Mostriamo l’automazione delle colture di cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (hiPSC) e delle differenziazioni neuronali compatibili con l’imaging e l’analisi automatizzati.
I protocolli manuali di coltura e differenziazione per le cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (hiPSC) sono difficili da standardizzare, mostrano un’elevata variabilità e sono soggetti a differenziazione spontanea in tipi di cellule indesiderate. I metodi sono ad alta intensità di lavoro e non sono facilmente suscettibili a esperimenti su larga scala. Per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato un sistema automatizzato di coltura cellulare accoppiato a un sistema di imaging ad alta produttività e implementato protocolli per mantenere più linee hiPSC in differenziazione parallela e neuronale. Descriviamo l’automazione di un protocollo di differenziazione a breve termine utilizzando l’espressione sovra-espressione Neurogenin-2 (NGN2) per produrre neuroni corticali derivati dall’hiPSC entro 6\u20128 giorni e l’implementazione di un protocollo di differenziazione a lungo termine per generare neuroni dopaminergici midbrain (mDA) derivati dall’hiPSC entro 65 giorni. Inoltre, abbiamo applicato l’approccio NGN2 a una piccola molecola di cellule precursori neurali derivate (smNPC) trasdotto con lentivirus GFP e stabilito un saggio di crescita automatica della neurite a cellule vive. Presentiamo un sistema automatizzato con protocolli adatti alla coltura hiPSC di routine e alla differenziazione in neuroni corticali e dopaminergici. La nostra piattaforma è adatta per la cultura a lungo termine a mani libere e gli screening a base di hiPSC ad alto contenuto / alta produttività, RNAi e CRISPR / Cas9 per identificare nuovi meccanismi di malattia e obiettivi farmacologici.
Le cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (hiPSC) si rinnovano e possono differenziarsi in quasi tutti i tipi di cellule adulte. Queste caratteristiche rendono l’hiPSC uno strumento utile per la modellazione delle malattie nella ricerca di base e nella scoperta difarmaci 1. L’iPSC umano mantiene il background genetico del donatore che consente di derivare tipi cellulari rilevanti per la malattia che sono più colpiti / coinvolti nel decorso della malattia, ad esempio diversi sottotipi neuronali per le malattie neurodegenerative2,3. Inoltre, hiPSC supera alcuni dei limiti dei modelli di sovra-espressione animale e cellulare modellando le malattie in un contesto umano e i livelli fisiologici di espressione proteica e si sono dimostrati una risorsa preziosa nella modellazione di malattie che vanno da disturbi monogenici, complessi ed epigenetici, nonché malattie ad esordio tardivo4.
Nonostante questi vantaggi e opportunità, diverse limitazioni dell’hiPSC devono ancora essere affrontate. Gli attuali protocolli di coltura e differenziazione hiPSC non sono convenienti, difficili da standardizzare e richiedono molto lavoro. Le fasi manuali della coltura possono comportare un’elevata variabilità nei rendimenti e nei fenotipi a causa delle differenze di crescita e differenziazione spontanea dell’hiPSC. Pertanto, la variazione dipendente dallo sperimentatore deve essere ridotta implementando tecniche di movimentazione più standardizzate e semplificando i protocolli che possono essere ottenuti utilizzando l’automazione5. L’istituzione di protocolli automatizzati di cultura e differenziazione hiPSC stabiliremo standard comuni per progetti di ricerca accademica e industriale e consentiranno la generazione di modelli di malattia biologicamente rilevanti e risultati più riproducibili.
Lavori precedenti hanno tentato l’automazione delle colture hiPSC6,7,8 mai loro protocolli sono stati limitati a specifici formati di lastre di coltura cellulare dipendenti dal sistema e privi di adattabilità ai diversi formati di dosaggio. Tali sistemi sono utili nella carica di cellule, ma potrebbero non essere adatti per la differenziazione automatizzata nei tipi di cellule desiderati, fenotipizzazione delle malattie e scopi di screening. Inoltre, è stata descritta una piattaforma automatizzata su larga scala per la derivazione, la generazione e la differenziazione dei fibroblasti9, ma su una scala che può essere raggiunta solo da laboratori ad alta produttività dedicati alla produzione di linee che sembrano attraenti ma possono essere inaccessibili per molti laboratori accademici.
Abbiamo sviluppato un sistema di coltura cellulare completamente automatizzato basato su una stazione di movimentazione dei liquidi in un ambiente filtrato hepa (High-Efficiency Particulate Air) in combinazione con un incubatore di CO 2 digrande capacità, un citometro di imaging a campo brillante e un braccio robotico per il trasporto delle lastre. Questi componenti forniscono la base per una coltura e una differenziazione hiPSC stabili e riproducibili. Abbiamo integrato il sistema con un sistema di archiviazione automatizzato a -20 °C per lo stoccaggio di composti o virus e un imager a celle vive confocale a disco rotante ad alta velocità. Sono stati generati protocolli su misura che consentono il seeding automatico delle cellule, le modifiche dei supporti, i controlli di confluenza, l’espansione delle celle e la generazione di lastre di dosaggio con il trattamento del campione e l’imaging delle lastre, rendendo il sistema compatibile con screening ad alto contenuto / ad alta produttività. La coltura cellulare automatizzata e il sistema di imaging sono gestiti utilizzando il software di controllo e l’interfaccia utente grafica (GUI) su misura. La GUI consente agli utenti di importare file CSV contenenti parametri specifici della riga di cella necessari per l’esecuzione del metodo. Inoltre, la GUI consente di pianificare numerosi esperimenti in qualsiasi sequenza utilizzando la visualizzazione calendario integrata, consentendo così il pieno controllo del tempo di avvio di ogni metodo.
Il nostro sistema automatizzato di coltura cellulare utilizza velocità di pipettaggio standardizzate, tempi di passaging, soglie di confluenza, densità di semina e volumi medi con la flessibilità di coltura delle celle in una varietà di formati di piastre (formato piastra da 96, 48, 24, 12, 6 o 1 pozzo). Abbiamo adattato un protocollo di differenziazione a breve termine recentemente pubblicato per convertire hiPSC in neuroni in grado di produrre neuroni positivi TUBB3 in 6giorni 10,11. Abbiamo anche stabilito la differenziazione automatizzata e l’imaging delle cellule precursori neurali di piccole molecole (smNPC) in neuroni che esprimono costitutivamente GFP sotto il promotore EF1a12 e iPSC nei neuroni dopaminergici midbrain (mDA), adattando un protocollo di inibizione dual-SMADprecedentemente pubblicato 13 che produce neuroni mDA entro 65 giorni.
Introduciamo un sistema automatizzato di coltura cellulare con capacità di imaging integrate per la standardizzazione della coltura hiPSC e della differenziazione neuronale. A causa del minimo intervento dell’utente, la variazione sperimentale è bassa garantendo la riproducibilità dei fenotipi cellulari durante la differenziazione. L’utilità di pianificazione basata sul calendario supporta l’organizzazione e la parallelizzazione degli esperimenti e consente un alto grado di flessibilità nel momento in cui vengono eseguiti gli esperimenti. I metodi esistenti possono essere facilmente adattati e lo spettro dei metodi disponibili può essere aumentato. Inoltre, è possibile utilizzare un gran numero di formati di lastre di dosaggio che aumentano la flessibilità di questo sistema. Il sistema minimo costituito da un incubatore di CO2, un braccio robotico, un citometro a celle a campo luminoso e una stazione di movimentazione dei liquidi forma l’unità di base necessaria per la cultura e la differenziazione hiPSC, con costi accessibili per i laboratori di ricerca accademici. La combinazione del sistema automatizzato di coltura cellulare con un sistema di archiviazione automatizzato -20 °C per lo stoccaggio di composti, librerie RNAi o librerie CRISPR /Cas9 e l’integrazione di un microscopio ad alto contenuto / alta produttività consentono l’esecuzione di screening fenotipici.
Nello studio attuale, il sistema automatizzato di coltura cellulare utilizzava punte usa e getta e i supporti di coltura sono stati riempiti manualmente nel serbatoio, limitando così l’uso della stazione di movimentazione dei liquidi per i cambiamenti dei supporti e altri processi di coltura, specialmente durante la notte. Per aggirare questa limitazione, i metodi possono essere regolati in base all’utilizzo dell’ago anziché alle punte usa e getta e, dopo aver installato i collegamenti dei tubi tra le linee dei supporti e i sacchetti multimediali conservati in frigorifero, i serbatoi dei supporti possono essere ricaricati automaticamente con supporti freschi preri riscaldati da elementi riscaldanti. Ciò ridurrebbe le interferenze degli utenti causate dal riempimento manuale di punte, supporti di coltura e scambi di serbatoi.
Il nostro sistema automatizzato di coltura cellulare offre diversi vantaggi. Uno è il sistema di tracciamento dei codici a barre. Le piastre caricate nel sistema sono identificate da un codice a barre unico che viene letto e salvato dal sistema consentendo il tracciamento dei campioni durante e dopo l’esecuzione del metodo. Un altro vantaggio è la possibilità di creare progetti specifici per l’utente. Qui, le piastre di coltura caricate nel sistema possono essere assegnate a un progetto specifico e raggruppate in lotti. La strutturazione in lotti semplifica l’esecuzione della stessa procedura a tutte le piastre di un determinato lotto poiché non è necessario selezionare singole piastre. Inoltre, un editor di classi liquide consente di regolare la velocità e l’altezza della pipettaggio, nonché i parametri di aspirazione e erogazione per ogni fase di trasferimento del liquido. Ogni processo è documentato in file di registro che consentono di ripercorrere quali attività sono state eseguite per una determinata coltura o piastra di dosaggio.
Neuroni e altri tipi di cellule derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (hiPSC) sono utili strumenti in vitro per studiare i meccanismi delle malattie neurodegenerative in specifiche popolazioni di pazienti (ad esempio neuroni dopaminergici per il morbo di Parkinson) offrendo la possibilità di screening personalizzati dei farmaci. Coltivare hiPSC richiede molto tempo e richiede persone addestrate per eseguire protocolli di differenziazione complessi, di solito limitati alla produzione su bassa scala. Abbiamo adattato la cultura senza alimentatori dell’hiPSC a una coltura automatizzata e implementato due protocolli di differenziazione neuronale, un protocollo di differenziazione dei neuroni corticali rapido basato sull’espressione troppo NGN2 sotto un promotore tet-on10,11e un protocollo a lungo termine a base di piccole molecole per la generazione di neuroni dopaminergici midbrain (mDA)13. Il semplice trasferimento e riproducibilità della cultura manuale e dei protocolli di differenziazione rende il sistema di coltura automatizzato molto utile. L’iPSC umano coltivato nel sistema automatizzato di coltura cellulare ha mostrato una morfologia coerente delle cellule staminali ed ha espresso importanti marcatori di pluripotenza, riproducibili tra esperimenti indipendenti. Inoltre, l’automazione del protocollo di coltura hiPSC favorì la coltura e l’espansione di un maggior numero di linee cellulari in parallelo. I controlli automatizzati di confluenza programmati per essere eseguiti durante la notte hanno fatto risparmiare tempo lasciando il sistema libero durante il giorno per le fasi del processo a valle effettuate quando l’utente era in laboratorio (ad esempio, raccolta di cellule o ripiazzatura manuale per differenziazioni). Al raggiungimento della soglia di confluenza definita dall’utente, le cellule vengono tralette e rilate in piastre rivestite a matrice extracellulare disponibili sullo stacker del sistema automatizzato di coltura cellulare. Ogni passaggio rotondo dura circa 70 minuti e genera quattro piastre da 1 pozzo da una piastra madre, che si traduce in una capacità di 20 passaggi in un giorno.
L’automazione del protocollo di differenziazione NGN2 è stata fatta con successo e ha permesso la generazione di una popolazione omogenea di cellule neuronali attraverso diversi passaggi e paragonabile alle differenziazioni manuali. Inoltre, i costi sperimentali per studi di screening su larga scala che coinvolgono più linee cellulari o esperimenti di screening con migliaia di condizioni/composti di prova sarebbero ridotti a causa di rapide differenziazioni. Letture convenienti e ad alta produttività, incluse le misurazioni della crescita della neurite a cellule vive, possono essere facilmente sviluppate, implementate e utilizzate come letture fenotipiche per la modellazione delle malattie, comemostrato in precedenza 14,15,16. Pertanto, abbiamo ulteriormente adattato il protocollo NGN2 usando cellule precursori neurali derivate da piccole molecole (smNPC) che esprimono in modo costitutivo la GFP. Le celle smNPC offrono ulteriori vantaggi, tra cui la riduzione dei costi con i mezzi di coltura (un terzo del costo con la coltura iPSC) e il tempo necessario per scalare gli esperimenti. Le rese cellulari da smNPC sono da 7 a 10 volte superiori a quelle ottenute con iPSC. I neuroni differenzianti sono stati monitorati e immagini con successo per diversi giorni utilizzando un processo di imaging completamente automatizzato senza la necessità di colorazioni manuali degli anticorpi o etichettatura chimica, risparmiando costi e tempo necessari per le procedure manuali tra cui l’imaging da solo. L’attuale imaging di 60 pozzi interni di una piastra da 96 pozzetti richiede circa 16 minuti per piastra quando vengono imageizzati 25 campi per pozzo, il che significa che i dati per uno screening basato sull’imaging per 1000 composti, potrebbero essere acquisiti e analizzati in un giorno. In futuro, questa lettura potrebbe essere utilizzata in studi di screening composto per il salvataggio di difetti di crescita della neurite.
Inoltre, dimostriamo anche il trasferimento di un protocollo di differenziazione manuale per la generazione di neuroni dopaminergici midbrain (mDA) da iPSC. Questo piccolo protocollo di differenziazione basato su molecole richiede 65 giorni ed è ad alta intensità di lavoro a causa dei molteplici passaggi di rimpiazzamento e dei frequenti cambiamenti dei media, per lo più ogni 2 giorni, che limita la produzione di neuroni mDA a poche linee iPSC contemporaneamente. Il protocollo di differenziazione mDA automatizzato ha il grande vantaggio di aumentare la differenziazione a dozzine di linee iPSC. Fino a 30 linee cellulari potrebbero essere differenziate in parallelo. Poiché la differenziazione si basa principalmente sui cambiamenti dei media, quasi l’intero processo di differenziazione può essere condotto senza interferenze umane. Utilizzando l’utilità di pianificazione basata sul calendario del sistema automatizzato, potremmo pianificare le modifiche dei supporti in base ai passaggi di differenziazione. Una limitazione del lavoro con un numero così elevato di linee cellulari e piastre di coltura era l’impossibilità di eseguire cambiamenti multimediali durante la notte. Il motivo principale è il fatto che il nostro sistema è impostato per l’utilizzo di punte usa e getta e il riempimento manuale di supporti di coltura che richiedono a un utente in laboratorio di eseguire questo passaggio manuale. Per facilitare il processo di cambio del supporto, le piastre caricate nel sistema sono state assegnate a un progetto e raggruppate in lotti. La dimensione del lotto è stata quindi adattata al numero di punte usa e getta e al volume dei supporti di coltura disponibili. Come discusso in precedenza, questa limitazione può essere facilmente superata mediante l’implementazione di aghi riutilizzabili / lavabili e il riempimento automatico dei supporti. Il passaging/ripiazzamento automatizzato delle celle, come mostrato per iPSC, è una delle comodità offerte dal nostro sistema automatizzato di coltura cellulare. Abbiamo testato la ripiazzatura automatizzata dei neuroni mDA il giorno 25 della differenziazione. Tuttavia, la dissociazione dei neuroni mDA richiede un’incubazione più lunga (40 min) con l’enzima di dissociazione rispetto all’iPSC (8 min) che estende il processo di placcatura automatica a più di 1 h per linea cellulare. Di conseguenza, la ripiazzatura automatizzata di 30 linee cellulari nello stesso giorno è diventata impossibile. Accelerare altre fasi durante la piastra automatica (trasporto di piastre, pipettaggio) e adattare il sistema all’uso di aghi e linee multimediali che rende possibile un lavoro notturno risolverebbe questa limitazione. Nonostante gli svantaggi, potremmo trasferire con successo il protocollo manuale a una differenziazione automatizzata dei neuroni mDA che producono colture con quantità sostanziali di cellule positive MAP2 (neuroni) e TH (neuroni mDA).
Differenziare dozzine di linee cellulari iPSC in parallelo è di grande interesse in progetti che indagano i meccanismi molecolari delle malattie neurodegenerative, incluso il morbo di Parkinson. Tuttavia, completare le attività più velocemente con meno errori e a costi ridotti è una grande sfida. Grazie all’automazione dei protocolli qui presentati (iPSC, smNPC e mDA neuron), potremmo accelerare, ridurre i costi e aumentare la riproducibilità nei nostri progetti. Lo sviluppo di progetti come FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) che coinvolgono centinaia di linee cellulari dei pazienti dimostra la necessità di protocolli automatizzati di coltura e differenziazione. Le nostre prospettive future includono il trasferimento di modelli manuali di coltura cellulare tridimensionale (3D) al sistema automatizzato. Piccoli adattamenti nelle impostazioni di definizione della piastra e l’uso di adattatori consentiranno l’uso di piastre commerciali o su misura e camere microfluidiche necessarie per le colture 3D. Inoltre, l’implementazione di un modello automatizzato di imaging senza etichette ci permetterà di monitorare la crescita neuronale in tempo reale e tradurre i cambiamenti nella crescita della neurite, nell’organizzazione dei neuroni e nella morte cellulare in una migliore comprensione dei meccanismi della malattia.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori riconoscono con gratitudine i pazienti e le loro famiglie che hanno contribuito al biomateriale per questo studio. Le linee di cellule utilizzate nello studio provengono dalla collezione NINDS con Rutgers (ND41865 come iPS #1) e dal laboratorio del Dr. Tilo Kunath (iPS#2). Questo lavoro è sostenuto in parte dalla Fondazione NOMIS (PH), RiMod-FTD, un programma congiunto dell’UE – Ricerca sulle malattie neurodegenerative (JPND) (PH); L’iniziativa DZNE I2A (AD); PD-Strat, un progetto finanziato da ERA-Net ERACoSysMed (PH) e la Foundational Data Initiative for Parkinson’s Disease (FOUNDIN-PD) (PH, EB). FOUNDIN-PD fa parte del programma PATH to PD della Michael J. Fox Foundation. Gli autori ringraziano Steven Finkbeiner e Melanie Cobb (Gladstone Institutes) per aver contribuito alla creazione del protocollo manuale di differenziazione dei neuroni mDA e Mahomi Suzuki (Yokogawa Electric Corporation) per l’assistenza nella configurazione dell’analisi della crescita della neurite.
Antibodies | Distributor | Catalog Number | Dilution |
iPSC pluripotency marker | |||
Mouse anti-SSEA4 | Abcam | ab16287 | 1 to 33 |
Rabbit anti-Oct3/4 | Abcam | ab19857 | 1 to 200 |
NGN2 neuron markers | |||
Mouse anti- TUBB3 | R & D | MAB1195 | 1 to 500 |
Rabbit anti-BRN2 | NEB | 12137 | 1 to 1,000 |
mDA neuron markers | |||
Chicken anti-TH | Pel-Freez Biologicals | 12137 | 1 to 750 |
Mouse anti-MAP2 | Santa Cruz | sc-74421 | 1 to 750 |
Secondary antibodies | |||
Goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11039 | 1 to 2,000 |
Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | 1 to 2,000 |
Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | 1 to 2,000 |
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1 to 2,000 |
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1 to 2,000 |
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | 1 to 2,000 |
Nuclei counterstaining | |||
Hoechest 33342 | Invitrogen | H3570 | 1 to 8,000 |
Instruments | Distributor | Catalog Number | Description/Application |
Agilent TapeStation system | Agilent technologies | 4200 | Automated electrophoresis for DNA and RNA samples |
Automated -20 °C storage system | Hamilton Storage Technologies |
Sample Access Manager (SAM -20C, 3200 series) |
Storage of reagents |
Barcode reader | Honeywell | Barcode Reader Orbit | Barcode scanner |
Brightfield cell cytomat | Nexcelom | Celigo | Confluence check and cell counting |
CellVoyager 7000 | Yokogawa | CellVoyager 7000 | Automated confocal microscope |
Cytomat for cell cultures | Thermo Fisher Scientific | Cytomat 24 C, CU | 12 stackers pitch 28 mm, 12 stackers pitch 23 mm (total of 456 plates) |
Cytomat for thawing samples | Thermo Fisher Scientific | Cytomat 2-LIN, 60 DU (Drying Unit) |
2 stackers pitch 28 mm (total of 42 plates) |
HEPA filters | Hamilton Robotics | Hood Flow Star UV | Modified by Hamilton Robotics |
Liquid handling station | Hamilton Robotics | Microlab Star | Channels: 8x 1-ml, 4x 5 ml and 96 Channel MPH |
Media reservoir | Hamilton Robotics | 188211APE | Media/reagents reservoir |
Pure water system | Veolia Water | ELGA PURELAB Classic | Provides pure water for needle wash station |
QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System |
Thermo Fisher Scientific | QSTUDIO12KOA | Real-time PCR machine |
Robotic arm | Hamilton Robotics | Rackrunner | Transport of plates |
Turn table | Hamilton Robotics | Turn Table | Adjust plate orientiation |
Uninterruptible power supply | APC | Smart UPS RT Unit, 10000 VA Power supply |
Backup power supply |
VIAFLO-pipettes | Integra | 4500 | Electronic pipette |
ViiA 7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4453545 | Real-time PCR machine |
Materials | Distributor | Catalog Number | Notes |
1-well culture plate (84 cm2) | Thermo Fischer Scientific | 165218 | Nunc OmniTray |
6-well culture plates (9.6 cm2) | Greiner Bio-One | 657160 | TC treated with lid |
12-well culture plate (3.9 cm2) | Greiner Bio-One | 665180 | TC treated with lid |
96-well culture plate (0.32 cm2) | Perkin Elmer | 6005558 | CellCarrier-96 Black plate |
Tips, 50-µL | Hamilton Robotics | 235987 | 50-uL tips |
Tips, 300-µL | Hamilton Robotics | 235985 | 300-µL tips |
Tips, 1000-µL | Hamilton Robotics | 235939 | 1000-µL tips |
Tips, 5-mL | Hamilton Robotics | 184022 | 5-mL tips |
Tubes, 15-mL | Greiner Bio-One | 188271 | 15-mL tubes |
Tubes, 50-mL | Greiner Bio-One | 227261 | 50-mL tubes |
Nalgene cryogenic 2.0 mL vials | Sigma Aldrich | V5007 | Cryovials |
Plasmids | Distributor | Catalog Number | Notes |
pLV_hEF1a_rtTA3 | Addgene | 61472 | Kind gift from Ron Weiss |
pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro | Addgene | 61474 | Kind gift from Ron Weiss |
pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus | Takara Bio | 631983 | |
Primers | Sequence (forward) | Sequence (reverse) | Source |
iPSC pluripotency | |||
OCT4 (ID 4505967a1) | CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG | GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC | PrimerBank |
NANOG (ID 153945815c3) | CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA | CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC | PrimerBank |
REX1 (ID 89179322c1) | AGAAACGGGCAAAGACAAGAC | GCTGACAGGTTCTATTTCCGC | PrimerBank |
NGN2 neurons | |||
MAP2 (ID 87578393c1) | CTCAGCACCGCTAACAGAGG | CATTGGCGCTTCGGACAAG | PrimerBank |
BRN2 (ID 380254475c1) | CGGCGGATCAAACTGGGATTT | TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT | PrimerBank |
CUX2 (ID 291045458c2) | CGAGACCTCCACACTTCGTG | TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG | PrimerBank |
NCAM1 (ID 336285437c3) | TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC | CTCACAGCGATAAGTGCCCTC | PrimerBank |
SYNAPSIN1 (ID 91984783c3) | TGCTCAGCAGTACAACGTACC | GACACTTGCGATGTCCTGGAA | PrimerBank |
mDA neurons | |||
TH | CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA | CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA | NCBI primer-BLAST |
MAP2 | GGATCAACGGAGAGCTGAC | TCAGGACTGCTACAGCCTCA | NCBI primer-BLAST |
Housekeeping genes | |||
GAPDH | GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG | GAGCCCCAGCCTTCTCCATG | NCBI primer-BLAST |
OAZ1 | AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT | ATGAAGACATGGTCGGCTCG | NCBI primer-BLAST |
RPLPO | CCTCATATCCGGGGGAATGTG | GCAGCAGCTGGCACCTTATTG | NCBI primer-BLAST |
RPL13A | GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC | TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC | NCBI primer-BLAST |
Media and Reagents | Distributor | Catalog Number | Use concentration |
Coating matrix | |||
Extracellular matrix (Matrigel) | Corning | 354277 | 10 μg/mL |
Fibronectin | Corning | 356008 | 2 μg/mL |
Laminin | Sigma | L2020 | 5 – 10 μg/mL |
Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | P3655 | 0.1 mg/mL |
Culture media | |||
iPSC culture medium (Essential 8 Flex medium) |
Gibco | A2858501 | |
NGN2 neurons – NGN2 medium | |||
2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 0.909 mL (50 µM) |
B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (1%) |
DMEM/F-12, GlutaMAX | Gibco | 31331093 | 484.75 mL |
GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL ( 2 mM) |
Insulin | Sigma | I9278 | 0.25 mL (2.5 µg/mL) |
MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140050 | 5 mL (0.5%) |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | 5 mL (0.5%) |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 485 mL |
mDA neurons – SRM medium | |||
2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 0.5 mL (55 µM) |
GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL (2 mM) |
Knockout DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | 409.5 mL |
Knockout serum replacement (serum replacement) |
Gibco | 10828028 | 75 mL (15%) |
MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140050 | 5 mL (1%) |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL (1%) |
mDA neurons – N2 medium | |||
B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (2%) |
GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL (2 mM) |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | 5 mL (1%) |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 475 mL |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL(1%) |
mDA neurons – Differentiation medium | |||
B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (2%) |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 485 mL |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL (1%) |
NGN2 neurons – Supplements | |||
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) |
Peprotech | 450-02 | 10 ng/mL |
CHIR99021 (CHIR) | R&D | 4423/10 | 2 μM |
Doxycyline (dox) | Sigma | D9891 | 2.5 μg/mL |
Glial-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) |
Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL |
L-ascorbic acid 2-phosphate magnesium (AA2) |
Sigma | A8960 | 64 mg/L |
Neurotrophic factor-3 (NT-3) | Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL |
Purmorphamine (PMA) | Cayman | 10009634 | 0.5 μM |
Puromycin | Sigma | P8833-10MG | 0.5 μg/mL |
Thiazovivin | Merk Millipore | 420220-10MG | 2 μM |
mDA neurons – Supplements | |||
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) |
Peprotech | 450-02 | 20 ng/mL |
CHIR99021 (CHIR) | R&D | 4423/10 | 3 μM |
DAPT | Cayman | 13197 | 10 µM |
Dibutyryl-cAMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | 1 mM |
Fibroblast Growth Factor 8B (FGF-8b) | Peprotech | 100-25 | 100 ng/mL |
Glial-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) |
Peprotech | 450-10 | 20 ng/mL |
L-ascorbic acid (AA1) | Sigma | A4403 | 0.2 mM |
LDN193189 (LDN) | Cayman | 11802 | 100 nM |
Purmorphamine (Purm) | Cayman | 10009634 | 2 μM |
Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus (SHH) |
R&D | 1845-SH | 100 ng/mL |
SB431542 (SB) | Cayman | 13031 | 10 μM |
Transforming Growth Factor type ß3 (TGFß3) |
R&D | 243-B3 | 1 ng/mL |
Y-27632 | Cayman | 10005583 | 10 µM |
Dissociation reagents | |||
Single cell dissociation reagent (StemPro Accutase) |
Gibco | A1110501 | 1x |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Gibco | 11575020 | 0.5 mM |
RNA isolation and cDNA kit | |||
RNA isolation kit | Qiagen | 74106 | Rneasy MiniKit |
RNA lysis buffer | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | Trizol lysis buffer (RNA lysis buffer) |
Reverse transcriptase (kit) | Thermo Fisher Scientific | 18080-085 | SuperScript III Reverse Transcriptase |
Software | Company | Catalog Number | Description/Application |
Cell Culture Framework (CCF) (Graphical user interface, GUI) |
Hamilton Robotics | Custom-made | User interface for the automated system |
CellPathFinder software (image analysis software 1) |
Yokogawa | CellPathfinder HCS Software | Image analysis tool |
CellVoyager Measurement System | Yokogawa | Included with CellVoyager 7000 |
Microscope controlling software |
Columbus software (image analysis software 2) |
Perkin Elmer | Columbus | Image analysis tool |
Cloud based qPCR app | Thermo Fisher Scientific | Themo Fisher cloud | Analysis software for qRT-PCR data |
Venus software | Hamilton Robotics | VENUS Two Dynamic Schedular 5.1 Software |
Controlling software for the automated system |