Levering af antistoffer i hjernen ved hjælp af fokuseret scanning ultralyd
Summary
Præsenteret her er en protokol til forbigående at åbne blod-hjerne-barrieren (BBB) enten fokalt eller i hele en musehjerne for at levere fluorescerende mærkede antistoffer og aktivere microglia. Også præsenteret er en metode til at detektere levering af antistoffer og mikroglia aktivering ved histologi.
Abstract
Kun en lille brøkdel af terapeutiske antistoffer rettet mod hjernesygdomme optager hjernen. Fokuseret ultralyd giver mulighed for at øge optagelsen af antistoffer og engagement gennem forbigående åbning af blod-hjerne-barrieren (BBB). I vores laboratorium udvikler vi terapeutiske tilgange til neurodegenerative sygdomme, hvor et antistof i forskellige formater leveres på tværs af BBB ved hjælp af mikrobobler, samtidig med fokuseret ultralydsapplikation gennem kraniet rettet mod flere pletter, en tilgang, vi kalder scanning ultralyd (SUS). De mekaniske virkninger af mikrobobler og ultralyd på blodkar øger paracellulær transport over BBB ved forbigående at adskille tætte kryds og forbedrer vesikelmedieret transcytose, hvilket gør det muligt for antistoffer og terapeutiske midler effektivt at krydse. Desuden letter ultralyd også optagelsen af antistoffer fra den interstitielle hjerne til hjerneceller såsom neuroner, hvor antistoffet fordeler sig gennem cellelegemet og endda i neuritiske processer. I vores undersøgelser fremstilles fluorescerende mærkede antistoffer, blandes med internt tilberedte lipidbaserede mikrobobler og injiceres i mus umiddelbart før SUS påføres hjernen. Den øgede antistofkoncentration i hjernen kvantificeres derefter. For at tage højde for ændringer i normal hjernehomeostase kan mikroglial fagocytose anvendes som en cellulær markør. De genererede data tyder på, at ultralydslevering af antistoffer er en attraktiv tilgang til behandling af neurodegenerative sygdomme.
Introduction
Terapeutisk ultralyd er en ny teknologi, der sigter mod at behandle hjernesygdomme på en ikke-invasiv måde, dels ved at lette adgangen til terapeutiske midler til hjernen1,2,3. Da kun en lille brøkdel af terapeutiske antistoffer rettet mod hjernesygdomme opfanges af og bevares i hjernen4, giver terapeutisk ultralyd mulighed for at øge deres optagelse og målrette engagement5,6.
I vores laboratorium udvikler vi terapeutiske tilgange til neurodegenerative sygdomme, hvor et antistof i forskellige formater leveres på tværs af blod-hjerne-barrieren (BBB) ved hjælp af mikrobobler. For at opnå dette påføres ultralyd gennem kraniet ind i hjernen på flere steder ved hjælp af en scanningstilstand, vi kalder scanning ultralyd (SUS)7. Den mekaniske interaktion mellem ultralydsenergien, de intravenøst injicerede mikrobobler og hjernevaskulaturen adskiller forbigående BBB’s stramme kryds i et givet sonikeringsvolumen, hvilket gør det muligt for antistoffer og andre laster, herunder terapeutiske midler, effektivt at krydse denne barriere7,8,9 . Desuden har ultralyd vist sig at lette optagelsen af antistoffer fra den interstitielle hjerne til hjerneceller, såsom neuroner, hvor antistoffet fordeler sig gennem hele cellekroppen og endda i neuritiske processer5,10.
Alzheimers sygdom er karakteriseret ved en amyloid-β- og tau-patologi11, og der findes et væld af dyremodeller til at dissekere patogene mekanismer og validere terapeutiske strategier. En SUS-tilgang, hvorved ultralyd anvendes i et sekventielt mønster over hele hjernen, når det gentages over flere behandlingssessioner, kan reducere amyloid plaquepatologi i hjernen hos amyloid-β-deponerende amyloid precursor protein (APP) mutant mus og aktivere microglia, der optager amyloid, hvilket fører til forbedring af kognitiv funktion7. BBB-åbning med ultralyd og mikrobobler reducerer også tau-patologi i pR5, K3 og rTg4510 tau transgene mus5,12,13. Det er vigtigt, at mens microglia fjerner ekstracellulære proteinaflejringer, er en af de underliggende clearancemekanismer for intraneuronale patologier induceret af SUS aktiveringen af neuronal autofagi12.
Her skitserer vi en eksperimentel proces, hvorved fluorescerende mærkede antistoffer fremstilles og derefter blandes med interne lipidbaserede mikrobobler efterfulgt af retroorbital injektion i bedøvende mus. Retroorbital injektion er et alternativ til haleveneinjektion, som vi har fundet ud af at være lige så effektiv og enklere at udføre gentagne gange. Dette efterfølges straks af påføring af SUS på hjernen. For at bestemme den terapeutiske antistofoptagelse ofres mus, og den øgede antistofkoncentration i hjernen kvantificeres derefter. Som en proxy for ændringen i hjernens homeostase bestemmes mikroglial fagocytisk aktivitet af histologi og volumetrisk 3D-rekonstruktion.
De genererede data tyder på, at ultralydslevering af antistoffer er en potentielt attraktiv tilgang til behandling af neurodegenerative sygdomme. Protokollen kan på samme måde anvendes på andre lægemiddelkandidater såvel som modellaster såsom fluorescerende mærket dextrans af definerede størrelser14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fluorescerende mærkede antistoffer kan leveres til hjernen ved hjælp af fokuseret ultralyd sammen med mikrobobler anvendt i scanningstilstand. Antistoflevering, mikroglial morfologi og lysosomal forstørrelse kan detekteres ved fluorescensmikroskopi efter scanning ultralyd. Microglia kan tage op i deres lysosomer antistoffer og antigener, som antistofferne har bundet til i en Fc-receptor-medieret proces4.
Der er en række kritiske trin for at opnå gentagelig BBB-åbn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender støtte fra boet efter Dr. Clem Jones AO, National Health and Medical Research Council of Australia [GNT1145580, GNT1176326], Metal Foundation og delstatsregeringen i Queensland (DSITI, Institut for Videnskab, Informationsteknologi og Innovation).
Materials
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti | 850365C | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti | 880128C | |
| AlexaFluor 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| CD68 antibody | AbD Serotec | MCA1957GA | Use 1:1000 dilution |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Coulter Counter (Multisizer 4e) | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo FIsher | A-11008 | Use 1:500 dilution |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11077 | Use 1:500 dilution |
| head holder (model SG-4N, Narishige Japan) | |||
| Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | Use 1:1000 dilution |
| Image analysis software | Beckman Coulter | #8547008 | |
| Isoflow flow solution | Beckman Coulter | B43905 | |
| Near infrared imaging system Odyssey Fc | Licor | 2800-03 | |
| Octafluoropropane | Arcadophta | 0229NC | |
| Propylene Glycol | Sigma-Aldrich | P4347 | |
| TIPS (Therapy Imaging Probe System) | Philips Research | TIPS_007 | |
| Bitplane |
References
- Choi, J. J., et al. Noninvasive and transient blood-brain barrier opening in the hippocampus of Alzheimer’s double transgenic mice using focused ultrasound. Ultrasonic Imaging. 30 (3), 189-200 (2008).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer’s disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
- Pandit, R., Chen, L., Götz, J. The blood-brain barrier: physiology and strategies for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. (19), 30238 (2019).
- Golde, T. E. Open questions for Alzheimer’s disease immunotherapy. Alzheimers Research & Therapy. 6 (1), 3 (2014).
- Nisbet, R. M., et al. Combined effects of scanning ultrasound and a tau-specific single chain antibody in a tau transgenic mouse model. Brain. 140 (5), 1220-1230 (2017).
- Janowicz, P. W., Leinenga, G., Götz, J., Nisbet, R. M. Ultrasound-mediated blood-brain barrier opening enhances delivery of therapeutically relevant formats of a tau-specific antibody. Scientific Reports. 9 (1), 9255 (2019).
- Leinenga, G., Götz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-beta and restores memory in an Alzheimer’s disease mouse model. Science Translational Medicine. 7 (278), 233 (2015).
- Burgess, A., et al. Targeted delivery of neural stem cells to the brain using MRI-guided focused ultrasound to disrupt the blood-brain barrier. PLoS One. 6 (11), 27877 (2011).
- Chen, H., et al. Focused ultrasound-enhanced intranasal brain delivery of brain-derived neurotrophic factor. Scientific Reports. 6, 28599 (2016).
- Leinenga, G., Langton, C., Nisbet, R., Götz, J. Ultrasound treatment of neurological diseases – current and emerging applications. Nature Reviews Neurology. 12 (3), 161-174 (2016).
- Götz, J., Halliday, G., Nisbet, R. M. Molecular Pathogenesis of the Tauopathies. Annual Reviews of Pathology. 14, 239-261 (2019).
- Pandit, R., Leinenga, G., Götz, J. Repeated ultrasound treatment of tau transgenic mice clears neuronal tau by autophagy and improves behavioral functions. Theranostics. 9 (13), 3754-3767 (2019).
- Karakatsani, M. E., et al. Unilateral Focused Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Opening Reduces Phosphorylated Tau from The rTg4510 Mouse Model. Theranostics. 9 (18), 5396-5411 (2019).
- Valdez, M. A., Fernandez, E., Matsunaga, T., Erickson, R. P., Trouard, T. P. Distribution and Diffusion of Macromolecule Delivery to the Brain via Focused Ultrasound using Magnetic Resonance and Multispectral Fluorescence Imaging. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (1), 122-136 (2020).
