Summary
Hier gepresenteerd is een protocol voor laser-capture microdissection (LCM) van plantaardige weefsels. LCM is een microscopische techniek voor het isoleren van gebieden van weefsel op een contaminatievrije manier. De procedure omvat weefselfixatie, paraffine inbedding, sectioning, LCM en RNA extractie. RNA wordt gebruikt in de downstream weefselspecifieke, tijdelijk opgeloste analyse van transcripto's.
Abstract
De ontwikkeling van een complex meercellig organisme wordt beheerst door verschillende celtypen die verschillende transcriptieprofielen hebben. Om transcriptieregels te identificeren die ontwikkelingsprocessen regelen, is het noodzakelijk om de ruimtelijke en temporele genexpressieprofielen van deze individuele celtypen te meten. Daarom is inzicht in de spatio-temporele controle van genexpressie essentieel om inzicht te krijgen in hoe biologische en ontwikkelingsprocessen worden gereguleerd. Hier beschrijven we een laser-capture microdissection (LCM) methode om een klein aantal cellen te isoleren van drie gerst embryo organen tijdens een tijd-cursus tijdens de kiemkracht, gevolgd door transcript profilering. De methode bestaat uit weefselfixatie, weefselverwerking, paraffine inbedding, sectioning, LCM en RNA extractie gevolgd door real-time PCR of RNA-seq. Deze methode heeft ons in staat gesteld om ruimtelijke en temporele profielen van zaadorgaantranscripties te verkrijgen uit verschillende aantallen cellen (tientallen tot honderden), wat veel meer weefselspecificatie biedt dan typische bulkweefselanalyses. Uit deze gegevens konden we transcriptienetwerken definiëren en vergelijken en kandidaat-regelgevende transcriptiefactoren voor individuele weefsels voorspellen. De methode moet van toepassing zijn op andere plantaardige weefsels met minimale optimalisatie.
Introduction
Plantenontwikkeling en -groei omvatten de gecoördineerde actie van transcriptie-regelgevende netwerken binnen verschillende cellen die bestaan in een complexe cellulaire omgeving. Om de activiteit van deze regulerende netwerken te begrijpen, hebben we de kennis van ruimtelijke en temporele genexpressie binnen verschillende celtypen in ontwikkelingsstadia nodig. Echter, analyses van genexpressie worden vaker uitgevoerd in hele organen of bulk weefsel monsters als gevolg van de technische uitdaging van het isoleren en analyseren van kleine aantallen cellen. De methode die we hier beschrijven heeft het verkrijgen van ruimtelijke en temporele weefselspecifieke transcriptome analyse mogelijk gemaakt door LCM te koppelen aan RNA-seq.
LCM werd twee decennia geleden ontwikkeld door Emmert-Buck en collega's1. De techniek stelde onderzoekers in staat om enkelcellen of clusters van cellen nauwkeurig te isoleren uit hun omgeving met behulp van directe microscopische visualisatie en manipulatie met een narrow beam laser1. Sindsdien is de methode op grote schaal gebruikt in kankerbiologie en pathologie2,3. Veel plantenonderzoeksgroepen hebben LCM ook aangepast voor het gebruik met verschillende plantensoorten en verschillende weefseltypen4,5,6,7,8,9,10,11. Onlangs hebben verschillende documenten ook LCM gebruikt op eudicot- en monocotzaden om embryo's, endos en andere zaadstructuren te bestuderen tijdens zaadontwikkeling en kiemkracht10,12,13. De meeste andere veelgebruikte eencellige isolatiemethoden zoals micropipetting, celsortering, magnetische scheiding en microfluïde platforms zijn afhankelijk van de enzymatische spijsvertering of mechanische homogenisatie om cellen te scheiden. Dit kan verstoren genexpressie, de invoering van technische artefacten die gegevens interpretatieverstoren 14,15. Deze methoden vereisen ook eerdere kennis van marker genen voor elk celtype om de gescheiden cellen te relateren aan hun ruimtelijke locatie en echte cel-type. Een andere groep technieken hangt af van op affiniteit gebaseerde isolatie van subcellulaire structuren in plaats van hele cellen, bijvoorbeeld INTACT (Isolatie van nuclei's gelabeld in celtypen) en TRAP (Vertalen ribosoom affiniteitszuivering)16,17. Affiniteit labelen en zuiveren van kernen of ribosomen zijn echter technisch uitdagend bij plantensoorten die geen gevestigde transformatieprotocollen hebben. LCM maakt gebruik van snelle weefselfixatie om transcriptieniveaus en conventionele histologische identificatie te behouden door directe visualisatie van cellen binnen hun normale weefsel/orgaancontext, waardoor afzonderlijke cellen in korte tijd18,19kunnen worden geïsoleerd.
Het hier gepresenteerde protocol is een geoptimaliseerde methode voor de isolatie van specifieke cellen of celtypen uit de weefselsecties van graanzaden, die kan worden toegepast op de meeste cellen die histologisch kunnen worden geïdentificeerd. LCM biedt een contactvrije methode van celisolatie, waardoor besmetting sterk wordt verminderd en de integriteit van teruggewonnen RNA wordt verhoogd. Bovendien illustreert de methode de kracht van LCM op grootschalige genoombrede studies te beginnen met kleine hoeveelheden biologische materialen. We beschrijven ook lineaire versterking van RNA voor het genereren van voldoende inputmateriaal voor downstream transcriptie/transcriptome analyses.
Er zijn tien belangrijke stappen in dit LCM RNA-seq protocol voor ruimtelijke en temporele weefselspecifieke transcriptomen, waaronder fixatie van weefselmonsters, uitdroging, paraffine-infiltratie, inbedding, sectie, LCM, RNA-extractie, RNA-versterking, RNA-kwantificering en qRT-PCR en/of RNA-seq(figuur 1).
Figuur 1: Stroomdiagram van LCM gevolgd door RNA-seq of qRT-PCR. LCM is een ruimtelijk nauwkeurige en contactvrije techniek om cellen te verzamelen van vaste weefselsecties met behulp van een laserstraal onder microscopische visualisatie. Het proces begint met fixatie van weefselmonsters, gevolgd door uitdroging met behulp van een gradiënt reeks ethanol en xyleen, en afgewerkt met paraffine infiltratie. Het proces kan volledig geautomatiseerd worden met behulp van een tissue processor. Zodra het weefsel is geïnfiltreerd met paraffine, het is ingebed in een mal met gesmolten paraffine met behulp van een inbedding station. Sectioning wordt uitgevoerd met behulp van microtome ingesteld op de gewenste dikte. Dia's worden voorbereid en LCM wordt vlak voor RNA uit gevangen cellen geëxtraheerd. RNA-extractie wordt direct gevolgd door twee rondes RNA-versterking voorafgaand aan qRT-PCR en/of RNA-seq. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aangezien het eindproduct RNA is, moet u ervoor zorgen dat het werk met RNases niet wordt besmet. Het dragen van handschoenen is een must. Gebruik diethyl pyrocarbonaat (DEPC) -behandeld water, buffers, enz. Autoclave buffers en bak glaswerk voor gebruik.
1. Weefselfixatie
- Bereid fixatieve keuze, afhankelijk van de soorten en weefselsoorten; voor gerstzaad het fixatiemiddel van farmer (75% ethanol, 25% glaciale azijnzuur (v/v)) gebruiken.
- Chill de fixatief op ijs voorafgaand aan het oogsten van weefsels.
- Verzamel het plantmateriaal van belang en ontleed het indien nodig in stukken van de juiste grootte om in de geselecteerde inbeddingsmaltvorm te passen. Voor gerstzaad, snijd het zaad in de helft in de lengterichting om te helpen penetratie van de fixatieve oplossing en om te passen in de inbedding schimmel.
- Dompel het weefsel onder in ten minste 10x volume ijskoud fixatief. Voor gerstzaad, dompel het zaad in de helft in de fixatieve.
- Gebruik vacuüminfiltratie om de penetratie van fixatief te versnellen. De weefsels moeten zinken na de vacuüminfiltratie van het fixatief. Voor gerstzaad, gebruik 30 min vacuüm infiltratie.
- Vervang de fixatieve en incubatie bij 4 °C zodat het fixatief volledig in het weefsel kan doordringen. Voor gerstzaad, incubeer de monsters 's nachts (~ 12-16 uur).
OPMERKING: Dunnere of kleine weefsels vereisen een kortere fixatietijd vanwege de hogere diffusiesnelheid van fixatie in het weefsel. - Verwijder het weefsel uit fixatief en breng het weefsel over in cassettes en begin vervolgens met weefselverwerking.
OPMERKING: Klein of breekbaar weefsel, zoals bladweefsel, kan in cassettes worden geplaatst om te bevestigen dat het niet beschadigd raakt tijdens de fixatie. Biopsie zakken, pads of wraps kunnen worden gebruikt om het weefsel veilig te houden in de cassettes tijdens weefsel fixatie en weefsel verwerking stappen.
2. Weefselverwerking
- Gebruik een geautomatiseerde weefselprocessor in stap 2 met minimaal 10 oplossingskamers en 2 verwarmde paraffinekamers (zie Tabel met materialen).
- Controleer of er in elke kamer voldoende oplossingshoeveelheden zijn; oplossingen vervangen na elk gebruik van de weefselprocessor.
- Plaats cassettes met weefsel in de metalen mand. Bevestig de metalen mand aan de houder boven kamer 1. De houder zal draaien en "dunk en dip" de cassettes in de kamers, volgens het aangewezen programma.
- Stel het programma in door klikken op knoppen uit te voeren op de bedieningspanelen van de weefselprocessor, waarbij de tijdsduur voor elke kamer wordt ingesteld.
- Druk op de knopStartom het verwerkingsprogramma te starten. Het volgende programma is ontworpen voor gerstzaden en loopt 's nachts (~ 18 uur)
- Voer uitdroging uit door de cassette 1 uur en 30 min in de gradiëntserie ethanol (75%, 85%, 100%, 100% en 100% (v/v) ethanol te dompelen.
- Clearing uitvoeren met ethanol: xyleenverloop gedurende 1 h 30 min elk om 75:25, 50:50, 25:75 (ethanol: xyleen %, v/v). Dan dip de cassette voor 1 h 30 min elk van 100% xyleen dan 100% xyleen.
- Voer paraffine-infiltratie uit bij 55-60 °C gedurende 1 uur 30 min twee maal bij gesmolten paraffine.
OPMERKING: De temperatuur van paraffine verwarmingskamers kan aan de achterkant van de weefselprocessor worden ingesteld.
- De volgende ochtend, verwijder de cassettes uit de weefselprocessor en ga over tot paraffine inbedding.
OPMERKING: De programmatijd kan variëren tussen het verschillende weefseltype. Vacuüm en/of agitatie kunnen tijdens weefselverwerking worden gebruikt om de infiltratie van geselecteerde oplossingen te versnellen door op "V" en/of "agitatie" knoppen op het bedieningspaneel van de weefselprocessor te drukken.
3. Paraffine inbedding
- Gebruik een inbeddingsmachine in deze stap (zie Tabel met materialen).
- Stel de inbeddingsmachine in om ten minste een paar uur voor het inbedden in te schakelen om de paraffine in de reservoirs volledig te laten smelten.
- Zet de koude plaat aan voordat u begint.
- Sluit monsters in mallen door het houden van de monsters in positie met behulp van fijne tangen en het verstrekken van gesmolten paraffine in de mal. Zorg voor een goede oriëntatie van de monsters voor elk experimenteel doel. Voor gerstzaad, oriënteren van het zaad langs de weg naar de snijrichting om longitudinale secties te verkrijgen.
OPMERKING: Inbeddingsvormen zijn er in verschillende maten. Selecteer een geschikte grootte om het monster goed te kunnen positioneren en in tesluiten. De oriëntatie van de monsters moet worden overwogen, afhankelijk van de experimentele behoeften. Indien longitudinale secties nodig zijn, moet het monster in de lengterichting op de snijrichting zijn gericht, terwijl het monster voor dwarse delen parallel aan de snijrichting moet worden georiënteerd. - Plaats een schone cassette op de mal en zorg ervoor dat voldoende paraffine de hele cassette volledig afdekt om het monster op de cassette te houden.
- Plaats de mal op de koude plaat en laat de paraffine volledig in te stellen (10-20 min) voor het vrijgeven van het blok uit schimmel.
- Ga over tot het doorkneringen of breng de blokken over naar 4 °C voor opslag.
LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken. De ingebouwde blokken kunnen maximaal drie maanden bij 4 °C worden bewaard.
4. Bereiding van polyethyleen naftalaat (PEN) membraanplaten
- Dompel PEN membraandia's onder in RNase deactiveringsoplossing voor 3 s, gevolgd door twee korte wasbeurten in DEPC-behandeld water om RNases op de dia's te verwijderen. Droog de glijbanen in een couveuse van 37 °C om de overgebleven oplossing te verwijderen.
- UV-behandelen van de dia's met behulp van een UV-lamp in een laminaire stroomkast voor 30 min om hydrofiele eigenschappen voor verbeterde paraffine hechting te verbeteren.
5.
- Gebruik een microtome in de sectiestap (zie Tabel met materialen).
- Plaats een nieuw mes in de messenhouder en houd de mesbeschermer altijd omhoog wanneer u niet actief doorsneed
LET OP: Microtome bladen zijn extreem scherp en kunnen aanzienlijke schade veroorzaken wanneer ze verkeerd worden behandeld.
OPMERKING: Er zijn twee vergrendelingsmechanismen op het microtome, de ene bevindt zich aan de zijkant van de machine en de andere op het handvat van het wiel. Beide moeten worden ingeschakeld wanneer ze niet actief worden ge sectioneerd. - Pas het mesblok zo dicht mogelijk bij het monster aan zonder aan te raken. Zorg ervoor dat de microtomearm nooit volledig in contact komt met het mesblok, omdat dit catastrofale structurele schade aan het microtome zal veroorzaken.
- Zet de koude plaat aan voordat u begint. Houd paraffine blokken op de koude plaat voorafgaand aan de sectie en opnieuw afkoelen blokken wanneer dat nodig is tijdens de sectie om te voorkomen dat de blokken verzachten.
- Vul het waterbad met DEPC-behandeld water en verwarm tot 42 °C voordat u begint.
- Trim blokken tot de gewenste diepte (waar de sectie waarin u geïnteresseerd bent) en sectie paraffine blokken op de gewenste dikte (6-10 μm) met behulp van de microtome; een goed gedesnede blok vormt een 'lint' aan de rand van het blad. Voor gerstzaad, sectie met een dikte van 8 μm.
- Breng linten van de microtome voorzichtig over naar het waterbad met behulp van fijne verfborstel of fijne tangen, zodat het lint plat op het wateroppervlak ligt.
- Houd een glijbaan onder een hoek van 45° met behulp van een opwaartse beweging, til een lint uit het water op de glijbaan en verwijder voorzichtig overtollig water met een pluisvrij weefsel.
- Droge glijbanen gedurende 30 minuten bij 37 °C om het resterende water onder de paraffine te elimineren.
- Ga naar paraffineverwijdering of bewaar bij 4 °C in een gesloten doos onder uitdrogingsomstandigheden (binnen enkele dagen te gebruiken).
- Verwijder paraffine door het wassen van de dia's 3x voor 20 s elk in xyleen, gevolgd door 2x wasbeurten van 30 s in 100% (v/ v) ethanol en 2x wasbeurten van 30 s in 70% (v/v) ethanol.
- Ga onmiddellijk over tot laser-capture microdissection nadat paraffine is verwijderd.
OPMERKING: Cryosectioning is een alternatieve methode die met succes is gekoppeld aan LCM. Monstervoorbereiding voor cryosectioning zal verschillen.
6. Microdissection voor laserafvang
- Gebruik een microdissectiemicrodissectiemicrodissectie van laserafvang (zie Tabel van Materialen)om cellen van gedeparfogeniseerde en gedroogde weefselsecties te microontpne.
- Laad dia's op de drie beschikbare sleuven.
- Gebruik de speciale kleefdoppen van opvangbuizen om de gevangen monsters te verzamelen. Het vastleggen zonder vloeistof ("droge" verzameling) minimaliseert RNase activiteit. Laad de opvangbuizen in de beschikbare sleuven.
- Verplaats het werkgebied om het gebied van het monster te lokaliseren dat moet worden gesneden. Dit kan met de muis of joystick van de LCM-machine, of de pijltoetsen op het toetsenbord.
- Om de snijsnelheid te optimaliseren, snijden energie en focus, laserdruk katapulteren (LPC) energie en focus, eerst gesneden op een leeg segment vrij van weefsel op het membraan dia. Voor gerstzaad, snijsnelheid = 18, CutEnergy = 52 CutFocus = 63, LPCEnergy = 78, LPC focus = 61 bij 10x vergroting.
OPMERKING: Snijden focus en energie moeten worden aangepast voor verschillende dia's, verschillende weefsels, en gevangen gebied, maar algemene regels zijn de katapult vermogen is hoger dan de snijkracht en de laser moet worden ontscherpt voor katapulteren. Hoe hoger de vergroting van de objectieve lens, hoe kleiner de focus van de laser en hoe hoger de energie. - Gebruik de gereedschappen Tekenen om cellen te selecteren door het interessegebied te schetsen.
- Selecteer de functie RoboLPC op de werkbalk van de functie om cellen in de kleefkappen te katapulteren op basis van de geoptimaliseerde parameters die worden verkregen door op een zwart segment hierboven te snijden.
OPMERKING: LCM parameters variëren tussen weefseltypes en dikte van sectie, tissue hardheid en objectieve lenzen. Daarom is het het beste om elke dia op een vlak membraangebied te optimaliseren zonder weefselmonster voordat het werkelijke monster wordt gesneden. - Gebruik de gereedschappen Markeren om interessegebieden te markeren om ze onmiddellijk te lokaliseren door die vlag te selecteren in de lijst met elementen.
- Controleer op "CapCheck" knop om de lijm dop te inspecteren om monsters te bevestigen werden gevangen. Typisch, LCM van 10-15 secties (~ 200 cellen) per dop is vereist voor RNA extractie.
- Bewaar de gevangen monsters op ijs. Ga onmiddellijk verder voor RNA-extractie om RNA-afbraak te voorkomen.
OPMERKING: Sommige LCM-microscopie zijn uitgerust met tl-licht, waardoor cellen met fluorescerende markeringen kunnen worden vastgehouden.
7. RNA-extractie
- Gebruik een RNA-isolatie met weinig invoer (zie Tabel van materialen)voor RNA-extractie na LCM. Dergelijke kits zijn ontworpen om hoogwaardig totaal RNA consistent te herstellen van minder dan tien cellen.
- Isoleer het totale RNA van de gevangen celtypen volgens de instructies van de fabrikant, inclusief de DNase-behandeling in de kolom.
OPMERKING: De eerste stap van de RNA-extractie waarbij de buis wordt omgekeerd en geflikt, is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de gevangen monsters op het deksel in contact komen met de toegevoegde extractiebuffer.
8. RNA-versterking
- Gebruik een antisense RNA (aRNA) versterkingskit (zie Tabel van Materialen) voor aRNA-versterking uit het RNA dat wordt geëxtraheerd door in vitro transcriptie om voldoende aRNA te produceren voor RNA-seq-bibliotheeksynthese.
- Voer twee rondes van versterking uit met behulp van de aRNA-versterkingskit volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Het is belangrijk om de thermo-cycler en het deksel voor te verwarmen op de temperatuur die door de kit (zie Tabel van materialen)fabrikant. Een alternatieve aanpak in plaats van RNA-versterking is het gebruik van een lage input bibliotheek voorbereiding kit om de bibliotheek direct synthetiseren uit geëxtraheerd RNA.
9. RNA-kwantificering
- Kwantificeren en kwalificeren aRNA met behulp van een geautomatiseerd elektroforesesysteem (zie Tabel van Materialen).
OPMERKING: Een geautomatiseerd elektroforesesysteem heeft de voorkeur omdat het minder monster (1-2 μL) vereist en een gelachtig beeld en elektroferogram biedt voor elk afzonderlijk monster.
10. qRT-PCR en/of RNA-seq
- Synthetiseer cDNA uit het aRNA voor qRT-PCR of maak RNA-seq bibliotheken met behulp van standaard RNA-seq bibliotheekkits.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We genereerden ruimtelijke en temporele weefselspecifieke transcripto's van gerstzaden tijdens de ontkieming met behulp van ons LCM RNA-seq protocol10. De studie werd uitgevoerd door het toepassen van LCM RNA-seq op een klein aantal cellen van drie embryoorganen (plumule, radicle tip, scutellum) om de 8 uur over een 48 uur tijdscursus tijdens de ontkieming (0-48 h, 7 tijdstippen) (Figuur 2A,B).
Figuur 2: Cellen verzameld uit gerstzaden door LCM. aA) Longitudinale dwarsdoorsnede van een gerstzaad en, inzet, een vergrote cartoon die de gebieden aangeeft waaruit cellen zijn gevangen. Blauw = plumule, magenta = radicle, groen = scutellum. (B) LCM van plumule, radicle, en scutellum. Bovenste paneel, weefsel voor laserdruk katapulteren (LPC). Onderste paneel, weefsel na LPC. Cellen werden gevangen uit 5 opeenvolgende longitudinale secties van elk monster met drie biologische replica's per monster. Elke replicaat bestond uit ongeveer 200 cellen (~ 0,05 - 0,15 mm2 totale oppervlakte). Bar = 100 μm. E = endosperm, C = gemalen cellaag, SE = scutellar epitheel, S = scutellum. Figuur gereproduceerd uit eerdere gegevens in The Plant Journal met toestemming10. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
De fixatie en inbedding zijn kritieke stappen als slecht vast weefsel monster kan resulteren in weefselschade en verlies van RNA kwantiteit en kwaliteit. Deze stappen moeten worden geoptimaliseerd en aangepast voor verschillende soorten en weefseltypen19,20,21. Hier gebruikten we vacuüminfiltratie om de penetratie van de fixatiemiddelen in de zaadweefsels en cellen te verbeteren. Uitdroging en paraffine infiltratie worden geleidelijk uitgevoerd om schade aan de weefselmonsters te voorkomen. We hebben de hele uitdroging en paraffine infiltratie proces versneld met behulp van een geautomatiseerde weefsel processor met agitatie en vacuüm toegepast bij elke stap. Dit vermindert sterk het risico van RNA afbraak die optreedt tijdens de langdurige weefsel verwerking stappen uitgevoerd door een menselijke agent. Voor de sectie is het van cruciaal belang om de membraanschuif te behandelen om paraffinehechting te garanderen en ervoor te zorgen dat het RNase-vrij is. Als de membraandia's niet goed zijn voorbereid, hecht de monstersectie zich niet aan het membraan, wat de LCM-katapulterende stap beïnvloedt en de weefseloverdracht naar de kleefkappen vermindert omdat het monster van het membraan zal scheiden (zie figuur 1).
Een andere kritieke stap in het LCM RNA-seq protocol is LCM parameter optimalisatie. Er zijn vijf belangrijke parameters die moeten worden geoptimaliseerd: (1) snijsnelheid; 2. het snijden van energie; 3. snijfocus; (4) LPC-energie; en (5) LPC focus. Het is belangrijk om de snijparameters correct aan te passen om het geselecteerde gebied nauwkeurig te snijden en los te maken van het omringende weefsel zonder de rand van het geselecteerde gebied te verbranden (figuur 3A,B). De juiste LPC energie en focus zijn essentieel om betrouwbaar katapult het geselecteerde gebied van de dia naar de speciale kleefdoppen van de collectie buizen, en altijd inspecteren gevangen monsters in de doppen om ervoor te zorgen genoeg materiaal wordt verzameld (Figuur 3C). De efficiëntie van LCM maakt het mogelijk om 1000 cellen binnen een uur op te vangen, wat de kans op RNA-afbraak tijdens de monsterverwerking sterk vermindert. Het gebruik van opvangbuizen met kleefdoppen maakt het mogelijk om te "drogen" op te halen zonder vloeistof vast te leggen, waardoor mogelijke RNases-activiteiten sterk worden verminderd. Het is belangrijk om de gevangen monsters op ijs te houden en de RNA-extractie onmiddellijk na het verzamelen van alle replicaties te doen.
RNA extractie en versterking worden uitgevoerd met behulp van commercieel verkrijgde kits door het volgen van de instructies van de fabrikanten. Kwantificering van het totale RNA vóór RNA-versterking met behulp van geautomatiseerd elektroforese systeem detecteert verschillende elektroforetische banden en fluorescerende pieken van 18S en 28S ribosomale subeenheden in RNA-monsters van goede kwaliteit(figuur 3D). Extra pieken die overeenkomen met chloroplast en mitochondriale ribosomale RNA zal worden gevonden vóór 18S en 28S pieken. Vanwege meerdere RNA-pieken in plantensoorten zijn de RIN-waarden (RNA Integrity Number) doorgaans lager dan 9 (de verwachte RIN-waarde van weefsels van zoogdieren) en weerspiegelen ze niet nauwkeurig de RNA-integriteit22. Het is aangewezen om door te gaan met RNA-versterking wanneer heldere 18S- en 28S-pieken zichtbaar zijn zonder teken van RNA-afbraak. De hoeveelheid RNA teruggewonnen in onze gerst zaad experiment varieerde tussen drie verschillende weefselsoorten (plumule, radicle en scutellum) en, ook tussen vroege en late stadia van ontkieming, ondanks ongeveer gelijke aantallen cellen worden geoogst. De bedragen van gerstzaden varieerden van 100 pg tot 20 ng van ongeveer 200 cellen (0,5 tot 100 pg per cel). De minimale hoeveelheid input RNA aanbevolen voor RNA versterking was 100 pg. De hoeveelheid gewonnen RNA hangt af van de efficiëntie van de extractie uit verschillende geoogste cellen en de totale transcriptie overvloed in het specifieke celtype in dat stadium van ontwikkeling19,21. Het is handig om dit te overwegen bij het plannen van een LCM RNA-seq experiment, hoewel dergelijke voorafgaande informatie niet in alle gevallen beschikbaar zal zijn.
Met succes gesynthetiseerd aRNA zal vertonen een unimodale, symmetrische grootte verdeling van 100 tot 1000 nucleotiden met een piek rond 300 nucleotiden na twee rondes van versterking(Figuur 3E). In ons gerstzaadexperiment kregen we 500 pg tot 2 μg aRNA na twee rondes RNA-versterking10. Vergelijking tussen versterkt en niet-versterkt RNA heeft aangetoond dat RNA-versterking reproduceerbaar, lineair is en geen systematische voorkeur geeft aan transcriptegegevens23,24,25. De output aRNA kan worden gebruikt voor qRT-PCR en/of RNA-seq voor ruimtelijke en temporele weefselspecifieke genexpressieanalyse. Validatie na RNA-seq moet worden uitgevoerd om de resultaten van analyse van aRNA te bevestigen. Dit kan worden gedaan door expressie van cel-type marker genen uit de RNA-seq gegevens met behulp van RNA in situ hybridisatie te onderzoeken.
Figuur 3: Representatief resultaat van LCM. (A) Weefsel na het snijden met de juiste snijenergie en focus. Een duidelijke fijne lijn kan worden gezien waar de snede werd gemaakt. Het geselecteerde gebied wordt losgemaakt van omliggende materialen. Bar = 100 μm.(B)Weefsel na het snijden met onjuiste snijenergie en focus. Het geselecteerde gebied is nog steeds verbonden met omringende materialen. Bar = 100 μm. (C) Onderzoek van gevangen cellen in speciale kleefdoppen van opvangbuizen. Bar = 100 μm. (D) Een voorbeeld van het totale RNA-profiel vóór RNA-versterking (links, gelachtig beeld; rechts, elektropherogram) met verschillende elektroforetische banden en fluorescerende pieken van 18S en 28S ribosomale subeenheden. Niet-gelabelde pieken komen overeen met extra ribosomale RNA, waaronder chloroplast en mitochondriale ribosomen. (E) Een voorbeeld van een typisch aRNA-profiel na RNA-versterking (links, gelachtig beeld; rechts, elektroferogram). Een verdeling van de maten van 100 tot 1000 nucleotiden, met een piek rond 300 nucleotiden, werd gedetecteerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
RNA-seq analyses werden uitgevoerd op alle monsters in biologische drievouden. Een multidimensionale schaling (MDS) plot van genen uitgedrukt in de verschillende weefsels meer dan 48 uur van de kiemkracht illustreert een grotere gelijkenis tussen monsters van een enkel weefsel dan tussen monsters uit hetzelfde moment punt, maar verschillende weefsels (Figuur 4A). Vervolgens hebben we uiteengezet hoe uitgebreid genexpressie werd gedifferentieerd in individuele weefsels in de tijd tijdens de kiemkracht. Het aantal differentiaal uitgedrukte genen (DEG's) steeg geleidelijk in de loop van de kiemkracht in elk weefsel, ten opzichte van het 0 uur-tijdpunt van dat weefsel (figuur 4B). Vijfentwintig procent (910) van plumule, 34% (1876) van radicle en 41% (2562) van scutellum DEGs bleken uitsluitend verschillend uitgedrukt in dat weefsel (dat wil zeggen, deze genen waren niet differentiaal uitgedrukt in de andere weefsels, figuur 4C). Samen laten deze resultaten zien hoe LCM RNA-seq kan worden gebruikt om temporele en ruimtelijke genexpressie te begrijpen tijdens de ontwikkeling van planten.
Figuur 4: Analyse van RNA-bibliotheken van LCM-monsters die een duidelijke scheiding van verschillende weefsels van meer dan 48 uur gerstkieming laten zien. (A) Multidimensionale schaling (MDS) plot van genen uitgedrukt in de verschillende weefsels meer dan 48 uur van de kiemkracht. Elk punt vertegenwoordigt 1 monster, en de afstand tussen 2 punten weerspiegelt de toonaangevende log fold verandering (FC) van de overeenkomstige RNA monsters. De x-, y- en z-as vertegenwoordigen eerste,tweede en derde dimensionale logFC. P = plumule, R = radicle, S = scutellum, 0-48u = h van ontkieming, R1-3 = Repliceren 1-3. (B) Aantal significante up-regulated (rood) en down-regulated (blauw) differentieel uitgedrukte genen (DEGs) gedurende zes tijdstippen in vergelijking met tijdspunt 0 h voor drie weefseltypen. (C) Venn-diagram met het aantal DEGs in drie weefseltypen. Genen in overlappende verzamelingen tonen de differentiële expressie in twee of drie weefseltypen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Veel weefselspecifieke genexpressiestudies zijn beperkt door handontleding van monsters, wat tijdrovend, arbeidsintensief is, een hoog risico op besmetting heeft en alleen monsters kan gebruiken die een menselijke agent voldoende behendig is om te oogsten. LCM is een nauwkeurige en contactloze techniek om cellen te verzamelen van vaste weefselsecties met behulp van een mechanisch bediende laserstraal onder microscopische visualisatie.
Een goede monstervoorbereiding is cruciaal voor LCM. Het proces is gebaseerd op een goede vaststelling en inbedding van monsters om een goede balans tussen weefselmorfologie en integriteit van RNA te behouden. Het hier gepresenteerde protocol biedt geoptimaliseerde bevestigings- en inbeddingsstappen voor gerstzaden, waaronder langere bevestigingstijd en vacuüminfiltratie van fixatiemiddelen. Analyse van verschillende weefsels of soorten vereist optimalisatie van de omstandigheden, omdat deze meestal verschillen tussen weefsels. Een ander belangrijk aspect van dit protocol is de RNA-versterkingsstap die ervoor zorgt dat er voldoende RNA wordt gegenereerd voor de bibliotheekbouw van RNA-seq. We vinden dat RNA-versterking resulteert in bibliotheken van hoge kwaliteit, maar als alternatief kunnen methoden voor het voorbereiden van bibliotheken met lage invoer worden gebruikt25. Histologische identificatie van doelcellen is een cruciale stap in onze methode en kan uitdagingen bieden voor zeldzame of slecht gekarakteriseerde celtypen. De herkenning van doelcellen kan worden verbeterd door traditionele histologische vlekken of immunofluorescentievlekken te gebruiken als onderdeel van de voorbewerkingsstap of, als alternatief, door transgene lijnen te gebruiken die fluorescerend gelabelde celspecifieke markers26,27uitdrukken .
De LCM-techniek werd voor het eerst ontwikkeld om te worden gebruikt op monsters van dierlijke afgeleide monsters voor celspecifieke transcriptieanalyse1. Vervolgens is echter een breed scala aan genomische, proteomische en epigenetische analyses ontwikkeld. Het aanpassen van deze methoden voor toepassing in plantenbiologische studies is een voortdurende uitdaging18,19,20,28. Schad et al. aangetoond dat eiwitten en metabolieten uit Arabidopsis vasculaire bundels kunnen worden geanalyseerd met behulp van LCM met 2-D gel elektroforese en massaspectrometrie29,30. Onlangs heeft Latrasse et al. chromatine immunoprecipitatie (ChIP)-qPCR-analyse uitgevoerd op LCM-disseceerde meeldraden en carpels met LCM, waarbij wordt vastgesteld dat weefselhomogeniteit de resolutie van celspecifieke epigenetische gebeurtenissen verbetert31. Turco et al. koppelden LCM ook aan bisulfiesequenties om DNA-methylatiegebeurtenissen te bestuderen tijdens vascularisatie in sorghum, waarbij het weefselspecifieke verschil tussen vasculaire en niet-vasculaire weefsels32werd benadrukt. Interessant is dat verschillende studies LCM hebben toegepast om de interacties tussen plantenmicrobe en plantenpathogen33,34,,35te onderzoeken . Het vermogen van LCM om cellen in verschillende infectiestadia te visualiseren en vast te leggen, gaf informatie over de ruimtelijke en temporele reacties van geïnfecteerde cellen.
Ons LCM-protocol in combinatie met RNA-seq dat hier wordt gepresenteerd, zal de spatio-temporele globale profilering van genexpressie van verschillende celtypen vergemakkelijken. Met verbeterde zuiveringsmethoden voor chromatine en eiwitten, samen met verbeterde massaspectrometrie-instrumenten, zal LCM een opkomend instrument zijn om celspecifieke epigenomische en proteomische studies in planten te vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Australian Research Council Centre of Excellence in Plant Energy Biology (CE140100008) aan JW. M.G.L werd ondersteund door een startbeurs van de Universiteit van La Trobe. Wij danken het La Trobe Genomics Platform voor hun steun bij high-throughput sequencing en data-analyse. Wij danken universitair hoofddocent Matthew Tucker voor deskundig advies over de oprichting van LCM in ons lab.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid 100 % ACS/R. | AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) | VWRC20104.323 | |
| AdhesiveCap 200 opaque | Zeiss | 415190-9181-000 | |
| Clear base moulds 8 X 10 | Leica | 3803015 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 40718-25ML | |
| High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | |
| Lowprofile disp.blades DB80LS | Leica | 14035843489 | |
| MembraneSlide 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9041-000 | |
| MessageAmp II aRNA Amplification Kit | Ambion (ThermoFisher) | AMB17515 | |
| On-Column DNase I Digestion Set | Sigma-Aldrich | DNASE70 | |
| Ovation RNA-Seq System V2 | NuGen (Integrated Science) | 7102-08 | |
| Paraffin (Surgipath Paraplast) | Leica | 39601006 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | ABI (ThermoFisher) | KIT0214 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Ambion (ThermoFisher) | AM9780 | |
| Xylene | AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) | VWRC28975.360 | |
| Leica Benchtop Tissue Processor | Leica Biosystems | TP1020 | |
| Leica Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems | EG1150H | |
| Leica Cold Plate | Leica Biosystems | EG1150C | |
| Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets | LAF Technologies Pty Ltd | Safemate 1.5 | |
| Leica Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | RM2265 | with PALMRobo v 4.6 software |
| Zeiss PALM MicroBeam LCM system | Zeiss miscroscopy | ||
| TapeStation | Agilent | TapeStation 2200 |
References
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Alevizos, I., et al. Oral cancer in vivo gene expression profiling assisted by laser capture microdissection and microarray analysis. Oncogene. 20 (43), 6196-6204 (2001).
- Cong, P., et al. In situ localization of follicular lymphoma: description and analysis by laser capture microdissection. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 99 (9), 3376-3382 (2002).
- Blokhina, O., et al. Laser capture microdissection protocol for xylem tissues of woody plants. Frontiers in Plant Science. 7, 1965 (2017).
- Casson, S., Spencer, M., Walker, K., Lindsey, K. Laser capture microdissection for the analysis of gene expression during embryogenesis of Arabidopsis. The Plant Journal. 42 (1), 111-123 (2005).
- Chen, Z., et al. LCM-seq reveals the crucial role of LsSOC1 in heat-promoted bolting of lettuce (Lactuca sativa L.). The Plant Journal. 95 (3), 516-528 (2018).
- Jiao, Y., et al. A transcriptome atlas of rice cell types uncovers cellular, functional and developmental hierarchies. Nature Genetics. 41 (2), 258-263 (2009).
- Kivivirta, K., et al. A protocol for laser microdissection (LMD) followed by transcriptome analysis of plant reproductive tissue in phylogenetically distant angiosperms. Plant Methods. 15 (1), 1-11 (2019).
- Li, P., et al. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nature Genetics. 42 (12), 1060-1067 (2010).
- Liew, L. C., et al. Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination. The Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).
- Matas, A. J., et al. Tissue-and cell-type specific transcriptome profiling of expanding tomato fruit provides insights into metabolic and regulatory specialization and cuticle formation. The Plant Cell. 23 (11), 3893-3910 (2011).
- Sakai, K., et al. Combining laser-assisted microdissection (LAM) and RNA-seq allows to perform a comprehensive transcriptomic analysis of epidermal cells of Arabidopsis embryo. Plant Methods. 14 (1), 10 (2018).
- Zhan, J., et al. RNA Sequencing of Laser-Capture Microdissected compartments of the maize kernel identifies regulatory modules associated with endosperm cell differentiation. The Plant Cell. 27 (3), 513-531 (2015).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
- Zeb, Q., Wang, C., Shafiq, S., Liu, L. Single-Cell Omics. , Elsevier. 101-135 (2019).
- Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nature Protocols. 6 (1), 56 (2011).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282 (2014).
- Bevilacqua, C., Ducos, B. Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level. Molecular Aspects of Medicine. 59, 5-27 (2018).
- Nelson, T., Tausta, S. L., Gandotra, N., Liu, T. Laser microdissection of plant tissue: what you see is what you get. Annual Reviews in Plant Biology. 57, 181-201 (2006).
- Day, R. C., Grossniklaus, U., Macknight, R. C. Be more specific! Laser-assisted microdissection of plant cells. Trends in Plant Science. 10 (8), 397-406 (2005).
- Takahashi, H., et al. A method for obtaining high quality RNA from paraffin sections of plant tissues by laser microdissection. Journal of Plant Research. 123 (6), 807-813 (2010).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (1), 3 (2006).
- Ferreira, E. N., et al. Linear mRNA amplification approach for RNAseq from limited amount of RNA. Gene. 564 (2), 220-227 (2015).
- Schneider, J., et al. Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments. BMC Genomics. 5 (1), 29 (2004).
- Shanker, S., et al. Evaluation of commercially available RNA amplification kits for RNA sequencing using very low input amounts of total RNA. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (1), 4 (2015).
- Bhattacherjee, V., et al. Laser capture microdissection of fluorescently labeled embryonic cranial neural crest cells. Genesis. 39 (1), 58-64 (2004).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Blokhina, O., et al. Parenchymal Cells Contribute to Lignification of Tracheids in Developing Xylem of Norway Spruce. Plant Physiology. 181 (4), 1552-1572 (2019).
- Schad, M., Lipton, M. S., Giavalisco, P., Smith, R. D., Kehr, J. Evaluation of two-dimensional electrophoresis and liquid chromatography-tandem mass spectrometry for tissue-specific protein profiling of laser-microdissected plant samples. Electrophoresis. 26 (14), 2729-2738 (2005).
- Schad, M., Mungur, R., Fiehn, O., Kehr, J. Metabolic profiling of laser microdissected vascular bundles of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 1 (1), 2 (2005).
- Latrasse, D., et al. The quest for epigenetic regulation underlying unisexual flower development in Cucumis melo. Epigenetics & Chromatin. 10 (1), 22 (2017).
- Turco, G. M., et al. DNA methylation and gene expression regulation associated with vascularization in Sorghum bicolor. The New Phytologist. 214 (3), 1213-1229 (2017).
- Gomez, S. K., Harrison, M. J. Laser microdissection and its application to analyze gene expression in arbuscular mycorrhizal symbiosis. Pest Management Science: Formerly Pesticide Science. 65 (5), 504-511 (2009).
- Roux, B., et al. An integrated analysis of plant and bacterial gene expression in symbiotic root nodules using laser-capture microdissection coupled to RNA sequencing. The Plant Journal. 77 (6), 817-837 (2014).
- Tang, W., Coughlan, S., Crane, E., Beatty, M., Duvick, J. The application of laser microdissection to in planta gene expression profiling of the maize anthracnose stalk rot fungus Colletotrichum graminicola. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (11), 1240-1250 (2006).
