植物における空間的および時間的組織特異的な遺伝子発現解析のためのレーザー捕捉マイクロ解離RNAシーケンシング
Summary
ここに示されているのが、植物組織のレーザー捕捉マイクロ解剖(LCM)のプロトコルです。LCMは、汚染のない方法で組織の領域を単離するための顕微鏡的な技術です。手順は、組織固定、パラフィン埋め込み、切片、LCMおよびRNA抽出を含む。RNAは、下流組織特異的な、一時的に分解されたトランスクリプトムの分析に使用される。
Abstract
複雑な多細胞生物の開発は、異なる転写プロファイルを有する異なる細胞タイプによって支配される。発達過程を支配する転写調節ネットワークを同定するには、これらの個々の細胞タイプの空間的および時間的遺伝子発現プロファイルを測定する必要がある。したがって、生物学的および発達過程がどのように調節されているかを理解するためには、遺伝子発現の時空間的制御に関する洞察が不可欠である。ここでは、発芽中の時間経過に伴い、少量の細胞を3つの大麦胚器官から分離し、転写プロファイリングを行うレーザー捕捉マイクロ解剖(LCM)法について述べた。この方法は、組織固定、組織処理、パラフィン埋め込み、切片、LCMおよびRNA抽出に続いて、リアルタイムPCRまたはRNA-seqで構成されています。この方法により、さまざまな数の細胞(数十~数百)から種子臓器転写体の空間的および時間的プロファイルを取得することができ、典型的なバルク組織分析よりもはるかに大きな組織特異性を提供することができました。これらのデータから、転写調節ネットワークを定義および比較し、個々の組織の候補調節転写因子を予測することができました。この方法は、最小限の最適化で他の植物組織に適用できる必要があります。
Introduction
植物の開発と成長は、複雑な細胞環境に存在する異なる細胞内の転写調節ネットワークの協調作用を伴う。これらの制御ネットワークの活動を理解するためには、発達段階を越えた異なる細胞型における空間的および時間的遺伝子発現に関する知識が必要である。しかし、遺伝子発現の分析は、少数の細胞を隔離して分析するという技術的な課題により、臓器全体またはバルク組織サンプルでより一般的に行われます。ここで説明する方法により、LCMとRNA-seqを結合させることにより、空間的および時間的組織特異的な転写法を得ることが可能になった。
LCMは20年前にエマート・バックと同僚によって開発されました1.この技術により、研究者は狭いビームレーザー1による直接的な顕微鏡的視覚化と操作を使用して、単一細胞または細胞のクラスターを環境から正確に分離することができました。それ以来、この方法は癌生物学と病理22,3において広く用いられている。多くの植物研究グループはまた、異なる植物種と異なる組織,,タイプ44、5、6、7、8、9、10、115,6,7,8で使用するためにLCM10を11適応させました。9最近では、いくつかの論文はまた、種子の発達と発芽10、12、13,12の間に胚、胚および他の種子構造を研究するために、ユージコットおよびモノコット種子にLCMを13使用している。マイクロピペット、細胞選別、磁気分離、マイクロ流体プラットフォームなどの他の一般的に使用される単細胞分離法のほとんどは、細胞を解離するために酵素消化または機械的均質化に依存します。これは、遺伝子発現を摂動させ、データ解釈14,15,15を混乱させる技術的なアーティファクトを導入する。これらの方法では、解き分けされた細胞を空間的位置と真の細胞タイプに関連付けるために、各細胞タイプのマーカー遺伝子に関する以前の知識も必要です。さらなる一群の技術は、例えばINTACT(細胞型でタグ付き核の単離)およびTRAP(リボソーム親和性精製の翻訳)16,17,17など、細胞全体の代わりに細胞内構造の親和性に基づく単離に依存する。しかし、原子核やリボソームの親和性の標識と精製は、確立された変換プロトコルを持たない植物種では技術的に困難です。LCMは、正常な組織/器官コンテキスト内の細胞を直接可視化することによって、迅速な組織固定を利用して転写レベルおよび従来の組織学的同定を維持し、離散細胞を短期間18、19,19で単離することを可能にする。
ここで提示されるプロトコルは、特定の細胞または細胞タイプを穀物種子の組織セクションから分離するための最適化された方法であり、組織学的に同定できるほとんどの細胞に適用することができる。LCMは細胞の分離の接触のない方法を提供し、汚染を大幅に減らし、回収されたRNAの完全性を高める。さらに、この方法は、少量の生物材料から始まる大規模ゲノムワイド研究におけるLCMの力を示す。また、下流転写/転写分析のための十分な入力材料を生成するためのRNAの線形増幅についても説明する。
このLCM RNA-seqプロトコルには、組織サンプルの固定、脱水、パラフィン浸潤、埋め込み、切除、LCM、RNA抽出、RNA増幅、RNA定量およびqRT-PCRおよび/またはRNA-セク法を含む、空間的および時間的組織特異的な転写術のための10の主要なステップがある(図1)。
図1:LCMのフローチャートに続いてRNA-seqまたはqRT-PCRが続く。LCMは、顕微鏡の視覚化の下でレーザービームを使用して固定組織セクションから細胞を収集する空間的に正確で、接触のない技術です。このプロセスは、組織サンプルの固定から始まり、次いでエタノールとキシレンの勾配シリーズを用いた脱水を行い、パラフィン浸潤で終了する。プロセスはティッシュのプロセッサを使用して完全に自動化することができる。組織にパラフィンを浸透させたら、埋め込みステーションを使用して溶融パラフィンを用いた型に埋め込まれる。断面化は、所望の厚さに設定されたミクロトームを用いて行われる。スライドは、RNAが捕捉された細胞から抽出される直前に調製され、LCMを行う。RNA抽出は、qRT-PCRおよび/またはRNA-セクの前に2ラウンドのRNA増幅を直接行います。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Protocol
Representative Results
Discussion
多くの組織特異的遺伝子発現研究は、時間がかかり、労働集約的であるサンプルの手による解剖によって制限されており、汚染のリスクが高く、人間の手術者が収穫に十分に器用であるサンプルのみを利用することができます。LCMは顕微鏡視覚化の下で機械操作のレーザービームを使用して固定組織セクションから細胞を集める精密で、無接触の技術である。
LCM では、?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、オーストラリア研究評議会植物エネルギー生物学優秀センター(CE140100008)によってJWに支援されました。M.G.Lは、ラ・トローブ大学の助成金の開始によって支援されました。ラ・トローブ・ゲノミクス・プラットフォームがハイスループットシーケンシングとデータ分析をサポートしてくれたことに感謝します。私たちの研究室でLCMを確立するための専門家のアドバイスをマシュー・タッカー准教授に感謝します。
Materials
| Acetic acid 100 % ACS/R. | AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) | VWRC20104.323 | |
| AdhesiveCap 200 opaque | Zeiss | 415190-9181-000 | |
| Clear base moulds 8 X 10 | Leica | 3803015 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 40718-25ML | |
| High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | |
| Lowprofile disp.blades DB80LS | Leica | 14035843489 | |
| MembraneSlide 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9041-000 | |
| MessageAmp II aRNA Amplification Kit | Ambion (ThermoFisher) | AMB17515 | |
| On-Column DNase I Digestion Set | Sigma-Aldrich | DNASE70 | |
| Ovation RNA-Seq System V2 | NuGen (Integrated Science) | 7102-08 | |
| Paraffin (Surgipath Paraplast) | Leica | 39601006 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | ABI (ThermoFisher) | KIT0214 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Ambion (ThermoFisher) | AM9780 | |
| Xylene | AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) | VWRC28975.360 | |
| Leica Benchtop Tissue Processor | Leica Biosystems | TP1020 | |
| Leica Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems | EG1150H | |
| Leica Cold Plate | Leica Biosystems | EG1150C | |
| Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets | LAF Technologies Pty Ltd | Safemate 1.5 | |
| Leica Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | RM2265 | with PALMRobo v 4.6 software |
| Zeiss PALM MicroBeam LCM system | Zeiss miscroscopy | ||
| TapeStation | Agilent | TapeStation 2200 |
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