אנו מראים את האוטומציה של תרבויות תאי גזע פלורופוטנטיים (hiPSC) הנגרמים על ידי בני אדם ובדיונים עצביים התואמים להדמיה וניתוח אוטומטיים.
תרבות ידנית ופרוטוקולי בידול עבור תאי גזע פלורופוטנטיים המושרה על ידי בני אדם (hiPSC) קשים לסטנדרטיזציה, להראות שונות גבוהה ונוטים הבידול ספונטני לסוגי תאים לא רצויים. השיטות הן עתירות עבודה ולא ניתן יהיה להגיע בקלות לניסויים בקנה מידה גדול. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פיתחנו מערכת אוטומטית של תרבות תאים בשילוב מערכת הדמיה בתפוקה גבוהה ויישמנו פרוטוקולים לשמירה על קווי hiPSC מרובים בידול מקביל ונוירונאי. אנו מתארים את האוטומציה של פרוטוקול בידול לטווח קצר באמצעות Neurogenin-2 (NGN2) ביטוי יתר כדי לייצר נוירונים קליפתיים נגזר hiPSC בתוך 6\u20128 ימים, ואת היישום של פרוטוקול בידול לטווח ארוך כדי ליצור hiPSC נגזר midbrain דופאמין נוירונים בתוך 65 ימים. כמו כן, יישמנו את הגישה NGN2 לתאים מבשר עצביים נגזר מולקולה קטנה (smNPC) המושרה עם GFP lentivirus והקמנו תא חי אוטומטי neurite outgrowth assay. אנו מציגים מערכת אוטומטית עם פרוטוקולים המתאימים לתרבות hiPSC שגרתית ובידול לנוירונים קליפתיים ודופאמין. הפלטפורמה שלנו מתאימה לתרבות ללא ידיים לטווח ארוך ולתרכובת מבוססת hiPSC מבוססת תפוקה גבוהה/בעלת תפוקה גבוהה, הקרנות RNAi ו-CRISPR/Cas9 לזיהוי מנגנוני מחלות חדשניים ויעדי סמים.
תאי גזע פלורופוטנטיים המושרה על ידי בני אדם (hiPSC) מתחדשים באופן עצמאי, יכולים להבדיל כמעט בכל סוג תא בוגר. מאפיינים אלה הופכים hiPSC כלי שימושי עבור מידול מחלות במחקר בסיסי וגילוי סמים1. IPSC האנושי שומר על הרקע הגנטי התורם המאפשר נגזרת סוגי תאים רלוונטיים למחלות המושפעים ביותר / מעורבים כמובן המחלה, למשל, תת סוגים עצביים שונים למחלות ניווניות2,3. כמו כן, hiPSC מתגבר על חלק מהמגבלות של בעלי חיים ותאי מודלים ביטוי יתר על ידי מודלים של מחלות בהקשר אנושי ורמות ביטוי חלבון פיזיולוגי, והוכיחו להיות נכס בעל ערך במחלות מידול החל הפרעות מונוגניות, מורכבות ואפיגנטיות, כמו גם מחלותבשלב מאוחר 4.
למרות יתרונות והזדמנויות אלה, מספר מגבלות של hiPSC עדיין צריך להיות מטופל. פרוטוקולי התרבות והבידול הנוכחיים של hiPSC אינם חסכוניים, קשים לסטנדרטיזציה ועתירי עבודה. שלבי תרבות ידניים יכולים לגרום לשונות גבוהה בתשואות ופנוטיפים בשל הבדלים בצמיחה ובדידול ספונטני של hiPSC. לכן, יש להפחית את הווריאציה התלויה בניסוי על-ידי יישום טכניקות טיפול מתוקנות יותר ופשט פרוטוקולים שניתן להשיג באמצעות אוטומציה5. הקמת פרוטוקולי תרבות ובידול אוטומטיים של hiPSC תגדיר סטנדרטים משותפים הן לפרויקטים אקדמיים והן לפרויקטים של מחקר תעשייתי, ותאפשר יצירת מודלים רלוונטיים ביולוגית של מחלות ותוצאות רבות יותר לשחזור.
עבודה קודמת ניסתה אוטומציה של תרבויות hiPSC 6,7,8, אבל הפרוטוקולים שלהם הוגבלו לתבניות ספציפיות של צלחת תרבות תא התלויה במערכת וחוסר יכולתהסתגלותלפורמטים שונים של תבניות ציון. מערכות כאלה שימושיות ב bulking של תאים, אבל לא יכול להיות מתאים בידול אוטומטי לסוגי תאים רצויים, phenotyping מחלה, ותוחלת ההקרנה. בנוסף, פלטפורמה אוטומטית בקנה מידה גדול עבור נגזרת פיברובלסט, דור hiPSCובידול תואר 9 אבל בקנה מידה שניתן להשיג רק על ידי מעבדות בתפוקה גבוהה המוקדש לייצור קווים אשר נראה אטרקטיבי אבל יכול להיות לא סביר עבור מעבדות אקדמיות רבות.
פיתחנו מערכת תרבות תא אוטומטית לחלוטין המבוססת על תחנת טיפול בנוזלים בסביבה מסוננת של חלקיקולט (HEPA) עם אינקובטור CO2 בעל קיבולת גדולה, ציטומטר הדמיה בשדה בהיר וזרוע רובוטית להובלת לוחות. רכיבים אלה מספקים את הבסיס לתרבות ובידול של hiPSC יציבים ותו לא. השלמנו את המערכת עם מערכת אחסון אוטומטית של -20°C לאחסון מורכב או וירוסים ותמונה במהירות גבוהה של תא חי בדיסק מסתובב. פרוטוקולים מותאמים אישית נוצרו המאפשרים זריעת תאים אוטומטית, שינויי מדיה, בדיקות קונפלואנציות, הרחבת תאים ויצירת לוחות תסה עם טיפול לדוגמה והדמיית לוח, מה שהופך את המערכת תואמת להקרנות בתפוקה גבוהה/בתפוקה גבוהה. מערכת תרבות התאים וההדמיה האוטומטית מופעלת באמצעות תוכנת השליטה וממשק המשתמש הגרפי (GUI) בהתאמה אישית. ה- GUI מאפשר למשתמשים לייבא קבצי CSV המכילים פרמטרים ספציפיים לקו התא הדרושים לביצוע פעולת שירות. בנוסף, GUI מאפשר לתזמן ניסויים רבים בכל רצף באמצעות תצוגת לוח השנה המוכלל ובכך מאפשר שליטה מלאה של הזמן שבו כל שיטה מתחילה.
מערכת תרבות התאים האוטומטית שלנו משתמשת במהירויות צנרת מתוקנן, זמני מעבר, סף confluency, צפיפויות זריעה, ונפחים בינוניים עם הגמישות לתאי תרבות במגוון פורמטים של לוחות (96-, 48-, 24-, 12-, 6- או 1-פורמט צלחת). התאמנו פרוטוקול בידול לטווח קצר שפורסם לאחרונה להמרת hiPSC לנוירונים שיכולים להניב TUBB3 נוירונים חיוביים ב 6 ימים10,11. הקמנו גם את ההבידול האוטומטי וההדמיה של מולקולה קטנה תאים מבשר עצביים (smNPC) לתוך נוירונים constitutivetiveing GFP תחת EF1aמקדם 12 ו iPSC לתוך דופאמין באמצע המוח (mDA) נוירונים, התאמת פרוטוקול עיכוב SMAD כפולשפורסם בעבר 13 המניב נוירונים mDA בתוך 65 ימים.
אנו מציגים מערכת תרבות תא אוטומטית עם יכולות הדמיה משולבות לסטנדרטיזציה של תרבות hiPSC ובדידול עצבי. בשל התערבות מינימלית של המשתמש, וריאציה ניסיונית היא נמוכה להבטיח שכפול של פנוטיפים תאיים במהלך בידול. מתזמן מבוסס לוח השנה תומך בארגון ובהקבלה מקבילית של ניסויים ומאפשר רמה גבוהה של גמישות בזמן ביצוע הניסויים. ניתן להתאים בקלות שיטות קיימות ותואם את הספקטרום של השיטות הזמינות. בנוסף, ניתן להשתמש במספר גדול של תבניות לוח אסההוספה לגמישות של מערכת זו. המערכת המינימלית המורכבתמאינקובטור CO 2, זרוע רובוטית, ציטומטר תא brightfield, ותחנה לטיפול בנוזלים מהווה את היחידה הבסיסית הדרושה לתרבות ובדידול של hiPSC, עם עלויות סבירות למעבדות מחקר אקדמיות. השילוב של מערכת תרבות התא האוטומטית עם מערכת אחסון אוטומטית של -20 °C לאחסון תרכובות, ספריות RNAi או ספריות CRISPR/Cas9, ושילוב של מיקרוסקופ בעל תוכן גבוה/תפוקה גבוהה מאפשר ביצוע של הקרנות פנוטיפיות.
במחקר הנוכחי, מערכת תרבות התא האוטומטית השתמשה בטיפים חד פעמיים ומדיית התרבות התמלאה מחדש באופן ידני לתוך המאגר, ובכך מגבילה את השימוש בתחנת הטיפול הנוזלי לשינויים בתקשורת ובתהליכי תרבות אחרים במיוחד בן לילה. כדי לעקוף מגבלה זו, ניתן לכוונן את השיטות לשימוש במחטים במקום טיפים חד פעמיים, ולאחר התקנת חיבורי צינור בין קווי מדיה ושקיות מדיה המאוחסנים במקרר, ניתן למלא מחדש באופן אוטומטי מאגרי מדיה עם מדיה טרייה המחממת מראש על ידי רכיבי חימום. פעולה זו תפחית את הפרעות המשתמש הנגרמות על ידי מילוי ידני של עצות, מדיה תרבות וחילופי מאגרים.
מערכת תרבות התא האוטומטית שלנו מציעה מספר יתרונות. אחת מהן היא מערכת המעקב אחר ברקודים. הצלחות שנטענו במערכת מזוהות על ידי ברקוד ייחודי אשר נקרא ושמור על ידי המערכת המאפשר מעקב אחר דגימות במהלך ואחרי ביצוע פעולת השירות. יתרון נוסף הוא האפשרות ליצור פרוייקטים ספציפיים למשתמש. כאן, ניתן להקצות לוחות תרבות הטעונים במערכת לפרוייקט מסוים ולקבוצה בקבוצות. ההתנה בקבוצות מפשטת את הביצוע של אותו הליך לכל הצלחות של אצווה מסוימת מאחר שאין צורך לבחור לוחות בודדים. בנוסף, עורך מחלקה נוזלי מאפשר להתאים את מהירות ההתכונות והגובה, כמו גם את השאיפה וחלוקת פרמטרים עבור כל שלב העברה נוזלית. כל תהליך מתועד בקבצי יומן רישום המאפשר לשחזר אילו משימות בוצעו עבור תרבות נתונה או לוח תסה.
נוירונים וסוגי תאים אחרים הנגזרים מתאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים (hiPSC) שימושיים במבחנה כלים לחקר המנגנונים של מחלות ניווניות באוכלוסיות ספציפיות החולה (למשל נוירונים דופאמין למחלת פרקינסון) מציע את האפשרות להקרנות סמים מותאמות אישית. Culturing hiPSC הוא זמן רב מאוד ודורש אנשים מיומנים לבצע פרוטוקולי בידול מורכבים, בדרך כלל מוגבל לייצור בקנה מידה נמוך. התאמנו את התרבות ללא מאכיל של hiPSC לתרבות אוטומטית ויישמנו שני פרוטוקולי בידול עצבי, פרוטוקול בידול נוירון קליפתי מהיר המבוסס על NGN2 ביטוי יתר תחתמקדם טט על 10,11, ופרוטוקול מבוסס מולקולה קטנה לטווח ארוך לדור של נוירונים דופאמין (mDA) אמצע המוח (mDA)13. ההעברה וההעתקה הפשוטה של פרוטוקולי תרבות ובידול ידניים הופכים את מערכת התרבות האוטומטית לשימושית מאוד. IPSC האנושי תרבותי במערכת תרבות התא האוטומטית הראה מורפולוגיה עקבית של תאי גזע והביע סמנים פלורופוטניים חשובים, לשחזור בין ניסויים עצמאיים. בנוסף, האוטומציה של פרוטוקול תרבות hiPSC העדיפה את התרבות וההרחבה של מספר גדול יותר של קווי תאים במקביל. בדיקות קונפלואנציות אוטומטיות המתוכננות להתבצע במשך הלילה וזמן פנוי, משאירות את המערכת חופשית במהלך היום עבור שלבי תהליך במורד הזרם שבוצעו כאשר המשתמש היה במעבדה (לדוגמה, קצירת תאים או תפרה ידנית עבור בידולים). בהגעה לסף ההתכנסות המוגדר על-ידי המשתמש, התאים מועברים ומרוחים מחדש ללחות חוץ-תאיות מצופים במטריצה הזמינות בערימה של מערכת תרבות התא האוטומטית. כל סיבוב מעבר לוקח כ-70 דקות ויוצר ארבע צלחות באר אחת מצלחת אב אחת, המתורגם לקיבולת של 20 מעברים ביום.
האוטומציה של פרוטוקול ההבידול NGN2 נעשתה בהצלחה ואפשרה לדור של אוכלוסייה הומוגנית של תאים עצביים על פני מעברים שונים ודומה להבדילים ידניים. יתר על כן, העלויות הניסיוניות עבור מחקרי סינון בקנה מידה גדול מעורבים קווי תאים מרובים או ניסויי הקרנה עם אלפי תנאי בדיקה / תרכובות יופחתו בשל בידות מהירות. ניתן לפתח, ליישם ולהשתמש בהם בקלות כקריאות פנוטיפיות למודלים של מחלות, כפי שהראהבעבר 14,15,16. לכן, התאמנו עוד יותר את פרוטוקול NGN2 באמצעות מולקולה קטנה נגזרת תאי מבשר עצבי (smNPC) כי באופן זמני over-express GFP. תאי SmNPC מציעים יתרונות נוספים, כולל עלויות מופחתות עם מדיה תרבות (שליש מהעלות עם תרבות iPSC) וזמן הנדרש כדי להגדיל את הניסויים. תפוקת התא מ smNPC הם 7 עד 10 פעמים גבוה יותר מזה שהושג עם iPSC. נוירונים מבדיל היו בהצלחה במעקב ותמונה במשך כמה ימים באמצעות תהליך הדמיה אוטומטי לחלוטין ללא צורך של כתמי נוגדנים ידניים או תיוג כימי, חיסכון בעלויות ובזמן הנדרש עבור הליכים ידניים כולל ההדמיה בפני עצמו. ההדמיה הנוכחית של 60 בארות פנימיות של צלחת 96-באר לוקח סביב 16 דקות לכל צלחת כאשר 25 שדות לכל באר הם תמונה, מה שאומר כי הנתונים עבור הקרנה מבוססת הדמיה עבור 1000 תרכובות, ניתן לרכוש ולנתח ביום. בעתיד, קריאה זו יכולה לשמש במחקרי סינון מורכבים להצלת פגמים נורייט ים.
יתר על כן, אנו גם להפגין את ההעברה של פרוטוקול בידול ידני ליצירת דופאמין באמצע המוח (mDA) נוירונים מ iPSC. פרוטוקול בידול קטן זה מבוסס מולקולה לוקח 65 ימים והוא עבודה אינטנסיבית בגלל שלבי replating מרובים ושינויים תכופים במדיה, בעיקר כל 2 ימים, אשר מגביל את הייצור של נוירונים MDA כמה קווי iPSC באותו זמן. פרוטוקול בידול MDA האוטומטי יש את היתרון הגדול של שינוי קנה המידה של ההבידול לעשרות קווי iPSC. ניתן להבדיל בין עד 30 קווי תאים במקביל. מכיוון שהבידול מבוסס בעיקר על שינויים בתקשורת, כמעט כל תהליך ההבידול יכול לתנהל ללא התערבות אנושית. באמצעות מתזמן לוח השנה של המערכת האוטומטית, אנו יכולים לתכנן את שינויי המדיה בהתאם לצעדי הבידול. מגבלה אחת של עבודה עם מספר כה גדול של קווי תאים וצלחת תרבות הייתה חוסר האפשרות לבצע שינויים במדיה בן לילה. הסיבה העיקרית היא העובדה שהמערכת שלנו מוגדרת לשימוש בטיפים חד פעמיים ומילוי ידני של מדיה תרבות המחייבת משתמש במעבדה לבצע שלב ידני זה. כדי להקל על תהליך שינוי המדיה, לוחות שנטענו במערכת הוקצו לפרוייקט וקיבלו קיבוץ באצוות. גודל האצווה הותאם לאחר מכן למספר הטיפים החד-פעמיים ונפח המדיה של התרבות הזמינים. כפי שנדון לעיל, מגבלה זו יכולה להתגבר בקלות על ידי יישום של מחטים הניתנות לשטיפה/רחיצה ומילוי אוטומטי של מדיה. מעבר/הפצה אוטומטיים של תאים, כפי שהראה עבור iPSC, היא אחת הנוחיות המוצעות על ידי מערכת תרבות התא האוטומטית שלנו. בדקנו את ההתזה האוטומטית של תאי העצב של משרד העבודה ביום ה-25 של בידול. עם זאת, ניתוק של נוירונים MDA דורש יותר (40 דקות) דגירה עם אנזים דיסוציאציה מאשר iPSC (8 דקות) הרחבת תהליך replating אוטומטי ליותר מ 1 שעה לכל קווי תא. כתוצאה מכך, ההתפלה האוטומטית של 30 קווי תאים באותו יום הפכה לבלתי אפשרית. להאיץ שלבים אחרים במהלך replating אוטומטי (הובלה של צלחות, pipetting) והתאמה של המערכת לשימוש מחטים וקו מדיה שעושה עבודה לילה אפשרי תפתור מגבלה זו. למרות החסרונות, אנחנו יכולים להעביר בהצלחה את הפרוטוקול הידני לבידול אוטומטי של נוירונים MDA לייצר תרבויות עם כמויות משמעותיות של MAP2 (נוירון) ו TH (נוירונים mDA) תאים חיוביים.
ביבדיל עשרות קווי תאי iPSC במקביל הוא עניין רב בפרויקטים לחקור את המנגנונים המולקולריים של מחלות ניווניות, כולל מחלת פרקינסון. עם זאת, להשלים משימות מהר יותר עם פחות שגיאות ובעלויות מופחתות הוא אתגר גדול. בשל האוטומציה של הפרוטוקולים המוצגים כאן (iPSC, smNPC ונוירון MDA), אנחנו יכולים להאיץ, להפחית את העלויות ולהגדיל את הרבייה בפרויקטים שלנו. פיתוח פרויקטים כמו FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) הכוללים מאות קווי תאים של מטופלים מראה צורך בתרבות אוטומטית ובפרוטוקולי בידול. נקודות המבט העתידיות שלנו כוללות העברה של מודלים ידניים של תרבות תאים תלת מימדיים (תלת-ממדיים) למערכת האוטומטית. התאמות מינוריות בהגדרות הגדרת הלוח והשימוש בהתאמאים יאפשרו שימוש בצלחות מסחריות או מותאמות אישית ותאים מיקרו-נוזלים הנדרשים עבור תרבויות תלת-מית-מי-די. יתר על כן, היישום של מודל הדמיה אוטומטי ללא תוויות יאפשר לנו לעקוב אחר הצמיחה העצבית בזמן אמת ולתרגם שינויים בצמיחה neurite, ארגון נוירון ומוות תאים להבנה טובה יותר של מנגנוני המחלה.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מכירים בהכרת תודה לחולים ומשפחותיהם שתרמו חומר ביולוגי למחקר זה. קווי תאים המשמשים במחקר היו מאוסף NINDS עם Rutgers (ND41865 כמו iPS #1) ואת המעבדה של ד”ר טילו Kunath (iPS #2). עבודה זו נתמכת בחלקה על ידי קרן NOMIS (PH), RiMod-FTD, תוכנית משותפת של האיחוד האירופי – מחקר מחלות ניווניות (JPND) (PH); יוזמת DZNE I2A (AD); PD-Strat, פרויקט במימון ERA-Net ERACoSysMed (PH) ויוזמת הנתונים היסודות למחלת פרקינסון (FOUNDIN-PD) (PH, EB). FOUNDIN-PD היא חלק מתוכנית PATH ל-PD של קרן מייקל ג’יי פוקס. המחברים מודים סטיבן פינקביינר ומלאני קוב (מכוני גלדסטון) על תרומתם להקמת פרוטוקול בידול נוירון MDA ידני ומומי סוזוקי (חברת החשמל יוקוגאווה) לסיוע בהגדרת ניתוח גידול neurite.
Antibodies | Distributor | Catalog Number | Dilution |
iPSC pluripotency marker | |||
Mouse anti-SSEA4 | Abcam | ab16287 | 1 to 33 |
Rabbit anti-Oct3/4 | Abcam | ab19857 | 1 to 200 |
NGN2 neuron markers | |||
Mouse anti- TUBB3 | R & D | MAB1195 | 1 to 500 |
Rabbit anti-BRN2 | NEB | 12137 | 1 to 1,000 |
mDA neuron markers | |||
Chicken anti-TH | Pel-Freez Biologicals | 12137 | 1 to 750 |
Mouse anti-MAP2 | Santa Cruz | sc-74421 | 1 to 750 |
Secondary antibodies | |||
Goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11039 | 1 to 2,000 |
Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | 1 to 2,000 |
Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | 1 to 2,000 |
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1 to 2,000 |
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1 to 2,000 |
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | 1 to 2,000 |
Nuclei counterstaining | |||
Hoechest 33342 | Invitrogen | H3570 | 1 to 8,000 |
Instruments | Distributor | Catalog Number | Description/Application |
Agilent TapeStation system | Agilent technologies | 4200 | Automated electrophoresis for DNA and RNA samples |
Automated -20 °C storage system | Hamilton Storage Technologies |
Sample Access Manager (SAM -20C, 3200 series) |
Storage of reagents |
Barcode reader | Honeywell | Barcode Reader Orbit | Barcode scanner |
Brightfield cell cytomat | Nexcelom | Celigo | Confluence check and cell counting |
CellVoyager 7000 | Yokogawa | CellVoyager 7000 | Automated confocal microscope |
Cytomat for cell cultures | Thermo Fisher Scientific | Cytomat 24 C, CU | 12 stackers pitch 28 mm, 12 stackers pitch 23 mm (total of 456 plates) |
Cytomat for thawing samples | Thermo Fisher Scientific | Cytomat 2-LIN, 60 DU (Drying Unit) |
2 stackers pitch 28 mm (total of 42 plates) |
HEPA filters | Hamilton Robotics | Hood Flow Star UV | Modified by Hamilton Robotics |
Liquid handling station | Hamilton Robotics | Microlab Star | Channels: 8x 1-ml, 4x 5 ml and 96 Channel MPH |
Media reservoir | Hamilton Robotics | 188211APE | Media/reagents reservoir |
Pure water system | Veolia Water | ELGA PURELAB Classic | Provides pure water for needle wash station |
QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System |
Thermo Fisher Scientific | QSTUDIO12KOA | Real-time PCR machine |
Robotic arm | Hamilton Robotics | Rackrunner | Transport of plates |
Turn table | Hamilton Robotics | Turn Table | Adjust plate orientiation |
Uninterruptible power supply | APC | Smart UPS RT Unit, 10000 VA Power supply |
Backup power supply |
VIAFLO-pipettes | Integra | 4500 | Electronic pipette |
ViiA 7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4453545 | Real-time PCR machine |
Materials | Distributor | Catalog Number | Notes |
1-well culture plate (84 cm2) | Thermo Fischer Scientific | 165218 | Nunc OmniTray |
6-well culture plates (9.6 cm2) | Greiner Bio-One | 657160 | TC treated with lid |
12-well culture plate (3.9 cm2) | Greiner Bio-One | 665180 | TC treated with lid |
96-well culture plate (0.32 cm2) | Perkin Elmer | 6005558 | CellCarrier-96 Black plate |
Tips, 50-µL | Hamilton Robotics | 235987 | 50-uL tips |
Tips, 300-µL | Hamilton Robotics | 235985 | 300-µL tips |
Tips, 1000-µL | Hamilton Robotics | 235939 | 1000-µL tips |
Tips, 5-mL | Hamilton Robotics | 184022 | 5-mL tips |
Tubes, 15-mL | Greiner Bio-One | 188271 | 15-mL tubes |
Tubes, 50-mL | Greiner Bio-One | 227261 | 50-mL tubes |
Nalgene cryogenic 2.0 mL vials | Sigma Aldrich | V5007 | Cryovials |
Plasmids | Distributor | Catalog Number | Notes |
pLV_hEF1a_rtTA3 | Addgene | 61472 | Kind gift from Ron Weiss |
pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro | Addgene | 61474 | Kind gift from Ron Weiss |
pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus | Takara Bio | 631983 | |
Primers | Sequence (forward) | Sequence (reverse) | Source |
iPSC pluripotency | |||
OCT4 (ID 4505967a1) | CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG | GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC | PrimerBank |
NANOG (ID 153945815c3) | CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA | CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC | PrimerBank |
REX1 (ID 89179322c1) | AGAAACGGGCAAAGACAAGAC | GCTGACAGGTTCTATTTCCGC | PrimerBank |
NGN2 neurons | |||
MAP2 (ID 87578393c1) | CTCAGCACCGCTAACAGAGG | CATTGGCGCTTCGGACAAG | PrimerBank |
BRN2 (ID 380254475c1) | CGGCGGATCAAACTGGGATTT | TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT | PrimerBank |
CUX2 (ID 291045458c2) | CGAGACCTCCACACTTCGTG | TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG | PrimerBank |
NCAM1 (ID 336285437c3) | TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC | CTCACAGCGATAAGTGCCCTC | PrimerBank |
SYNAPSIN1 (ID 91984783c3) | TGCTCAGCAGTACAACGTACC | GACACTTGCGATGTCCTGGAA | PrimerBank |
mDA neurons | |||
TH | CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA | CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA | NCBI primer-BLAST |
MAP2 | GGATCAACGGAGAGCTGAC | TCAGGACTGCTACAGCCTCA | NCBI primer-BLAST |
Housekeeping genes | |||
GAPDH | GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG | GAGCCCCAGCCTTCTCCATG | NCBI primer-BLAST |
OAZ1 | AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT | ATGAAGACATGGTCGGCTCG | NCBI primer-BLAST |
RPLPO | CCTCATATCCGGGGGAATGTG | GCAGCAGCTGGCACCTTATTG | NCBI primer-BLAST |
RPL13A | GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC | TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC | NCBI primer-BLAST |
Media and Reagents | Distributor | Catalog Number | Use concentration |
Coating matrix | |||
Extracellular matrix (Matrigel) | Corning | 354277 | 10 μg/mL |
Fibronectin | Corning | 356008 | 2 μg/mL |
Laminin | Sigma | L2020 | 5 – 10 μg/mL |
Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | P3655 | 0.1 mg/mL |
Culture media | |||
iPSC culture medium (Essential 8 Flex medium) |
Gibco | A2858501 | |
NGN2 neurons – NGN2 medium | |||
2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 0.909 mL (50 µM) |
B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (1%) |
DMEM/F-12, GlutaMAX | Gibco | 31331093 | 484.75 mL |
GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL ( 2 mM) |
Insulin | Sigma | I9278 | 0.25 mL (2.5 µg/mL) |
MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140050 | 5 mL (0.5%) |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | 5 mL (0.5%) |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 485 mL |
mDA neurons – SRM medium | |||
2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 0.5 mL (55 µM) |
GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL (2 mM) |
Knockout DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | 409.5 mL |
Knockout serum replacement (serum replacement) |
Gibco | 10828028 | 75 mL (15%) |
MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140050 | 5 mL (1%) |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL (1%) |
mDA neurons – N2 medium | |||
B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (2%) |
GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL (2 mM) |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | 5 mL (1%) |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 475 mL |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL(1%) |
mDA neurons – Differentiation medium | |||
B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (2%) |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 485 mL |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL (1%) |
NGN2 neurons – Supplements | |||
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) |
Peprotech | 450-02 | 10 ng/mL |
CHIR99021 (CHIR) | R&D | 4423/10 | 2 μM |
Doxycyline (dox) | Sigma | D9891 | 2.5 μg/mL |
Glial-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) |
Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL |
L-ascorbic acid 2-phosphate magnesium (AA2) |
Sigma | A8960 | 64 mg/L |
Neurotrophic factor-3 (NT-3) | Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL |
Purmorphamine (PMA) | Cayman | 10009634 | 0.5 μM |
Puromycin | Sigma | P8833-10MG | 0.5 μg/mL |
Thiazovivin | Merk Millipore | 420220-10MG | 2 μM |
mDA neurons – Supplements | |||
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) |
Peprotech | 450-02 | 20 ng/mL |
CHIR99021 (CHIR) | R&D | 4423/10 | 3 μM |
DAPT | Cayman | 13197 | 10 µM |
Dibutyryl-cAMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | 1 mM |
Fibroblast Growth Factor 8B (FGF-8b) | Peprotech | 100-25 | 100 ng/mL |
Glial-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) |
Peprotech | 450-10 | 20 ng/mL |
L-ascorbic acid (AA1) | Sigma | A4403 | 0.2 mM |
LDN193189 (LDN) | Cayman | 11802 | 100 nM |
Purmorphamine (Purm) | Cayman | 10009634 | 2 μM |
Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus (SHH) |
R&D | 1845-SH | 100 ng/mL |
SB431542 (SB) | Cayman | 13031 | 10 μM |
Transforming Growth Factor type ß3 (TGFß3) |
R&D | 243-B3 | 1 ng/mL |
Y-27632 | Cayman | 10005583 | 10 µM |
Dissociation reagents | |||
Single cell dissociation reagent (StemPro Accutase) |
Gibco | A1110501 | 1x |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Gibco | 11575020 | 0.5 mM |
RNA isolation and cDNA kit | |||
RNA isolation kit | Qiagen | 74106 | Rneasy MiniKit |
RNA lysis buffer | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | Trizol lysis buffer (RNA lysis buffer) |
Reverse transcriptase (kit) | Thermo Fisher Scientific | 18080-085 | SuperScript III Reverse Transcriptase |
Software | Company | Catalog Number | Description/Application |
Cell Culture Framework (CCF) (Graphical user interface, GUI) |
Hamilton Robotics | Custom-made | User interface for the automated system |
CellPathFinder software (image analysis software 1) |
Yokogawa | CellPathfinder HCS Software | Image analysis tool |
CellVoyager Measurement System | Yokogawa | Included with CellVoyager 7000 |
Microscope controlling software |
Columbus software (image analysis software 2) |
Perkin Elmer | Columbus | Image analysis tool |
Cloud based qPCR app | Thermo Fisher Scientific | Themo Fisher cloud | Analysis software for qRT-PCR data |
Venus software | Hamilton Robotics | VENUS Two Dynamic Schedular 5.1 Software |
Controlling software for the automated system |