Summary
Presentert her er en protokoll for laser-fangst mikrodisseksjon (LCM) av plantevev. LCM er en mikroskopisk teknikk for å isolere områder av vev på en forurensningsfri måte. Prosedyren inkluderer vev fiksering, parafin innebygging, snitting, LCM og RNA ekstraksjon. RNA brukes i nedstrøms vevsspesifikke, tidsmessig løste analyser av transkripsjoner.
Abstract
Utviklingen av en kompleks flercellet organisme styres av forskjellige celletyper som har forskjellige transkripsjonsprofiler. For å identifisere transkripsjonelle regulatoriske nettverk som styrer utviklingsprosesser, er det nødvendig å måle de romlige og timelige genuttrykksprofilene til disse individuelle celletypene. Derfor er innsikt i spatio-temporal kontroll av genuttrykk avgjørende for å få forståelse for hvordan biologiske og utviklingsprosesser reguleres. Her beskriver vi en laserfangst mikrodisseksjonsmetode (LCM) for å isolere lite antall celler fra tre byggembryoorganer over et tidsforløpet under spiring etterfulgt av transkripsjonsprofilering. Metoden består av vevfiksering, vevsbehandling, parafininnbygging, snitting, LCM og RNA-ekstraksjon etterfulgt av sanntids PCR eller RNA-seq. Denne metoden har gjort oss i stand til å få romlige og timelige profiler av frø organ transkripsjoner fra varierende antall celler (titalls til hundrevis), noe som gir mye større vev-spesifisitet enn typiske bulk-vev analyser. Fra disse dataene var vi i stand til å definere og sammenligne transkripsjonelle regulatoriske nettverk samt forutsi kandidat regulatoriske transkripsjonsfaktorer for individuelle vev. Metoden skal gjelde for andre plantevev med minimal optimalisering.
Introduction
Planteutvikling og vekst innebærer koordinert handling av transkripsjonelle regulatoriske nettverk i forskjellige celler som finnes i et komplekst cellulært miljø. For å forstå aktiviteten til disse regulatoriske nettverkene, krever vi kunnskap om romlig og timelig genuttrykk innenfor ulike celletyper på tvers av utviklingsstadier. Analyser av genuttrykk utføres imidlertid oftere i hele organer eller bulkvevsprøver på grunn av den tekniske utfordringen med å isolere og analysere et lite antall celler. Metoden vi beskriver her har tillatt å skaffe romlig og temporal vevsspesifikk transkripsjonsanalyse ved å koble LCM med RNA-seq.
LCM ble utviklet for to tiår siden av Emmert-Buck og kolleger1. Teknikken gjorde det mulig for forskere å nøyaktig isolere enkeltceller eller klynger av celler fra deres miljø ved hjelp av direkte mikroskopisk visualisering og manipulasjon med en smal strålelaser1. Siden da har metoden vært mye brukt i kreftbiologi og patologi2,3. Mange planteforskningsgrupper har også tilpasset LCM for bruk med ulike plantearter og ulike vevstyper4,5,6,7,8,9,10,11. Nylig har flere papirer også brukt LCM på eudicot og monocot frø for å studere embryo, endpermer og andre frøstrukturer under frøutvikling ogspiring 10,12,13. De fleste av de andre vanlige encellede isolasjonsmetodene som mikropipettering, cellesortering, magnetisk separasjon og mikrofluidiske plattformer er avhengige av enzymatisk fordøyelse eller mekanisk homogenisering for å dissosiere celler. Dette kan påvirke genuttrykket, og introdusere tekniske gjenstander som forvirrer datatolkning14,15. Disse metodene krever også tidligere kunnskap om markørgener for hver celletype for å relatere de dissosierte cellene til deres romlige plassering og sann celletype. En annen gruppe teknikker avhenger av affinitetsbasert isolering av subcellulære strukturer i stedet for hele celler, for eksempel INTAKT (Isolering av Nuclei merket i celletyper) og TRAP (Translating Ribosome Affinity Purification)16,17. Affinitetsmerking og rensing av kjerner eller ribosomer er imidlertid teknisk utfordrende hos plantearter som ikke har veletablerte transformasjonsprotokoller. LCM utnytter rask vevfiksering for å bevare transkripsjonsnivåer og konvensjonell histologisk identifikasjon ved direkte visualisering av celler i normal vev / organkontekst, noe som gjør at diskrete celler kan isoleres på kort tid18,19.
Protokollen som presenteres her er en optimalisert metode for isolering av spesifikke celler eller celletyper fra vevsdelene av kornfrø, som kan brukes på de fleste cellene som kan histologisk identifiseres. LCM gir en kontaktfri metode for celleisolasjon, noe som reduserer forurensning og øker integriteten til gjenvunnet RNA. Videre illustrerer metoden kraften i LCM på store genom brede studier som starter med små mengder biologiske materialer. Vi beskriver også lineær forsterkning av RNA for å generere tilstrekkelig inndatamateriale for nedstrøms transkripsjon/transkripsjonsanalyser.
Det er ti hovedtrinn i denne LCM RNA-seq protokollen for romlig og temporal vev-spesifikke transkripsjoner, inkludert fiksering av vevsprøver, dehydrering, parafin infiltrasjon, innebygging, snitting, LCM, RNA ekstraksjon, RNA forsterkning, RNA kvantifisering og qRT-PCR og / eller RNA-seq (Figur 1).
Figur 1: Flytskjema for LCM etterfulgt av RNA-seq eller qRT-PCR. LCM er en romlig presis og kontaktfri teknikk for å samle celler fra faste vevsseksjoner ved hjelp av en laserstråle under mikroskopisk visualisering. Prosessen starter med fiksering av vevsprøver, etterfulgt av dehydrering ved hjelp av en gradientserie av etanol og xylen, og avsluttet med parafininfiltrasjon. Prosessen kan være helautomatisk ved hjelp av en vevsprosessor. Når vevet er infiltrert med parafin, er det innebygd i en mugg med smeltet parafin ved hjelp av en innebyggingsstasjon. Snitting utføres ved hjelp av mikrotom satt til ønsket tykkelse. Lysbilder er forberedt og LCM utføres umiddelbart før RNA skal ekstraheres fra fangede celler. RNA-ekstraksjon etterfølges direkte av to runder med RNA-forsterkning før qRT-PCR og/eller RNA-seq. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Siden det endelige produktet er RNA, må du være forsiktig med å unngå å forurense arbeidet med RNases. Bruk av hansker er et must. Bruk dietyl pyrkarbonat (DEPC) -behandlet vann, buffere, etc. Autoklavbuffere og bake glass før bruk.
1. Vev fiksering
- Forbered fikseringsmiddel avhengig av arten og vevstypene; for byggfrø, bruk Farmer's fikseringsmiddel (75% etanol, 25% glacial eddiksyre (v / v)).
- Chill fikseringsmiddelet på is før høsting vev.
- Samle plantematerialet av interesse og om nødvendig dissekere det i biter av passende størrelse for å passe inn i den valgte innebyggingsformen. For byggfrø, kutt frøet i halvparten langsgående for å hjelpe penetrasjon av den fikseringsmiddelløsningen og for å passe inn i innebyggingsformen.
- Senk vevet ned i minst 10x volum av iskaldt fikseringsmiddel. For byggfrø, senk frøet skåret i halvparten i fikseringen.
- Bruk vakuuminfiltrasjon for å akselerere inntrengning av fikseringsmiddel. Vevet skal synke etter vakuuminfiltrasjonen av fikseringsmiddelet. For byggfrø, bruk 30 min vakuuminfiltrasjon.
- Erstatt fikseringsmiddelet og inkuber ved 4 °C for å la fikseringen trenge helt inn i vevet. For byggfrø, inkuber prøvene over natten (~ 12-16 h).
MERK: Tynnere eller små vev vil kreve kortere fikseringstid på grunn av den høyere diffusjonshastigheten av fikseringsmiddel i vevet. - Fjern vevet fra fikseringsmiddel og overfør vevet til kassetter og start deretter vevsbehandling.
MERK: Lite eller skjør vev, som bladvev, kan plasseres i kassetter for å feste for å sikre at det ikke blir skadet under fiksering. Biopsiposer, pads eller wraps kan brukes til å holde vevet sikkert inne i kassettene under vevfiksering og vevsbehandlingstrinn.
2. Vev behandling
- Bruk en automatisert vevsprosessor i trinn 2 med minimum 10 løsningskamre og 2 oppvarmede parafinkamre (se Materialtabell).
- Kontroller at det er tilstrekkelige mengder løsning i hvert kammer; erstatte løsninger etter noen få bruksområder av vevprosessoren.
- Legg kassetter med vev i metallkurven. Fest metallkurven til holderen over kammer 1. Holderen vil rotere og "dunke og dyppe" kassettene inn i kamrene, etter det angitte programmet.
- Sett programmet ved å utføre knappeklikk på kontrollpanelene på vevsprosessoren som innebærer å angi hvor lang tid for hvert kammer.
- Trykk på tasten "Start"for å starte behandlingsprogrammet. Følgende program er designet for byggfrø og går over natten (~ 18 h)
- Utfør dehydrering ved å dyppe kassetten i 1 t 30 min hver i gradientserien etanol (75%, 85%, 100%, 100% og 100% (v / v) etanol).
- Utfør rydding med etanol: xylengradient i 1 t 30 min hver kl 75:25, 50:50, 25:75 (etanol: xylen %, v/v). Dypp deretter kassetten i 1 t 30 min hver på 100% xylen og deretter 100% xylen.
- Utfør parafininfiltrasjon ved 55-60 °C i 1 t 30 min to ganger i smeltet parafin.
MERK: Temperaturen på parafinvarmerkamrene kan stilles inn på baksiden av vevsprosessoren.
- Neste morgen, fjern kassettene fra vevsprosessoren og fortsett til parafininnbygging.
MERK: Programtiden kan variere mellom ulike vevstyper. Vakuum og/eller agitasjon kan brukes under vevsbehandling for å akselerere infiltrasjonen av utvalgte løsninger ved å trykke påknappene " V" og/eller "agitasjon"på kontrollpanelet på vevsprosessoren.
3. Parafin innebygging
- Bruk en innebyggingsmaskin i dette trinnet (se Materialtabell).
- Forhåndsinnstill innebyggingsmaskinen for å slå på minst et par timer før innebygging for å gi tid til parafinen i reservoarene å smelte helt.
- Slå på kjøleplaten før du starter.
- Bygg inn prøver i former ved å holde prøvene på plass ved hjelp av fine tang og dispenser smeltet parafin inn i formen. Sikre riktig orientering av prøver for hvert eksperimentelle formål. For byggfrø, orienter frøet langsgående til skjæreretningen for å oppnå langsgående seksjoner.
MERK: Innebyggingsformer kommer i forskjellige størrelser. Velg en passende størrelse for å tillate at prøven kan plasseres og bygges inn riktig. Orientering av prøvene bør vurderes avhengig av eksperimentelle behov. Hvis det er behov for langsgående seksjoner, bør prøven orienteres langsgående til skjæreretningen, mens prøven for tverrgående seksjoner skal orienteres parallelt med skjæreretningen. - Plasser en ren kassett på formen og sørg for tilstrekkelig parafin fullt dekke hele kassetten for å holde prøven på kassetten.
- Plasser formen på den kalde platen og la parafinen settes helt (10-20 min) før du slipper blokken ut av mugg.
- Fortsett å snitte eller overføre blokkene til 4 °C for lagring.
MERK: Protokollen kan settes på pause her. De innebygde blokkene kan lagres ved 4 °C i opptil tre måneder.
4. Fremstilling av polyetylen naftalat (PEN) membran lysbilder
- Senk PEN-membranskliene i RNase-deaktiveringsløsningen i 3 s etterfulgt av to korte vasker i DEPC-behandlet vann for å fjerne RNases på lysbildene. Tørk lysbildene i en 37 °C inkubator for å fjerne rester oppløsning.
- UV-behandle lysbildene ved hjelp av en UV-lampe i en laminær strømningskabinett i 30 min for å forbedre hydrofile egenskaper for forbedret parafin vedheft.
5. Snitting
- Bruk en mikrotom i snittetrinnet (se Materialtabell).
- Plasser et nytt blad i knivholderen, og hold alltid knivbeskyttelsen oppe når det ikke er aktivt snitting
FORSIKTIG: Mikrotombladene er ekstremt skarpe og kan forårsake betydelig skade når de håndteres upassende.
MERK: Det er to låsemekanismer på mikrotomen, den ene er på siden av maskinen og den andre er på håndtaket på hjulet. Begge skal være engasjert når de ikke er aktivt snitting. - Juster knivblokken slik at den er så nær prøven som mulig uten å berøre. Pass på at mikrotomarmen aldri kommer i full kontakt med knivblokken, da dette vil forårsake katastrofal strukturell skade på mikrotomen.
- Slå på kjøleplaten før du starter. Hold parafinblokker på kjøleplaten før snitting og kjøle blokker når det er nødvendig under snitting for å hindre at blokkene mykner.
- Fyll vannbadet med DEPC-behandlet vann og varm opp til 42 °C før start.
- Trim blokker til ønsket dybde (der delen du er interessert i) og seksjon parafin blokker med ønsket tykkelse (6-10 μm) ved hjelp av mikrotom; en godt delt blokk vil danne et "bånd" på kanten av bladet. For byggfrø, seksjon med 8 μm tykkelse.
- Overfør forsiktig bånd fra mikrotomen til vannbadet ved hjelp av fin pensel eller fine tang, slik at båndet er flatt på overflaten av vannet.
- Hold en glide i en 45° vinkel, ved hjelp av en oppadgående bevegelse, løft et bånd opp av vannet på lysbildet og fjern forsiktig overflødig vann med et lofritt vev.
- Tørre sklier i 30 min ved 37 °C for å eliminere gjenværende vann under parafinen.
- Fortsett til fjerning av parafin eller oppbevar ved 4 °C i en lukket boks under dehydrerende forhold (som skal brukes innen flere dager).
- Fjern parafin ved å vaske lysbildene 3x for 20 s hver i xylen, etterfulgt av 2x vasker av 30 s i 100% (v / v) etanol og 2x vasker av 30 s i 70% (v / v) etanol.
- Fortsett umiddelbart til laserfangst mikrodisseksjon etter at parafin er fjernet.
MERK: Kryoseksjon er en alternativ metode som har blitt vellykket kombinert med LCM. Prøveforberedelse for kryoseksjon vil variere.
6. Laserfangst mikrodisseksjon
- Bruk et mikroskop for laserfangst (se Materialtabell)til å mikrodissect celler fra de-paraffiniserte og tørkede vevsseksjoner.
- Last inn lysbilder på de tre tilgjengelige sporene.
- Bruk de spesielle klebende caps av oppsamlingsrør for å samle de fangede prøvene. Fanging uten væske ("tørr" samling) minimerer RNase-aktivitet. Legg oppsamlingsrørene i de tilgjengelige sporene.
- Flytt fasen for å finne området for prøven som må kuttes. Dette kan gjøres ved hjelp av mus eller joystick av LCM-maskinen, eller piltastene på tastaturet.
- For å optimalisere skjærehastigheten, kutte energi og fokus, lasertrykk katapulting (LPC) energi og fokus, først kuttet på et tomt segment uten vev på membran lysbildet. For byggfrø, skjærehastighet = 18, CutEnergy = 52 CutFocus = 63, LPCEnergy = 78, LPC fokus = 61 ved 10x forstørrelse.
MERK: Skjærefokus og energi må justeres for forskjellige lysbilder, forskjellige vev og fanget område, men generelle regler er katapultingskraften er høyere enn skjærekraften og laseren må defokusert for katapulting. Jo høyere forstørrelse av objektivobjektivet, desto mindre er fokuset på laseren og jo høyere energi. - Bruk tegneverktøyene til å merke celler ved å beskrive interesseområdet.
- Velg RoboLPC-funksjonen fra funksjonsverktøylinjen for å katapultceller i klebehetsdeks basert på de optimaliserte parametrene oppnådd ved å kutte på et svart segment ovenfor.
MERK: LCM-parametere varierer mellom vevstyper samt tykkelsen på seksjonen, vevhardhet og objektive linser. Derfor er det best å optimalisere hvert lysbilde på et vanlig membranområde uten vevsprøve før du kutter den faktiske prøven. - Bruk Flagg-verktøyene til å merke interesseområder til å finne dem umiddelbart ved å velge dette flagget fra elementene-listen.
- Sjekk av "CapCheck" knappen for å inspisere klebelokken for å bekrefte at prøvene ble fanget. Vanligvis er LCM på 10-15 seksjoner (~ 200 celler) per hette nødvendig for RNA ekstraksjon.
- Hold de fangede prøvene på is. Fortsett umiddelbart for RNA-ekstraksjon for å unngå RNA-nedbrytning.
MERK: Noen LCM mikroskopi er utstyrt med fluorescerende lys som gjør det mulig å fange celler merket med fluorescerende markører.
7. RNA ekstraksjon
- Bruk en RNA-isolasjon med lav inngang (se Materials tabell)for RNA-ekstraksjon etter LCM. Slike sett er designet for å gjenopprette høy kvalitet totalt RNA konsekvent fra færre enn ti celler.
- Isoler den totale RNA fra de fangede celletypene i henhold til produsentens instruksjoner, inkludert DNase-behandlingen på kolonne.
MERK: Det første trinnet i RNA-ekstraksjonen der røret er invertert og flikket er avgjørende for å sikre at de fangede prøvene på lokket er i kontakt med ekstraksjonsbufferen lagt til.
8. RNA forsterkning
- Bruk et forsterkningssett for antisense RNA (aRNA) (se materialseksjon) for aRNA-forsterkning fra RNA som er hentet ut ved in vitro-transkripsjon for å produsere tilstrekkelig aRNA for RNA-seq biblioteksyntese.
- Utfør to runder med forsterkning ved hjelp av aRNA-forsterkningssettet i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: Det er viktig å forvarme termo-cycler og lokket til temperaturen som er instruert av settet (se Materialtabell). En alternativ tilnærming i stedet for RNA-forsterkning er å bruke et forberedelsessett for lav input library til å syntetisere biblioteket direkte fra utpakket RNA.
9. RNA-kvantifisering
- Kvantifisere og kvalifisere aRNA ved hjelp av et automatisert elektroforesesystem (se Materialse tabell).
MERK: Et automatisert elektroforesesystem foretrekkes da det krever mindre prøve (1-2 μL) og gir et gellignende bilde og elektrofært for hver enkelt prøve.
10. qRT-PCR og/eller RNA-seq
- Syntetisere cDNA fra aRNA for qRT-PCR eller for å lage RNA-seq biblioteker ved hjelp av standard RNA-seq bibliotek kits.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi genererte romlige og temporale vevsspesifikke transkripsjoner fra byggfrø under spiring ved hjelp av LCM RNA-seq-protokollen10. Studien ble utført ved å bruke LCM RNA-seq til et lite antall celler fra tre embryoorganer (plumule, radikkelspiss, scutellum) hver 8 timer over et 48 h tidskurs under spiring (0-48 h, 7 tidspunkter) (Figur 2A, B).
Figur 2: Celler samlet inn fra byggfrø av LCM. (A)Langsgående tverrsnitt av en byggfrø og, innfelt, en forstørret tegneserie som indikerer regionene som cellene ble fanget. Blå = plumule, magenta = radicle, grønn = scutellum. (B) LCM av plumule, radicle, og scutellum. Topppanel, vev før lasertrykk katapulting (LPC). Bunnpanel, vev etter LPC. Celler ble fanget fra 5 påfølgende langsgående deler av hver prøve med tre biologiske repliker per prøve. Hver repliker besto av ca. 200 celler (~0,05 - 0,15 mm2 totalt areal). Bar = 100 μm. E = endperm, C = knust cellelag, SE = scutellar epitel, S = scutellum. Figur gjengitt fra tidligere data i The Plant Journal med tillatelse10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Fiksering og innebygging er kritiske skritt som dårlig fast vev prøve kan resultere i vevsskade og tap av RNA kvantitet og kvalitet. Disse trinnene må optimaliseres og justeres for ulike arter og vevstyper19,,20,,21. Her brukte vi vakuuminfiltrasjon for å forbedre penetrasjonen av fikseringene i frøvevet og cellene. Dehydrering og parafininfiltrasjon utføres gradvis for å unngå skade på vevsprøvene. Vi har akselerert hele dehydrerings- og parafininfiltrasjonsprosessen ved hjelp av en automatisert vevsprosessor med agitasjon og vakuum påført på hvert trinn. Dette reduserer risikoen for at RNA-nedbrytning oppstår under de langvarige vevsbehandlingstrinnene utført av en menneskelig operativ. Før snitting er det avgjørende å behandle membranlysbildet for å sikre parafin vedheft og for å sikre at den er RNase-fri. Hvis membranskliene ikke er riktig forberedt, vil prøvedelen ikke holde seg til membranen, noe som vil påvirke LCM katapultingstrinnet og redusere vevsoverføring til klebehetthettene fordi prøven vil skille seg fra membranen (se figur 1).
Et annet kritisk trinn i LCM RNA-seq-protokollen er LCM-parameteroptimalisering. Det er fem hovedparametere som skal optimaliseres: (1) skjærehastighet; (2) kutte energi; (3) skjærefokus; (4) LPC energi; og (5) LPC-fokus. Det er viktig å justere skjæreparametrene riktig for å kutte det valgte området nøyaktig og løsne fra omkringliggende vev uten å brenne kanten av valgt område (figur 3A, B). Riktig LPC energi og fokus er avgjørende for pålitelig katapult det valgte området fra lysbildet til spesielle klebende caps av oppsamlingsrør, og alltid inspisere fanget prøver i caps for å sikre nok materiale er samlet (Figur 3C). Effektiviteten til LCM gjør det mulig å fange opp 1000 celler innen en time, noe som i stor grad reduserer sannsynligheten for RNA-nedbrytning under prøvebehandling. Bruken av oppsamlingsrør med selvklebende caps gjør det mulig å "tørke" innsamling uten å fange væske, noe som reduserer mulige RNases-aktiviteter. Det er viktig å holde de fangede prøvene på is og gjøre RNA-ekstraksjonen umiddelbart etter å ha samlet alle repliker.
RNA-ekstraksjon og forsterkning utføres ved hjelp av kommersielt tilgjengelige sett ved å følge produsentens instruksjoner. Kvantifisering av total RNA før RNA forsterkning ved hjelp av automatisert elektroforese system vil oppdage distinkte elektroforetiske bånd og fluorescerende topper på 18S og 28S ribosomale underenheter i god kvalitet RNA prøver (Figur 3D). Ytterligere topper tilsvarende kloroplast og mitokondrie ribosomal RNA vil bli funnet før 18S og 28S topper. På grunn av flere RNA-topper i plantearter, er RIN (RNA Integrity Number)-verdiene vanligvis lavere enn 9 (forventet RIN-verdi fra pattedyrvev) og reflekterer ikke RNA-integriteten22 nøyaktig. Det er hensiktsmessig å fortsette til RNA-forsterkning når klare 18S- og 28S-topper er synlige uten tegn på RNA-nedbrytning. Mengden RNA gjenvunnet i vårt byggfrøeksperiment varierte mellom tre forskjellige vevstyper (plumule, radikkel og scutellum) og, også mellom tidlige og sene stadier av spiring, til tross for omtrent like mange celler som høstes. Mengdene fra byggfrø varierte fra 100 pg til 20 ng fra omtrentlig 200 celler (0,5 til 100 pg per celle). Minimumsbeløpet for inngang RNA anbefalt for RNA-forsterkning var 100 pg. Mengden RNA ekstrahert avhenger av effektiviteten av utvinning fra forskjellige høstede celler og total transkripsjon overflod i den bestemte celletypen på det stadiet av utviklingen19,21. Det er nyttig å vurdere dette når du planlegger et LCM RNA-seq eksperiment, selv om slik tidligere informasjon ikke vil være tilgjengelig i alle tilfeller.
Vellykket syntetisert aRNA vil vise en unimodal, symmetrisk størrelsesfordeling fra 100 til 1000 nukleotider med en topp rundt 300 nukleotider etter to runder med forsterkning (figur 3E). I vårt byggfrøeksperiment fikk vi 500 pg til 2 μg aRNA etter to runder med RNA-forsterkning10. Sammenligning mellom forsterket og uforenklet RNA har vist at RNA-forsterkning er reproduserbar, lineær og ikke introduserer en systematisk bias til transkripsjonsdata23,,24,,25. UtgangsaRNA kan brukes til qRT-PCR og/eller RNA-seq for romlig og temporal vevsspesifikk genuttrykksanalyse. Validering etter RNA-seq må utføres for å bekrefte resultater fra analyse av aRNA. Dette kan gjøres ved å undersøke uttrykk for celletype markør gener fra RNA-seq data ved hjelp av RNA in situ hybridisering.
Figur 3: Representativt resultat av LCM. (A) Vev etter kutting med riktig skjæreenergi og fokus. En klar fin linje kan sees hvor kuttet ble gjort. Det valgte området vil bli løsnet fra omkringliggende materialer. Bar = 100 μm. (B) Vev etter kutting med feil skjæreenergi og fokus. Det valgte området er fortsatt koblet til omkringliggende materialer. Bar = 100 μm. (C) Undersøke fangede celler i spesielle selvklebende caps av oppsamlingsrør. Bar = 100 μm. (D) Et eksempel på total RNA-profil før RNA-forsterkning (venstre, gellignende bilde; høyre, elektroforammet) med distinkte elektroforetiske bånd og fluorescerende topper på 18S og 28S ribosomale underenheter. Umerkede topper tilsvarer ekstra ribosomal RNA, inkludert kloroplast og mitokondrieribbosomer. (E) Et eksempel på en typisk aRNA-profil etter RNA-forsterkning (venstre, gellignende bilde; høyre, elektrofoerogram). En fordeling av størrelser fra 100 til 1000 nukleotider, med en topp rundt 300 nukleotider, ble oppdaget. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
RNA-seq analyser ble utført på alle prøver i biologiske triplicates. En flerdimensjonal skalering (MDS) plott av gener uttrykt i de forskjellige vev over 48 timer spiring illustrerer større likhet mellom prøver av et enkelt vev enn mellom prøver fra samme tidspunkt, men forskjellige vev (figur 4A). Vi bestemte oss deretter for å finne ut hvor omfattende genuttrykk ble differensialt regulert i enkeltvev over tid under spiring. Antall differensialt uttrykte gener (DEGs) økte gradvis i løpet av spiring i hvert vev, i forhold til at vevets 0 h timepoint (figur 4B). Tjuefem prosent (910) av plumule, 34% (1876) radikkel og 41% (2562) av scutellum DEGs ble funnet å være utelukkende differensial uttrykt i dette vevet (det vil si disse genene ble ikke differensialt uttrykt i de andre vev, Figur 4C). Samlet viser disse resultatene hvordan LCM RNA-seq kan brukes til å forstå timelig og romlig genuttrykk under planteutvikling.
Figur 4: Analyse av RNA-biblioteker av LCM-prøver som viser tydelig separasjon av forskjellige vev over 48 timer med byggspiring. (A)Flerdimensjonal skalering (MDS) plott av gener uttrykt i de forskjellige vev over 48 timer spiring. Hvert punkt representerer 1 prøve, og avstanden mellom 2 punkter gjenspeiler den ledende log fold endring (FC) av tilsvarende RNA prøver. X-, y- og z-aksen representerer første, andre og tredje dimensjonale logFC. P = plumule, R = radicle, S = scutellum, 0-48h = t av spiring, R1-3 = Replikere 1-3. (B) Antall signifikante oppregulerte (rød) og nedregulerte (blå) differensialt uttrykte gener (DEGs) for seks tidspunkter sammenlignet med tidspunkt 0 t for tre vevstyper. (C) Venn diagram som viser antall DEGs i tre vev typer. Gener i overlappende sett viser differensialuttrykket i to eller tre vevstyper. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mange vevsspesifikke genuttrykksstudier har vært begrenset av hånddeksjon av prøver, som er tidkrevende, arbeidsintensive, har høy risiko for forurensning og kan bare bruke prøver som en menneskelig operativ er tilstrekkelig dexterous å høste. LCM er en presis og kontaktfri teknikk for å samle celler fra faste vevsseksjoner ved hjelp av en mekanisk drevet laserstråle under mikroskopisk visualisering.
God prøveklargjøring er avgjørende for LCM. Prosessen er avhengig av riktig fiksering og innebygging av prøver for å opprettholde en god balanse mellom vevmorfologi og integriteten til RNA. Protokollen som presenteres her gir optimaliserte feste- og innebyggingstrinn for byggfrø som inkluderer lengre fikseringstid og vakuuminfiltrasjon av fikseringsmidler. Analyse av ulike vev eller arter vil kreve optimalisering av forholdene, da disse vanligvis varierer mellom vev. Et annet viktig aspekt ved denne protokollen er RNA-forsterkningstrinnet som sikrer at det genereres tilstrekkelige mengder RNA for RNA-seq bibliotekkonstruksjon. Vi finner at RNA-forsterkning resulterer i biblioteker av høy kvalitet, men alternativt kan det være brukt lav input library forberedelsesmetoder25. Histologisk identifisering av målceller er et kritisk skritt i vår metode og kan gi utfordringer for sjeldne eller dårlig karakteriserte celletyper. Målcellegjenkjenning kan forbedres ved hjelp av tradisjonelle histologiske flekker eller immunofluorescensflekker som en del av forprosesseringstrinnet eller alternativt ved hjelp av transgene linjer som uttrykker fluorescerende merkede cellespesifikke markører26,27.
LCM-teknikken ble først utviklet for å brukes på dyreavledede prøver for celletypespesifikk transkripsjonsanalyse1. Det er imidlertid utviklet et bredt spekter av genomiske, proteomiske og epigenetiske analyser. Tilpasning av disse metodene for bruk i plantebiologiske studier er en pågåendeutfordring 18,,19,,20,,28. Schad et al. viste at proteiner og metabolitter fra Arabidopsis vaskulære bunter kunne analyseres ved hjelp av LCM med 2D gel elektroforese ogmassespektrometri 29,30. Nylig utførte Latrasse et al. kromatinimmunoprecipitation (ChIP)-qPCR-analyse på LCM-dissekerte pollenbærere og karpels ved hjelp av LCM, og fastslår at vevhomogenitet forbedrer oppløsningen av cellespesifikke epigenetiske hendelser31. Turco et al. også sammenlignet LCM med bisulfitt sekvensering for å studere DNA metylering hendelser under vaskularisering i sorghum, fremhever vev-spesifikk forskjell mellom vaskulære og ikke-vaskulærevev 32. Interessant, flere studier har brukt LCM å utforske plante-mikrobe og plante-patogen interaksjoner33,34,35. LCM's evne til å visualisere og fange opp celler på ulike infeksjonsstadier ga informasjon om de romlige og timelige responsene til infiserte celler.
Vår LCM-protokoll kombinert med RNA-seq presentert her vil lette spatio-temporal global profilering av genuttrykk av forskjellige celletyper. Med forbedrede rensemetoder for kromatin og proteiner sammen med forbedrede massespektrometriinstrumenter, vil LCM være et fremvoksende verktøy for å lette celletypespesifikke epigenomiske og proteomiske studier i planter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Australian Research Council Centre of Excellence in Plant Energy Biology (CE140100008) til JW. M.G.L ble støttet av en La Trobe University starter stipend. Vi takker La Trobe Genomics Platform for deres støtte i sekvensering og dataanalyse med høy gjennomstrømning. Vi takker førsteamanuensis Matthew Tucker for ekspertråd om å etablere LCM i laboratoriet vårt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid 100 % ACS/R. | AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) | VWRC20104.323 | |
| AdhesiveCap 200 opaque | Zeiss | 415190-9181-000 | |
| Clear base moulds 8 X 10 | Leica | 3803015 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 40718-25ML | |
| High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | |
| Lowprofile disp.blades DB80LS | Leica | 14035843489 | |
| MembraneSlide 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9041-000 | |
| MessageAmp II aRNA Amplification Kit | Ambion (ThermoFisher) | AMB17515 | |
| On-Column DNase I Digestion Set | Sigma-Aldrich | DNASE70 | |
| Ovation RNA-Seq System V2 | NuGen (Integrated Science) | 7102-08 | |
| Paraffin (Surgipath Paraplast) | Leica | 39601006 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | ABI (ThermoFisher) | KIT0214 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Ambion (ThermoFisher) | AM9780 | |
| Xylene | AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) | VWRC28975.360 | |
| Leica Benchtop Tissue Processor | Leica Biosystems | TP1020 | |
| Leica Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems | EG1150H | |
| Leica Cold Plate | Leica Biosystems | EG1150C | |
| Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets | LAF Technologies Pty Ltd | Safemate 1.5 | |
| Leica Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | RM2265 | with PALMRobo v 4.6 software |
| Zeiss PALM MicroBeam LCM system | Zeiss miscroscopy | ||
| TapeStation | Agilent | TapeStation 2200 |
References
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Alevizos, I., et al. Oral cancer in vivo gene expression profiling assisted by laser capture microdissection and microarray analysis. Oncogene. 20 (43), 6196-6204 (2001).
- Cong, P., et al. In situ localization of follicular lymphoma: description and analysis by laser capture microdissection. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 99 (9), 3376-3382 (2002).
- Blokhina, O., et al. Laser capture microdissection protocol for xylem tissues of woody plants. Frontiers in Plant Science. 7, 1965 (2017).
- Casson, S., Spencer, M., Walker, K., Lindsey, K. Laser capture microdissection for the analysis of gene expression during embryogenesis of Arabidopsis. The Plant Journal. 42 (1), 111-123 (2005).
- Chen, Z., et al. LCM-seq reveals the crucial role of LsSOC1 in heat-promoted bolting of lettuce (Lactuca sativa L.). The Plant Journal. 95 (3), 516-528 (2018).
- Jiao, Y., et al. A transcriptome atlas of rice cell types uncovers cellular, functional and developmental hierarchies. Nature Genetics. 41 (2), 258-263 (2009).
- Kivivirta, K., et al. A protocol for laser microdissection (LMD) followed by transcriptome analysis of plant reproductive tissue in phylogenetically distant angiosperms. Plant Methods. 15 (1), 1-11 (2019).
- Li, P., et al. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nature Genetics. 42 (12), 1060-1067 (2010).
- Liew, L. C., et al. Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination. The Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).
- Matas, A. J., et al. Tissue-and cell-type specific transcriptome profiling of expanding tomato fruit provides insights into metabolic and regulatory specialization and cuticle formation. The Plant Cell. 23 (11), 3893-3910 (2011).
- Sakai, K., et al. Combining laser-assisted microdissection (LAM) and RNA-seq allows to perform a comprehensive transcriptomic analysis of epidermal cells of Arabidopsis embryo. Plant Methods. 14 (1), 10 (2018).
- Zhan, J., et al. RNA Sequencing of Laser-Capture Microdissected compartments of the maize kernel identifies regulatory modules associated with endosperm cell differentiation. The Plant Cell. 27 (3), 513-531 (2015).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
- Zeb, Q., Wang, C., Shafiq, S., Liu, L. Single-Cell Omics. , Elsevier. 101-135 (2019).
- Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nature Protocols. 6 (1), 56 (2011).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282 (2014).
- Bevilacqua, C., Ducos, B. Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level. Molecular Aspects of Medicine. 59, 5-27 (2018).
- Nelson, T., Tausta, S. L., Gandotra, N., Liu, T. Laser microdissection of plant tissue: what you see is what you get. Annual Reviews in Plant Biology. 57, 181-201 (2006).
- Day, R. C., Grossniklaus, U., Macknight, R. C. Be more specific! Laser-assisted microdissection of plant cells. Trends in Plant Science. 10 (8), 397-406 (2005).
- Takahashi, H., et al. A method for obtaining high quality RNA from paraffin sections of plant tissues by laser microdissection. Journal of Plant Research. 123 (6), 807-813 (2010).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (1), 3 (2006).
- Ferreira, E. N., et al. Linear mRNA amplification approach for RNAseq from limited amount of RNA. Gene. 564 (2), 220-227 (2015).
- Schneider, J., et al. Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments. BMC Genomics. 5 (1), 29 (2004).
- Shanker, S., et al. Evaluation of commercially available RNA amplification kits for RNA sequencing using very low input amounts of total RNA. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (1), 4 (2015).
- Bhattacherjee, V., et al. Laser capture microdissection of fluorescently labeled embryonic cranial neural crest cells. Genesis. 39 (1), 58-64 (2004).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Blokhina, O., et al. Parenchymal Cells Contribute to Lignification of Tracheids in Developing Xylem of Norway Spruce. Plant Physiology. 181 (4), 1552-1572 (2019).
- Schad, M., Lipton, M. S., Giavalisco, P., Smith, R. D., Kehr, J. Evaluation of two-dimensional electrophoresis and liquid chromatography-tandem mass spectrometry for tissue-specific protein profiling of laser-microdissected plant samples. Electrophoresis. 26 (14), 2729-2738 (2005).
- Schad, M., Mungur, R., Fiehn, O., Kehr, J. Metabolic profiling of laser microdissected vascular bundles of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 1 (1), 2 (2005).
- Latrasse, D., et al. The quest for epigenetic regulation underlying unisexual flower development in Cucumis melo. Epigenetics & Chromatin. 10 (1), 22 (2017).
- Turco, G. M., et al. DNA methylation and gene expression regulation associated with vascularization in Sorghum bicolor. The New Phytologist. 214 (3), 1213-1229 (2017).
- Gomez, S. K., Harrison, M. J. Laser microdissection and its application to analyze gene expression in arbuscular mycorrhizal symbiosis. Pest Management Science: Formerly Pesticide Science. 65 (5), 504-511 (2009).
- Roux, B., et al. An integrated analysis of plant and bacterial gene expression in symbiotic root nodules using laser-capture microdissection coupled to RNA sequencing. The Plant Journal. 77 (6), 817-837 (2014).
- Tang, W., Coughlan, S., Crane, E., Beatty, M., Duvick, J. The application of laser microdissection to in planta gene expression profiling of the maize anthracnose stalk rot fungus Colletotrichum graminicola. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (11), 1240-1250 (2006).
