Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ייצור אוטומטי של נוירונים קורטיים קורטיים ודופאמין נגזר תאי גזע המושרה על ידי תאי גזע אנושיים עם ניטור משולב של תאים חיים

Published: August 6, 2020 doi: 10.3791/61525
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 2, 1,3
1Genome Biology of Neurodegenerative Diseases, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 2Applied Genomics for Neurodegenerative Diseases, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 3Department for Neurodegenerative Diseases, Hertie Institute for Clinical Brain Research, University of Tübingen
* These authors contributed equally

Summary

אנו מראים את האוטומציה של תרבויות תאי גזע פלורופוטנטיים (hiPSC) הנגרמים על ידי בני אדם ובדיונים עצביים התואמים להדמיה וניתוח אוטומטיים.

Abstract

תרבות ידנית ופרוטוקולי בידול עבור תאי גזע פלורופוטנטיים המושרה על ידי בני אדם (hiPSC) קשים לסטנדרטיזציה, להראות שונות גבוהה ונוטים הבידול ספונטני לסוגי תאים לא רצויים. השיטות הן עתירות עבודה ולא ניתן יהיה להגיע בקלות לניסויים בקנה מידה גדול. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פיתחנו מערכת אוטומטית של תרבות תאים בשילוב מערכת הדמיה בתפוקה גבוהה ויישמנו פרוטוקולים לשמירה על קווי hiPSC מרובים בידול מקביל ונוירונאי. אנו מתארים את האוטומציה של פרוטוקול בידול לטווח קצר באמצעות Neurogenin-2 (NGN2) ביטוי יתר כדי לייצר נוירונים קליפתיים נגזר hiPSC בתוך 6\u20128 ימים, ואת היישום של פרוטוקול בידול לטווח ארוך כדי ליצור hiPSC נגזר midbrain דופאמין נוירונים בתוך 65 ימים. כמו כן, יישמנו את הגישה NGN2 לתאים מבשר עצביים נגזר מולקולה קטנה (smNPC) המושרה עם GFP lentivirus והקמנו תא חי אוטומטי neurite outgrowth assay. אנו מציגים מערכת אוטומטית עם פרוטוקולים המתאימים לתרבות hiPSC שגרתית ובידול לנוירונים קליפתיים ודופאמין. הפלטפורמה שלנו מתאימה לתרבות ללא ידיים לטווח ארוך ולתרכובת מבוססת hiPSC מבוססת תפוקה גבוהה/בעלת תפוקה גבוהה, הקרנות RNAi ו-CRISPR/Cas9 לזיהוי מנגנוני מחלות חדשניים ויעדי סמים.

Introduction

תאי גזע פלורופוטנטיים המושרה על ידי בני אדם (hiPSC) מתחדשים באופן עצמאי, יכולים להבדיל כמעט בכל סוג תא בוגר. מאפיינים אלה הופכים hiPSC כלי שימושי עבור מידול מחלות במחקר בסיסי וגילוי סמים1. IPSC האנושי שומר על הרקע הגנטי התורם המאפשר נגזרת סוגי תאים רלוונטיים למחלות המושפעים ביותר / מעורבים כמובן המחלה, למשל, תת סוגים עצביים שונים למחלות ניווניות2,3. כמו כן, hiPSC מתגבר על חלק מהמגבלות של בעלי חיים ותאי מודלים ביטוי יתר על ידי מודלים של מחלות בהקשר אנושי ורמות ביטוי חלבון פיזיולוגי, והוכיחו להיות נכס בעל ערך במחלות מידול החל הפרעות מונוגניות, מורכבות ואפיגנטיות, כמו גם מחלותבשלב מאוחר 4.

למרות יתרונות והזדמנויות אלה, מספר מגבלות של hiPSC עדיין צריך להיות מטופל. פרוטוקולי התרבות והבידול הנוכחיים של hiPSC אינם חסכוניים, קשים לסטנדרטיזציה ועתירי עבודה. שלבי תרבות ידניים יכולים לגרום לשונות גבוהה בתשואות ופנוטיפים בשל הבדלים בצמיחה ובדידול ספונטני של hiPSC. לכן, יש להפחית את הווריאציה התלויה בניסוי על-ידי יישום טכניקות טיפול מתוקנות יותר ופשט פרוטוקולים שניתן להשיג באמצעות אוטומציה5. הקמת פרוטוקולי תרבות ובידול אוטומטיים של hiPSC תגדיר סטנדרטים משותפים הן לפרויקטים אקדמיים והן לפרויקטים של מחקר תעשייתי, ותאפשר יצירת מודלים רלוונטיים ביולוגית של מחלות ותוצאות רבות יותר לשחזור.

עבודה קודמת ניסתה אוטומציה של תרבויות hiPSC 6,7,8, אבל הפרוטוקולים שלהם הוגבלו לתבניות ספציפיות של צלחת תרבות תא התלויה במערכת וחוסר יכולתהסתגלותלפורמטים שונים של תבניות ציון. מערכות כאלה שימושיות ב bulking של תאים, אבל לא יכול להיות מתאים בידול אוטומטי לסוגי תאים רצויים, phenotyping מחלה, ותוחלת ההקרנה. בנוסף, פלטפורמה אוטומטית בקנה מידה גדול עבור נגזרת פיברובלסט, דור hiPSCובידול תואר 9 אבל בקנה מידה שניתן להשיג רק על ידי מעבדות בתפוקה גבוהה המוקדש לייצור קווים אשר נראה אטרקטיבי אבל יכול להיות לא סביר עבור מעבדות אקדמיות רבות.

פיתחנו מערכת תרבות תא אוטומטית לחלוטין המבוססת על תחנת טיפול בנוזלים בסביבה מסוננת של חלקיקולט (HEPA) עם אינקובטור CO2 בעל קיבולת גדולה, ציטומטר הדמיה בשדה בהיר וזרוע רובוטית להובלת לוחות. רכיבים אלה מספקים את הבסיס לתרבות ובידול של hiPSC יציבים ותו לא. השלמנו את המערכת עם מערכת אחסון אוטומטית של -20°C לאחסון מורכב או וירוסים ותמונה במהירות גבוהה של תא חי בדיסק מסתובב. פרוטוקולים מותאמים אישית נוצרו המאפשרים זריעת תאים אוטומטית, שינויי מדיה, בדיקות קונפלואנציות, הרחבת תאים ויצירת לוחות תסה עם טיפול לדוגמה והדמיית לוח, מה שהופך את המערכת תואמת להקרנות בתפוקה גבוהה/בתפוקה גבוהה. מערכת תרבות התאים וההדמיה האוטומטית מופעלת באמצעות תוכנת השליטה וממשק המשתמש הגרפי (GUI) בהתאמה אישית. ה- GUI מאפשר למשתמשים לייבא קבצי CSV המכילים פרמטרים ספציפיים לקו התא הדרושים לביצוע פעולת שירות. בנוסף, GUI מאפשר לתזמן ניסויים רבים בכל רצף באמצעות תצוגת לוח השנה המוכלל ובכך מאפשר שליטה מלאה של הזמן שבו כל שיטה מתחילה.

מערכת תרבות התאים האוטומטית שלנו משתמשת במהירויות צנרת מתוקנן, זמני מעבר, סף confluency, צפיפויות זריעה, ונפחים בינוניים עם הגמישות לתאי תרבות במגוון פורמטים של לוחות (96-, 48-, 24-, 12-, 6- או 1-פורמט צלחת). התאמנו פרוטוקול בידול לטווח קצר שפורסם לאחרונה להמרת hiPSC לנוירונים שיכולים להניב TUBB3 נוירונים חיוביים ב 6 ימים10,11. הקמנו גם את ההבידול האוטומטי וההדמיה של מולקולה קטנה תאים מבשר עצביים (smNPC) לתוך נוירונים constitutivetiveing GFP תחת EF1aמקדם 12 ו iPSC לתוך דופאמין באמצע המוח (mDA) נוירונים, התאמת פרוטוקול עיכוב SMAD כפולשפורסם בעבר 13 המניב נוירונים mDA בתוך 65 ימים.

Protocol

1. הליכים בסיסיים לאוטומציה של תרביות תאים והדמיה

  1. טען צלחות תרבות וטיפים חדשים
    1. פתח את ממשק GUI ולחץ על לחצן תצוגת תהליך משאב/מכשיר. כדי להפעיל תהליך פעולה זמין/כלי, בחר את תהליך המשאב/מכשיר ולחץ על לחצן תהליך הפעלת כלי נגינה.
    2. הפעל את תהליך המשאב RunHepaHood וטעונה מחדש (ראה שלב 1.1.1). פתח את הדלת, טען את לוחות תרבות התא ואת הטיפים החד-פעמיים במיקום המתאים כפי שצוין בתמונה המקפצת במחשב השולט.
    3. נגב את הדלת עם 70% אתנול לטיהור וסגור אותה. הפעל את תהליך המכשיר טיהור מתוך GUI (ראה שלב 1.1.1). המערכת מקבלת עיקור על ידי קרינת UV במשך 30 דקות.
  2. מילוי מחדש של מדיה של תרבות ו/או דיסוציאציה
    1. בצע את שלב המכשיר RunHepahood (ראה שלב 1.1.1). פתח את הדלת הקדמית של תחנת הטיפול בנוזלים. תרסם מאגרים (המכילים מדיה, PBS ו/או reagent דיסוציאציה) עם 70% אתנול ולמקם אותם על הסיפון לפוזיטון שהוקצה (כפי שהוגדר cfg.csv הקובץ). תסתגר את המאגרים.
    2. תסתיר את הדלת עם 70% אתנול ותסגור אותה. תכו את מכסה המנוע של HEPA על-ידי הפעלת תהליך המשאב/מכשיר "InitHepaHood" מה-GUI.
  3. יצירת "קו תא" חדש ופרוייקט ב- GUI
    1. צור/שנה את קבצי "קו התא" המוגדרים על-ידי המשתמש המורכבים מקבצי Config (*.cfg.csv), הייבוא ( *.imp.csv), המשאב (*.rsv.csv) וקבצי זרימת העבודה (*.wfl.csv).
    2. פתח את GUI וליצור "קו תא" חדש על-ידי לחיצה על לחצן הוסף קו תא בתצוגה "עורך קו תא". אשף נפתח במקום שבו יש לבחור את קובץ Config ויש להזין שם פרוייקט עם תיאור קצר.
    3. נווט באשף זה באמצעות ראש החץ הירוק ואשר את ההגדרות על-ידי לחיצה על סימן הסימון הירוק. צור פרוייקט חדש עבור "קו התא" שנוצר על-ידי לחיצה על לחצן הוסף פרוייקט.
    4. הזן שם פרוייקט ותיאור והגדר צבע פרוייקט שיהיה גלוי בתצוגת לוח התאריכים של ממשק המשתמש GUI. נווט לעמוד הבא של האשף על-ידי לחיצה על ראש החץ.
    5. צור אצווה חדשה על-ידי לחיצה על לחצן הוסף אצווה ומתן שם ותיאור קצרים בחלון המוקפץ. בחר את כל שלבי התהליך וזמן את זמן ההתחלה עבור כל אחד לשלבי התהליך. סגור את החלון על-ידי לחיצה על אישור.
  4. ביצוע שיטה אוטומטית באמצעות ממשק המשתמש
    1. עבור אל תצוגת לוח השנה של ממשק משתמש GUI ולחץ על לחצן הוסף שלב תהליך.
    2. בחר את קו התא ולאחר ניווט לעמוד הבא של האשף בחר את הפרוייקט. סמן את האצווה לשימוש ולחץ על ראש החץ מצביע ימינה. בהתאם לשיטה שבה נעשה שימוש, אצוות צריכים להיות ריקות (לקבלת לוחות חדשים), או להכיל צלחות תרבות או לוחות תסרוקת (כל התהליכים האחרים).
    3. נווט לעמוד הבא של האשף ובחר את שלב התהליך שיבוצע. עבור לעמוד האחרון של אשף זה וזמן את הניסוי. בסעיף "פרטי פרמטר" משתנים הדרושים כדי להפעיל את פעולת השירות ניתן לשנות. אשר על-ידי לחיצה על אישור.
  5. טעינת צלחות תרבות ואסא לתוך אינקובטור CO2
    הערה: 1-well צלחות מוגדרות צלחות תרבות מאז הם משמשים בדרך כלל לתאים בתפזורת. כל הצלחות מרובות הבאר מוגדרות כלחות תסה.
    1. בצע את תהליך המכשיר "RunHepaHood" מתוך GUI כמתואר בשלב 1.1.1. ולפתוח את הדלת מול הזרוע הרובוטית.
    2. נגב את תחתית לוחות ה-assay עם 70% אתנול ורקמות ללא מוך אם הלוחות טעונים להדמיה אוטומטית. מניחים את התרבות או צלחות ההסתה על המדף השמאלי. ודא שכיוון הלוח נכון. עבור צלחות assay, גם A1 צריך להצביע לכיוון הזרוע הרובוטית בעוד הקצוות של צלחות תרבות צריך להצביע ימינה.
    3. נגב את הדלת עם 70% אתנול לטיהור וסגור אותה.
    4. בצע את השיטה "טעינת צלחות תרבות" לייבוא לוחות 1-well או "טעינת לוחות אסאי" לייבוא לוחות רב-בארות כמתואר בשלב 1.4. השתמש באצווה ריקה כדי להפעיל את שתי השיטות. אם ברקודים של לוחות כבר קיימים באצווה זו, בטל את הסימון בהם על-ידי לחיצה על תיבות הסימון.
    5. הובל צלחות בודדות מהמדף לפלטפורמת האינקובטור CO2 באמצעות הזרוע הרובוטית. תחנת ההסעות המובנה מחזירה את הצלחת ומאחסנת אותם באחד מארונות התקשורת של חממת CO2. התאים נשמרים ב- 37 °C ו- 5% CO2.
  6. פריקת צלחות מהאינקובטור CO2
    1. בצע את פעולת השירות "בטל טעינה של לוחות" (ראה שלב 1.4). בחר את האצווה המכילה את הצלחות שיש לייצא. ניתן לבחור צלחות בודדות על ידי הברקודים שלהן.
    2. להעביר את הצלחות החוצהמאינקובטור CO 2 למדף השמאלי באמצעות הזרוע הרובוטית.
    3. הפעל את מכסה המנוע HEPA באמצעות תהליך המכשיר "RunHepaHood" כמתואר בשלב 1.1.1. ולפתוח את הדלת מול הזרוע הרובוטית. הסר את הצלחות, תטהר את הדלת עם 70% אתנול לפני סגירתה והושבת מכסה המנוע של ה-HEPA.

2. פרוטוקולי אוטומציה

  1. זריעת צלחות מצינורות
    1. הפעל את מכסה המנוע HEPA על ידי ביצוע תהליך המכשיר RunHepaHood (ראה שלב 1.1.1). פתח את הדלת מול תחנת הטיפול בנוזלים. הזן את צינור 50 מ"ל המכיל את מתלי התא וde-lid הצינור.
    2. פתח את הדלת מול הזרוע הרובוטית והטען צלחות תרבות מצופה לקבלת תאים על המדף. תטהר ותסגור את שתי הדלתות. בצע את השיטה "זריעת צלחות מצינורות" (ראה שלב 1.4).
    3. ספירת תאים בציטומטר ההדמיה של Brightfield באמצעות פונקציית ספירת תאים ישירה. לספירת תאים, השתמש ב- 16 בארות כמשכפלים בתבנית לוח של 384 בארות.
    4. להעביר את לוחית ספירה 384 גם מהסיפון אל cytometer הדמיה brightfield באמצעות פטיפון באמצעות הזרוע הרובוטית ולהתחיל את תהליך ההדמיה. הציטומטר קובע באופן אוטומטי את מספר התא למיליליטר. החזירו את לוחית הספירה למיקום המקורי שלה באמצעות הזרוע הרובוטית.
    5. להעביר תרבות מצופה או צלחת תסה מהמדף לסיפון pipetting באמצעות הזרוע הרובוטית. הסר תאי ציפוי וזרע במספר המוגדר על-ידי המשתמש ונפח האחסון המתאים לתבנית הלוח (ראה טבלה 1). מעבירים את הצלחת לשייקר על הסיפון ל-10 שניות ב-500 סל"ד לחלוקת תאים והעברו לאקובטור CO2.
  2. הערכת התכנסות אוטומטית
    1. בצע את השיטה "בדוק את Confluency" כמתואר בשלב 1.4. בחר אצווה המכילה לפחות לוח תרבות אחד ואין לוחות תסה. בסעיף "פרטי פרמטר" קלט "iPSCf_2020" עבור רכישת תמונה והגדרות ניתוח הדמיה.
    2. הובל את הצלחת הראשונה מהאינקובטור CO2 אל ציטומטר ההדמיה של Brightfield באמצעות הפטיפון באמצעות הזרוע הרובוטית.
    3. בצע הדמיה של תאים בציטומטר הדמיה brightfield עבור בדיקת התכנסות של מושבות hiPSC. השתמש ביישום "confluence" ובתמונה 13 שדות של פאטה 1-well ולחשב באופן אוטומטי את האזור הממוצע הכבוש על-ידי תאים.
    4. להעביר את הצלחת בחזרה לאקובטור CO2 באמצעות הזרוע הרובוטית. חזור על שלבים 2.2.2. ל-2.2.4. עבור הצלחות הנותרות.
  3. שינוי מדיה של צלחות תרבות או צלחות תסה
    1. בצע את השיטה "שינוי מדיה של לוחות תרבות" כמתואר בשלב 1.4. ובחר אצווה המכילה לוחות תרבות בלבד. הגדר את המשתנה המציין אם טיפים או מחטים משמשים עבור שלבי pipetting בסעיף "פרטי פרמטר". לשינוי מדיה של כל לוח רב-בארות, בצע את השיטה "שינוי מדיה של לוחות תס"א" ובחר אצווה המכילה לוחות אסאי.
    2. להעביר את הצלחות הבודדות מאינקובטור CO2 לסיפון באמצעות הזרוע הרובוטית ולהוות את המכסה את הצלחות. הטיה אוטומטית של הצלחות ושאפה מדיה ישנה והשליך אותה למודול איסוף הפסולת. הוסף 12 מ"ל של מדיה טרייה. מכסים מחדש את הצלחת ומעבירים את הלוחות בחזרה לאקובטור CO2 באמצעות הזרוע הרובוטית.
  4. תת-תרגום
    הערה: בצע את תהליך המכשיר "RunHepaHood" מתוך GUI כמתואר ב- 1.1.1. ולפתוח את הדלת הקדמית של תחנת הטיפול בנוזלים. טען את reagent מדיה ודיסוציאציה במשרות הנדרשות (ראה שלב 1.2). אם יש צורך במילוי מחדש של עצות, השתמש ב"טעינה מחדש" כמתואר בשלב 1.1. קלט צינור 50 מ"ל לקבלת מתלה התא וde-lid הצינור.
    1. בצע את השיטה "תת-תרבות של תאים נדבקים" (ראה שלב 1.4). בחר את האצווה המכילה לוחות תרבות הזקוקים לתת-תרבות.
    2. להעביר את הצלחות מהאינקובטור CO2 לסיפון באמצעות הזרוע הרובוטית ולהוות את המכסה את הצלחות. הטיה אוטומטית של הלוחות והסר מדיה ישנה והשלך אותה למודול איסוף הפסולת. לשטוף תאים פעם אחת עם 8 מ"ל של PBS. הוסף 8 מ"ל של 0.5 מ"ר EDTA עבור מעבר מבוסס גוש. דגירה על הסיפון במשך 8 דקות.
    3. הסר את פתרון EDTA מההצלחות וזרוק אותו למודול איסוף הפסולת. מוסיפים 12 מ"ל של מדיום טרי ומעבירים את הצלחות לשייקר. לנער ב 2000 סל"ד במשך 1 דקות כדי לנתק את המושבות.
    4. לתכלת את מתלי התא עבור חמישה מחזורים של pipetting כדי לשבור את מושבות iPSC לגודל קטן יותר (~ 50\u201280 μm). העבר את מתלה התא לצינור של 50 מ"ל על הסיפון. תאי זרעים באופן אוטומטי כמתואר בשלב 2.1.5 באמצעות יחס מפוצל של 1 ל- 7.
      הערה: מעבר תא יחיד אופציונלי. צור מתלה תא בודד באמצעות תיוג ניתוק של תא יחיד (ראה טבלת חומרים). במקום 0.5 mM EDTA בשלב 2.4.2., השתמש 8 מ"ל של reagent דיסוציאציה תא יחיד דגירה במשך 20 דקות ב 37 °C. לאסוף את מתלה התא לתוך צינור 50 מ"ל ולהוסיף נפח שווה של מדיה. ניתוק באמצעות reagent ניתוק תא יחיד דורש שלב ידני כדי גלולת התאים. תאי צנטריפוגה ב- 300 x g למשך 3 דקות. הסר את supernatant ולתחות מחדש את גלולת התא ב 12 מ"ל של המדיה הנדרשת ולהמשיך עם "זריעת צלחות מצינורות" (ראה שלב 2.1). להשלים את המדיה עם 2 μM thiazovivin ביום של זריעה בעת שימוש השעיה תא יחיד של hiPSCs.
  5. הדמיית תפוקה גבוהה אוטומטית בעלת תוכן גבוה
    הערה: הגדרת המדידה צריכה להיות זמינה (ראה קובץ משלים 1: שלב 1.1). לוחות ה-assay שיש למצוא בתמונה זמינים באינקובטור.
    1. בצע את פעולת השירות "הדמיה" (ראה שלב 1.4). בחר אצווה המכילה לפחות לוח תסה אחד ללא לוח תרבות. בסעיף "פרטי פרמטר", הזן את סוג הלוח, את הגדרות הלוח (עבור לוחות הדמיה סטנדרטיים של 96 בארות: "Plate-96-20170918113842") ואת שם הגדרת המדידה.
    2. להעביר את לוח הבדיקה דרך פטיפון למיקרוסקופ confocal אוטומטי באמצעות הזרוע הרובוטית כדי להתחיל את תהליך ההדמיה. לשחזר את הצלחת בסוף ההדמיה מהמיקרוסקופ ולהעביר אותו בחזרה לאקובטור CO2. חזור על התהליך של הצלחות הנותרות באצווה.

3. תחזוקה אוטומטית והרחבה של hiPSC

  1. רצף בדיקות ההתקנות האוטומטיות, שינויי מדיה ותת-טיבציה
    1. תאי זרע על 1-well צלחות באמצעות שיטת "זריעת צלחות מצינורות" (ראה שלב 2.1). לחלופין, ייבוא ידני זרעים 1-well צלחות באמצעות שיטת "טעינת לוח תרבות" (ראה שלב 1.5).
    2. תזמן בדיקות קונפלואנציות אוטומטיות מדי יום כדי לפקח על צמיחת המושבה מהיום הראשון עד היום ה-6 של התרבות עבור iPSC (ראה שלב 2.2).
    3. רענן מדיה בכל יום שני באמצעות השיטה "שינוי מדיה של לוחות תרבות" (ראה שלב 2.3). 12 מ"ל של מדיום משמש לכל צלחת.
    4. ביום 6, התחל את תהליך "תת-טיבציה" (ראה שלב 2.4.).

4. בידול אוטומטי

  1. IPSC אנושי לנוירונים קליפתיים NGN2
    הערה: הכנה ידנית ל- hiPSC. הפרוטוקול כולל ביטוי יתר של NGN2 באמצעות וקטורים lentiviral למסירה. מתמר hiPSC עם NGN2 כדי rTTA3 lentivirus ביחס 1:2 (> ~ 107 TU / מ"ל). לאחר מכן, תאים נבחרים עבור מעבר אחד עם פורומיצין 0.5 μg/mL. פרוטוקול מפורט ליצירת שורות hiPSC-NGN2 יציבות נמצא בקובץ משלים 1: שלב 2.
    1. המשך בתהליך "Subcultivation" כמתואר באמצעות reagent ניתוק תא יחיד המתואר בהערה של שלב 2.4.4. כאשר hiPSC מגיע 70\u201280% confluency
    2. הסר את supernatant ולתחות מחדש את גלולת התא ב 12 מ"ל של NGN2 מדיה(טבלת חומרים)המכיל 2.5 μg / mL דוקסיציקלין (דוקס) ו 2 μM thiazovivin.
    3. התחל בידול באמצעות השיטה "זריעת צלחותמצינורות" (ראה שלב 2.1). הגדר את צפיפות הזרעים הרצויה של iPSC ל- 30,000/ס"מ2 (ראה טבלה 1). ה-iPSC מצופה על צלחות מצופה מראש עם 0.1 מ"ג/מ"ל פולי-L-ornithine (אש"ף) ו 5 μg / מ"ל למינין.
      הערה: לוחות 1-well מועדפים עבור מחקרים מבוססי RNA ופרוטאומיקה בעוד פורמט צלחת 96-באר מועדף על ניסויי הדמיה. ניתן להשתמש גם בתבניות אחרות של לוחות צלחת ציון כגון 48-, 24-, 12 או 6-בארות.
    4. ביום הראשון של בידול, רענן מדיה באמצעות "שינוי מדיה של לוחות אסה (ראה שלב 2.3) באמצעות NGN2 בינוני, בתוספת 2.5 μg/mL dox ו 10 μM N-[2S-(3,5-difluorophenyl)אצטיל]-L-alanyl-2-phenyl-גליסין, 1,1-דימתילאתיל אסתר (DAPT). המשך בשינויי מדיה כל 2\u20123 ימים עד ליום הרצוי של בידול (ראה שלב 2.3).
    5. ביום ה-4 של ההבידול, לבצע שינוי מדיה אחר (ראה שלב 2.3.) באמצעות NGN2 בינוני בתוספת עם 10 ng/mL המוח נגזר גורם נוירוטרופי (BDNF), 10 ng/mL גליה תא נגזר גורם נוירוטרופי (GDNF) ו 10 ng/mL גורם נוירוטרופי 3 (NT-3) כדי לשפר את ההתבגרות. בסוף הניסוי, לייצא את צלחות התרבות מהמערכת לניסויים במורד הזרם (ראה שלב 1.6).
  2. מולקולה קטנה תאים מבשר עצבי (smNPC) לנוירונים NGN2
    הערה: נגזר smNPC בעקבות הגירסה המותאמת שלפרוטוקול שפורסם 12 (ראה קובץ משלים 1: שלב 5). שנה את smNPC עם NGN2 ווירוס rTTA3 (ראה קובץ משלים 1: שלב 2). סיבוב אחד של NGN2 ו- rTTA מתמר מספיק כדי ליצור אוכלוסייה יציבה. שינוי נוסף smNPC עם pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus המאפשר לבצע ניטור תא חי. ריבוי של זיהום (MOI) של 10 משמש עבור מתמר lentiviral GFP.
    1. מעבר smNPC על הגעה confluency באמצעות reagent ניתוק תא יחיד כמתואר בשלב 2.4. הערה.
    2. תאי זרע באמצעות מערכת תרבות התא האוטומטית בצפיפות תא של 50,000/cm2 באמצעות שיטת "זריעת צלחות מצינורות" (ראה שלב 2.1.) על לוחות מצופים מראש עם 0.1 מ"ג/מ"ל PLO, ו 5 μg/mL למין ב NGN2 בינוני בתוספת 2.5 μg/mL dox.
    3. ביום 3, בצע שינוי מדיה (ראה שלב 1.3.) באמצעות אמצעי NGN2 טרי המכיל 2.5 μg/mL dox ו- 10 μM DAPT. לאחר היום השלישי, בצע שינויי מדיה בכל יום שלישי עם בינוני NGN2 טרי המכיל 2.5 μg/mL dox, BDNF, GDNF ו- NT-3 ב 10 ng/mL כל אחד.
    4. תאי תמונה מדי יום באמצעות השיטה "תוכן גבוה אוטומטי, הדמיית תפוקה גבוהה" (ראה שלב 2.5) לניטור מצב בידול באמצעות GFP כקריאה עבור נורייט outgrowth. הגדר את כוח הלייזר ל-80% והשתמש בזמן חשיפה של 30 אלפיות השנייה. רכוש מספר גדול של שדות (לדוגמה, 25 שדות) באמצעות יעד של 20x.
  3. ניתוח תמונת אצווה
    1. בצע ניתוח תמונה באמצעות תוכנת ניתוח תמונה 1, באמצעות תבנית ההתרבות neurite.
    2. פתח את התוכנה. בחר באפשרות "נתונים" ואתר את תיקיית נתוני ההדמיה, לחץ על אישור כדי לטעון נתונים לניתוח. לחץ על פתח ומשורת התפריטים העליונה, בחר פרוטוקול ומתפריט היישום בחר neurite outgrowth. עבור אל "אלגוריתמים" והשתמש בערוץ "488" כדי להגדיר את הגרעין, גוף התא ונורייט. התאם את פרמטרי הסף עבור כל אחד מהם.
    3. בחר את בארות שישמשו לניתוח תמונה. בפינה השמאלית התחתונה לחץ על קישור ובחר תכונות שיש לנתח, כגון ממוצע ספירת תאים, סה"כ אורך שלד. המשך עם "ניתוח קדם" ואחריו "תצוגה מקדימה".
    4. בדוק אם הגדרות התצוגה המקדימה קבילות והתחיל את הניתוח במצב אצווה. התוצאות זמינות בתיקיית האב תחת "דוחות" בתבנית .csv זמינה שניתן לפתוח ב- Excel.
      הערה: קובץ Script לניתוח תמונה זמין על פי בקשה.
    5. התוויית אורך נורייט ממוצע שהושג על-ידי אורך נורייט הכולל מנורמל למספר תא.

5. בידול אוטומטי של hiPSC לתוך דופאמין באמצע המוח (mDA) נוירונים

  1. הכנה ידנית ל-hiPSC
    1. נתק hiPSC של 70\u201280% לתאים בודדים באמצעות ריגנט ניתוק תאים בודדים. בקצרה, תאי דגירה עם ריאגנט דיסוציאציה תא יחיד (100 μL / ס"מ2) במשך30 דקות ב 37 ° C, לאסוף מתלה תא לתוך צינור חרוץ, צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות וכדור תא תלוי מחדש במדיום תרבות iPSC.
    2. זרע 200,000 תאים/ס"מ 2 על צלחות 1-well מצופה מטריצה חוץ תאית ו- iPSC תרבות בינוני בתוספת 10 μM Y-27632. תאי תרבות ללילה ב- 37 °C ו 5% CO2.
  2. בדידול אוטומטי: שלב 1
    1. הכן את מערכת התרבות האוטומטית כמתואר בשלב 1.1\u20121.2.
    2. טען לוחות תרבות המכילים תאים לתוך אינקובטור CO2 של מערכת התרבות האוטומטית (ראה שלב 1.5).
    3. הכן את KSR בינוני (ראה טבלת חומרים)ותושלם עם מולקולות קטנות (ראה טבלה 2)הנדרשת ליום ההתחלה 0 של בידול. השתמש רק במדיה טרייה עם מולקולות קטנות וגוברי גדילה.
    4. בצע שינויים במדיה של לוחות התרבות כמתואר בשלב 2.3 בימים 0 ו- 1 של בידול ולאחר מכן בכל יום שני עד היום ה-25.
    5. מהיום ה', הסט את ניסוח המדיה בהדרגה כמתואר בפירוט בטבלה 3.
    6. ביום 11, להוסיף מדיום בידול נוירון MDA בתוספת CHIR (עד היום 13), BDNF, AA1, GDNF, db-cAMP, TGFß3 ו DAPT (ראה טבלת החומרים).
    7. ביום ה-25, פרק לוחיות פריקה (ראה שלב 1.6).
  3. תוחם ידני 1
    1. נתק את היום 25 מבשרי MDA לתאים בודדים באמצעות reagent ניתוק תא יחיד. בקצרה, תאי דגירה עם ריאגנט ניתוק תא יחיד (100 μL/cm2) במשך40 דקות ב 37 °C, לאסוף מתלי תא לתוך צינור חרוץ, צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות וכדור תא תלוי מחדש במדיום בידול נוירון MDA.
    2. זרע 400,000 תאים /ס"מ2 ב 1-באר צלחות תרבות מצופה מראש עם 0.1 מ"ג / מ"ל PLO, 10 μg/mL למינין ו 2 μg /mL פיברונטין במדיום בידול נוירון MDA בתוספת 10 μM Y-27632 (עד היום 26) מולקולות קטנות וגדילה גורמי המתוארים בטבלה 2. תאי תרבות ללילה ב- 37 °C ו 5% CO2.
  4. בדידול אוטומטי: שלב 2
    1. טען לוחות תרבות המכילים נוירונים MDA לתוך אינקובטור CO2 של מערכת התרבות האוטומטית כמתואר בשלב 1.5
    2. להכין מדיום בידול נוירון MDA (ראה טבלת חומרים)ולהשלים עם מולקולות קטנות גורמי גדילה הנדרשים עבור ההבידול הסופי מהיום 26 ואילך (ראה טבלה 2).
    3. בצע שינויי מדיה של לוחות תרבות כמתואר בשלב 2.3 ביום 26 של בידול ולאחר מכן כל 3\u20124 ימים עד היום 65.
      הערה: למטרות הדמיה בתפוקה גבוהה, מומלץ לתבל מחדש את תאי העצב של ה-MDA ב-96-well צלחות בצפיפות נמוכה ביום 32 של בידול, כמתואר בשלב 5.5.
  5. פלטה ידנית 2
    1. פרקו צלחות תרבות כמתואר בשלב 1.6. לנתק את היום 32 נוירונים mDA לתאים בודדים כמתואר בשלב 5.3.1.
    2. זרע 100,000 תאים/ס"מ2 ב-96-באר צלחות מצופה מראש עם 0.1 מ"ג/מ"ל אש"ף, 10 μg/mL למינין ו 2 μg /mL פיברונטין במדיום הבחנה נוירון MDA בתוספת עם 10 μM Y-27632 (עד היום 33) מולקולות קטנות וגדילה גורמים (ראה טבלה 2). תאי תרבות ללילה ב- 37 °C ו 5% CO2.
    3. ביום 33, להחליף בינוני על ידי מוכן טרי DA נוירונים דיבידול בינוני בתוספת מולקולות קטנות וגווני גדילה (ללא Y-27632). שנה מדיום באופן ידני כל 3\u20124 ימים עד היום ה-65.

6. רכישת וניתוח אוטומטי של תמונות בתפוקה גבוהה

  1. כתמי פלואורסץ
    1. בצע פלואורסצנט חיסוני כמתואר בקובץ משלים 1: שלב 4.
    2. תאי תמונה כמתואר בקובץ משלים 1: שלב 1.2.
    3. העלה קבצי הדמיה שנוצרו על-ידי מערכת ההדמיה לתוכנה לניתוח תמונה 2 (ראה טבלת חומרים)לניתוח תמונה נוסף, כמתואר בשלב 6.2.
  2. ניתוח תמונה באמצעות תוכנת ניתוח תמונה 2
    1. לאחר קבצי הדמיה מועלים בתוכנה לניתוח תמונה 2, עבור אל הפונקציה "ניתוח תמונה" ולבנות את אלגוריתם הניתוח באמצעות התפריט הנפתח.
    2. בחר גרעין באמצעות המשימה "למצוא גרעין", אשר מזהה אזורים על התמונה השייכים גרעין התא (כאן מוכתם Hoechst). אל תכלול גרעינים מתים (גרעין פיקנוטי) על-ידי קביעת סף לאזור גרעיני או קוטר.
    3. בחר את ציטופלסמה התא באמצעות המשימה "למצוא צטופלסמה". משימה זו מזהה אזורים סביב גרעין השייכים צינופלסמה תא. כלול תאים מחולקים היטב בלבד. אל תכלול תאים מיטוטיים, אפופטוטיים ומפולחים בצורה גרועה. הסר תאים הנוגעים בגבול התמונה.
    4. הוסף את הפעילויות "חשב מאפייני מורפולוגיה" ו"חשב מאפייני עוצמה". הפרמטרים המורפולוגיה כוללים את החישוב של מאפייני מורפולוגיה כגון אזור עבור אזור עניין. פרמטרי העוצמה כוללים את החישוב של מאפייני עוצמה כגון עוצמה ממוצעת עבור אזור עניין (למשל צטופלסמה של נוירונים).
    5. בחר תת-אוכלוסיה (לדוגמה, נוירונים חיוביים TH) של אוכלוסיית הקלט (כל ציותופלסמות שנבחרו) באמצעות תנאי אחד או יותר, מורפולוגיה ו/או עוצמה.
      הערה: בדרך כלל, עוצמה נבחרת עבור נוירונים. בהתבסס על פקדים שליליים, ניתן להגדיר מעל איזה סף של עוצמה הנוירונים נחשבים חיוביים עבור TH.
    6. הגדר את תוצאות הפלט. זהו הבניין האחרון של כל ניתוח. הוא מגדיר את ערכי הקריאה של ה-Assay עבור כל באר של לוח תרבות (תוצאות לבאר).
    7. הפעל את ניתוח האצווה ולייצא את התוצאות. לנרמל את מספר התאים החיוביים למספר הכולל של גרעין ולייצג נתונים כאחוז התאים החיוביים.

7. תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qRT-PCR)

  1. בצע את פרוטוקול qRT-PCR כמתואר בקובץ משלים 1: שלב 3.

Representative Results

תרבות התא האוטומטית שלנו ומערכת הדמיה נועדה למזער את ההתערבות האנושית המאפשרת לנו לתקנן את הטיפוח של hiPSC ובדידול לסוגי תאים שונים כגון קליפת המוח או דופאמין באמצע המוח (MDA) נוירונים. סקירה סכמטית של מערכת תרבות התא האוטומטית שלנו עם התקני הדמיה משולבים מתוארת באות 1. המבוא הראשוני של תרביות תאים למערכת תרבות תא אוטומטית זו יכול להיעשות על ידי זריעת תאים באופן אוטומטי מצינור 50 מ"ל או באמצעות השיטה "טעינת צלחות תרבות" או "טעינת לוחות אסאי" לייבוא של צלחות תרבות או תסה. מרכיב מרכזי במערכת שלנו הוא תחנת הטיפול בנוזלים שבה מתבצעים כל שלבי ההעברה הנוזליים, כגון שינויי מדיה או תת-חישובים. פריסת הסיפון המותאמת אישית של המטפל הנוזלי מיוצגת באות 2. תחנת הטיפול בנוזלים מצוידת בארבע תנוחות. ניתן להעביר עד ארבע צלחות מהאינקובטור לסיפון, ולאפשר שינויי מדיה מקבילים. מכיוון בשיטת תת-התת-טיבציה, יש לאכלס את צלחות התרבות של ההורים והבת על הסיפון, המספר המרבי של צלחות תרבות המעובדות במקביל מוגבל לשניים. תכונה חשובה של תחנת טיפול בנוזל היא האפשרות להטות את הצלחות במהלך שינוי מדיה להסרה מלאה של supernatant תרבות התא. כמו כן, תחנת טיפול נוזלי מצויד שייקרים להעדפת דיסוציאציה אנזימטית של תאים במהלך ביצוע פרוטוקול subcultivation. מערכת התרבות האוטומטית שלנו מצוידת גם בשתי מערכות הדמיה: ציטומטר הדמיה של Brightfield לביצוע בדיקות ספירת תאים ואי-פלואנציות, ולכן ניטור צמיחת התאים לאורך זמן, ומיקרוסקופ כפול של דיסק מסתובב לצורך ספירת תאים מהירה, גבוהה והדמיה ברזולוציה גבוהה של תאים.

תרביות hiPSC מנוטרות מדי יום לצמיחה בציטומטר ההדמיה של Brightfield וניתחו עבור אחוז ההתברבות. תמונת brightfield בלוח השמאלי ובחלונית הימנית מסיכה ירוקה מניתוח תמונת brightfield שהושגה עם ציטומטר (איור 3א). צמיחה הומוגנית hiPSC נצפתה לאורך זמן, כפי המוצג על ידי אחוזי ההתכנסות של שני קווי hiPSC (n = 4 צלחות) גדל במקביל נתון בדיקות confluency מהיום 1 עד היום 6(איור 3B). עם ההגעה לסף שנקבע, ה-hiPSC מעבר. קווי התא היו תרבותיים באופן ידני (m) או על ידי מערכת אוטומציה (א) ונצפו לתחזוקה של מורפולוגיה טיפוסית של תאי גזע עבור לפחות שני מעברים, תמונות ברייטפילד נציג(איור 4A). hiPSC מתורבת באופן ידני (לא מוצג) או במערכת האוטומטית הציג את סמן תאי גזע טיפוסי OCT4 (אדום) ו SSEA4 (ירוק), כפי שמוצג במאגר immunofluorescence(איור 4B). הביטוי של סמני pluripotency OCT4, NANOG ו REX1 הוערכו גם ברמת mRNA על ידי qRT-PCR (איור 4C). כימות יחסית בוצעו עם דגימות שנאספו משורת תא אחת שגדלה באופן ידני (m) ובמערכת התרבות האוטומטית (א) בכפילויות (משכפל 1 ו- 2). רמות הביטוי של כל שלושת סמני הפלורופוטנסיה בשכפולים המעובדים במערכת התרבות האוטומטית דומות לביטוי סמן לאחר תרבות ידנית. ביום 8 (D8), הביטוי של סמני pluripotency נעדר נוירונים קליפתיים מובדיל (Diff) מ hiPSC.

יישום חשוב אחד של מערכת התרבות האוטומטית הוא ההבידול של hiPSC לסוגי תאים שונים כולל נוירונים. כאן אנו מראים את ההבידול של hiPSC לתוך נוירונים באמצעות אסטרטגיית NGN2, אשר מייצרת תרבות נוירון קליפתית טהורה בזמן קצר מאוד (כ 6 ימים). נוירונים מובדילים במערכת התרבות האוטומטית (א) הציגו מורפולוגיה דומה וארגון רשת עצבית כמו הנוירונים מעובדים באופן ידני (m) (איור 5A). נוירונים קליפתיים מובדילים אוטומטיים היו חיוביים עבור TUBB3 (נוירון ספציפי Class III β-טובלין, אדום) ו BRN2 (סמן שכבה קליפתית עליונה, ירוק)(איור 5B), דומה נוירוניםמובדילים באופן ידני (נתונים לא מוצגים). הביטוי של סמנים עצביים כולל החלבון המשויך microtubule 2 (MAP2), מולקולת הדבקת תאים עצביים(NCAM1)ו Synapsin-1 (SYN1),כמו גם סמני נוירון קליפתיים BRN2 ו CUX1 (שכבה קליפתית עליונה) הועשרו בנוירונים ביום 8 (D8) של בידול (איור 5C). נמוך מאוד או שום ביטוי של סמנים אלה נצפתה hiPSC. כימות יחסית בוצעו עם דגימות שנאספו משורת תא אחת שגדלה באופן ידני (m) ובמערכת התרבות האוטומטית (א) בכפילויות (משכפל 1 ו- 2). רמות הביטוי בשכפולים מציגות וריאציות דומות בין בידיונות ידניים ואוטומטיים.

יכולת ההדמיה המשולבת של מערכת התרבות האוטומטית מאפשרת איסוף נתונים ללא ידיים לבריאות התרבויות ובכך מאפשרת רכישה אוטומטית ארוכת טווח של קראות פנוטיפיק. באמצעות הגישה NGN2 מולקולה קטנה נגזר מבשר עצבי (smNPC) קו המושרה עם GFP lentivirus, הקמנו תא חי אוטומטי neurite outgrowth תוואי שבו אורך neurite נמדד על פני 11 ימים של בידול ללא כל התערבות ידנית. מורכבות הנורייט גדלה עם הזמן, כפי שהוכח בשטח הכבוש עם נורייטים ביום הראשון, 3 ו-11, ביטוי GFP ותמונות רעולי פניםמניתוח (איור 6א', ב).). העלייה באורך נורייט מהיום הראשון עד 11 של בידול היה לכמת והראה התפתחות דומה על פני בארות שונות. למען הפשטות, נתונים מ-3 עמודות בלבד עם 6 בארות כל אחת מצלחת 96 בארות מתוארים בגרף המייצג למרות שכל 60 הבארות הפנימיות נותחו(איור 6C).

יישום נוסף של מערכת התרבות האוטומטית המוצגת כאן הוא ההבידול של hiPSC לתוך נוירונים mDA. ההבידול מבוסס על שינויים במדיה בעקבות פרוטוקול שנקבע מראש ובוצע במערכת התרבות האוטומטית בין ימים 0 ל-65. שינויי מדיה אוטומטיים לא גורמים לניתוק תאים או לשינויים אחרים הניתנים לזיהוי חזותית בהבחנה. בסוף ההבידול, ביום ה-65, נוירונים של מד"א מראים ארגון סלולרי ומורפולוגיה (סומה ספרית, דנדריטים ארוכים וקוציים) הדומים להבדיל ידני(איור 7א', ב). ברמת ה-MRNA, נוירונים מד"א מובדילים במערכת התרבות האוטומטית להראות את הביטוי של סמנים עצביים ו-MDA, MAP2 ו TH (טירוסין hydroxylase), בהתאמה(איור 7C). שתי ההביזויות יצרו כמויות משמעותיות של נוירונים חיוביים TH ו- MAP2(איור 7D).

Figure 1
איור 1: סקירה סכמטית של תרבות התא האוטומטית ופלטפורמת ההדמיה.
המערכת תוכננה עם דיור פוליקרבונט ושני ברדסים HEPA (A ו-B) מצויד ארבע מנורות UV הבטחת סביבה סטרילית עבור יישומי תרבות התא. לוחות תרבות התאים טעונים על המדפים מול הזרוע הרובוטית אשר ניתן לגשת דרך הדלת הקדמית (C). הצלחות נטענות לתוך אינקובטור CO2 (D) עם קיבולת של 456 צלחות. ציטומטר תא brightfield (ה) משמש לבדיקות קונפלציה וספירת תאים במהלך שגרת תת-טיבציה. תחנת הטיפול בנוזלים נמצאת מתחת לאחת מברדסי HEPA (B). פריסת הסיפון של המטפל הנוזלי מתוארת באות 2. זרוע ההתזתה של תחנת הטיפול בנוזלים נושאת ראש צינור 96 ערוצים, שמונה ערוצי צנרת 1 מ"ל וארבעה ערוצי צנרת של 5 מ"ל. במקרה של 1 מ"ל pipetting ערוצים, טיפים או מחטים יכול לשמש עבור העברות נוזליות. למטרות סינון, ניתן לטפל בתאים הזרעים לוחות אחסון בדגימות המאוחסנות ב-20°C במערכת האחסון האוטומטית של -20°C (F) לאחר הפשרת דגימות אלה באינקובטור שני (G). הדמיית תפוקה גבוהה מתבצעת במיקרוסקופ הנוקודאלי האוטומטי (H) המציע לרכוש תמונות במצב קונפוקאלי באמצעות שני דיסקים מסתובבים או במצב אפיפלואורסצינטי. תא תא חי המשולב במיקרוסקופ מאפשר ביצוע הדמיה ארוכת טווח של תאים תרבותיים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: פריסת הסיפון של תחנת הטיפול בנוזלים.
עמדות עצה מסומנים על ידי "50 μL" עבור 50 טיפים μL, על ידי "רגיל" עבור 300 טיפים μL, על ידי "גבוה" עבור 1 טיפים מ"ל ועל ידי "5 מ"ל" עבור 5 טיפים מ"ל. רכיבי סיפון:(A)ארבע עמדות שייקר מחוממות (מהירות מרבית: 2500 סל"ד) אשר ניתן להשתמש בהן עבור כל צלחת תרבות או פורמט צלחת תסה. עמדות השייקר מצוידות במהדקים הניתנים להצמדה המשמשים גם ליישור צלחת בעקבות הובלות לסיפון. יתר על כן, עמדות שייקר מתפקדות כמיקום חניה מכסה עבור צלחות במהלך צעדי העברה נוזלית. למטרות ייצוגיות, כל משרות השייקר מאוכלסות על ידי 96 צלחות ציון. (ב)ארבעה מודולי הטיה לעיבוד ארבע לוחות בכל פורמט בו-זמנית ממוקמים למעלה. המיקום הנמוך ביותר מסמן את תא איסוף הפסולת עבור צלחות תרבות ואסאי ואת ראש צינור 96 ערוץ. למטרות ייצוגיות, כל מודולי ההטיה מאוכלסים על-ידי לוחות ציון של 96 בארות. (ג)במיקום העליון, ממוקם הלוח 384 באר עבור ספירת תאים. להלן שתי עמדות עבור צלחות התפוסות על ידי צלחות 96-באר למטרות מייצגות ו rack עבור ארבעה 50 מ"ל וארבעה צינורות 15 מ"ל. המיקום הנמוך ביותר מאוכלס על ידי 5 טיפים מ"ל. (ד)שלושה קווי מדיה עם משרות למאגרים תקשורתיים. קווי המדיה מחזיקים בחיישנים ברמת נוזל המאפשרים למלא באופן אוטומטי את מאגר המדיה עם עד 250 מ"ל של מדיה. (ה)שני מודולי פסולת נוזלית עם ניקוז פעיל מבוססים על החלק העליון, מתחת למודול מבוקר טמפרטורה עם מיקום עבור מיכל אחד (לבן) ומדף טיפים של 5 מ"ל ממוקמים. חמשעמדותל-1 מ"ל טיפים. (ז)שני מודולים מבוקרי טמפרטורה ממוקמים בתחתית ומיקום לחניה אחד המכסים שלהם על גבי. (H)עמדות עבור שני 50 μL מקוננים טיפים מתלים (NTR) בראש ואחריו שתי עמדות עבור ערוץ יחיד ו 96 ערוצים להרים של 300 טיפים μL ו 5 מ"ל עצה מתלה בתחתית. (I)מערם עבור 384 גם ספירת צלחות בראש ואחריו שלושה 300 μL NTR ו 5 מ"ל עצה מתלה בתחתית. (J)תחנת אחסון ושטיפה עבור שלושה סטים של שמונה מחטי מתכת 1 מ"ל הניתנים לתווכות חוזרות. (K)מיקום פסולת עבור 1 מ"ל ו 5 מ"ל pipetting ערוצים NTR ריק (אפור) כמו גם בלוק gripper עבור 1 ו 5 מ"ל ערוצים (לבן) המשמשים עבור מדרגות תחבורה על הסיפון. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: בדיקת קונפלואנציות אוטומטית של hiPSC.
(א)תמונות מייצגות של brightfield (BF) של hiPSC שצולמו על ידי ציטומטר התא (משמאל) ולאחר ניתוח קונפלונלי אוטומטי (מימין) המציין את השטח היחסי הכבוש על ידי תאים בירוק; (ב)אחוזי קליטה שנרשמו משתי שורות hiPSC (iPS #1 ו- #2) מהיום הראשון עד 6 של תרבות, n = 4 לוחות 1-well לכל קו תא. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: מעבר של hiPSC.
(A) תמונת BF של קו hiPSC אחד גדל באופן ידני (משמאל) ובשימוש במערכת התרבות האוטומטית (מימין). התמונות צולמו 6 ימים לאחר המעבר השני; (ב)תמונות מייצגות של hiPSC מוכתמות עבור סמני pluripotency OCT4 ו- SSEA4, ומוכתמות עם Hoechst 33342 (Nuclei); (ג)תוצאות qRT-PCR עבור סמני pluripotency OCT4, NANOG ו REX1 בקו hiPSC אחד מעובד בכפילויות (1 ו 2) באופן ידני (m) ובמערכת התרבות האוטומטית (a), ואת הנוירונים הקליפתיים נגזר hiPSC בהתאמה (Diff) ביום 8 (D8) של בידול. הנתונים מיוצגים בשם הכמות היחסית (RQ) באמצעות iPS_a_1 כדגימה לעיון. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן (SD) מ- 3 שכפולים טכניים של תגובת qRT-PCR. GAPDH, RPL13A1 ו RPLPO שימשו כגנים משק בית. סרגל קנה מידה: 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

Figure 5
איור 5: נוירונים קליפתיים הנגזרים על-ידי IPSC.
(א)תמונות ברייטפילד של היום 6, באופן ידני (m) ואוטומטי (א) נוירונים קליפתיים מובדילים המציגים רשתות עצביות דומות; (ב)תמונות מייצגות של תאים מוכתמים עבור TUBB3 (נוירונל פאן), BRN2 (נוירונים קליפתיים) ו Hoechst 33342 (גרעין) ביום 8 של בידול; (ג)תוצאות qRT-PCR עבור גנים סמן של נוירונים קליפתיים (MAP2, BRN2, CUX2, NCAM1 ו SYN1) מועשר ביום 8 (D8) של בידול. הנתונים מיוצגים בשם הכמות היחסית (RQ) באמצעות iPS_a_1 כדגימה לעיון. קווי שגיאה מייצגים את ה-SD מ- 3 שכפולים טכניים של תגובת qRT-PCR. GAPDH, RPL13A1 ו RPLPO שימשו כגנים משק בית. סרגל קנה מידה: 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

Figure 6
איור 6: תפוקה גבוהה עבור נורייט.
(א)תמונות מייצגות של GFP המביעים תאים בימים 1, 3 ו-11 של בידול; (ב)תמונות בינאריות מייצגות של נורייטים בימים 1, 3 ו-11 של בידול. ההתנוי של neurite היה מכמת באמצעות תוכנת ניתוח תמונת תוכן גבוהה 1 והוא מיוצג כאורך neurite; (ב) הגרפיקה מציגה את העלייה באורך הנורייטים בנוירונים NGN2 הנגזרים מ-NPC ובהיוצרות רשת צפופה. שלוש צלחות 96 באר עם תאים ב 60 בארות הפנימיות הם בתמונה. לפשטות, רק שלוש עמודות של בארות לכל לוח 96 באר מוצגות כדוגמה עם n = 6 בארות לכל עמודה. ממוצע של 1308 תאים נותחו לבאר. קווי שגיאה מייצגים את השגיאה הסטנדרטית של ממוצע (S.E.M.). סרגל קנה מידה = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

Figure 7
איור 7: נוירונים אנושיים הנגזרים מ-IPSC.
נוירונים DA המוח האמצעי מובדילים באופן ידני (m) ובמערכת התרבות האוטומטית (א). (A, B) תמונות פלורסנט מייצגות של נוירונים מד"א מוכתמים עבור טירוסין hydroxylase (TH, סמן נוירון MDA; ירוק), MAP2 (סמן עצבי; אדום) ו Hoechst 33342 (גרעין; כחול); (ג)תוצאות QRT-PCR מייצגות עבור גנים סמן של נוירונים MDA מובדיל באופן ידני ובמערכת התרבות האוטומטית. רמות הביטוי TH ו- MAP2 מיוצגות ככמות יחסית (RQ) המנורמלת לגנים של משק בית (OAZ1 ו- GAPDH); (D)אחוזים של תאי TH ו- MAP2 חיוביים שנוצרו על ידי בידול ידני ואוטומטי. קווי שגיאה מייצגים את ה- SD של שתי בדילות עצמאיות המבוצעות עם שתי שורות iPSC נפרדות (#1 #2). סרגל קנה מידה = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

סוג תא מטרה שלב פרוטוקול צפיפות תאים תבנית לוח מספר תא/באר
בדיל NGN2
iPSC (IPSC) NGN2 יצירת קו יציב ס.2.3. 30,000 תאים/ס"מ2 12 בארות 1,17,000
iPSC (IPSC) בדיל נוירון NGN2 3.1.3. 30,000 תאים/ס"מ2 1-באר 25,20,000
iPSC (IPSC) בדיל נוירון NGN2 3.1.3. 30,000 תאים/ס"מ2 96 באר 9,600
דור smNPC
ת'ןונו יום ה-12 וה-16 ס.נ.ט. ו-S5.11. 70,000 תאים/ס"מ2 6-באר 6,72,000
ת'ןונו מתעוות ממעבר 5 5.11. 50,000 תאים/ס"מ2 6-באר 4,80,000
ת'ןונו smNPC לנוירונים NGN2 3.2.2 50,000 תאים/ס"מ2 96 באר 16,000
בדיל בין מ.א.
iPSC (IPSC) בדיל נוירון mDA 4.1.2. 200,000 תאים/ס"מ2 1-באר 1,68,00,000
נוירונים של התובע המחוזי היום ה-25 4.3.2. 400,000 תאים/ס"מ2 1-באר 3,36,00,000
נוירונים של התובע המחוזי היום ה-25 4.5.2. 100,000 תאים/ס"מ2 96 באר 32,000
ציפוי מטרה שלב פרוטוקול ריכוז /
דילול		 תבנית לוח פרטי ציפוי
תרבות IPS
מטריצה Extracellular IPSC, קו NGN2,
נוירונים mDA		 1.5.7. ו-S2.3. 1 עלי ותו לא
25 מ"ל DMEM/F-12		 1-/12-באר 8/0.5 מ"ל/טוב; שעה אחת ב- RT
בדיל NGN2
פולי-ל-אורניתין בדיל נוירון NGN2 3.1.3 ו-3.2.2. 0.1 מ"ג/מ"ל; Pbs 1-/96-באר 8/0.1 מ"ל/טוב; 12 שעות ב-37 מעלות צלזיוס;
3 שטיפת PBS
למינין (11 בדיל נוירון NGN2 3.1.3 ו-3.2.2. 5 μg/ מ"ל; Pbs 1-/96-באר 8/0.1 מ"ל/טוב; 4 שעות ב-37° צלזיוס
דור smNPC
מטריצה Extracellular דור ותרבות smNPC S5.6., S5.9.,
ס.נ5.11 .		 1 עלי ותו לא
25 מ"ל DMEM/F-12		 6-באר 1 מ"ל; 2 שעות ב- RT
בדיל בין מ.א.
מטריצה Extracellular בדיל בין מ.א. 4.1.2. 1 עלי ותו לא
25 מ"ל DMEM/F-12		 1-באר 12 מ"ל; 12 שעות ב- 37° צלזיוס
פולי-ל-אורניתין בדיל בין מ.א. 4.3.2 ו-4.5.2. 0.1 מ"ג/מ"ל; Pbs 1-/96-באר 12/0.1 מ"ל/טוב;
12 שעות ב-37 מעלות צלזיוס; 3 שטיפת PBS
למינין (11 בדיל בין מ.א. 4.3.2 ו-4.5.2. 10 μg/ מ"ל; Pbs 1-/96-באר 12/0.1 מ"ל/טוב; 12 שעות ב- 37° צלזיוס
פיברונקטין (פיברונטין) בדיל בין מ.א. 4.3.2 ו-4.5.2. 2 μg / מ"ל; Pbs 1-/96-באר 12/0.1 מ"ל/טוב; 12 שעות ב- 37° צלזיוס
*aliquot מטריצה חוץ-תאית מוגדרת כגורם דילול (ב- μL) הקיים בתעודת הניתוח של מוצר זה.

טבלה 1: זריעת צפיפות תאים וציפוי בהתאמה לתבנית הלוח.

יום מגיב
יום 0 - 1 100 00 00 00 00:00:00,000 00 00:00,000 --& 10 μM SB431542
היום הראשון - 3 100 00 00 00:00:00,000 00:00,000 --&10 00:00,000 --&200 00:00,000 --&200 00:00,000 --&200 00:00,000 00:00,000 --&2
100ng/מ"ל FGF-8b
היום ה-3 - 5 100 00 00 00:00:00,000 00:00,000 --&10 00:00,000 --&200 00:00,000 --&200 00:00,000 --&200 00:00,000 00:00,000 --&2
100ng/mL FGF-8b, 3 μM CHIR99021
היום ה- 5 - 7 100 00 00 00:00:00,000 00:00,000 --&200 00:00,000 --&200 00:00,000 --&200 00:00,000 --&200 00:00,000 --&10:00,0
3 μM CHIR99021
היום ה-7 - 9 100 00 00 00 00:00:00,000 00:00,000 00:00,000 --& 1 00:00:00,000 --& 100 00:00:00,000 --&
היום ה-9 - 11 100 00 00 00 00:00:00,000 00:00,000 00:00,000 --& 1 00:00:00,000 --& 100 00:00:00,000 --&
היום ה-11 - 13 3 μM CHIR99021, 20 ng/mL BDNF, 0.2 מ"מ חומצה ל' אסקורבית (AA1), 20 ng/mL
GDNF, 1 mM db-cAMP, 1 ng/mL TGFß3, 10 μM DAPT
היום ה-13 - 65 20 ng/mL BDNF, 0.2 מ"מ חומצה אסקורבית (AA1), 20 ng/mL GDNF, 1 mM db-cAMP,
1 ng/mL TGFß3, 10 μM DAPT

טבלה 2: תוספת מולקולה קטנה עבור בידול נוירון דופאמין.

יום KSR בינוני N2 בינוני מדיום בדיל
יום 0 - 1 100% 0 0
היום הראשון - 3 100% 0 0
היום ה-3 - 5 100% 0 0
היום ה- 5 - 7 75% 25% 0
היום ה-7 - 9 50% 50% 0
היום ה-9 - 11 25% 75% 0
היום ה-11 - 13 0 0 100%
היום ה-13 - 65 0 0 100%

טבלה 3: מעבר צבע מדיה עבור בידול נוירון דופאמין.

קובץ משלים 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

אנו מציגים מערכת תרבות תא אוטומטית עם יכולות הדמיה משולבות לסטנדרטיזציה של תרבות hiPSC ובדידול עצבי. בשל התערבות מינימלית של המשתמש, וריאציה ניסיונית היא נמוכה להבטיח שכפול של פנוטיפים תאיים במהלך בידול. מתזמן מבוסס לוח השנה תומך בארגון ובהקבלה מקבילית של ניסויים ומאפשר רמה גבוהה של גמישות בזמן ביצוע הניסויים. ניתן להתאים בקלות שיטות קיימות ותואם את הספקטרום של השיטות הזמינות. בנוסף, ניתן להשתמש במספר גדול של תבניות לוח אסההוספה לגמישות של מערכת זו. המערכת המינימלית המורכבתמאינקובטור CO 2, זרוע רובוטית, ציטומטר תא brightfield, ותחנה לטיפול בנוזלים מהווה את היחידה הבסיסית הדרושה לתרבות ובדידול של hiPSC, עם עלויות סבירות למעבדות מחקר אקדמיות. השילוב של מערכת תרבות התא האוטומטית עם מערכת אחסון אוטומטית של -20 °C לאחסון תרכובות, ספריות RNAi או ספריות CRISPR/Cas9, ושילוב של מיקרוסקופ בעל תוכן גבוה/תפוקה גבוהה מאפשר ביצוע של הקרנות פנוטיפיות.

במחקר הנוכחי, מערכת תרבות התא האוטומטית השתמשה בטיפים חד פעמיים ומדיית התרבות התמלאה מחדש באופן ידני לתוך המאגר, ובכך מגבילה את השימוש בתחנת הטיפול הנוזלי לשינויים בתקשורת ובתהליכי תרבות אחרים במיוחד בן לילה. כדי לעקוף מגבלה זו, ניתן לכוונן את השיטות לשימוש במחטים במקום טיפים חד פעמיים, ולאחר התקנת חיבורי צינור בין קווי מדיה ושקיות מדיה המאוחסנים במקרר, ניתן למלא מחדש באופן אוטומטי מאגרי מדיה עם מדיה טרייה המחממת מראש על ידי רכיבי חימום. פעולה זו תפחית את הפרעות המשתמש הנגרמות על ידי מילוי ידני של עצות, מדיה תרבות וחילופי מאגרים.

מערכת תרבות התא האוטומטית שלנו מציעה מספר יתרונות. אחת מהן היא מערכת המעקב אחר ברקודים. הצלחות שנטענו במערכת מזוהות על ידי ברקוד ייחודי אשר נקרא ושמור על ידי המערכת המאפשר מעקב אחר דגימות במהלך ואחרי ביצוע פעולת השירות. יתרון נוסף הוא האפשרות ליצור פרוייקטים ספציפיים למשתמש. כאן, ניתן להקצות לוחות תרבות הטעונים במערכת לפרוייקט מסוים ולקבוצה בקבוצות. ההתנה בקבוצות מפשטת את הביצוע של אותו הליך לכל הצלחות של אצווה מסוימת מאחר שאין צורך לבחור לוחות בודדים. בנוסף, עורך מחלקה נוזלי מאפשר להתאים את מהירות ההתכונות והגובה, כמו גם את השאיפה וחלוקת פרמטרים עבור כל שלב העברה נוזלית. כל תהליך מתועד בקבצי יומן רישום המאפשר לשחזר אילו משימות בוצעו עבור תרבות נתונה או לוח תסה.

נוירונים וסוגי תאים אחרים הנגזרים מתאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים (hiPSC) שימושיים במבחנה כלים לחקר המנגנונים של מחלות ניווניות באוכלוסיות ספציפיות החולה (למשל נוירונים דופאמין למחלת פרקינסון) מציע את האפשרות להקרנות סמים מותאמות אישית. Culturing hiPSC הוא זמן רב מאוד ודורש אנשים מיומנים לבצע פרוטוקולי בידול מורכבים, בדרך כלל מוגבל לייצור בקנה מידה נמוך. התאמנו את התרבות ללא מאכיל של hiPSC לתרבות אוטומטית ויישמנו שני פרוטוקולי בידול עצבי, פרוטוקול בידול נוירון קליפתי מהיר המבוסס על NGN2 ביטוי יתר תחתמקדם טט על 10,11, ופרוטוקול מבוסס מולקולה קטנה לטווח ארוך לדור של נוירונים דופאמין (mDA) אמצע המוח (mDA)13. ההעברה וההעתקה הפשוטה של פרוטוקולי תרבות ובידול ידניים הופכים את מערכת התרבות האוטומטית לשימושית מאוד. IPSC האנושי תרבותי במערכת תרבות התא האוטומטית הראה מורפולוגיה עקבית של תאי גזע והביע סמנים פלורופוטניים חשובים, לשחזור בין ניסויים עצמאיים. בנוסף, האוטומציה של פרוטוקול תרבות hiPSC העדיפה את התרבות וההרחבה של מספר גדול יותר של קווי תאים במקביל. בדיקות קונפלואנציות אוטומטיות המתוכננות להתבצע במשך הלילה וזמן פנוי, משאירות את המערכת חופשית במהלך היום עבור שלבי תהליך במורד הזרם שבוצעו כאשר המשתמש היה במעבדה (לדוגמה, קצירת תאים או תפרה ידנית עבור בידולים). בהגעה לסף ההתכנסות המוגדר על-ידי המשתמש, התאים מועברים ומרוחים מחדש ללחות חוץ-תאיות מצופים במטריצה הזמינות בערימה של מערכת תרבות התא האוטומטית. כל סיבוב מעבר לוקח כ-70 דקות ויוצר ארבע צלחות באר אחת מצלחת אב אחת, המתורגם לקיבולת של 20 מעברים ביום.

האוטומציה של פרוטוקול ההבידול NGN2 נעשתה בהצלחה ואפשרה לדור של אוכלוסייה הומוגנית של תאים עצביים על פני מעברים שונים ודומה להבדילים ידניים. יתר על כן, העלויות הניסיוניות עבור מחקרי סינון בקנה מידה גדול מעורבים קווי תאים מרובים או ניסויי הקרנה עם אלפי תנאי בדיקה / תרכובות יופחתו בשל בידות מהירות. ניתן לפתח, ליישם ולהשתמש בהם בקלות כקריאות פנוטיפיות למודלים של מחלות, כפי שהראהבעבר 14,15,16. לכן, התאמנו עוד יותר את פרוטוקול NGN2 באמצעות מולקולה קטנה נגזרת תאי מבשר עצבי (smNPC) כי באופן זמני over-express GFP. תאי SmNPC מציעים יתרונות נוספים, כולל עלויות מופחתות עם מדיה תרבות (שליש מהעלות עם תרבות iPSC) וזמן הנדרש כדי להגדיל את הניסויים. תפוקת התא מ smNPC הם 7 עד 10 פעמים גבוה יותר מזה שהושג עם iPSC. נוירונים מבדיל היו בהצלחה במעקב ותמונה במשך כמה ימים באמצעות תהליך הדמיה אוטומטי לחלוטין ללא צורך של כתמי נוגדנים ידניים או תיוג כימי, חיסכון בעלויות ובזמן הנדרש עבור הליכים ידניים כולל ההדמיה בפני עצמו. ההדמיה הנוכחית של 60 בארות פנימיות של צלחת 96-באר לוקח סביב 16 דקות לכל צלחת כאשר 25 שדות לכל באר הם תמונה, מה שאומר כי הנתונים עבור הקרנה מבוססת הדמיה עבור 1000 תרכובות, ניתן לרכוש ולנתח ביום. בעתיד, קריאה זו יכולה לשמש במחקרי סינון מורכבים להצלת פגמים נורייט ים.

יתר על כן, אנו גם להפגין את ההעברה של פרוטוקול בידול ידני ליצירת דופאמין באמצע המוח (mDA) נוירונים מ iPSC. פרוטוקול בידול קטן זה מבוסס מולקולה לוקח 65 ימים והוא עבודה אינטנסיבית בגלל שלבי replating מרובים ושינויים תכופים במדיה, בעיקר כל 2 ימים, אשר מגביל את הייצור של נוירונים MDA כמה קווי iPSC באותו זמן. פרוטוקול בידול MDA האוטומטי יש את היתרון הגדול של שינוי קנה המידה של ההבידול לעשרות קווי iPSC. ניתן להבדיל בין עד 30 קווי תאים במקביל. מכיוון שהבידול מבוסס בעיקר על שינויים בתקשורת, כמעט כל תהליך ההבידול יכול לתנהל ללא התערבות אנושית. באמצעות מתזמן לוח השנה של המערכת האוטומטית, אנו יכולים לתכנן את שינויי המדיה בהתאם לצעדי הבידול. מגבלה אחת של עבודה עם מספר כה גדול של קווי תאים וצלחת תרבות הייתה חוסר האפשרות לבצע שינויים במדיה בן לילה. הסיבה העיקרית היא העובדה שהמערכת שלנו מוגדרת לשימוש בטיפים חד פעמיים ומילוי ידני של מדיה תרבות המחייבת משתמש במעבדה לבצע שלב ידני זה. כדי להקל על תהליך שינוי המדיה, לוחות שנטענו במערכת הוקצו לפרוייקט וקיבלו קיבוץ באצוות. גודל האצווה הותאם לאחר מכן למספר הטיפים החד-פעמיים ונפח המדיה של התרבות הזמינים. כפי שנדון לעיל, מגבלה זו יכולה להתגבר בקלות על ידי יישום של מחטים הניתנות לשטיפה/רחיצה ומילוי אוטומטי של מדיה. מעבר/הפצה אוטומטיים של תאים, כפי שהראה עבור iPSC, היא אחת הנוחיות המוצעות על ידי מערכת תרבות התא האוטומטית שלנו. בדקנו את ההתזה האוטומטית של תאי העצב של משרד העבודה ביום ה-25 של בידול. עם זאת, ניתוק של נוירונים MDA דורש יותר (40 דקות) דגירה עם אנזים דיסוציאציה מאשר iPSC (8 דקות) הרחבת תהליך replating אוטומטי ליותר מ 1 שעה לכל קווי תא. כתוצאה מכך, ההתפלה האוטומטית של 30 קווי תאים באותו יום הפכה לבלתי אפשרית. להאיץ שלבים אחרים במהלך replating אוטומטי (הובלה של צלחות, pipetting) והתאמה של המערכת לשימוש מחטים וקו מדיה שעושה עבודה לילה אפשרי תפתור מגבלה זו. למרות החסרונות, אנחנו יכולים להעביר בהצלחה את הפרוטוקול הידני לבידול אוטומטי של נוירונים MDA לייצר תרבויות עם כמויות משמעותיות של MAP2 (נוירון) ו TH (נוירונים mDA) תאים חיוביים.

ביבדיל עשרות קווי תאי iPSC במקביל הוא עניין רב בפרויקטים לחקור את המנגנונים המולקולריים של מחלות ניווניות, כולל מחלת פרקינסון. עם זאת, להשלים משימות מהר יותר עם פחות שגיאות ובעלויות מופחתות הוא אתגר גדול. בשל האוטומציה של הפרוטוקולים המוצגים כאן (iPSC, smNPC ונוירון MDA), אנחנו יכולים להאיץ, להפחית את העלויות ולהגדיל את הרבייה בפרויקטים שלנו. פיתוח פרויקטים כמו FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) הכוללים מאות קווי תאים של מטופלים מראה צורך בתרבות אוטומטית ובפרוטוקולי בידול. נקודות המבט העתידיות שלנו כוללות העברה של מודלים ידניים של תרבות תאים תלת מימדיים (תלת-ממדיים) למערכת האוטומטית. התאמות מינוריות בהגדרות הגדרת הלוח והשימוש בהתאמאים יאפשרו שימוש בצלחות מסחריות או מותאמות אישית ותאים מיקרו-נוזלים הנדרשים עבור תרבויות תלת-מית-מי-די. יתר על כן, היישום של מודל הדמיה אוטומטי ללא תוויות יאפשר לנו לעקוב אחר הצמיחה העצבית בזמן אמת ולתרגם שינויים בצמיחה neurite, ארגון נוירון ומוות תאים להבנה טובה יותר של מנגנוני המחלה.

Disclosures

אין לנו מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מכירים בהכרת תודה לחולים ומשפחותיהם שתרמו חומר ביולוגי למחקר זה. קווי תאים המשמשים במחקר היו מאוסף NINDS עם Rutgers (ND41865 כמו iPS #1) ואת המעבדה של ד"ר טילו Kunath (iPS #2). עבודה זו נתמכת בחלקה על ידי קרן NOMIS (PH), RiMod-FTD, תוכנית משותפת של האיחוד האירופי - מחקר מחלות ניווניות (JPND) (PH); יוזמת DZNE I2A (AD); PD-Strat, פרויקט במימון ERA-Net ERACoSysMed (PH) ויוזמת הנתונים היסודות למחלת פרקינסון (FOUNDIN-PD) (PH, EB). FOUNDIN-PD היא חלק מתוכנית PATH ל-PD של קרן מייקל ג'יי פוקס. המחברים מודים סטיבן פינקביינר ומלאני קוב (מכוני גלדסטון) על תרומתם להקמת פרוטוקול בידול נוירון MDA ידני ומומי סוזוקי (חברת החשמל יוקוגאווה) לסיוע בהגדרת ניתוח גידול neurite.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies Distributor Catalog Number Dilution
iPSC pluripotency marker
Mouse anti-SSEA4 Abcam ab16287 1 to 33
Rabbit anti-Oct3/4 Abcam ab19857 1 to 200
NGN2 neuron markers
Mouse anti- TUBB3 R & D MAB1195 1 to 500
Rabbit anti-BRN2 NEB 12137 1 to 1,000
mDA neuron markers
Chicken anti-TH Pel-Freez Biologicals 12137 1 to 750
Mouse anti-MAP2 Santa Cruz sc-74421 1 to 750
Secondary antibodies
Goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11039 1 to 2,000
Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11029 1 to 2,000
Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594 Invitrogen A11032 1 to 2,000
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008 1 to 2,000
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008 1 to 2,000
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 594 Invitrogen A11012 1 to 2,000
Nuclei counterstaining
Hoechest 33342 Invitrogen H3570 1 to 8,000
Instruments Distributor Catalog Number Description/Application
Agilent TapeStation system Agilent technologies 4200 Automated electrophoresis
for DNA and RNA samples
Automated -20 °C storage system Hamilton Storage
Technologies		 Sample Access Manager
(SAM -20C, 3200 series)		 Storage of reagents
Barcode reader Honeywell Barcode Reader Orbit Barcode scanner
Brightfield cell cytomat Nexcelom Celigo Confluence check and
cell counting
CellVoyager 7000 Yokogawa CellVoyager 7000 Automated confocal
microscope
Cytomat for cell cultures Thermo Fisher Scientific Cytomat 24 C, CU 12 stackers pitch 28 mm,
12 stackers pitch 23 mm
(total of 456 plates)
Cytomat for thawing samples Thermo Fisher Scientific Cytomat 2-LIN, 60 DU
(Drying Unit)		 2 stackers pitch 28 mm
(total of 42 plates)
HEPA filters Hamilton Robotics Hood Flow Star UV Modified by Hamilton
Robotics
Liquid handling station Hamilton Robotics Microlab Star Channels: 8x 1-ml, 4x 5 ml
and 96 Channel MPH
Media reservoir Hamilton Robotics 188211APE Media/reagents reservoir
Pure water system Veolia Water ELGA PURELAB Classic Provides pure water for
needle wash station
QuantStudio 12K Flex Real-Time
PCR System		 Thermo Fisher Scientific QSTUDIO12KOA Real-time PCR machine
Robotic arm Hamilton Robotics Rackrunner Transport of plates
Turn table Hamilton Robotics Turn Table Adjust plate orientiation
Uninterruptible power supply APC Smart UPS RT Unit,
10000 VA Power supply		 Backup power supply
VIAFLO-pipettes Integra 4500 Electronic pipette
ViiA 7 Real-Time PCR System Applied Biosystems 4453545 Real-time PCR machine
Materials Distributor Catalog Number Notes
1-well culture plate (84 cm2) Thermo Fischer Scientific 165218 Nunc OmniTray
6-well culture plates (9.6 cm2) Greiner Bio-One 657160 TC treated with lid
12-well culture plate (3.9 cm2) Greiner Bio-One 665180 TC treated with lid
96-well culture plate (0.32 cm2) Perkin Elmer 6005558 CellCarrier-96 Black plate
Tips, 50-µL Hamilton Robotics 235987 50-uL tips
Tips, 300-µL Hamilton Robotics 235985 300-µL tips
Tips, 1000-µL Hamilton Robotics 235939 1000-µL tips
Tips, 5-mL Hamilton Robotics 184022 5-mL tips
Tubes, 15-mL Greiner Bio-One 188271 15-mL tubes
Tubes, 50-mL Greiner Bio-One 227261 50-mL tubes
Nalgene cryogenic 2.0 mL vials Sigma Aldrich V5007 Cryovials
Plasmids Distributor Catalog Number Notes
pLV_hEF1a_rtTA3 Addgene 61472 Kind gift from Ron Weiss
pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro Addgene 61474 Kind gift from Ron Weiss
pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus Takara Bio 631983
Primers Sequence (forward) Sequence (reverse) Source
iPSC pluripotency
OCT4 (ID 4505967a1) CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC PrimerBank
NANOG (ID 153945815c3) CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC PrimerBank
REX1 (ID 89179322c1) AGAAACGGGCAAAGACAAGAC GCTGACAGGTTCTATTTCCGC PrimerBank
NGN2 neurons
MAP2 (ID 87578393c1) CTCAGCACCGCTAACAGAGG CATTGGCGCTTCGGACAAG PrimerBank
BRN2 (ID 380254475c1) CGGCGGATCAAACTGGGATTT TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT PrimerBank
CUX2 (ID 291045458c2) CGAGACCTCCACACTTCGTG TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG PrimerBank
NCAM1 (ID 336285437c3) TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC CTCACAGCGATAAGTGCCCTC PrimerBank
SYNAPSIN1 (ID 91984783c3) TGCTCAGCAGTACAACGTACC GACACTTGCGATGTCCTGGAA PrimerBank
mDA neurons
TH CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA NCBI primer-BLAST
MAP2 GGATCAACGGAGAGCTGAC TCAGGACTGCTACAGCCTCA NCBI primer-BLAST
Housekeeping genes
GAPDH GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG GAGCCCCAGCCTTCTCCATG NCBI primer-BLAST
OAZ1 AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT ATGAAGACATGGTCGGCTCG NCBI primer-BLAST
RPLPO CCTCATATCCGGGGGAATGTG GCAGCAGCTGGCACCTTATTG NCBI primer-BLAST
RPL13A GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC NCBI primer-BLAST
Media and Reagents Distributor Catalog Number Use concentration
Coating matrix
Extracellular matrix (Matrigel) Corning 354277 10 μg/mL
Fibronectin Corning 356008 2 μg/mL
Laminin Sigma L2020 5 - 10 μg/mL
Poly-L-Ornithine (PLO) Sigma P3655 0.1 mg/mL
Culture media
iPSC culture medium
(Essential 8 Flex medium)		 Gibco A2858501
NGN2 neurons - NGN2 medium
2-mercaptoethanol Gibco 21985023 0.909 mL (50 µM)
B27 supplement Gibco 12587010 10 mL (1%)
DMEM/F-12, GlutaMAX Gibco 31331093 484.75 mL
GlutaMAX Gibco 35050038 5 mL ( 2 mM)
Insulin Sigma I9278 0.25 mL (2.5 µg/mL)
MEM Non-Essential Amino Acids Gibco 11140050 5 mL (0.5%)
N2 supplement Gibco 17502048 5 mL (0.5%)
Neurobasal medium Gibco 21103049 485 mL
mDA neurons - SRM medium
2-mercaptoethanol Gibco 21985023 0.5 mL (55 µM)
GlutaMAX Gibco 35050038 5 mL (2 mM)
Knockout DMEM/F-12 Gibco 12660012 409.5 mL
Knockout serum replacement
(serum replacement)		 Gibco 10828028 75 mL (15%)
MEM Non-Essential Amino Acids Gibco 11140050 5 mL (1%)
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 5 mL (1%)
mDA neurons - N2 medium
B27 supplement Gibco 12587010 10 mL (2%)
GlutaMAX Gibco 35050038 5 mL (2 mM)
N2 supplement Gibco 17502048 5 mL (1%)
Neurobasal medium Gibco 21103049 475 mL
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 5 mL(1%)
mDA neurons - Differentiation medium
B27 supplement Gibco 12587010 10 mL (2%)
Neurobasal medium Gibco 21103049 485 mL
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 5 mL (1%)
NGN2 neurons - Supplements
Brain-Derived Neurotrophic Factor
(BDNF)		 Peprotech 450-02 10 ng/mL
CHIR99021 (CHIR) R&D 4423/10 2 μM
Doxycyline (dox) Sigma D9891 2.5 μg/mL
Glial-Derived Neurotrophic Factor
(GDNF)		 Peprotech 450-10 10 ng/mL
L-ascorbic acid 2-phosphate
magnesium (AA2)		 Sigma A8960 64 mg/L
Neurotrophic factor-3 (NT-3) Peprotech 450-10 10 ng/mL
Purmorphamine (PMA) Cayman 10009634 0.5 μM
Puromycin Sigma P8833-10MG 0.5 μg/mL
Thiazovivin Merk Millipore 420220-10MG 2 μM
mDA neurons - Supplements
Brain-Derived Neurotrophic Factor
(BDNF)		 Peprotech 450-02 20 ng/mL
CHIR99021 (CHIR) R&D 4423/10 3 μM
DAPT Cayman 13197 10 µM
Dibutyryl-cAMP (db-cAMP) Sigma D0627 1 mM
Fibroblast Growth Factor 8B (FGF-8b) Peprotech 100-25 100 ng/mL
Glial-Derived Neurotrophic Factor
(GDNF)		 Peprotech 450-10 20 ng/mL
L-ascorbic acid (AA1) Sigma A4403 0.2 mM
LDN193189 (LDN) Cayman 11802 100 nM
Purmorphamine (Purm) Cayman 10009634 2 μM
Sonic Hedgehog/Shh (C24II)
N-Terminus (SHH)		 R&D 1845-SH 100 ng/mL
SB431542 (SB) Cayman 13031 10 μM
Transforming Growth Factor type ß3
(TGFß3)		 R&D 243-B3 1 ng/mL
Y-27632 Cayman 10005583 10 µM
Dissociation reagents
Single cell dissociation reagent
(StemPro Accutase)		 Gibco A1110501 1x
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Gibco 11575020 0.5 mM
RNA isolation and cDNA kit
RNA isolation kit Qiagen 74106 Rneasy MiniKit
RNA lysis buffer Thermo Fisher Scientific 15596018 Trizol lysis buffer (RNA
lysis buffer)
Reverse transcriptase (kit) Thermo Fisher Scientific 18080-085 SuperScript III Reverse
Transcriptase
Software Company Catalog Number Description/Application
Cell Culture Framework (CCF)
(Graphical user interface, GUI)		 Hamilton Robotics Custom-made User interface for the automated system
CellPathFinder software
(image analysis software 1)		 Yokogawa CellPathfinder HCS Software Image analysis tool
CellVoyager Measurement System Yokogawa Included with
CellVoyager 7000		 Microscope controlling
software
Columbus software
(image analysis software 2)		 Perkin Elmer Columbus Image analysis tool
Cloud based qPCR app Thermo Fisher Scientific Themo Fisher cloud Analysis software for
qRT-PCR data
Venus software Hamilton Robotics VENUS Two Dynamic
Schedular 5.1 Software		 Controlling software for the
automated system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Payne, N. L., Sylvain, A., O'Brien, C., Herszfeld, D., Sun, G., Bernard, C. C. A. Application of human induced pluripotent stem cells for modeling and treating neurodegenerative diseases. New biotechnology. 32 (1), 212-228 (2015).
  3. Wu, Y. Y., Chiu, F. L., Yeh, C. S., Kuo, H. C. Opportunities and challenges for the use of induced pluripotent stem cells in modelling neurodegenerative disease. Open Biology. 9 (1), 180177 (2019).
  4. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular cell biology. 17 (3), 170-182 (2016).
  5. Jain, S., Heutink, P. From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease. Neuron. 68 (2), 207-217 (2010).
  6. Soares, F. A. C., Chandra, A., Thomas, R. J., Pedersen, R. A., Vallier, L., Williams, D. J. Investigating the feasibility of scale up and automation of human induced pluripotent stem cells cultured in aggregates in feeder free conditions. Journal of biotechnology. 173, 53-58 (2014).
  7. Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific reports. 5, 16647 (2015).
  8. Conway, M. K., et al. Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System. Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52755 (2015).
  9. Paull, D., et al. high-throughput derivation, characterization and differentiation of induced pluripotent stem cells. Nature methods. 12 (9), 885-892 (2015).
  10. Busskamp, V., et al. Rapid neurogenesis through transcriptional activation in human stem cells. Molecular systems biology. 10, 760 (2014).
  11. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  12. Reinhardt, P., et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PloS one. 8 (3), 59252 (2013).
  13. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
  14. Koch, J. C., et al. Alpha-Synuclein affects neurite morphology, autophagy, vesicle transport and axonal degeneration in CNS neurons. Cell death & disease. 6, 1811 (2015).
  15. Korecka, J. A., et al. Neurite Collapse and Altered ER Ca2+ Control in Human Parkinson Disease Patient iPSC-Derived Neurons with LRRK2 G2019S Mutation. Stem cell reports. 12 (1), 29-41 (2019).
  16. Mehta, S. R., et al. Human Huntington's Disease iPSC-Derived Cortical Neurons Display Altered Transcriptomics, Morphology, and Maturation. Cell reports. 25 (4), 1081-1096 (2018).
  17. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC bioinformatics. 13, 134 (2012).
  18. Spandidos, A., Wang, X., Wang, H., Seed, B. PrimerBank: a resource of human and mouse PCR primer pairs for gene expression detection and quantification. Nucleic acids research. 38, Database issue 792 (2010).

Tags

החודש ב JoVE גיליון 162 תרבות תא אוטומטי תאי גזע פלורופוטנטיים המושרה על ידי בני אדם הדמיית תפוקה גבוהה מחלות ניווניות נוירונים קליפתיים ודופאמין
ייצור אוטומטי של נוירונים קורטיים קורטיים ודופאמין נגזר תאי גזע המושרה על ידי תאי גזע אנושיים עם ניטור משולב של תאים חיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dhingra, A., Täger, J.,… More

Dhingra, A., Täger, J., Bressan, E., Rodriguez-Nieto, S., Bedi, M. S., Bröer, S., Sadikoglou, E., Fernandes, N., Castillo-Lizardo, M., Rizzu, P., Heutink, P. Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring. J. Vis. Exp. (162), e61525, doi:10.3791/61525 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter