial (aproximadamente dentro de 4 dias de cultura após a passagem, e cerca de 70% de confluência), inspecionam visualmente a presença de células espontaneamente diferenciadas dentro e ao redor das bordas das colônias. Se necessário, assepticamente raspar áreas de diferenciação.
- Aspirar hiPS CCM a partir de células hiPS e enxaguar as células 3 vezes com DMEM/F12 quente. Incubar as células com 1 mL de tampão de dissociação celular livre de enzimas por 10 min a 37 °C e verificar a dissociação sob um microscópio. Devido a diferenças inerentes entre diferentes linhas de células hiPS, o tempo real de incubação para o buffer de dissociação celular deve ser determinado para uma determinada linha celular.
- Raspe suavemente o poço com um levantador de células para desalojar células frouxamente aderidas e transferir a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL, seguido de tubulação para cima e para baixo várias vezes para individualizar as células hiPS.
- Leve a suspensão celular para o volume de 15 mL com DMEM/F12 quente e centrífuga por 5 min a 290 x g em temperatura ambiente.
- Aspire suavemente o supernasciente e resuspenque as células com DMEM/F12 quente para mais uma rodada de centrifugação para remover os componentes residuais da matriz BM 1 e tampão de dissociação.
- Aspire as células supernascidas e resuspendas em 1 mL de meio de indução de mesoderme, conforme descrito acima. Conte o número total de células usando um hemocítômetro ou contador de coulter para determinar o volume apropriado do meio de diferenciação de mesoderme necessário para alcançar uma concentração de 1 x 105 células/mL.
- Aspirar a solução ECM a partir da matriz BM placas revestidas de 2 e enxaguar as placas duas vezes com DMEM/F12 quente. Misture a suspensão da célula hiPS suavemente por pipetar algumas vezes. Transfira 1 mL da suspensão celular para cada poço da matriz BM de 2 placas revestidas de 2 poços e, em seguida, agite suavemente as placas para distribuir as células de forma mais uniforme.
- Incubar a placa a 37 °C em uma incubadora de CO2 de 5%. Refrescar o meio de indução de mesoderm no dia seguinte.
NOTA: Após 2 dias, as células de mesoderme derivadas de células hiPS estariam prontas para indução intermediária de mesoderme.
5. Diferenciação das células de mesoderme derivadas de células hiPS em mesoderme intermediário (dias 2-16)
- No dia 2 do protocolo de diferenciação, aspirar meio de indução de mesoderm e reabastecer com 1 mL por meio de indução de mesoderm bem intermediário.
- Atualizar o meio todos os dias para manter um limiar preciso de fatores de crescimento e pequenas moléculas para as células metabolicamente ativas. Se houver crescimento celular substancial e rápido esgotamento dos nutrientes da mídia (indicado pelo amarelamento da mídia), o volume do meio intermediário de diferenciação de mesoderme pode ser aumentado para 1,3 mL por poço das 12 placas do poço.
- Células de cultura por mais 14 dias para obter células intermediárias de mesoderme. Até o dia 16, essas células podem ser criopreservadas para uso posterior.
6. Diferenciação de células mesoderm intermediárias derivadas de células hiPS em podocitos (dias 16 a 21)
- Enxágüe as células intermediárias de mesoderme com DMEM/F12 quente seguido de incubação das células com 0,5 mL por poço de 0,05 % trypsin-EDTA por 3 min a 37 °C. Faça inspeção visual para garantir que as células estejam começando a se dissociar.
- Raspar células usando um levantador de células e pipeta a suspensão celular várias vezes usando uma ponta de pipeta de 1.000 μL para obter células individualizadas (ou pequenas moitas de) células.
NOTA: Nesta fase, certifique-se de que as células estão totalmente dissociadas, pois as células agregadas podem não adquirir um fenótipo terminalmente diferenciado dentro da linha do tempo do protocolo. - Adicione cerca de 2 mL por poço de solução neutralizante de trippsina para parar a atividade de trippsina.
- Transfira as células para um tubo cônico de 50 mL e leve o volume até 50 mL usando DMEM/F12 e, em seguida, centrifugar a suspensão celular por 5 min a 201 x g à temperatura ambiente.
- Aspire as células supernascidas e resuspendas no meio de indução de podocito. Para obter resultados ideais, garanta uma densidade final de semeadura de aproximadamente 100.000 células/poço de uma placa de 12 poços. Adicione a suspensão da célula à matriz BM de placas revestidas de 2 e agite suavemente a placa para ajudar a distribuir as células de forma mais uniforme.
- Incubar células a 37 °C e 5% de CO2 e atualizar o meio diariamente por até 5 dias para obter podocytes até o dia 21.
NOTA: Os podócitos derivados de células hiPS resultantes podem ser mantidos na cultura por 2-4 semanas adicionais usando meio completo com mídia de manutenção de podocyte. Uma vez em mídia de manutenção podocyte, as células podem ser alimentadas a cada dois dias e podem ser usadas para estudos subsequentes ou análises a jusante.
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Representative Results
O objetivo deste protocolo foi demonstrar que podocitos humanos maduros podem ser derivados de células hiPS em condições quimicamente definidas. Os dados apresentados neste manuscrito foram gerados por meio da linha de células DU11 hiPS17, que foram testadas pela primeira vez, e constataram estar livres de mycoplasma. A análise cromossômica também foi realizada, e as células foram encontradas karyotipicamente normais. Começando com as células hiPS DU11 indiferenciadas, a estratégia de diferenciação (Figura 1) descrita neste relatório foi empregada primeiro para diferenciar as células-tronco (Figura 2A) em células de mesoderme que expressam Brachyury (T) (Figura 1B e Figura 2B), seguida pela diferenciação em células de mesoderme intermediário PAX2-positivo(Figura 2C), e finalmente em podocitos glomerulares renais maduros (Figura 1B, Figura 2D, Figura 3De Figura 4). As células de mesoderme foram obtidas até o dia 2 do protocolo de diferenciação, as células intermediárias de mesoderme foram geradas até o dia 16, e os podócitos maduros foram obtidos até o dia 21 do protocolo de diferenciação. Os podocitos resultantes tinham cerca de 150-200 μm de tamanho quando aderidos a uma superfície de cultura de tecido plano, como as placas revestidas de laminina usadas neste experimento. Os podócitos derivados de células hiPS exibem numerosas extensões semelhantes ao processo do pé que foram visualizadas utilizando múltiplas técnicas complementares, incluindo microscopia de contraste de fase(Figura 1),microscopia imunofluorescente(Figura 4) e microscopia eletrônica de varredura8,11. Os podócitos derivados de células-tronco também mancharam positivo para WT115 (Figura 2D), bem como o marcador de identificação de linhagem nephrin14 (Figura 4). Curiosamente, a localização subcelular de nefrina foi predominantemente nos processos do pé podocito e citoplasma celular, consistente com um fenótipo podocyte maduro(Figura 2D e Figura 4A,B). Durante o desenvolvimento e na fisiologia podocito, a nefrina proteica é transportada entre o núcleo celular e o citoplasma, mas a nefezensma torna-se predominantemente expressa nos processos de citoplasma e pé à medida que os podocitos amadurecem e adquirem um fenótipo funcional18. Assim, a observação de que os podocitos produzidos utilizando o protocolo de diferenciação descrito aqui expressa nephrin em grande parte nas estruturas de citoplasma e processo de pé ressalta a utilidade deste protocolo para geração de podocitos mais maduros ou especializados. Micrografos eletrônicos de varredura de podocitos derivados de células hiPS destacam a ramificação dos processos de pé primário e secundário nos podócitos derivados de células hiPS, conforme relatado anteriormente pelo nosso grupo8,11. Como o WT1 não é por si só um marcador definitivo de podocitos renais, é altamente recomendável que os pesquisadores também caracterizem suas células para a expressão simultânea de marcadores específicos de podocyte, como podocina e nefrina. Foi demonstrado anteriormente que podocitos terminatavelmente diferenciados derivados utilizando este método imunostain positivo para podocina, nefrina e WT1, com uma diminuição correspondente na expressão do marcador celular progenitor PAX28,11. Juntos, esses resultados indicam que os podocitos derivados usando este protocolo são desenvolvimento maduros ou especializados, conforme necessário para um podocyte glomerular renal humano funcional.
Na otimização das condições para o método de diferenciação, foram observadas as instâncias em que as células intermediárias de mesoderme foram inadequadamente dissociadas. Células semeadas em densidades que excediam significativamente a densidade recomendada de 100.000 células/poço de uma placa de 12 poços (antes da etapa final de indução do podocito) resultaram em grandes aglomerados de células que não tinham o fenótipo morfológico esperado de podocitos maduros dentro da linha do tempo padrão do protocolo (Figura 3A,B). Por essas razões, recomenda-se que os pesquisadores usem as densidades de semeadura recomendadas neste protocolo (Figura 3C,D) antes de experimentar outras condições que possam ser desejadas para aplicações específicas a jusante. Juntos, esses resultados representam a diferenciação direcionada das células hiPS em podocitos glomerulares renais dentro de três semanas usando as mídias quimicamente definidas descritas acima.
Figura 1: Diferenciação de células hiPS para podocitos.
(A) Representação esquemática do método de diferenciação direcionada das células hiPS em podocitos. BMP7, proteína morfogenética óssea 7; RA, ácido retinóico; VEGF, fator de crescimento endotelial vascular. Este valor foi modificado a partir do ref.11. (B) Imagens representativas de células hiPS em cada estágio de diferenciação. Da esquerda para a direita, as imagens mostram as características colônias de células iPS humanas antes da dissociação para diferenciação no dia 0, seguidas por células de mesoderme após 2 dias de diferenciação, depois células intermediárias de mesoderm em cerca de 10 dias de diferenciação, e finalmente os podocitos terminais diferenciados no dia 22. Barra de escala, 100 μm para todas as imagens (no painel B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens imunofluorescentes de células hiPS e seus derivados diferenciados mostrando a expressão de marcadores específicos de linhagem e contrastaining nuclear durante o cronograma de diferenciação.
(A) Células iPS humanas expressando o marcador de pluripotência Oct4; (B) células de mesoderme expressando braquiury (T); (C) células de mesoderme intermediária expressando PAX2; e (D)os podocitos derivados de células hiPS expressando o marcador de identificação de linhagem, nefrina e o marcador associado, WT1. Barra de escala, 100 μm para todas as imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Efeitos da densidade de semeadura sub-ideal sobre o potencial de diferenciação das células intermediárias de mesoderme derivadas da linha celular HIPS DU11.
(A) Quando a densidade inicial de semeadura celular é muito alta (aproximadamente 500.000 células/poço de uma placa de 12 poços), as células podem formar agregados densos (B) durante o estágio de indução do podocyte. (C) Densidades de semeadura recomendadas para evitar a aglomeração (100.000 células/poço de uma placa de 12 poços), e observar microscopicamente a extensão (D) de estruturas semelhantes ao processo do pé durante a fase de diferenciação do podocyte (inset). Barra de escala, 200 μm para A-D; e 100 μm para o inset em D. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: podocitos derivados de células hiPS exibem fenótipo morfologicamente maduro in vitro.
(A) Imunostaining de podocitos derivados de células hiPS para nefrínia, e (B) imagem de ampliação mais elevada de processos de pé podocito mostrando processos primários e secundários (setas brancas), bem como a expressão de nefrina nessas estruturas celulares especializadas. Barra de escala, 100 μm (A); 50 μm (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste relatório, descrevemos um protocolo para a geração de podocitos glomerulares renais a partir de células hiPS. Os podocitos derivados de células hiPS apresentam características morfológicas e moleculares associadas ao fenótipo de podocito renal maduro13. Em publicações anteriores, mostramos que os podocitos derivados de células hiPS podem imitar a estrutura e a função de filtragem seletiva do glomerulus renal quando co-cultivado com células endoteliais microvasculares glomerulares em um dispositivo microfluidic microfluidic perfusável8,11.
Os seguintes passos críticos devem ser considerados pelos pesquisadores interessados em adaptar este protocolo. Primeiro, a semeadura de células hiPS em placas revestidas de laminina para a indução de células de mesoderme é um passo crucial. Embora seja recomendada uma densidade de semeadura de 100.000 células/poço, os pesquisadores podem ajustar a densidade inicial de semeadura celular dependendo da taxa de replicação da linha de células-tronco utilizada para o estudo. Se necessário, essa otimização garantirá a densidade celular adequada durante o estágio de indução do mesoderme e evitará a formação de agregados celulares ou aglomerados muito grandes que possam comprometer potencialmente a qualidade do mesoderme, mesoderme intermediário ou fenótipo de podocyte(Figura 3). Também é importante notar que as diferenças nas especificações do fabricante para alguns reagentes como CHIR99021 podem afetar a qualidade das células diferenciadas. Assim, é aconselhável testar reagentes de diferentes lotes ou fornecedores e fornecedores para sua atividade biológica e consistência entre experimentos independentes. Além disso, é importante evitar a exposição excessiva de células hiPS às enzimas de dissociação, pois isso poderia levar ao descolamento indesejado da matriz adesiva e possível perda de células durante a aspiração média. Outro passo crucial digno de nota é garantir que o meio de indução de podocyte esteja protegido contra a luz para evitar a inativação induzida por foto de ácido retinóico.
Em comparação com os métodos anteriores para a diferenciação dos podócitos renais humanos, o método descrito aqui emprega fatores quimicamente definidos (incluindo pequenas moléculas, fatores de crescimento e isoformes específicos de proteínas de membrana de porão, nas concentrações desejadas) conforme necessário para regular vias específicas de sinalização celular envolvidas no desenvolvimento renal e função podocyte. Especificamente, a geração de células de mesoderme a partir de células hiPS envolveu a ativação da via de sinalização canônica Wnt efetuada pelo uso da pequena molécula CHIR9902119. A via canônica de sinalização Wnt é conhecida por regular a atividade transcricional de genes envolvidos no desenvolvimento e padronização do tecido in vivo, bem como a proliferação celular e migração20,21. O meio de indução celular utilizado neste protocolo permite a derivação de podocitos de células mesoderm intermediárias derivadas de células iPS. Este meio de indução de podocyte consiste em Activin A, BMP7, VEGF, ácido retinóico e CHIR99021. Notavelmente, este meio de indução de podocito não requer componentes de soro indefinido, como o soro bovino fetal, que pode obscurecer as contribuições de fatores específicos e limitar as aplicações de outros métodos de diferenciação celular para estudos mecanicistas de desenvolvimento de tecidos e doenças, tornando-o distinto daqueles empregados em tentativas anteriores de gerar células renaistipos 22. Além disso, observou-se que FGF2 e FGF9 não são necessários para a diferenciação de podocitos renais das células hiPS6,7,22. Embora métodos anteriores dependam da formação de agregados multicelulares, como corpos embrionários e organoides, o método descrito aqui produz células que exibem um fenótipo maduro, tanto morfologicamente quanto pela expressão de marcadores específicos de linhagem, incluindo nefrina e podocina, e baixa regulação de marcadores progenitores celulares como PAX2. Espera-se que o conhecimento dos componentes químicos empregados neste protocolo possa facilitar estudos mecanicistas sobre o desenvolvimento do tecido renal humano, especificação de linhagem podocyte e patogênese da doença no futuro.
Este método de diferenciação celular hiPS também permite a geração de podócitos maduros, pós-médicos e funcionais com mais de 90% de eficiência, sem seleção de subpopulação, manipulações genéticas ou xenotransplante. Isso é notavelmente diferente das tentativas anteriores, onde altos níveis de heterogeneidade celular6,7,23 limitaram o uso dos métodos de diferenciação de células-tronco para aplicações de medicamentos translacionais. Este método também apresenta um avanço significativo para o campo, dado os desafios associados à disponibilidade extremamente limitada de podocitos renais humanos de outras fontes, como tecidos primários ou organoides. Alguns dos desafios incluem baixa eficiência de derivação inferior a 1% ao utilizar métodos que dependem da formação de corpos embrionários ou organoides6,7.
Uma limitação a este protocolo é o custo relativamente alto dos reagentes necessários para a cultura das células-tronco e etapas de diferenciação, o que pode dificultar sua implementação em alguns laboratórios ou grupos de pesquisa. Além disso, como muitos fatores de otimização no microambiente da célula (ou seja, sinais solúveis e insolúveis ou adesivos) estavam envolvidos, recomendamos que o protocolo seja seguido conforme descrito. Um erro comum observado por outros interessados em usar este método de diferenciação de podocyte incluiu o uso de matrizes de adesão celular inadequadas, como a matriz BM 1 ou outras proteínas mal definidas derivadas de animais. Uma vez que o protocolo é seguido como descrito, novos experimentos podem ser realizados para examinar a eficácia de outras modificações no protocolo. Além disso, devido às diferenças inerentes entre diferentes linhas de células-tronco humanas, vale ressaltar que alguns aspectos do método de diferenciação, por exemplo, o tempo de exposição ao meio de dissociação de diferenciação ou células médias, e densidades de semeadura celular, podem precisar ser otimizados. No entanto, essas condições não foram alteradas para as linhas celulares hiPS e linhas de células-tronco embrionárias testadas até o momento. Este método de diferenciação de podocyte funciona em várias linhas de células hiPS, incluindo as células PGP1, IMR-90-1 e IISH3i-CB6, bem como a linha de células-tronco embrionárias H98,11. Neste relatório, também demonstramos a diferenciação bem sucedida da linha de células HIPS DU11 utilizando o mesmo protocolo (Figura 1 e Figura 2). Assim, dada a consistência deste método em várias linhas celulares, incluindo resultados de trabalhos inéditos de outros laboratórios de pesquisa independentes (pré-publicação), esperamos que este protocolo de diferenciação seja útil para a derivação de podocitos renais de uma grande variedade de linhas celulares hiPS e, portanto, não se limitando à utilizada neste protocolo.
Dada a capacidade das células hiPS de se auto-renovar indefinidamente, esse método de diferenciação poderia ser usado para fornecer aos pesquisadores uma fonte prontamente disponível de podocitos renais humanos. Isso poderia ajudar a avançar na compreensão atual da biologia renal humana e da doença24, bem como permitir o desenvolvimento de novos sistemas renais in vitro para modelar a função renal humana e respostas à terapêutica. Por exemplo, o protocolo aqui descrito foi recentemente empregado e integrado com um sistema microfluídico de órgão em chip para desenvolver um modelo in vitro funcional da parede capilar glomerular do rim humano. Este chip glomerular filtrava seletivamente moléculas circulantes e recapitulava neftoxicidade induzida por drogas quando exposto à droga de quimioterapia, Adriamycin8. No futuro, esses resultados poderiam potencialmente ser integrados com tecnologias de bioimpressão 3D para projetar modelos in vitro mais complexos do rim humano. Tais avanços poderiam fornecer novas plataformas para avaliar candidatos a medicamentos, particularmente aqueles que visam as formas de doenças renais decorrentes da disfunção de podocitos glomerulares. Isso é especialmente importante, pois as diferenças específicas das espécies dos modelos animais e a falta de funcionalidades de nível de órgão tipicamente observadas em métodos padrão de cultura tecidual podem impedir o desenvolvimento de terapêuticas direcionadas para várias formas de doenças renais humanas25. Assim, esse protocolo poderia, em algum dia, proporcionar oportunidades para desvendar os caminhos de sinalização envolvidos no desenvolvimento do rim humano, bem como a patogênese da doença.
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Disclosures
S.M. é um autor de uma patente pendente para métodos para a geração de podocitos renais a partir de células-tronco pluripotentes (pedido de patente dos EUA 14/950859). Os demais autores declaram que não têm interesses concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Escola Pratt de Engenharia da Duke University, a Divisão de Nefrologia da Duke Medical School, um Prêmio de Pesquisa de Uma Cadeira do Departamento de Medicina da Duke University, e um Burroughs Wellcome Fund PDEP Career Transition Ad Hoc Award to S.M.. M.B foi apoiado pelo Programa de Bolsas de Pós-Graduação em Pesquisa da Fundação Nacional de Ciência. Agradecemos ao Laboratório Bursac por nos fornecer generosamente a linha de células-tronco DU11, e o Laboratório Varghese da Universidade duke por compartilhar temporariamente suas instalações de cultura de tecidos com nosso grupo. Esta publicação é dedicada à Profª Laura L. Kiessling, Novartis Professora de Química do Instituto de Tecnologia de Massachusetts, em comemoração aos seus 60anos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal. | ||
| Growth Factors and Media Supplements | |||
| All-trans retinoic acid (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| B27 serum-free supplement | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | May show lot-to-lot variation |
| Complete Medium Kit with CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Cell Systems | Podocyte maintenance media |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 with glutamine supplement |
| Heat-inactivated FBS | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| Human activin A | PHC9564 | Thermo/Life Technologies | |
| Human BMP7 | PHC9544 | Thermo/Life Technologies | |
| Human VEGF | PHC9394 | Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 medium | 05850 | Stem Cell Technologies | hiPS cell culture media (CCM) |
| Penicillin–streptomycin, liquid (100×) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 ROCK inhibitor | 1254 | Tocris | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T) | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R&D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | N-892012 | Iwai North America | Basement membrane (BM) matrix 2 |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | 354277 | BD Biosciences | Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation |
| Enzymes and Other Reagents | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Cell detachment solution |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood |
| Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | 97065-058 | VWR | Ethanol is flammable and toxic |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyde (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Sterile Distilled Water | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Aspirating pipettes, individually wrapped | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R Centrifuge | B99516 | Beckman Coulter | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | 352097 | Corning | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryoboxes | 3395465 | Thermo/Life Technologies | For storing frozen aliquots |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives |
| Hemocytometer | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | 51030403 | Thermo/Life Technologies | For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives |
| Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | Carl Zeiss Microscopy | Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation |
| Kimberly-Clark nitrile gloves | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, large | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, small | 21905-026 | VWR | |
| P10 precision barrier pipette tips | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 barrier pipette tips | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 barrier pipette tips | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 barrier pipette tips | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 barrier pipette tips | P1122 | Denville Scientific | |
| Serological pipette, 10 mL, individually wrapped | 356551 | Corning | |
| Serological pipette, 25 mL, individually wrapped | 356525 | Corning | |
| Serological pipette, 5 mL, individually wrapped | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0.22 μm, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes | 1138W14 | Thomas Scientific | For aliquoting growth factors |
| Tissue culture–treated 12-well plates | 353043 | Corning | |
| Tissue culture–treated six-well plates | 353046 | Corning | |
| VWR white techuni lab coat | 10141-342 | VWR | |
| Wide-beveled cell lifter | 3008 | Corning |
References
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, 1145 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526, 564-568 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33, 1193-1200 (2015).
- Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13, 1662-1685 (2018).
- Pozzi, A., et al. Beta1 integrin expression by podocytes is required to maintain glomerular structural integrity. Developmental Biology. 316, 288-301 (2008).
- Kanasaki, K., et al. Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus. Developmental Biology. 313, 584-593 (2008).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).
- Torban, E., et al. PAX2 Activates WNT4 Expression during Mammalian Kidney Development. Journal of Biological Chemistry. 281, 12705-12712 (2006).
- Reiser, J., Sever, S. Podocyte biology and pathogenesis of kidney disease. Annual Review of Medicine. 64, 357-366 (2013).
- Kuusniemi, A. M., et al. Tissue Expression of Nephrin in Human and Pig. Pediatric Research. 55, 774-781 (2004).
- Guo, J. K., et al. WT1 is a key regulator of podocyte function: reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis. Human Molecular Genetics. 11, 651-659 (2002).
- Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. American Journal of Pathology. 160, 131-139 (2002).
- Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825 (2017).
- Satoh, D., et al. aPKCλ maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. The Journal of Biochemistry. 156, 115-128 (2014).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
- Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
- Clevers, H., Nusse, R.
- Ciampi, O., et al. Generation of functional podocytes from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 17, 130-139 (2016).
- Fuente Mora, C., et al. Differentiation of Podocyte and Proximal Tubule-Like Cells from a Mouse Kidney-Derived Stem Cell Line. Stem Cells and Development. 21, 296-307 (2011).
- Chuah, J. K. C., Zink, D. Stem cell-derived kidney cells and organoids: Recent breakthroughs and emerging applications. Biotechnology Advances. 35, 150-167 (2017).
- Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).
