Summary
Burada sunulan bitki dokularının lazer yakalama mikrodisseksi (LCM) için bir protokoldür. LCM, doku alanlarını kontaminasyonsuz bir şekilde izole etmek için mikroskobik bir tekniktir. Prosedür doku fiksasyonu, parafin katıştırma, kesit, LCM ve RNA ekstraksiyon içerir. RNA, transkripsiyonların alt dokuya özgü, zamansal olarak çözümlenmiş analizinde kullanılır.
Abstract
Karmaşık çok hücreli bir organizmanın gelişimi farklı transkripsiyonel profillere sahip farklı hücre tipleri tarafından yönetilir. Gelişimsel süreçleri yöneten transkripsiyonel düzenleyici ağları belirlemek için bu bireysel hücre türlerinin mekansal ve zamansal gen ekspresyonu profillerini ölçmek gerekir. Bu nedenle, biyolojik ve gelişimsel süreçlerin nasıl düzenlendiğini anlamak için gen ekspresyonunun mekano-zamansal kontrolüne ilişkin içgörü esastır. Burada, çimlenme sırasında üç arpa embriyo organlarından az sayıda hücreyi izole etmek ve ardından transkript profilleme yöntemini lazer yakalama mikrodizesi (LCM) yöntemini tanımlıyoruz. Yöntem doku fiksasyonu, doku işleme, parafin katıştırma, kesit, LCM ve RNA ekstraksiyongerçek zamanlı PCR veya RNA-seq takip oluşur. Bu yöntem, tohum organ transkripsiyonlarının mekansal ve zamansal profillerini farklı sayıda hücreden (onlarca ila yüzlerce) elde etmemizi sağlayarak tipik toplu doku analizlerinden çok daha fazla doku özgüllüğü sağlamıştır. Bu verilerden transkripsiyonel düzenleyici ağları tanımlayabildik ve karşılaştırabildik ve bireysel dokular için aday düzenleyici transkripsiyon faktörlerini tahmin edebildik. Yöntem en az optimizasyon ile diğer bitki dokuları için geçerli olmalıdır.
Introduction
Bitki geliştirme ve büyüme karmaşık bir hücresel ortamda var olan farklı hücreler içinde transkripsiyonel düzenleyici ağların koordine eylem içerir. Bu düzenleyici ağların etkinliğini anlamak için, gelişim aşamalarında farklı hücre tipleri içinde mekansal ve zamansal gen ekspresyonu bilgisine ihtiyaç duyarız. Ancak, gen ekspresyonunun analizleri daha yaygın olarak tüm organlarda veya toplu doku örneklerinde, az sayıda hücrenin izole edilip analiz edilebis teknik zorluğu nedeniyle yapılır. Burada tanımladığımız yöntem, LCM'yi RNA-seq ile kaplayarak mekansal ve temporal dokuya özgü transkripsiyon analizinin elde edilmesine olanak sağlamıştır.
LCM emmert-Buck ve meslektaşları1tarafından yirmi yıl önce geliştirilmiştir. Bu teknik, araştırmacıların dar bir ışınlazeri1 ile doğrudan mikroskobik görüntüleme ve manipülasyon kullanarak tek hücreli veya hücre kümelerini çevrelerinden tam olarak izole etmelerini sağladı. O zamandan beri yöntem yaygın kanser biyolojisi ve patoloji2,3kullanılmaktadır . Birçok bitki araştırma grupları da farklı bitki türleri ve farklı doku türleri4,5,6,7,8,,9,10,11ile kullanım için LCM adapte var. Son zamanlarda, çeşitli kağıtları da embriyo, endosperm ve tohum gelişimi ve çimlenme sırasında diğer tohum yapıları incelemek için eudicot ve monocot tohumları üzerinde LCM kullandık10,12,13. Mikro-pipetleme, hücre ayrıştırma, manyetik ayırma ve mikroakışkan platformlar gibi yaygın olarak kullanılan diğer tek hücreli izolasyon yöntemlerinin çoğu hücreleri ayırmak için enzimatik sindirim veya mekanik homojenizasyon bağlıdır. Bu perturb gen ekspresyonu olabilir, bu veri yorumu 14 ,,15şaşırtan teknik eserler tanıtan .14 Bu yöntemler aynı zamanda her hücre tipi için işaretgenleri önceki bilgi gerektirir onların mekansal konumu ve gerçek hücre tipi ile ayrıştırılmış hücreleri ilişkilendirmek için. Tekniklerin bir başka grup tüm hücreler yerine hücre altı yapıların yakınlık tabanlı izolasyon bağlıdır, örneğin INTACT (Hücre Tiplerinde Etiketli Çekirdeklerin İzolasyon) ve TRAP (Ribozom Affinity Arınma Çevirme)16,17. Ancak, iyi kurulmuş dönüşüm protokolleri olmayan bitki türlerinde, çekirdek lerin veya ribozomların yakınlık etiketlemesi ve arınması teknik olarak zordur. LCM transkript düzeylerini korumak için hızlı doku fiksasyonu ve normal doku / organ bağlamında hücrelerin doğrudan görselleştirme ile konvansiyonel histolojik kimlik yararlanır, hangi kısa bir süre içinde izole edilmesine olanak sağlar18,19.
Burada sunulan protokol, histolojik olarak tanımlanabilen hücrelerin çoğuna uygulanabilen tahıl tohumlarının doku bölümlerinden belirli hücrelerin veya hücre tiplerinin izole edilmesi için optimize edilmiş bir yöntemdir. LCM, kontaminasyonu büyük ölçüde azaltarak ve kurtarılan RNA'nın bütünlüğünü artırarak temassız bir hücre yalıtımı yöntemi sağlar. Ayrıca, yöntem biyolojik malzemelerin küçük miktarlarda başlayan büyük ölçekli genom geniş çalışmalarda LCM gücünü göstermektedir. Ayrıca, downstream transkript/transkripsiyon analizleri için yeterli giriş materyali oluşturmak için RNA'nın doğrusal amplifikasyonuna neden olduğunu da açıklıyoruz.
Doku örneklerinin fiksasyonu, dehidratasyon, parafin infiltrasyonu, katıştırma, kesitleme, LCM, RNA ekstraksiyonu, RNA amplifikasyonu, RNA nicelleştirme ve qRT-PCR ve/veya RNA-seq dahil olmak üzere bu LCM RNA-seq protokolünde on ana adım vardır (Şekil 1).
Şekil 1: LCM akış şeması ve ardından RNA-seq veya qRT-PCR. LCM mikroskobik görselleştirme altında bir lazer ışını kullanarak sabit doku bölümlerinden hücreleri toplamak için bir mekansal hassas ve temassız bir tekniktir. Süreç doku örneklerinin fiksasyonu ile başlar, etanol ve ksilen gradyan bir dizi kullanarak dehidratasyon takip, ve parafin infiltrasyon ile bitmiş. İşlem, bir doku işlemcisi kullanılarak tam otomatikhale alınabilir. Doku parafin ile infiltrasyon sonra, bir katışma istasyonu kullanarak erimiş parafin ile bir kalıp gömülüdür. Kesit istenilen kalınlıkta mikrotom seti kullanılarak yapılır. Slaytlar hazırlanır ve RNA yakalanan hücrelerden ayıklanacak hemen önce LCM yapılır. RNA ekstraksiyonu, qRT-PCR ve/veya RNA-seq'dan önce iki tur RNA amplifikasyonu ile doğrudan takip edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nihai ürün RNA olduğundan, rnas ile kirlenmeönlemek için dikkat edin. Eldiven giymek şart. Diethyl pyrocarbonate (DEPC) ile işlenmiş su, tamponlar, vb kullanın. Otoklav tamponlar ve pişirme cam kullanmadan önce.
1. Doku fiksasyonu
- Tür ve doku tiplerine bağlı olarak tercih edilen fiksatif hazırlayın; arpa tohumu için Farmer's fixative (%75 etanol, %25 buzul asetik asit (v/v)) kullanın.
- Dokuları hasat önce buz üzerinde fiksatif chill.
- İlgi çekici bitki malzeme toplamak ve gerekirse, seçilen katıştırma kalıp sığacak şekilde uygun boyutta parçalar halinde incelemek. Arpa tohumu için, fiksatif çözeltipenetrasyon yardımcı olmak ve katıştırma kalıbına sığacak şekilde tohumu yarıya kesin.
- Dokuyu en az 10x hacimbuz gibi fiksatif ebata batırın. Arpa tohumu için, fiksatif içine yarısı kesilmiş tohum batırın.
- Fiksatif penetrasyonu hızlandırmak için vakum infiltrasyon kullanın. Dokular fiksatif vakum infiltrasyonu sonra batmak gerekir. Arpa tohumu için, vakum infiltrasyon 30 dk kullanın.
- Fiksatif ve inkübatif inkübatasyon değiştirin 4 °C tam doku nüfuz etmek için fiksatif sağlar. Arpa tohumu için, örnekleri bir gecede kuluçkaya yatırın (~12-16 saat).
NOT: İnce veya küçük dokular dokuya fiksatif yüksek difüzyon oranı nedeniyle daha kısa fiksasyon süresi gerektirir. - Fiksatif doku çıkarın ve kasetler içine doku transferi ve daha sonra doku işleme başlar.
NOT: Yaprak dokusu gibi küçük veya kırılgan dokular, fiksasyon sırasında zarar görmemesi için sabitleme için kasetlere yerleştirilebilir. Biyopsi torbaları, pedleri veya sargıları doku fiksasyon ve doku işleme adımları sırasında kasetler içinde güvenli bir şekilde doku tutmak için kullanılabilir.
2. Doku işleme
- Adım 2'de en az 10 çözelti odası ve 2 ısıtmalı parafin odası ile otomatik doku işlemcisi kullanın (Bkz. Malzeme Tablosu).
- Her odada yeterli miktarda çözelti olup olmadığını kontrol edin; doku işlemciher birkaç kullanır sonra çözümleri değiştirin.
- Metal sepetiçine doku ile kaset yerleştirin. Metal sepeti 1. Tutucu, belirlenen programı izleyerek kasetleri döndürülecek ve odalarına "batırıp batıracak".
- Her oda için zaman ayarlama uzunluğu içeren doku işlemci kontrol panelleri üzerinde düğme tıklamagerçekleştirerek programı ayarlayın.
- İşlem programını başlatmak için "Başlat" düğmesine basın. Aşağıdaki program arpa tohumu için tasarlanmıştır ve bir gecede çalışır (~ 18 saat)
- Degrade etanol serisinde (%75, %85, %100, %100 ve %100 (v/v) etanolde kaseti 1 saat 30 dk'ya batırarak dehidratasyon gerçekleştirin.
- Etanol kullanarak takas gerçekleştirin: 75:25, 50:50, 25:75 (etanol: ksilen %, v/v) her biri 1 saat 30 dk için ksilen gradyanı. Sonra 1 saat 30 dk her biri için kaset daldırma 100% xylene sonra% 100 xylene.
- 55-60 °C'de erimiş parafinde 1 saat 30 dk iki kez parafin infiltrasyonu yapın.
NOT: Parafin ısıtıcı odalarının sıcaklığı doku işlemcisinin arkasına ayarlanabilir.
- Ertesi sabah, doku işlemci kasetleri çıkarın ve parafin gömme devam edin.
NOT: Program süresi farklı doku tipi arasında değişebilir. Vakum ve/veya ajitasyon doku işleme sırasında, doku işlemcisinin kontrol panelindeki "V" ve/veya "ajitasyon" tuşlarına basarak seçilen çözeltilerin sızmasını hızlandırmak için kullanılabilir.
3. Parafin gömme
- Bu adımda bir katıştırma makinesi kullanın (bkz. Malzemeler Tablosu).
- Gömme makinesini, rezervuarlarda parafinin tamamen erimesi için zaman tanımak için gömmeişleminden en az birkaç saat önce açmak üzere önceden ayarlayın.
- Başlamadan önce soğuk tabağı açın.
- İnce çifenler kullanarak numuneleri pozisyonda tutarak ve erimiş parafini kalıba dağıtarak örnekleri kalıplara yerleştirin. Her deneysel amaç için numunelerin doğru yönünü sağlayın. Arpa tohumu için, uzunlamasına kesitler elde etmek için tohum uzunlamasına kesme yönüne yönlendirmek.
NOT: Katıştırma kalıpları farklı boyutlarda gelir. Örneğin düzgün bir şekilde konumlandırılmasıve gömülmesi için uygun bir boyut seçin. Deneysel ihtiyaçlar göz önünde bulundurularak numunelerin oryantasyonu göz önünde bulundurulmalıdır. Uzunlamasına kesitler gerekiyorsa, numune kesme yönüne uzunlamasına yönlendirilmeli, enine kesitler için ise numune kesme yönüne paralel olarak yönlendirilmelidir. - Kalıba temiz bir kaset yerleştirin ve numuneyi kasete tutmak için tüm kaseti tam olarak kaplayacak yeterli parafinin olmasını sağlayın.
- Kalıbı soğuk tabağa yerleştirin ve kalıbın bloğunu kalıptan çıkarmadan önce parafinin tam olarak (10-20 dk) ayarlamasını bekleyin.
- Kesitleme devam edin veya depolama için 4 °C'ye bloklar aktarın.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Gömülü bloklar 4 °C'de üç aya kadar saklanabilir.
4. Polietilen naftalalate (PEN) membran slaytlarının hazırlanması
- 3 s için RNase deaktivating çözeltisi pen membran slaytlar batırın slaytlar üzerinde RNases kaldırmak için DEPC tarafından arıtılmış suda iki kısa yıkar izledi. Sol çözeltiyi çıkarmak için slaytları 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde kurulayın.
- UV-geliştirilmiş parafin yapışması için hidrofilik özellikleri geliştirmek için 30 dakika için bir laminar akış kabininde bir UV lambası kullanarak slaytlar tedavi.
5. Kesitleme
- Kesit adımında bir mikrotom kullanın (bkz. Malzeme Tablosu).
- Bıçak tutucuya yeni bir bıçak yerleştirin ve aktif olarak kesit lemediğinizde her zaman bıçak koruyucuyu koruyun
DİkKAT: Mikrotom bıçakları son derece keskindir ve uygun olmayan şekilde işlendiğinde önemli zararlara neden olabilir.
NOT: Mikrotomda iki kilitleme mekanizması vardır, biri makinenin yanında, diğeri tekerleğin sapındadır. Her ikisi de aktif olarak kesit değilken meşgul edilmelidir. - Bıçak bloğunu dokunmadan örneğe mümkün olduğunca yakın olacak şekilde ayarlayın. Mikrotom un bıçak bloğuyla tam temas alamaması, mikrotome yıkıcı yapısal hasara yol açacağından emin olun.
- Başlamadan önce soğuk tabağı açın. Kesitlenmeden önce parafin bloklarını soğuk tabakta tutun ve blokların yumuşamasını önlemek için kesit sırasında blokları gerektiğinde yeniden soğutun.
- Su banyosunu DEPC ile işlenmiş su ve ısı ile 42 °C'ye kadar doldurun.
- Blokları istenilen derinliğe kadar (ilgilendiğiniz bölümün bulunduğu yerde) ve mikrotomu kullanarak istenilen kalınlıkta (6-10 μm) kesit parafin blokları; iyi kesitli bir blok bıçağın kenarında bir 'şerit' oluşturacaktır. Arpa tohumu için, 8 μm kalınlığında kesit.
- İnce boya fırçası veya ince çerkezlikler kullanarak mikrotomdan su banyosuna kurdeleleri yavaşça aktarArak şeridin su yüzeyinde düz olmasını sağlar.
- Yukarı doğru bir hareket kullanarak bir kaydırağı 45° açıda tutun, bir şeridi sudan kaydırağını kaldırın ve fazla suyu tüy bırakmayan bir dokuyla dikkatlice çıkarın.
- Parafinin altında kalan suyu ortadan kaldırmak için 37 °C'de 30 dk kuru slaytlar.
- Parafin çıkarma işlemine devam edin veya 4 °C'de susuz kalma koşullarında kapalı bir kutuda saklayın (birkaç gün içinde kullanılacak).
- Ksilende 20'şer s'lik slaytları 3x yıkayarak parafini çıkarın, ardından %100 (v/v) etanolde 30 s'lik 2x yıkama ve %70 (v/v) etanolde 30 s'lik 2x yıkar.
- Parafin çıkarıldıktan sonra hemen lazer yakalama mikrodiseksiyondevam edin.
NOT: Kriyoding, LCM ile başarıyla birleştirilmiş alternatif bir yöntemdir. Kriyoding için örnek hazırlık farklı olacaktır.
6. Lazer yakalama mikrodisze
- Parafinize edilmiş ve kurutulmuş doku bölümlerindeki hücreleri mikrodisetize etmek için lazer yakalama mikrodisze mikroskobu (Bkz. Malzeme Tablosu)kullanın.
- Slaytları kullanılabilir üç yuvaya yükleyin.
- Yakalanan örnekleri toplamak için toplama tüplerinin özel yapıştırıcı kapaklarını kullanın. Sıvı olmadan yakalama ("kuru" toplama) RNase aktivitesini en aza indirir. Toplama tüplerini kullanılabilir yuvalara yükleyin.
- Kesilmesi gereken numunenin bölgesini bulmak için sahneyi hareket ettirin. Bu işlem, LCM makinesinin fare si veya joystick'i veya klavyedeki ok tuşları kullanılarak yapılabilir.
- Kesme hızını optimize etmek için, kesme enerjisi ve odak, lazer basınç mancınık (LPC) enerji ve odak, ilk membran slayt üzerinde doku serbest boş bir segment üzerinde kesti. Arpa tohumu için kesme hızı = 18, CutEnergy = 52 CutFocus = 63, LPCEnergy = 78, LPC focus = 61 10x büyütme.
NOT: Kesme odağı ve enerjisi farklı kaydıraklar, farklı dokular ve yakalanan alan için ayarlanmalıdır, ancak genel kurallar mancınık gücünün kesme gücünden daha yüksek olduğu ve lazerin mancınık için deodağıolması gerektiğidir. Objektif lensin büyütmesi ne kadar yüksekse, lazerin odağı o kadar küçük ve enerji de o kadar yüksek tir. - İlgi alanını özetleyerek hücreleri seçmek için Çizim araçlarını kullanın.
- Yukarıdaki siyah segmentin kesilmesiyle elde edilen en iyi parametreleri temel alarak hücreleri yapışkan kapaklara mancınık lamak için işlev araç çubuğundan RoboLPC işlevini seçin.
NOT: LCM parametreleri doku tipleri arasında, kesit kalınlığı, doku sertliği ve objektif lensler arasında farklılık gösterir. Bu nedenle, gerçek numune kesmeden önce doku örneği olmadan düz bir membran alanında her slayt optimize etmek en iyisidir. - Öğeler listesinden bu bayrağı seçerek onları hemen bulmak için ilgi alanları bölgeleri işaretlemek için Bayrak araçlarını kullanın.
- Örneklerin ele geçirildiğini doğrulamak için yapıştırıcı kapağı incelemek için "CapCheck" düğmesine basın. Tipik olarak, RNA ekstraksiyonu için kapak başına 10-15 kesitli (~200 hücre) LCM gereklidir.
- Yakalanan örnekleri buzda tutun. RNA bozulmasını önlemek için RNA ekstraksiyonu için hemen ilerleyin.
NOT: Bazı LCM mikroskopifloresan belirteçleri ile etiketlenmiş hücrelerin yakalanmasını sağlayan floresan ışık ile donatılmıştır.
7. RNA çıkarma
- LCM'den sonra RNA ekstraksiyonu için düşük girişli RNA yalıtımı kullanın (Bkz. Malzeme Tablosu)kiti. Bu tür kitleri sürekli az on hücreden yüksek kaliteli toplam RNA kurtarmak için tasarlanmıştır.
- Toplam RNA'yı, kolon daki DNase tedavisi de dahil olmak üzere üreticinin talimatlarına göre yakalanan hücre tiplerinden ayırın.
NOT: Tüpün ters çevrildiği ve hareket ettirildiği RNA ekstraksiyonunun ilk adımı, kapakta yakalanan numunelerin eklenen ekstraksiyon arabelleğiyle temas halinde olduğundan emin olmak için çok önemlidir.
8. RNA amplifikasyon
- RNA-seq kitaplığı sentezi için yeterli aRNA üretmek için in vitro transkripsiyon tarafından çıkarılan RNA'dan aRNA amplifikasyon için bir antisense RNA (aRNA) amplifikasyon kiti (bkz. Malzeme Tablosu) kullanın.
- Üreticinin talimatlarına göre aRNA amplifikasyon Kiti'ni kullanarak iki tur amplifikasyon gerçekleştirin.
NOT: Termo-çevrimcinin ve kapağın kittarafından talimat edilen sıcaklığa önceden ısıtılmış olması önemlidir (bkz. Malzeme Tablosu)üreticisi. RNA amplifikasyon yerine alternatif bir yaklaşım, kitaplığı doğrudan çıkarılan RNA'dan sentezlemek için düşük girişli kitaplık hazırlama kiti kullanmaktır.
9. RNA niceleme
- Otomatik bir elektroforez sistemi kullanarak aRNA'yı ölçün ve niteleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: Daha az numune (1-2 μL) gerektirdiği ve her bir numune için jel benzeri bir görüntü ve elektrofromite sağladığı için otomatik elektroforez sistemi tercih edilir.
10. qRT-PCR ve/veya RNA-seq
- QRT-PCR için aRNA'dan cDNA sentezlemek veya standart RNA-seq kitaplık kitleri kullanarak RNA-seq kitaplıkları yapmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LCM RNA-seqprotokol10'umuzukullanarak çimlenme sırasında arpa tohumlarından mekansal ve temporal dokuya özgü transkripsiyonlar ürettik. Çalışma, çimlenme sırasında 48 h'lik bir zaman diliminde her 8 saat (0-48 saat, 7 zaman puanı)(Şekil 2A,B)üç embriyo organından (plumule, radicle ucu, scutellum) az sayıda hücreye LCM RNA-seq uygulanarak gerçekleştirilmiştir.
Şekil 2: Arpa tohumlarından LCM ile toplanan hücreler. (A) Bir arpa tohumuuzun uzunlamasına kesiti ve hücrelerin yakalandığı bölgeleri gösteren genişlemiş bir çizgi film. Mavi = plumule, macenta = radicle, yeşil = scutellum. (B) LCM plumule, radicle ve scutellum. Üst panel, lazer basınç mancınık (LPC) önce doku. Alt panel, LPC sonra doku. Hücreler, her numunenin ardışık 5 uzunlamasına bölümünden, numune başına üç biyolojik kopya ile yakalandı. Her çoğaltma yaklaşık 200 hücre (~ 0,05 - 0,15 mm2 toplam alan) oluşuyordu. Çubuk = 100 μm. E = endosperm, C = ezilmiş hücre tabakası, SE = scutellar epitel, S = scutellum. Bitki Günlüğü'ndeki önceki verilerden izinli olarak çoğaltılan şekil10. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Fiksasyon ve katıştırma, düşük sabit doku numunesi doku hasarına ve RNA miktarının ve kalitesinin kaybına yol açabileceğinden kritik adımlardır. Bu adımlar optimize edilmeli ve farklı türler ve doku tipleri19,,20,21için ayarlanmalıdır. Burada fiksatiflerin tohum dokularına ve hücrelere nüfuzunu artırmak için vakum infiltrasyonu kullandık. Dehidratasyon ve parafin infiltrasyonu doku örneklerinin zarar görmesini önlemek için kademeli olarak yapılır. Biz ajitasyon ve vakum her adımda uygulanan bir otomatik doku işlemci kullanarak tüm dehidratasyon ve parafin infiltrasyon sürecini hızlandırdı. Bu son derece bir insan operatif tarafından yürütülen uzun süreli doku işleme adımları sırasında meydana gelen RNA bozulma riskini azaltır. Kesitlemeden önce, parafin yapışmasını sağlamak ve RNase'siz olduğundan emin olmak için membran kaydırağının tedavisi çok önemlidir. Membran slaytları düzgün hazırlanmazsa, örnek bölümü membrana yapışmaz, bu da LCM mancınık adımını etkiler ve doku transferini yapışkan kapaklara düşürür, çünkü örnek membrandan ayrılır (Bkz. Şekil 1).
LCM RNA-seq protokolündeki bir diğer kritik adım da LCM parametre optimizasyonudur. Optimize edilmesi gereken beş ana parametre vardır: (1) kesme hızı; (2) kesme enerjisi; (3) kesme odak; (4) LPC enerji; ve (5) LPC odak. Seçilen alanın kesin olarak kesilmesi ve seçilen alanın kenarını yakmadan çevre dokudan çıkmak için kesme parametrelerinin doğru ayarlanması önemlidir(Şekil 3A,B). Uygun LPC enerjisi ve odak, seçilen alanı slayttan toplama tüplerinin özel yapışkan kapaklarına kadar güvenilir bir şekilde mancınık lamak ve yeterli malzemenin toplanmasını sağlamak için her zaman kapaklarda yakalanan numuneleri incelemek için gereklidir(Şekil 3C). LCM'nin verimliliği 1000 hücrenin bir saat içinde yakalanmasını sağlar ve bu da numune işleme sırasında RNA bozulması olasılığını büyük ölçüde azaltır. Yapışkan kapaklı toplama tüplerinin kullanımı, herhangi bir sıvı yakalama dan "kuru" toplama sağlar, büyük ölçüde olası RNases faaliyetlerini azaltır. Yakalanan örnekleri buzda tutmak ve tüm kopyaları topladıktan hemen sonra RNA ekstraksiyonu yapmak önemlidir.
RNA çıkarma ve amplifikasyon üreticilerin talimatlarına uyarak ticari olarak kullanılabilir kitleri kullanılarak gerçekleştirilir. Otomatik elektroforez sistemi kullanılarak RNA amplifikasyonundan önce toplam RNA'nın ölçülmesi, kaliteli RNA örneklerinde 18S ve 28S ribozomal alt birimlerinin farklı elektroforetik bantları ve floresan zirvelerini tespit edecektir(Şekil 3D). Kloroplast ve mitokondriyal ribozomal RNA'ya karşılık gelen ek zirveler 18S ve 28S zirvelerinden önce bulunacaktır. Bitki türlerinde birden fazla RNA zirvesi nedeniyle, RIN (RNA Bütünlük Numarası) değerleri genellikle 9'dan daha düşüktür (memeli dokularından beklenen RIN değeri) ve RNA bütünlüğünü doğru bir şekilde yansıtmaz22. Net 18S ve 28S zirveleri RNA bozulması belirtisi olmadan görünür olduğunda RNA amplifikasyon devam etmek uygundur. Arpa tohumu denememizde ele geçirilen RNA miktarı, yaklaşık olarak eşit sayıda hücre nin hasat edilmesine rağmen, üç farklı doku tipi (plumule, radicle ve scutellum) ile çimlenmenin erken ve geç evreleri arasında değişmektedir. Arpa tohumlarından elde edilen miktarlar yaklaşık 200 hücreden (hücre başına 0,5 ila 100 pg) 100 pg ile 20 ng arasında değişmektedir. RNA amplifikasyonu için önerilen minimum giriş RNA miktarı 100 pg idi. Çıkarılan RNA miktarı farklı hasat hücrelerinden çıkarma verimliliği ve geliştirme nin bu aşamasında belirli hücre tipinde toplam transkript bolluğu bağlıdır19,21. Bir LCM RNA-seq deneyi planlarken bunu göz önünde bulundurmak yararlıdır, ancak bu tür önceki bilgiler her durumda mevcut olmayacaktır.
Başarıyla sentezlenen aRNA, iki tur amplifikasyondan sonra 300 nükleotit civarında bir tepe ile 100 ila 1000 nükleotit arasında tek modal, simetrik boyut dağılımı sergileyecektir(Şekil 3E). Arpa tohumu denememizde, iki tur RNA amplifikasyon10'dansonra 500 pg ile 2 g aRNA elde ettik. Amplifiye ve amplifikasyonsuz RNA arasında karşılaştırma RNA amplifikasyon reürdüktörü olduğunu göstermiştir, doğrusal ve transkript verileri için sistematik bir önyargı tanıtmak değildir23,24,25. Çıkış aRNA qRT-PCR ve / veya RNA-seq için mekansal ve temporal doku özgü gen ekspresyonu analizi için kullanılabilir. RNA-seq sonrası doğrulama, aRNA analizinden elde edilen sonuçları doğrulamak için yapılmalıdır. Bu, rna-seq verilerinden hücre tipi marker genlerinin in situ hibridizasyon da Kullanılarak ekspresyonu inceleyerek yapılabilir.
Şekil 3: LCM'nin temsili sonucu. (A) Uygun kesme enerjisi ve odak ile kestikten sonra doku. Kesiğin yapıldığı yerde ince bir çizgi görülebilir. Seçilen alan çevredeki malzemelerden çıkarılacaktır. Çubuk = 100 μm. (B) Doku yanlış kesme enerjisi ve odak ile kestikten sonra. Seçilen alan hala çevredeki malzemelere bağlıdır. Çubuk = 100 μm. (C) Toplama tüplerinin özel yapışkan kapaklarında yakalanan hücrelerin incelenmesi. Bar = 100 μm. (D) RNA amplifikasyon öncesi toplam RNA profilinin bir örneği (sol, jel benzeri görüntü; sağ, elektrofeogram) farklı elektroforetik bantlar ve 18S ve 28S ribozomal alt birimlerinfloresan zirveleri ile. Etiketsiz zirveler kloroplast ve mitokondriyal ribozomlar da dahil olmak üzere ek ribozomal RNA karşılık gelir. (E) RNA amplifikasyon sonrası tipik bir aRNA profili örneği (sol, jel benzeri görüntü; sağ, elektroferogram). Büyüklüklerin 100 ile 1000 nükleotit arasında bir dağılımı tespit edildi ve tepe noktası 300 nükleotit oldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Biyolojik trikiflerde tüm numuneler üzerinde RNA-seq analizleri yapıldı. Çimlenmenin 48 h üzerinde farklı dokularda ifade edilen genlerin çok boyutlu ölçekleme (MDS) çizimi, tek doku örnekleri arasında aynı zaman noktasından ancak farklı dokulardan alınan örneklerden daha büyük benzerlik göstermektedir(Şekil 4A). Daha sonra çimlenme sırasında zaman içinde bireysel dokularda gen ekspresyonunun ne kadar kapsamlı bir şekilde farklı düzenlendiğini belirlemek için yola çıktık. Farklı olarak ifade edilen genlerin (DEGs) sayısı her dokuda çimlenme boyunca, o dokunun 0 saat zaman noktasına göre kademeli olarak artmıştır(Şekil 4B). Dolgunun %25'i (910), %34'ü (1876) radicle ve %41'i (2562) scutellum DEG'lerinin sadece o dokuda (yani, bu genlerin diğer dokularda, Şekil 4C'defarklı olarak ifade edilmemiştir) sadece farklı olarak ifade edildiği bulunmuştur. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar bitki gelişimi sırasında lcm RNA-seq'nin zamansal ve mekansal gen ekspresyonunu anlamak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
Şekil 4: Arpa çimlenme 48 saat üzerinde farklı dokuların farklı ayrılması gösteren LCM örneklerinin RNA kütüphanelerinin analizi. (A) Çimlenme 48 h üzerinde farklı dokularda ifade genlerin çok boyutlu ölçekleme (MDS) arsa. Her nokta 1 örneği temsil eder ve 2 nokta arasındaki mesafe, ilgili RNA örneklerinin önde gelen günlük kıvrım değişimini (FC) yansıtır. x, y ve z ekseni birinci, ikinci ve üçüncü boyutlu logFC'yi temsil eleştirir. P = plumule, R = radicle, S = scutellum, 0-48h = çimlenme h, R1-3 = Çoğaltma 1-3. (B) Üç doku tipi için saat 0 saat ile karşılaştırıldığında altı zaman puanı için önemli yukarı düzenlenmiş (kırmızı) ve aşağı düzenlenmiş (mavi) farklı ifade genlerin (DEGs) sayısı. (C) Venn diyagramı üç doku tipinde DEG sayısını gösterir. Örtüşen setlerdeki genler iki veya üç doku tipinde diferansiyel ifadeyi gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dokuya özgü gen ekspresyonu çalışmaları, zaman alan, emek yoğun olan örneklerin el diseksiyonu ile sınırlandırılmıştır, bu da yüksek kontaminasyon riskine sahiptir ve sadece bir insan operatifinin hasat için yeterince becerikli olduğu örneklerinden yararlanabilmiştir. LCM mikroskobik görselleştirme altında mekanik olarak işletilen lazer ışını kullanarak sabit doku bölümlerinden hücreleri toplamak için hassas ve temassız bir tekniktir.
İyi numune hazırlama LCM için çok önemlidir. Süreç, doku morfolojisi ve RNA'nın bütünlüğü arasında iyi bir denge sağlamak için numunelerin uygun şekilde sabitlenmesine ve gömünmeye dayanır. Burada sunulan protokol, arpa tohumları için daha uzun sabitleme süresi ve fiksatiflerin vakuma sızmalarını içeren optimize edilmiş sabitleme ve gömme adımları sağlar. Farklı doku veya türlerin analizi koşulların optimizasyonu gerektirir, bu genellikle dokular arasında farklılık gibi. Bu protokolün bir diğer önemli yönü, RNA-seq kütüphane inşaatı için yeterli miktarda RNA oluşturulmasını sağlayan RNA amplifikasyon adımıdır. Biz Yüksek kaliteli kütüphanelerde RNA amplifikasyon sonuçları bulmak, ancak alternatif olarak düşük giriş kitaplık hazırlama yöntemleri istihdam edilebilir25. Hedef hücrelerin histolojik olarak tanımlanması yöntemimizde kritik bir adımdır ve nadir veya kötü karakterize edilen hücre tipleri için zorluklar sağlayabilir. Hedef hücre tanıma preprocessing adımın bir parçası olarak geleneksel histolojik lekeler veya immünororesans lekeleri kullanılarak geliştirilebilir veya alternatif olarak, floresan olarak etiketli hücre özel belirteçleri ifade transgenik çizgiler kullanılarak26,27.
LCM tekniği ilk olarak hücre tipine özgü transkript analizi1için hayvan kaynaklı numuneler üzerinde kullanılmak üzere geliştirilmiştir. Ancak daha sonra çok çeşitli genomik, proteomik ve epigenetik analizler geliştirilmiştir. Bitki biyolojik çalışmalarda uygulama için bu yöntemlerin adapte devam eden bir sorun18,19,20,28. Schad ve ark. Arabidopsis vasküler demetleri protein ve metabolitleri 2-D jel elektroforezi ve kütle spektrometresi29,30ile LCM kullanılarak analiz edilebilir olduğunu göstermiştir. Son zamanlarda, Latrasse ve ark. LCM-diseksiyon stamens ve karpels LCM üzerinde kromatin immünopresiksiyon (ChIP)-qPCR analizi yürütülen, doku homojenliği hücreye özgü epigenetik olayların çözünürlüğünü artırır kurulması31. Turco ve ark. ayrıca sorgum da vaskülarizasyon sırasında DNA metilasyon olayları çalışma için bisülfit sıralama ile LCM birleştiğinde, vasküler ve nonvasküler dokular arasındaki doku-spesifik farkı vurgulayarak32. İlginçtir, çeşitli çalışmalar bitki-mikrop ve bitki-patojen etkileşimleri33,34,35keşfetmek için LCM uygulanmıştır. LCM yeteneği görselleştirmek ve farklı enfeksiyon aşamalarında hücreleri yakalamak enfekte hücrelerin mekansal ve zamansal tepkiler hakkında bilgi sağladı.
Burada sunulan RNA-seq ile birleşen LCM protokolümüz, farklı hücre tiplerinin gen ekspresyonunun spatio-temporal küresel profilini kolaylaştıracaktır. Kromatin ve proteinler için geliştirilmiş arıtma yöntemleri nin yanı sıra gelişmiş kütle spektrometresi aletleri ile LCM, bitkilerde hücre tipine özgü epigenomik ve proteomik çalışmaları kolaylaştırmak için ortaya çıkan bir araç olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Avustralya Araştırma Konseyi Bitki Enerji Biyolojisi Mükemmellik Merkezi (CE140100008) tarafından JW'ye desteklenmiştir. M.G.L, La Trobe Üniversitesi'nin başlangıç bursu ile desteklendi. La Trobe Genomik Platformu'na yüksek iş bilgisi sıralaması ve veri analizine verdikleri destekiçin teşekkür ederiz. Laboratuvarımızda LCM kurulması konusunda uzman tavsiyesi için Doçent Matthew Tucker'a teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid 100 % ACS/R. | AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) | VWRC20104.323 | |
| AdhesiveCap 200 opaque | Zeiss | 415190-9181-000 | |
| Clear base moulds 8 X 10 | Leica | 3803015 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 40718-25ML | |
| High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | |
| Lowprofile disp.blades DB80LS | Leica | 14035843489 | |
| MembraneSlide 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9041-000 | |
| MessageAmp II aRNA Amplification Kit | Ambion (ThermoFisher) | AMB17515 | |
| On-Column DNase I Digestion Set | Sigma-Aldrich | DNASE70 | |
| Ovation RNA-Seq System V2 | NuGen (Integrated Science) | 7102-08 | |
| Paraffin (Surgipath Paraplast) | Leica | 39601006 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | ABI (ThermoFisher) | KIT0214 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Ambion (ThermoFisher) | AM9780 | |
| Xylene | AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) | VWRC28975.360 | |
| Leica Benchtop Tissue Processor | Leica Biosystems | TP1020 | |
| Leica Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems | EG1150H | |
| Leica Cold Plate | Leica Biosystems | EG1150C | |
| Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets | LAF Technologies Pty Ltd | Safemate 1.5 | |
| Leica Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | RM2265 | with PALMRobo v 4.6 software |
| Zeiss PALM MicroBeam LCM system | Zeiss miscroscopy | ||
| TapeStation | Agilent | TapeStation 2200 |
References
- Emmert-Buck, M. R., et al.
- Alevizos, I., et al. Oral cancer in vivo gene expression profiling assisted by laser capture microdissection and microarray analysis. Oncogene. 20 (43), 6196-6204 (2001).
- Cong, P., et al. In situ localization of follicular lymphoma: description and analysis by laser capture microdissection. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 99 (9), 3376-3382 (2002).
- Blokhina, O., et al. Laser capture microdissection protocol for xylem tissues of woody plants. Frontiers in Plant Science. 7, 1965 (2017).
- Casson, S., Spencer, M., Walker, K., Lindsey, K. Laser capture microdissection for the analysis of gene expression during embryogenesis of Arabidopsis. The Plant Journal. 42 (1), 111-123 (2005).
- Chen, Z., et al. LCM-seq reveals the crucial role of LsSOC1 in heat-promoted bolting of lettuce (Lactuca sativa L.). The Plant Journal. 95 (3), 516-528 (2018).
- Jiao, Y., et al. A transcriptome atlas of rice cell types uncovers cellular, functional and developmental hierarchies. Nature Genetics. 41 (2), 258-263 (2009).
- Kivivirta, K., et al. A protocol for laser microdissection (LMD) followed by transcriptome analysis of plant reproductive tissue in phylogenetically distant angiosperms. Plant Methods. 15 (1), 1-11 (2019).
- Li, P., et al. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nature Genetics. 42 (12), 1060-1067 (2010).
- Liew, L. C., et al. Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination. The Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).
- Matas, A. J., et al. Tissue-and cell-type specific transcriptome profiling of expanding tomato fruit provides insights into metabolic and regulatory specialization and cuticle formation. The Plant Cell. 23 (11), 3893-3910 (2011).
- Sakai, K., et al. Combining laser-assisted microdissection (LAM) and RNA-seq allows to perform a comprehensive transcriptomic analysis of epidermal cells of Arabidopsis embryo. Plant Methods. 14 (1), 10 (2018).
- Zhan, J., et al. RNA Sequencing of Laser-Capture Microdissected compartments of the maize kernel identifies regulatory modules associated with endosperm cell differentiation. The Plant Cell. 27 (3), 513-531 (2015).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
- Zeb, Q., Wang, C., Shafiq, S., Liu, L. Single-Cell Omics. , Elsevier. 101-135 (2019).
- Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nature Protocols. 6 (1), 56 (2011).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282 (2014).
- Bevilacqua, C., Ducos, B. Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level. Molecular Aspects of Medicine. 59, 5-27 (2018).
- Nelson, T., Tausta, S. L., Gandotra, N., Liu, T. Laser microdissection of plant tissue: what you see is what you get. Annual Reviews in Plant Biology. 57, 181-201 (2006).
- Day, R. C., Grossniklaus, U., Macknight, R. C. Be more specific! Laser-assisted microdissection of plant cells. Trends in Plant Science. 10 (8), 397-406 (2005).
- Takahashi, H., et al. A method for obtaining high quality RNA from paraffin sections of plant tissues by laser microdissection. Journal of Plant Research. 123 (6), 807-813 (2010).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (1), 3 (2006).
- Ferreira, E. N., et al. Linear mRNA amplification approach for RNAseq from limited amount of RNA. Gene. 564 (2), 220-227 (2015).
- Schneider, J., et al. Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments. BMC Genomics. 5 (1), 29 (2004).
- Shanker, S., et al. Evaluation of commercially available RNA amplification kits for RNA sequencing using very low input amounts of total RNA. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (1), 4 (2015).
- Bhattacherjee, V., et al. Laser capture microdissection of fluorescently labeled embryonic cranial neural crest cells. Genesis. 39 (1), 58-64 (2004).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Blokhina, O., et al. Parenchymal Cells Contribute to Lignification of Tracheids in Developing Xylem of Norway Spruce. Plant Physiology. 181 (4), 1552-1572 (2019).
- Schad, M., Lipton, M. S., Giavalisco, P., Smith, R. D., Kehr, J. Evaluation of two-dimensional electrophoresis and liquid chromatography-tandem mass spectrometry for tissue-specific protein profiling of laser-microdissected plant samples. Electrophoresis. 26 (14), 2729-2738 (2005).
- Schad, M., Mungur, R., Fiehn, O., Kehr, J. Metabolic profiling of laser microdissected vascular bundles of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 1 (1), 2 (2005).
- Latrasse, D., et al. The quest for epigenetic regulation underlying unisexual flower development in Cucumis melo. Epigenetics & Chromatin. 10 (1), 22 (2017).
- Turco, G. M., et al. DNA methylation and gene expression regulation associated with vascularization in Sorghum bicolor. The New Phytologist. 214 (3), 1213-1229 (2017).
- Gomez, S. K., Harrison, M. J. Laser microdissection and its application to analyze gene expression in arbuscular mycorrhizal symbiosis. Pest Management Science: Formerly Pesticide Science. 65 (5), 504-511 (2009).
- Roux, B., et al. An integrated analysis of plant and bacterial gene expression in symbiotic root nodules using laser-capture microdissection coupled to RNA sequencing. The Plant Journal. 77 (6), 817-837 (2014).
- Tang, W., Coughlan, S., Crane, E., Beatty, M., Duvick, J. The application of laser microdissection to in planta gene expression profiling of the maize anthracnose stalk rot fungus Colletotrichum graminicola. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (11), 1240-1250 (2006).
