Summary
מוצג כאן פרוטוקול עבור microdissection לכידת לייזר (LCM) של רקמות צמח. LCM היא טכניקה מיקרוסקופית לבידוד אזורים של רקמות באופן ללא זיהום. ההליך כולל קיבעון רקמות, הטמת פרפין, מקטע, LCM וחילוץ RNA. RNA משמש במורד הזרם ספציפי רקמה, ניתוח נפתר זמנית של transcriptomes.
Abstract
הפיתוח של אורגניזם רב-תאי מורכב נשלט על ידי סוגי תאים שונים בעלי פרופילים תמלול שונים. כדי לזהות רשתות רגולטוריות שעתוק השולטות בתהליכים התפתחותיים, יש צורך למדוד את פרופילי ביטוי הגנים המרחביים והזמניים של סוגי תאים בודדים אלה. לכן, תובנה על השליטה spatio-זמני של ביטוי גנים היא חיונית כדי לקבל הבנה של איך תהליכים ביולוגיים והתפתחותיים מוסדרים. כאן, אנו מתארים שיטת microdissection לכידת לייזר (LCM) כדי לבודד מספר קטן של תאים משלושה איברי עובר שאורה על פני קורס זמן במהלך נביטה ואחריו פרופיל תעתיק. השיטה מורכבת קיבעון רקמות, עיבוד רקמות, הטבעת פרפין, מקטע, LCM וחילוץ RNA ואחריו PCR בזמן אמת או RNA-seq. שיטה זו אפשרה לנו להשיג פרופילים מרחביים וזמניים של תמלול איברים זרעים ממספרים שונים של תאים (עשרות עד מאות), מתן ספציפיות רקמות הרבה יותר גדול מאשר ניתוחים טיפוסיים של רקמות בתפזורת. מנתונים אלה הצלחנו להגדיר ולהשוות רשתות רגולטוריות שעתוק, כמו גם לחזות גורמי שעתוק רגולטורי מועמד עבור רקמות בודדות. השיטה צריכה להיות ישימה לרקמות צמח אחרות עם אופטימיזציה מינימלית.
Introduction
פיתוח צמחים וצמיחה כרוכים בפעולה מתואמת של רשתות רגולטוריות שעתוק בתוך תאים שונים הקיימים בסביבה סלולרית מורכבת. כדי להבין את הפעילות של רשתות רגולטוריות אלה, אנו דורשים את הידע של ביטוי גנים מרחבי וזמן בתוך סוגי תאים שונים על פני שלבים התפתחותיים. עם זאת, ניתוחים של ביטוי גנים מתבצעים בדרך כלל באיברים שלמים או דגימות רקמות בתפזורת בשל האתגר הטכני של בידוד וניתוח של מספר קטן של תאים. השיטה שאנו מתארים כאן אפשרה להשיג ניתוח תמלול ספציפי לרקמות מרחביות וזקופיות על ידי צימוד LCM עם RNA-seq.
LCM פותחה לפני שני עשורים על ידי אמרט-באק ועמיתיו1. הטכניקה אפשרה לחוקרים לבודד במדויק תאים בודדים או אשכולות של תאים מהסביבה שלהם באמצעות הדמיה מיקרוסקופית ישירה ומניפולציה עם לייזר קרןצרה 1. מאז השיטה שימשה באופן נרחב בביולוגיה סרטן ופתולוגיה2,3. קבוצות מחקר צמחים רבות גם התאימו LCM לשימוש עם מיניצמחים שונים וסוגי רקמות שונים 4,,5,,6,,7,,8,,9,,10,,11. לאחרונה, מספר ניירות השתמשו גם LCM על זרעי אפדו ומונוקוט כדי ללמוד עובר, אנדוספרמים ומבנים זרעים אחרים במהלך פיתוחזרע ונביטה 10,12,13. רוב שיטות הבידוד האחרות הנפוצות של תאים בודדים כגון מיקרו-צנרת, מיון תאים, הפרדה מגנטית ופלטפורמות מיקרו-נוזלים תלויות בעיכול אנזימטי או הומוגניזציה מכנית כדי לנתק תאים. זה עלול לפוג ביטוי גנים, הצגת חפצים טכניים כי פרשנות נתוניםמבלבלים 14,15. שיטות אלה דורשות גם ידע קודם של גנים סמן עבור כל סוג תא לקשר את התאים התנתקו למיקום המרחבי שלהם וסוג תא אמיתי. קבוצה נוספת של טכניקות תלויה בבידוד מבוסס זיקה של מבנים תת תאיים במקום תאים שלמים, למשל INTACT (בידוד של Nuclei מתויג בסוגי תאים) ו TRAP (תרגום טיהור זיקה ריבוזום)16,17. עם זאת, תיוג זיקה וטיהור של גרעין או ריבוזומים הם מאתגרים מבחינה טכנית במין צמחים שאין להם פרוטוקולי טרנספורמציה מבוססים היטב. LCM מנצל קיבעון רקמות מהיר כדי לשמר את רמות התמליל וזיהוי היסטולוגי קונבנציונלי על ידי הדמיה ישירה של תאים בתוך הקשר הרקמה / איבר הרגיל שלהם, המאפשר תאים דיסקרטיים להיות מבודדבפרק זמן קצר של 18,19.
הפרוטוקול המוצג כאן הוא שיטה ממוטבת לבידוד של תאים ספציפיים או סוגי תאים מקטעי הרקמה של זרעי דגנים, אשר ניתן להחיל על רוב התאים שניתן לזהות היסטולוגית. LCM מספק שיטה ללא מגע של בידוד תאים, צמצום משמעותי של זיהום והגדלת שלמות של RNA התאושש. יתר על כן, השיטה ממחישה את העוצמה של LCM על מחקרים רחבים גנום בקנה מידה גדול החל בכמויות קטנות של חומרים ביולוגיים. אנו גם מתארים את ההגדלה ליניארית של RNA ליצירת חומר קלט מספיק עבור ניתוחי תעתיק/תעתיק במורד הזרם.
ישנם עשרה שלבים עיקריים בפרוטוקול LCM RNA-seq זה עבור תעתיקים מרחביים ורקתיים ספציפיים לרקמות, כולל קיבעון של דגימות רקמה, התייבשות, חדירת פרפין, הטבעה, מקטע, LCM, חילוץ RNA, התעצמות RNA, כימות RNA ו- qRT-PCR ו/או RNA-seq(איור 1).
איור 1: תרשים זרימה של LCM ואחריו RNA-seq או qRT-PCR. LCM היא טכניקה מרחבית מדויקת ונחינם במגע כדי לאסוף תאים מקטעי רקמה קבועה באמצעות קרן לייזר תחת הדמיה מיקרוסקופית. התהליך מתחיל עם קיבעון של דגימות רקמה, ואחריו התייבשות באמצעות סדרה הדרגתית של אתנול ותו לא, וסיים עם הסתננות פרפין. התהליך יכול להיות אוטומטי לחלוטין באמצעות מעבד רקמות. ברגע שהרקמות מסתננות עם פרפין, היא מוטבעת בתבנית עם פרפין מותך באמצעות תחנת הטבעה. המקטע מתבצע באמצעות מיקרוטומי מוגדר לעובי הרצוי. שקופיות מוכנות LCM שנערך מיד לפני RNA הוא להיות מופק מתאי שנתפסו. חילוץ RNA מלווה ישירות על ידי שני סיבובים של הגברת RNA לפני qRT-PCR ו /או RNA-seq. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כמו המוצר הסופי הוא RNA, לדאוג להימנע מזהם את העבודה עם RNases. לבישת כפפות היא חובה. השתמש diethyl pyrocarbonate (DEPC) -מטופלים מים, מאגרים, וכו '. אוטוקלב מאגרים ואופים כלי זכוכית לפני השימוש.
1. קיבעון רקמות
- להכין קיבעון של בחירה בהתאם לסוגי מינים ורקמות; עבור זרעי שורה, להשתמש קיבעון של חקלאי (75% אתנול, 25% חומצה אצטי קרחונית (v /v)).
- מצננים את התיקון על קרח לפני קצירת רקמות.
- לאסוף את החומר הצמח של עניין ובמידת הצורך, לנתח אותו לתוך חתיכות בגודל המתאים כדי להתאים לתבנית הטבעה שנבחרה. עבור זרעי שורה, לחתוך את הזרע לחצי אורכי כדי לעזור חדירה של הפתרון המקבע ולהתאים לתוך תבנית ההטמיה.
- לשקוע הרקמה לנפח של לפחות 10x של קיבעון קר כקרח. עבור זרעי שורה, לשקוע הזרע לחתוך לחצי לתוך קיבעון.
- השתמש בחדירה ואקום כדי להאיץ את החדירה של קיבעון. הרקמות אמורות לשקוע לאחר חדירת הוואקום של המקבע. לזרעי שורה, השתמשו ב-30 דקות של חדירת ואקום.
- החלף את קיבעון הדגירה ב 4 ° C כדי לאפשר את קיבעון לחדור באופן מלא את הרקמה. עבור זרעי שורה, דגירה את הדגימות בן לילה (~ 12-16 שעות).
הערה: רקמות דקות או קטנות ידרשו זמן קיבעון קצר יותר בשל קצב דיפוזיה גבוה יותר של קיבעון לתוך הרקמה. - הסר את הרקמה ממתקן ולהעביר את הרקמה לתוך קלטות ולאחר מכן להתחיל בעיבוד רקמות.
הערה: רקמה קטנה או שברירית, כגון רקמת עלה, ניתן לשים לתוך קלטות לתיקון כדי להבטיח שהוא לא פגום במהלך קיבעון. שקיות ביופסיה, רפידות או עטיפות יכול לשמש כדי להחזיק את הרקמה באופן מאובטח בתוך הקסטות במהלך קיבעון רקמות וצעדי עיבוד רקמות.
2. עיבוד רקמות
- השתמש במעבד רקמות אוטומטי בשלב 2 עם מינימום של 10 תאי פתרון ושני תאי פרפין מחוממים (ראה טבלת חומרים).
- ודא כי יש כמויות מספיקות של פתרון בכל תא; להחליף פתרונות לאחר כל כמה שימושים של מעבד הרקמות.
- מניחים קלטות עם רקמות לסל המתכת. חבר את סל המתכת למחזיק מעל תא 1. המחזיק יסתובב ו"יטביע ויטבול" את הקסטות לתוך התאים, תוך כדי התוכנית המיועדת.
- הגדר את התוכנית על-ידי ביצוע לחיצות לחצן על לוחות הבקרה של מעבד הרקמות הכוללות הגדרת משך זמן עבור כל תא.
- לחץעללחצן "התחל" כדי להפעיל את תוכנית העיבוד. התוכנית הבאה מיועדת לזרעי שעורה ופועלת במהלך הלילה (כ-18 ש')
- לבצע התייבשות על ידי טבילה את הקלטת במשך 1 שעות 30 דקות כל אחד בסדרה הדרגתית של אתנול (75%, 85%, 100%, 100%, ו 100% (v/v) אתנול).
- לבצע סליקה באמצעות אתנול: הדרגתי xylene עבור 1 שעות 30 דקות כל אחד ב 75:25, 50:50, 25:75 (אתנול: xylene %, v / v). לאחר מכן לטבול את הקלטת במשך 1 h 30 דקות כל 100% xylene ואז 100% קסילן.
- לבצע הסתננות פרפין ב 55-60 °C עבור 1 שעות 30 דקות פעמיים בפרפין מותך.
הערה: ניתן להגדיר את הטמפרטורה של תאי דוד פרפין בחלק האחורי של מעבד הרקמות.
- למחרת בבוקר, להסיר את הקסטות ממעבד הרקמות ולהמשיך להטמיע פרפין.
הערה: זמן התוכנית עשוי להשתנות בין סוג רקמות שונה. ואקום ו/או תסיסה יכולים לשמש במהלך עיבוד רקמות כדי להאיץ את החדירה של פתרונות נבחרים על ידי לחיצה על כפתורי "V"ו/ או " תסיסה " בלוח הבקרה של מעבד הרקמות.
3. הטמיע פרפין
- השתמש במכונת הטבעה בשלב זה (ראה טבלת חומרים).
- הגדר מראש את מכונת ההטלה כדי להפעיל לפחות כמה שעות לפני ההטלה כדי לאפשר זמן לפרפין במאגרים להמיס לחלוטין.
- הפעל את הצלחת הקרה לפני תחילת.
- הטבע דגימות בתבניות על ידי החזקת הדגימות במיקום באמצעות מרטים עדינים וחלוקת פרפין מותך לתוך התבנית. הבטח כיוון נכון של דגימות לכל מטרה ניסיונית. עבור זרעי שזירה, לכוון את הזרע אורכי לכיוון חיתוך כדי להשיג קטעים אורכיים.
הערה: תבניות הטבעה מגיעות בגדלים שונים. בחר גודל מתאים כדי לאפשר למקם ולהטביע את הדגימה כראוי. יש לשקול את כיוון הדגימות בהתאם לצרכים הניסיוניים. אם נדרשים מקטעים אורכיים, המדגם צריך להיות מונחה אורכי לכיוון החיתוך ואילו עבור מקטעים רוחביים המדגם צריך להיות מונחה במקביל לכיוון חיתוך. - מניחים קלטת נקייה על התבנית ומוודאים שמספיק פרפין מכסים את כל הקלטת כדי להחזיק את הדגימה על הקלטת.
- מניחים את התבנית על הצלחת הקרה ומאפשרים לפרפין להגדיר באופן מלא (10-20 דקות) לפני שחרור הבלוק מהתבנית.
- המשך למקטע או העבר את הבלוקים ל- 4 °C לאחסון.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. ניתן לאחסן את הבלוקים המוטבעים ב- 4 °C למשך עד שלושה חודשים.
4. הכנת פוליאתילן נפטלט (PEN) שקופיות קרום
- תחליף שקופיות ממברנה PEN בפתרון ביטול הפעלה של RNase עבור 3 שניות ואחריו שתי שטיפה קצרה במים שטופלו ב- DEPC כדי להסיר RNases על השקופיות. ייבאי את השקופיות באינקובטור של 37°C כדי להסיר את השאריות מהפתרון.
- UV-לטפל השקופיות באמצעות מנורת UV בארונות זרימה למינאר במשך 30 דקות כדי לשפר את המאפיינים הידרופיליים עבור הידבקות פרפין משופרת.
5. מקטע
- השתמש במיקרוטומי בשלב המקטע (ראה טבלת חומרים).
- מניחים להב חדש לתוך מחזיק הסכין, ותמיד לשמור על מגן הסכין כאשר לא באופן פעיל למקטע
התראה: להבי Microtome הם חדים מאוד יכולים לגרום נזק משמעותי כאשר מטופלים באופן בלתי הולם.
הערה: ישנם שני מנגנוני נעילה על microtome, אחד הוא בצד של המכונה והשני הוא על הידית של הגלגל. שניהם יהיו מעורבים כאשר לא מקטע פעיל. - התאם את בלוק הסכין כך שיהיה קרוב ככל האפשר לדגימה מבלי לגעת. ודא כי זרוע microtome לעולם לא מגיע במגע מלא עם בלוק הסכין כמו זה יגרום נזק מבני קטסטרופלי microtome.
- הפעל את הצלחת הקרה לפני תחילת. שמרו על קוביות פרפין על הצלחת הקרה לפני המקטע וקררו מחדש בלוקים בעת הצורך במהלך המקטע כדי למנוע את ריכוך הבלוקים.
- מלאו את אמבט המים במים שטופלו ב-DEPC וחום ל-42°C לפני תחילת הדרך.
- חותכים בלוקים לעומק הרצוי (שבו המקטע שבו אתה מתעניין) ובלוקי פרפין סעיף בעובי הרצוי (6-10 μm) באמצעות microtome; בלוק במקטע היטב יגבש 'רצועת כלים' בקצה הלהב. עבור זרעי שעורה, סעיף עם 8 μm עובי.
- העבר בעדינות סרטים מהמיקרוטומיה לאמבט המים באמצעות מברשת צבע עדינה או מכחול עדין, כדי להבטיח שהסרט שטוח על פני המים.
- החזק מגלשה בזווית של 45°, באמצעות תנועה כלפי מעלה, הרם סרט מהמים אל המגלשה והסר בזהירות מים עודפים עם רקמה ללא מוך.
- מגלשות יבשות במשך 30 דקות ב-37°C כדי לחסל את כל המים הנותרים מתחת לפרפין.
- המשך להסרת פרפין או לאחסן ב 4 °C בתיבה סגורה תחת תנאי התייבשות (לשימוש בתוך מספר ימים).
- הסר פרפין על ידי שטיפת השקופיות 3x עבור 20 s כל קסילן, ואחריו 2 x שטיפה של 30 s ב 100% (v /v) אתנול ו 2 שטיפה של 30 s ב 70% (v / v) אתנול.
- המשך מיד למיקרו-דיזה של לכידת לייזר לאחר הסרת הפרפין.
הערה: Cryosectioning היא שיטה חלופית שצוברה בהצלחה עם LCM. הכנה לדוגמה עבור cryosectioning יהיה שונה.
6. מיקרו-דיזה של לכידת לייזר
- השתמש במיקרוסקופ מיקרו-דיזה בלייזר (ראה טבלת חומרים)כדי למיין תאים ממקטעי רקמות דה-פרפין ומיובשים.
- טען שקופיות על שלושת החריצים הזמינים.
- השתמש בכובעי דבק מיוחדים של צינורות איסוף כדי לאסוף את הדגימות שנתפסו. לכידה ללא נוזל (אוסף "יבש") ממזערת את פעילות RNase. טען את צינורות האיסוף לתוך החריצים הזמינים.
- הזז את השלב כדי לאתר את אזור המדגם שיש לחתוך. ניתן לעשות זאת באמצעות העכבר או ג'ויסטיק של מכונת LCM, או במקשי החצים בלוח המקשים.
- כדי לייעל את מהירות החיתוך, חיתוך אנרגיה ומיקוד, לחץ לייזר מזרז (LPC) אנרגיה ומיקוד, לחתוך תחילה על קטע ריק ללא רקמות על שקופית קרום. עבור זרעי שזירה, מהירות חיתוך = 18, CutEnergy = 52 CutFocus = 63, LPCEnergy = 78, LPC המוקד = 61 בהגדלה 10x.
הערה: חיתוך מיקוד ואנרגיה יש להתאים עבור שקופיות שונות, רקמות שונות, ותחום שנתפסו אבל כללים כלליים הם כוח ההזליקה הוא גבוה יותר מאשר כוח החיתוך ואת הלייזר יש defocused עבור בליסטראות. גבוה יותר את ההגדלה של העדשה האובייקטיבית, קטן יותר המוקד של הלייזר והאנרגיה גבוהה יותר. - השתמש בכלי הציור כדי לבחור תאים על-ידי חלוקה לרמות של אזור העניין.
- בחר RoboLPC פונקציה מסרגל הכלים פונקציה כדי להזניק תאים לתוך כמוסות דבק בהתבסס על הפרמטרים הממוטבים שהתקבלו על ידי חיתוך על מקטע שחור לעיל.
הערה: פרמטרי LCM משתנים בין סוגי רקמות, כמו גם עובי של סעיף, קשיחות רקמות ועדשות אובייקטיביות. לכן, עדיף לייעל כל שקופית על אזור קרום רגיל ללא דגימה רקמה לפני חיתוך המדגם בפועל. - השתמש בכלים סמן בדגל כדי לסמן אזורים בעלי עניין כדי לאתר אותם באופן מיידי על-ידי בחירת דגל זה מהרשימה רכיבים.
- בדוק על ידי "CapCheck" כפתור כדי לבדוק את מכסה הדבק כדי לאשר דגימות נתפסו. בדרך כלל, נדרש LCM של 10-15 מקטעים (כ- 200 תאים) לכל מכסה עבור חילוץ RNA.
- שמור את הדגימות שנתפסו על קרח. המשך מיד לחילוץ רנ"א כדי למנוע השפלה של רנ"א.
הערה: מיקרוסקופ LCM מסוימים מצוידים באור פלורסנט המאפשר לכידת תאים המסומנים סמני פלורסנט.
7. חילוץ רנ"א
- השתמש בערכת בידוד RNA בקלט נמוך (ראה טבלת חומרים) לחילוץ RNA לאחר LCM. ערכות כאלה נועדו לשחזר RNA הכולל באיכות גבוהה באופן עקבי מפחות מעשרה תאים.
- בודד את ה- RNA הכולל מסוגי התאים שנלכדו בהתאם להוראות היצרן, כולל הטיפול בעמודה DNase.
הערה: השלב הראשון של החילוץ RNA שבו הצינור הוא הפוך והועק הוא קריטי כדי להבטיח את הדגימות שנתפסו על המכסה נמצאים במגע עם מאגר החילוץ שנוסף.
8. 55
- השתמש ערכת נגד RNA (aRNA) amp; (ראה טבלת חומרים) להגדלת RNA מן RNA שחולץ על ידי שעתוק מבחנה כדי לייצר ARNA מספיק עבור סינתזה ספריית RNA-seq.
- בצע שני סבבי הגברה באמצעות ערכת הגברה aRNA בהתאם להוראות היצרן.
הערה: חשוב לחמם מראש את התרמו-מחזור ואת המכסה לטמפרטורה שהורה לערכה (ראה טבלת חומרים)של יצרן. גישה חלופית במקום ההגדלה RNA היא להשתמש ערכת הכנה ספריית קלט נמוך כדי לסנתז את הספריה ישירות מתוך RNA שחולץ.
9. כימות RNA
- לכמת ולהכשיר aRNA באמצעות מערכת אלקטרופורזה אוטומטית (ראה טבלת חומרים).
הערה: מערכת אלקטרופורזה אוטומטית עדיפה כפי שהיא דורשת פחות מדגם (1-2 μL) ומספקת תמונה כמו ג'ל ואלקטרופרוגרמה עבור כל מדגם בודד.
10. qRT-PCR ו/או RNA-seq
- סינתזה של cDNA מה- ARNA עבור qRT-PCR או כדי ליצור ספריות RNA-seq באמצעות ערכות ספריית RNA-seq סטנדרטיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
יצרנו תעתיקים מרחביים וזמניים ספציפיים לרקמות מזרעי שורה במהלך נביטה באמצעות פרוטוקול RNA-seq LCMשלנו 10. המחקר בוצע על ידי החלת LCM RNA-seq על מספר קטן של תאים משלושה איברי עובר (plumule, קצה רדיק, scutellum) כל 8 שעות על 48 שעות כמובן זמן במהלך נביטה (0-48 שעות, 7 נקודות זמן) (איור 2A, B).
איור 2: תאים שנאספו מזרעי שורה לפי LCM. (א)חתך רוחב אורכי של זרעי שורה, ו, התחלה, קריקטורה מוגדלת המציינת את האזורים מהם נתפסו תאים. כחול = plumule, מג'טנטה = רדיק, ירוק = scutellum. (ב)LCM של פלומה, רדיק, ו scutellum. לוח עליון, רקמה לפני לייזר לחץ בליסטרה (LPC). לוח תחתון, רקמה אחרי LPC. תאים נלכדו מ-5 קטעים אורכיים רצופים של כל מדגם עם שלושה העתקים ביולוגיים לכל דגימה. כל שכפל כלל כ- 200 תאים (כ- 0.05 - 0.15 מ"מ2 שטח כולל). בר = 100 μm. E = אנדוספרם, C = שכבת תא מרוסקת, SE = אפיתל scutellar, S = scutellum. איור שוחזר מנתונים קודמים ביומן הצמח עםהרשאה 10. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
קיבעון והטלה הם צעדים קריטיים כמו מדגם רקמה קבוע גרוע יכול לגרום נזק לרקמות ואובדן של כמות RNA ואיכות. יש לייעל ולהסתגל למינים וסוגירקמות שונים 19,20,21. כאן השתמשנו בחדירה ואקום כדי לשפר את החדירה של fixatives לתוך רקמות הזרעים והתאים. התייבשות וחדירה פרפין מתבצעים בהדרגה כדי למנוע נזק לדגימות הרקמה. האצנו את כל תהליך ההתייבשות והחדירה לפרפין באמצעות מעבד רקמות אוטומטי עם תסיסה ואקום המיושם בכל שלב. זה מפחית מאוד את הסיכון של השפלה RNA המתרחשת במהלך צעדי עיבוד רקמות ממושכים שנערכו על ידי פעיל אנושי. לפני הניתוח, חשוב לטפל בשקופית הממברנה כדי להבטיח הידבקות פרפין ולוודא שהיא תהיה ללא RNase. אם שקופיות הממברנה אינן מוכנות כראוי, המקטע לדוגמה לא ידבוק בממברנה, אשר תשפיע על שלב ההזליקה של LCM ותקטין את העברת הרקמות לפקקי הדבקה מכיוון שהדגימה תיפרד מהממברנה (ראה איור 1).
שלב קריטי נוסף בפרוטוקול RNA-seq של LCM הוא מיטוב פרמטר LCM. ישנם חמישה פרמטרים עיקריים שיש למטב: (1) מהירות חיתוך; (2) חיתוך אנרגיה; (3) חיתוך המוקד; (4) אנרגיית LPC; ו-(5) מיקוד LPC. חשוב להתאים את הפרמטרים חיתוך כראוי על מנת לחתוך את האזור הנבחר בדיוק ולהתנתק מן הרקמה שמסביב מבלי לשרוף את קצה האזור הנבחר (איור 3A,B). האנרגיה הנכונה LPC ומיקוד חיוניים כדי להזניק באופן אמין את האזור הנבחר מהשקופית לכובעי דבק מיוחדים של צינורות איסוף, ותמיד לבדוק דגימות שנתפסו בכובעים כדי להבטיח מספיק חומרנאסף (איור 3C). היעילות של LCM מאפשרת 1000 תאים להילכד בתוך שעה אחת, אשר מפחית מאוד את הסבירות של השפלה RNA במהלך עיבוד מדגם. השימוש בצינורות איסוף עם כובעי דבק מאפשר איסוף "יבש" ללא כל נוזל לכידה, ומפחית מאוד את פעילות RNases אפשרית. חשוב לשמור את הדגימות שנלכדו על קרח ויעשה את החילוץ RNA מיד לאחר איסוף כל השכפולים.
חילוץ RNA והגדלה מתבצעים באמצעות ערכות מסחריות זמינות על ידי ביצוע הוראות היצרנים. כימות של RNA הכולל לפני RNA amplification באמצעות מערכת אלקטרופורזה אוטומטית יזהה רצועות אלקטרופורטיות נפרדות ופסגות פלורסנט של 18S ו 28S ריבוזומל יחידות בדגימות RNA באיכות טובה(איור 3D). פסגות נוספות המתאימות לכלורופלסט וRNA ריבוזומל מיטוכונדריאלי יימצאו לפני פסגות 18S ו-28S. בשל פסגות RNA מרובות במין צמחי, ערכי RIN (מספר תקינות RNA) הם בדרך כלל נמוכים מ- 9 (ערך RIN הצפוי מרקמות היונקים) והם אינם משקפים במדויק את שלמות RNA22. ראוי להמשיך להגברת RNA כאשר פסגות ברורות של 18S ו- 28S נראות ללא סימן של השפלה RNA. כמות RNA התאושש בניסוי זרעי השכורה שלנו מגוונת בין שלושה סוגי רקמות שונים (plumule, רדיק ו scutellum) וגם, בין שלבים מוקדמים מאוחרים של נביטה, למרות כמספר שווה של תאים שנקטפו. הכמויות מזרעי שורה נעו בין 100 pg ל 20 ng ng מ כ 200 תאים (0.5 כדי 100 pg לכל תא). הכמות המינימלית של קלט RNA מומלץ עבור RNA היה 100 pg. כמות RNA שחולצו תלויה ביעילות החילוץ מתאי קציר שונים ושפע תמלול מוחלט בסוג תא מסוים בשלב זה שלפיתוח 19,21. זה שימושי לשקול את זה בעת תכנון ניסוי RNA-seq LCM, למרות מידע מוקדם כזה לא יהיה זמין בכל המקרים.
ARNA מסונתז בהצלחה יציג חד מודאלי, התפלגות גודל סימטרי מ 100 כדי 1000 נוקלאוטידים עם שיא סביב 300 נוקלאוטידים לאחר שני סיבובים של הגברה (איור 3E). בניסוי זרעי שוורה שלנו, השגנו 500 pg כדי 2 μg של aRNA לאחר שני סיבובים של הגברת RNA10. השוואה בין RNA מוגבר ולא מוגבר הוכיחה כי RNA amp;amp; התרברב, ליניארי ואינו מציג הטיהשיטתית לתמלול נתונים 23,24,25. ARNA פלט יכול לשמש qRT-PCR ו / או RNA-seq לניתוח ביטוי ביטוי גנים מרחבית וזמנית ספציפית לרקמה. אימות לאחר RNA-seq חייב לערך כדי לאשש את התוצאות מניתוח של aRNA. ניתן לעשות זאת על-ידי בדיקת ביטוי של גנים סמן סוג תא מנתוני RNA-seq באמצעות RNA בהכלאה situ.
איור 3: תוצאה מייצגת של LCM. (א)רקמה לאחר חיתוך עם אנרגיה חיתוך נכונה ומיקוד. ניתן לראות קו דק ברור היכן נעשה החתך. האזור הנבחר יונתק מהמומלים שמסביב. בר = 100 μm. (ב)רקמה לאחר חיתוך עם אנרגיה חיתוך שגוי ומיקוד. האזור הנבחר עדיין מחובר לחומרים שמסביב. בר = 100 μm. (ג)בדיקת תאים שנתפסו בכובעי דבק מיוחדים של צינורות איסוף. Bar = 100 μm. (D) דוגמה של פרופיל RNA הכולל לפני RNA amplification (שמאל, דמוי ג'ל תמונה; ימין, electropherogram) עם להקות אלקטרופורטיות נפרדות ופסגות פלורסנט של 18S ו 28S ריבוזומל יחידות משנה. פסגות ללא תיווית מתאימות ל-RNA ריבוזומל נוסף, כולל ריבוזומים כלורופלסט ומיטוכונדריאליים. (ה)דוגמה לפרופיל ARNA טיפוסי לאחר ההגדלה של RNA (תמונה שמאלית, כמו ג'ל; ימין, אלקטרופרוגרמה). התגלתה התפלגות של גדלים מ-100 ל-1000 נוקלאוטידים, עם שיא של כ-300 נוקלאוטידים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
ניתוחי RNA-seq בוצעו על כל הדגימות בטריקאטים ביולוגיים. עלילת קנה מידה רב-מימדי (MDS) של גנים המבוטאים ברקמות השונות מעל 48 שעות של נביטה ממחישה דמיון גדול יותר בין דגימות של רקמה אחת מאשר בין דגימות מאותה נקודת זמן אךרקמות שונות (איור 4א). לאחר מכן יצאנו לקבוע באיזו דרך נרחבת ביטוי גנים היה מוסדר באופן דיפרנציאלי ברקמות בודדות לאורך זמן במהלך הנביטה. מספר הגנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי (DEGs) גדל בהדרגה במהלך הנביטה בכל רקמה, יחסית לנקודת הזמן של 0 h של רקמה זו(איור 4B). 25 אחוזים (910) של plumule, 34% (1876) של רדיק ו 41% (2562) של DEGs scutellum נמצאו באופן בלעדי דיפרנציאלי ברקמה זו (כלומר, גנים אלה לא באים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי ברקמות האחרות, איור 4C). יחד, תוצאות אלה מדגימות כיצד LCM RNA-seq יכול לשמש כדי להבין ביטוי גנים זמניים ומרחביים במהלך פיתוח הצמח.
איור 4: ניתוח של ספריות RNA של דגימות LCM המציגות הפרדה ברורה של רקמות שונות מעל 48 שעות של נביטת שורה. (א)עלילת קנה מידה רב-מימדי (MDS) של גנים המתבטאים ברקמות השונות מעל 48 שעות של נביטה. כל נקודה מייצגת דוגמה אחת, והמרחק בין 2 נקודות משקף את שינוי קיפול יומן הרישום (FC) המוביל של דגימות ה- RNA המתאימות. ציר x, y ו- z מייצגים logFC של יומן רישום של המימד הראשון, השני והשלישי. P = plumule, R = רדיק, S = scutellum, 0-48h = h של נביטה, R1-3 = לשכפל 1-3. (ב)מספר משמעותי עד מוסדר (אדום) ו כלפי מטה מוסדר (כחול) מבוטא דיפרנציאלית גנים (DEGs) עבור שש נקודות זמן לעומת נקודת זמן 0 h עבור שלושה סוגי רקמות. (ג)דיאגרמת Venn המציגה את מספר דגי ה- DEGs בשלושה סוגי רקמות. גנים בקבוצות חופפות מציגים את הביטוי ההפרנציאלי בשניים או שלושה סוגי רקמות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקרים רבים ביטוי גנים ספציפיים לרקמות הוגבלו על ידי ניתוח יד של דגימות, אשר גוזל זמן, עבודה אינטנסיבית, יש סיכון גבוה של זיהום והוא יכול רק לנצל דגימות כי פעיל אנושי הוא מספיק מיומן לקצור. LCM היא טכניקה מדויקת ונלויה במגע לאיסוף תאים מקטעי רקמות קבועות באמצעות קרן לייזר המופעלת מכנית תחת הדמיה מיקרוסקופית.
הכנת מדגם טובה היא קריטית עבור LCM. התהליך מסתמך על תיקון והטלה נאותים של דגימות כדי לשמור על איזון טוב בין מורפולוגיה רקמות ושלמות של RNA. הפרוטוקול המוצג כאן מספק צעדים ממוטבים לתיקון והטמיעה של זרעי שורה הכוללים זמן וחדירה לאקום ארוך יותר של חומרים מקבעים. ניתוח של רקמות או מינים שונים ידרוש אופטימיזציה של התנאים, כמו אלה בדרך כלל שונים בין רקמות. היבט חשוב נוסף של פרוטוקול זה הוא שלב ההגדלה RNA אשר מבטיח כמויות מספיקות של RNA נוצרים עבור בניית ספריית RNA-seq. אנו מוצאים כי ההגדלה RNA גורמת ספריות באיכות גבוהה, אבל לחלופין שיטות הכנה ספריית קלט נמוכה עשוי להיות מועסק25. זיהוי היסטולוגי של תאי יעד הוא צעד קריטי בשיטה שלנו עשוי לספק אתגרים עבור סוגי תאים נדירים או מאופיינים בצורה גרועה. זיהוי תאי היעד ניתן לשפר באמצעות כתמים היסטולוגיים מסורתיים או כתמי immunofluorescence כחלק מהצעד קדם-עיזור או, לחלופין, באמצעות קווים טרנסגניים המבטאים סמנים ספציפיים לתא פלואורסצנטי26,27.
טכניקת LCM פותחה לראשונה לשימוש בדגימות הנגזרות על-ידי בעלי חיים לניתוח תמלול ספציפי לתא1. עם זאת, מגוון רחב של ניתוחים גנומיים, פרוטאומיים, ואפיגנטיים פותחו לאחר מכן. התאמת שיטות אלה ליישום במחקרים ביולוגיים צמח הוא אתגר מתמשך18,19,20,28. Schad et al. הוכיח כי חלבונים ומטבוליטים מחבילות כלי דם Arabidopsis ניתן לנתח באמצעות LCM עם אלקטרופורזה ג'ל דו-מיו וספקטרומטריהמסה 29,,30. לאחרונה, Latrasse ואח ' ביצעו כרומטין immunoprecipitation (ChIP)-qPCR ניתוח על קרחנים LCM-לנתח קרפלס באמצעות LCM, קביעת הומוגניות רקמות משפר את הרזולוציה של אירועים אפיגנטיים ספציפיים לתא31. Turco ואח 'גם בשילוב LCM עם רצף בישולפיט לחקור אירועי מתילציה DNA במהלך כלי דם בsorghum, הדגשת ההבדל ספציפי רקמה בין רקמות כלידם ורקמות לא וסקולריות 32. מעניין, מספר מחקרים יישמו LCM לחקור צמח-חיידקים וצמח-פתוגןאינטראקציות 33,34,35. היכולת של LCM לדמיין וללכוד תאים בשלבי זיהום שונים סיפקה מידע על התגובות המרחביות והזמניות של תאים נגועים.
פרוטוקול LCM שלנו יחד עם RNA-seq המוצג כאן יקלו על פרופיל גלובלי spatio-זמני של ביטוי גנים של סוגי תאים שונים. עם שיטות טיהור משופרות עבור כרומטין וחלבונים יחד עם מכשירי ספקטרומטריה מסה משופרת, LCM יהיה כלי המתעוררים כדי להקל על מחקרים אפיגנומיים ופרוטונומיים ספציפיים לתא בצמחים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לסופרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מרכז מועצת המחקר האוסטרלית למצוינות בביולוגיה של אנרגיה צמחית (CE140100008) עד JW. M.G.L נתמך על ידי מענק מתחיל של אוניברסיטת לה טרוב. אנו מודים לפלטפורמת הגנומיקה La Trobe על תמיכתם בהנחיתות גבוהות וניתוח נתונים. אנו מודים לפרופסור מת'יו טאקר על ייעוץ מומחה להקמת LCM במעבדה שלנו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid 100 % ACS/R. | AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) | VWRC20104.323 | |
| AdhesiveCap 200 opaque | Zeiss | 415190-9181-000 | |
| Clear base moulds 8 X 10 | Leica | 3803015 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 40718-25ML | |
| High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | |
| Lowprofile disp.blades DB80LS | Leica | 14035843489 | |
| MembraneSlide 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9041-000 | |
| MessageAmp II aRNA Amplification Kit | Ambion (ThermoFisher) | AMB17515 | |
| On-Column DNase I Digestion Set | Sigma-Aldrich | DNASE70 | |
| Ovation RNA-Seq System V2 | NuGen (Integrated Science) | 7102-08 | |
| Paraffin (Surgipath Paraplast) | Leica | 39601006 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | ABI (ThermoFisher) | KIT0214 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Ambion (ThermoFisher) | AM9780 | |
| Xylene | AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) | VWRC28975.360 | |
| Leica Benchtop Tissue Processor | Leica Biosystems | TP1020 | |
| Leica Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems | EG1150H | |
| Leica Cold Plate | Leica Biosystems | EG1150C | |
| Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets | LAF Technologies Pty Ltd | Safemate 1.5 | |
| Leica Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | RM2265 | with PALMRobo v 4.6 software |
| Zeiss PALM MicroBeam LCM system | Zeiss miscroscopy | ||
| TapeStation | Agilent | TapeStation 2200 |
References
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Alevizos, I., et al. Oral cancer in vivo gene expression profiling assisted by laser capture microdissection and microarray analysis. Oncogene. 20 (43), 6196-6204 (2001).
- Cong, P., et al. In situ localization of follicular lymphoma: description and analysis by laser capture microdissection. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 99 (9), 3376-3382 (2002).
- Blokhina, O., et al. Laser capture microdissection protocol for xylem tissues of woody plants. Frontiers in Plant Science. 7, 1965 (2017).
- Casson, S., Spencer, M., Walker, K., Lindsey, K. Laser capture microdissection for the analysis of gene expression during embryogenesis of Arabidopsis. The Plant Journal. 42 (1), 111-123 (2005).
- Chen, Z., et al. LCM-seq reveals the crucial role of LsSOC1 in heat-promoted bolting of lettuce (Lactuca sativa L.). The Plant Journal. 95 (3), 516-528 (2018).
- Jiao, Y., et al. A transcriptome atlas of rice cell types uncovers cellular, functional and developmental hierarchies. Nature Genetics. 41 (2), 258-263 (2009).
- Kivivirta, K., et al. A protocol for laser microdissection (LMD) followed by transcriptome analysis of plant reproductive tissue in phylogenetically distant angiosperms. Plant Methods. 15 (1), 1-11 (2019).
- Li, P., et al. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nature Genetics. 42 (12), 1060-1067 (2010).
- Liew, L. C., et al. Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination. The Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).
- Matas, A. J., et al. Tissue-and cell-type specific transcriptome profiling of expanding tomato fruit provides insights into metabolic and regulatory specialization and cuticle formation. The Plant Cell. 23 (11), 3893-3910 (2011).
- Sakai, K., et al. Combining laser-assisted microdissection (LAM) and RNA-seq allows to perform a comprehensive transcriptomic analysis of epidermal cells of Arabidopsis embryo. Plant Methods. 14 (1), 10 (2018).
- Zhan, J., et al. RNA Sequencing of Laser-Capture Microdissected compartments of the maize kernel identifies regulatory modules associated with endosperm cell differentiation. The Plant Cell. 27 (3), 513-531 (2015).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
- Zeb, Q., Wang, C., Shafiq, S., Liu, L. Single-Cell Omics. , Elsevier. 101-135 (2019).
- Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nature Protocols. 6 (1), 56 (2011).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282 (2014).
- Bevilacqua, C., Ducos, B. Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level. Molecular Aspects of Medicine. 59, 5-27 (2018).
- Nelson, T., Tausta, S. L., Gandotra, N., Liu, T. Laser microdissection of plant tissue: what you see is what you get. Annual Reviews in Plant Biology. 57, 181-201 (2006).
- Day, R. C., Grossniklaus, U., Macknight, R. C. Be more specific! Laser-assisted microdissection of plant cells. Trends in Plant Science. 10 (8), 397-406 (2005).
- Takahashi, H., et al. A method for obtaining high quality RNA from paraffin sections of plant tissues by laser microdissection. Journal of Plant Research. 123 (6), 807-813 (2010).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (1), 3 (2006).
- Ferreira, E. N., et al. Linear mRNA amplification approach for RNAseq from limited amount of RNA. Gene. 564 (2), 220-227 (2015).
- Schneider, J., et al. Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments. BMC Genomics. 5 (1), 29 (2004).
- Shanker, S., et al. Evaluation of commercially available RNA amplification kits for RNA sequencing using very low input amounts of total RNA. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (1), 4 (2015).
- Bhattacherjee, V., et al. Laser capture microdissection of fluorescently labeled embryonic cranial neural crest cells. Genesis. 39 (1), 58-64 (2004).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Blokhina, O., et al. Parenchymal Cells Contribute to Lignification of Tracheids in Developing Xylem of Norway Spruce. Plant Physiology. 181 (4), 1552-1572 (2019).
- Schad, M., Lipton, M. S., Giavalisco, P., Smith, R. D., Kehr, J. Evaluation of two-dimensional electrophoresis and liquid chromatography-tandem mass spectrometry for tissue-specific protein profiling of laser-microdissected plant samples. Electrophoresis. 26 (14), 2729-2738 (2005).
- Schad, M., Mungur, R., Fiehn, O., Kehr, J. Metabolic profiling of laser microdissected vascular bundles of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 1 (1), 2 (2005).
- Latrasse, D., et al. The quest for epigenetic regulation underlying unisexual flower development in Cucumis melo. Epigenetics & Chromatin. 10 (1), 22 (2017).
- Turco, G. M., et al. DNA methylation and gene expression regulation associated with vascularization in Sorghum bicolor. The New Phytologist. 214 (3), 1213-1229 (2017).
- Gomez, S. K., Harrison, M. J. Laser microdissection and its application to analyze gene expression in arbuscular mycorrhizal symbiosis. Pest Management Science: Formerly Pesticide Science. 65 (5), 504-511 (2009).
- Roux, B., et al. An integrated analysis of plant and bacterial gene expression in symbiotic root nodules using laser-capture microdissection coupled to RNA sequencing. The Plant Journal. 77 (6), 817-837 (2014).
- Tang, W., Coughlan, S., Crane, E., Beatty, M., Duvick, J. The application of laser microdissection to in planta gene expression profiling of the maize anthracnose stalk rot fungus Colletotrichum graminicola. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (11), 1240-1250 (2006).
