Summary
ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)培養の自動化と、自動イメージングと解析に対応した神経分化を示す。
Abstract
ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)の手動培養および分化プロトコルは、標準化が困難であり、高い変動性を示し、望ましくない細胞型への自発的分化を起こしやすい。この方法は労働集約的であり、大規模な実験に容易に適さない。これらの限界を克服するために、我々は、ハイスループットイメージングシステムに結合された自動化された細胞培養システムを開発し、複数のhiPSCラインを並列および神経分化で維持するためのプロトコルを実装した。ニューロゲニン-2(NGN2)過剰発現を用いた短期分化プロトコルの自動化により、6\u20128日以内にhiPSC由来の皮質ニューロンを産生し、65日以内にHiPSC由来の中脳ドーパミン作動性(mDA)ニューロンを生成する長期分化プロトコルの実装について述べた。また、GFPレンチウイルスを導入した低分子由来神経前駆体細胞(smNPC)にNGN2アプローチを適用し、生細胞自動神経突起増殖アッセイを確立しました。我々は、日常的なhiPSC培養および皮質およびドーパミン作動性ニューロンへの分化に適したプロトコルを備えた自動化システムを提示する。当社のプラットフォームは、長期的なハンズフリー培養および高含有量/高スループットのhiPSCベースの化合物、RNAiおよびCRISPR/ Cas9スクリーニングに適しており、新しい疾患メカニズムおよび薬物標的を同定します。
Introduction
ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)は自己更新であり、ほぼすべての成体細胞型で分化することができます。これらの特性は、hiPSCを基礎研究や創薬1における疾患モデリングのための有用なツールにする。ヒトiPSCは、疾患経過に最も影響を受ける/関与する疾患関連細胞型を導出することを可能にするドナー遺伝的背景を保持し、例えば、神経変性疾患2、3に対する異なる神経サブタイプである。また、hiPSCは、ヒトの文脈および生理学的タンパク質発現レベルで疾患をモデル化することにより、動物および細胞過発現モデルの限界を克服し、単因性、複雑、およびエピジェネティックな疾患、ならびに遅発性疾患に至るまでの疾患をモデル化する上で貴重な資産であることが証明されている。
これらの利点と機会にもかかわらず、hiPSCのいくつかの制限に対処する必要があります。現在のhiPSCの文化と分化プロトコルは費用対効果が高く、標準化が難しく、労力を要します。手動培養ステップは、hiPSCの成長と自発的な分化の違いにより、収率と型の変動性が高くなる可能性があります。したがって、自動化5を使用して達成できるより標準化された処理技術とプロトコルの簡素化を実装することによって、実験者依存の変動を減らす必要があります。自動化されたhiPSC培養と分化プロトコルの確立は、学術および産業研究プロジェクトの両方に共通の基準を設定し、生物学的に関連する疾患モデルとより再現可能な結果の生成を可能にする。
これまでの研究では、hiPSC培養6、7、8の自動化が試みられましたが、そのプロトコルはシステムに依存する特定の細胞培養プレートフォーマットに制限されており、異なるアッセイ形式への適応性が欠けています。このようなシステムは細胞の増量に有用であるが、所望の細胞タイプへの自動分化、疾患のフェノタイピング、およびスクリーニング目的には適さない場合がある。さらに、線維芽細胞誘導、hiPSC生成および分化のための大規模な自動化プラットフォームは9を説明したが、魅力的に見えるが、多くの学術研究所にとって手頃な価格であり得ないラインの生産に専念するハイスループットの実験室によってのみ達成することができる規模で。
高効率微粒子空気(HEPA)ろ過環境の液体ハンドリングステーションをベースにした、大容量CO2 インキュベーター、明視野イメージングサイトメーター、プレート輸送用ロボットアームを用いた完全自動細胞培養システムを開発しました。これらのコンポーネントは、安定した再現性のあるhiPSC培養と分化の基礎となります。化合物またはウイルス貯蔵用の自動-20°Cストレージシステムと高速スピニングディスク共焦点ライブセルイメージャーでシステムを補完しました。カスタムメイドのプロトコルを生成することで、サンプル処理とプレートイメージングによる自動細胞播種、メディア変更、合流性チェック、細胞拡張、アッセイプレート生成を可能にし、高コンテンツ/ハイスループットスクリーニングに対応したシステムを実現しました。自動細胞培養およびイメージングシステムは、制御ソフトウェアとカスタムメイドのグラフィカルユーザインタフェース(GUI)を使用して操作されます。GUI を使用すると、メソッドの実行に必要なセル行固有のパラメータを含む CSV ファイルをインポートできます。さらに、GUIは組み込みのカレンダービューを使用して、任意のシーケンスで多数の実験をスケジュールすることができ、各メソッドが開始される時間を完全に制御することができます。
当社の自動細胞培養システムでは、標準化されたピペット速度、通過時間、合流度の閾値、播種密度、および中量を使用して、様々なプレート形式(96、48-、24-、12-、6-または1ウェルプレート形式)で細胞を培養する柔軟性を備えています。我々は、hiPSCを6日間10、11でTUBB3陽性ニューロンを得ることができるニューロンに変換するための最近発表された短期分化プロトコルを適応させました。また、EF1aプロモーター12およびiPSCの下でGFPを構成的に発現するニューロンへの小分子神経前駆細胞(smNPC)の自動分化とイメージングを中脳ドーパミン作動性(mDA)ニューロンに確立し、65日以内にmDAニューロンを生み出す以前に発表されたデュアルSMAD阻害プロトコル13を適応させた。
Protocol
1. 細胞培養とイメージングの自動化に関する基本的な手順
- 新しいカルチャープレートとヒントをロードする
- GUIを開き、 リソース/インストゥルメントプロセスビュー ボタンをクリックします。リソース/計測器プロセスを実行するには、リソース/インストゥルメントプロセスを選択し、 計測器の実行プロセス ボタンをクリックします。
- リソースプロセス RunHepaHood と リロード を実行します (ステップ 1.1.1 を参照)。ドアを開け、制御PCのポップアップ画像に示されているように、対応する位置に細胞培養プレートと使い捨てのヒントをロードします。
- 除染のために70%エタノールでドアを拭き、それを閉じます。GUIから機器プロセス の除染 を実行します(ステップ1.1.1を参照)。システムは30分間紫外線放射によって殺菌される。
- リフィル培養液および/または解離試薬
- 計測器ステップ RunHepahood を実行します (ステップ 1.1.1 を参照)。液体ハンドリングステーションの正面ドアを開けます。70%エタノールを用いて貯蔵所(培地、PBSおよび/または解離試薬を含む)を除染し、割り当てられたポジトン(cfg.csvファイルで定義されているように)にデッキに置きます。貯水池の蓋を外します。
- 70%エタノールでドアを除染し、閉じます。GUIからリソース/インストゥルメントプロセス「InitHepaHood」を実行してHEPAフードの電源を切ります。
- GUI で新しい「セルライン」を作成し、プロジェクトを作成します。
- 構成 (*.cfg.csv)、インポート(*.imp.csv)、リソース(*.rsv.csv)、およびワークフロー(*.wfl.csv)ファイルで構成されるユーザー定義の「セル行」ファイルを作成または変更します。
- GUIを開き、「セル行エディタ」ビューの 「セル行の追加 」ボタンをクリックして新しい「セルライン」を作成します。ウィザードが開き、構成ファイルを選択する必要があり、短い説明を含むプロジェクト名を入力する必要があります。
- 緑色の矢印を使用してこのウィザードをナビゲートし、緑色のチェックマークをクリックして設定を確認します。[プロジェクトの追加] ボタンをクリックして、生成された "セルライン" の新しい プロジェクト を作成します。
- プロジェクト名と説明を入力し、GUI のカレンダー ビューに表示されるプロジェクトの色を定義します。矢印をクリックして、ウィザードの次のページに移動します。
- [ バッチの追加 ] ボタンをクリックし、ポップアップ ウィンドウに短い名前と説明を入力して、新しいバッチを作成します。すべてのプロセスステップを選択し、各プロセスステップの開始時刻をスケジュールします。 [OK]をクリックしてウィンドウを閉じます。
- GUIを使用した自動化メソッドの実行
- GUI のカレンダービューに移動し、[ プロセスステップの追加 ] ボタンをクリックします。
- [セル] 行を選択し、ウィザードの次のページに移動した後でプロジェクトを選択します。使用するバッチをマークし、右を指す矢印をクリックします。使用する方法に応じて、バッチは空(新しいプレートを受け取る場合)であるか、培養プレートまたはアッセイプレート(他のすべてのプロセス)を含んでいる必要があります。
- ウィザードの次のページに移動し、実行するプロセスステップを選択します。このウィザードの最後のページに移動し、実験のスケジュールを設定します。「パラメータの詳細」セクションでは、メソッドを実行するために必要な変数を変更することができます。 [OK]をクリックして確認します。
- 培養プレートとアッセイプレートをCO2 インキュベーターにロード
注: 1 ウェルプレートは、バルクセルに一般的に使用されるため、培養プレートとして定義されます。すべてのマルチウェルプレートはアッセイプレートとして定義されています。- ステップ 1.1.1 で説明されているように、GUI からインストゥルメントプロセス"RunHepaHood"を実行します。ロボットアームの前のドアを開けます。
- プレートが自動イメージングのためにロードされている場合は、70%エタノールと糸くずのない組織でアッセイプレートの底を拭きます。左の棚に培養プレートまたはアッセイプレートを置きます。プレートの向きが正しいことを確認します。アッセイプレートの場合、井戸A1はロボットアームを指し、培養プレートの端は右を指す必要があります。
- 除染のために70%エタノールでドアを拭き、それを閉じます。
- ステップ1.4で説明したように、マルチウェルプレートをインポートするための1ウェルプレートまたは「アッセイプレートのロード」をインポートするための方法「培養プレートのロード」を実行します。両方のメソッドを実行するには、空のバッチを使用します。プレートバーコードがこのバッチに既に存在する場合は、チェックボックスをクリックして選択を解除します。
- ロボットアームを使用して、棚からCO2インキュベータープラットフォームに個々のプレートを輸送します。作り付けの版のシャトル・ステーションは版を取り出し、CO2インキュベーターの棚の1つに入れて保存する。細胞は37°Cおよび5%CO2で維持される。
- CO2インキュベーターからのプレートのアンロード
- 「プレートをアンロード」メソッドを実行します(ステップ1.4を参照)。エクスポートするプレートを含むバッチを選択します。個々のプレートは、バーコードによって選択することができます。
- ロボットアームを使用して、CO2 インキュベーターから左の棚にプレートを輸送します。
- ステップ 1.1.1 で説明されているように、機器プロセス "RunHepaHood" を使用して HEPA フードを起動します。ロボットアームの前のドアを開けます。プレートを取り外し、ドアを閉める前に70%エタノールで除染し、HEPAフードの電源を切ります。
2. オートメーションプロトコル
- チューブからのプレートの播種
- 計測器プロセス RunHepaHood を実行して HEPA フードを起動します (ステップ 1.1.1 を参照)。液体ハンドリングステーションの前のドアを開けます。セル懸濁液を含む50 mLチューブを入力し、チューブを取り外します。
- ロボットアームの前のドアを開け、棚の上の細胞を受け取るための培養プレートをロードします。除染し、両方のドアを閉めます。「チューブからのプレートのシード」メソッドを実行します(ステップ1.4を参照)。
- 直接細胞計数機能を使用して、明視野画像細胞計で細胞を数える。セルカウントの場合は、384 ウェルプレート形式での複製として 16 ウェルを使用します。
- 384ウェルカウントプレートを、ロボットアームを使用してターンテーブルを介してデッキから明視野イメージングサイトメーターに輸送し、イメージングプロセスを開始します。細胞数は、ミリリットル当たりの細胞数を自動的に決定します。ロボットアームを使用して、計数プレートを元の位置に戻します。
- ロボットアームを使用して、コーティングされた培養またはアッセイプレートを棚からピペッティングデッキに輸送します。ユーザー定義数のコーティングセルとシードセル、およびプレートフォーマットに適した体積を除去します( 表1参照)。セル分布のために500 rpmで10 sのオンデッキシェーカーにプレートを移動し、CO2 インキュベーターに移します。
- 自動合流評価
- 手順 1.4 で説明されているように、メソッド 「コンフルエンスのチェック」を実行します。少なくとも1つの培養プレートとアッセイプレートを含むバッチを選択します。「パラメータの詳細」セクションでは、画像取得およびイメージング解析設定のための入力"iPSCf_2020"。
- ロボットアームを使用して、ターンテーブルを介してCO2 インキュベーターから明視野イメージングサイトメーターに最初のプレートを輸送します。
- hiPSCコロニーの合流チェックのための明視野画像サイトメーターの細胞のイメージングを行います。1ウェルパテの「合流」アプリケーションと画像13フィールドを使用し、細胞が占める平均面積を自動的に計算する。
- ロボットアームを使用してプレートをCO2 インキュベーターに戻します。ステップ 2.2.2 を繰り返します。2.2.4に。残りのプレート用。
- 培養プレートまたはアッセイプレートのメディア交換
- ステップ 1.4 で説明したように、"培養プレートのメディア交換" メソッドを実行します。をクリックし、培養プレートのみを含むバッチを選択します。「パラメータの詳細」セクションのピペッティング手順にチップまたは針を使用するかどうかを示す変数を設定します。マルチウェルプレートのメディア交換については、「アッセイプレートのメディア交換」を実行し、アッセイプレートを含むバッチを選択します。
- CO2 インキュベーターからデッキに個々のプレートをロボットアームを使用して輸送し、プレートの蓋を解除します。プレートを自動的に傾け、古いメディアを吸引し、廃棄物収集モジュールに捨てます。12 mLの新鮮なメディアを追加します。プレートを再蓋し、ロボットアームを使用してプレートをCO2 インキュベーターに戻します。
- サブ栽培
メモ:1.1.1で説明されているように、GUIからインストゥルメントプロセス"RunHepaHood"を実行します。をクリックし、液体ハンドリングステーションの正面ドアを開けます。必要な位置での媒体および解離試薬のロード(ステップ1.2参照)。ヒントを再入力する必要がある場合は、ステップ 1.1 で説明されているように「再ロード」を使用します。細胞懸濁液を受け取るための50 mLチューブを入力し、チューブを取り外します。- 「接着細胞のサブ栽培」の方法を実行します(ステップ1.4を参照)。サブ栽培が必要な培養プレートを含むバッチを選択します。
- CO2 インキュベーターからデッキにプレートをロボットアームで運び、プレートの蓋を外します。プレートを自動的に傾け、古い媒体を取り除き、廃棄物回収モジュールに捨てます。PBSの8 mLで細胞を一度洗浄します。0.5 mM EDTAの8 mLを加え、束ベースのパスを加えます。デッキで8分間インキュベートします。
- プレートからEDTA溶液を取り出し、廃棄物回収モジュールに廃棄します。12mLの新鮮な培地を加え、プレートをシェーカーに運ぶ。コロニーを外すために1分間2000 rpmで振ります。
- iPSCコロニーを小さなサイズ(〜50\u201280 μm)に分割するために、5サイクルのピペット処理のために細胞懸濁液をトリチュレートします。セルサスペンションをデッキの50 mLチューブに移します。ステップ 2.1.5 で説明したように、7 分の 1 の分割比を使用して、自動的にセルをシードします。
注: オプションの単一セルの通過。単一細胞解離試薬を用いて単一細胞懸濁液を生成する(材料表を参照)。ステップ2.4.2で0.5 mM EDTAの代わりに、8 mLの単一細胞解離試薬を使用し、37°Cで20分間インキュベートする。 50 mLチューブにセルサスペンションを収集し、メディアの等量を追加します。単一細胞解離試薬を用いた解離は、細胞をペレット化するための手動ステップを必要とする。遠心分離細胞は300×gで3分間。上清を取り除き、必要な培地の12mLで細胞ペレットを再懸濁し、「チューブからのプレートの播種」に進みます(ステップ2.1を参照)。HIPSCの単一細胞懸濁液を使用する場合、シードの日に2μMチアゾビビンでメディアを補います。
- 自動高コンテンツ、高スループットイメージング
注:測定設定が利用可能である必要があります(補足ファイル1:ステップ1.1を参照)。画像化されるアッセイプレートは、インキュベーターで入手可能である。- 「イメージング」メソッドを実行します(ステップ1.4を参照)。少なくとも 1 つのアッセイ プレートと培養プレートを含むバッチを選択します。「パラメータ詳細」セクションに、プレートの種類、プレートの定義(標準の96ウェルイメージングプレートの場合:「プレート-96-2017091813842」)と測定設定の名前を入力します。
- ロボットアームを使用して自動共焦点顕微鏡にターンテーブルを介してアッセイプレートを輸送し、イメージングプロセスを開始します。顕微鏡から撮像の終わりのプレートを回収し、CO2 インキュベーターに戻します。バッチ内の残りのプレートのプロセスを繰り返します。
3. hiPSCの自動メンテナンスと拡張
-
自動合流性チェック、メディア変更、サブ栽培のシーケンス
- 「チューブからのプレートの播種」法を用いた1ウェルプレート上のシードセル(ステップ2.1参照)。あるいは、「培養プレートのロード」法を使用して手動でシードされた1ウェルプレートをインポートします(ステップ1.5を参照)。
- iPSCの培養の1日目から6日目までのコロニーの成長を監視するために、毎日自動合流性チェックをスケジュールします(ステップ2.2を参照)。
- 「培養プレートのメディア交換」方式を使用して、2日ごとにメディアをリフレッシュします(ステップ2.3を参照)。1プレートあたり12mLの培地が使用される。
- 6日目に「サブ栽培」プロセスを開始します(ステップ2.4を参照)。
4. 自動差別化
- ヒト iPSC から皮質 NGN2 ニューロン
メモ: 手動の hiPSC 準備。プロトコルは、送達のためにレンチウイルスベクターを使用してNGN2の過剰発現を伴う。NGN2とrTTA3レンチウイルスを1:2比でトランスデュースhiPSC(> 〜107 TU/mL)次に、細胞は0.5 μg/mLのピューロマイシンを用いた1つの通路に対して選択される。安定した hiPSC-NGN2 回線を生成するための詳細なプロトコルは 、補足ファイル 1: ステップ 2 にあります。- ステップ2.4.4のノートに記載の単一細胞解離試薬を用いて記載した「サブ培養」プロセスを進める。HiPSC が 70\u201280% 合流に達した場合
- 上清を取り除き、2.5 μg/mLドキシサイクリン(ドキシサイクリン)および2 μMチアゾビビンを含むNGN2培地(材料表)の12 mLで細胞ペレットを再懸濁します。
- 「チューブからのプレートのシード処理」 方法を使用して差別化を開始します(ステップ2.1を参照)。iPSC の必要なシード密度を 30,000/cm2 に設定します(表 1 を参照)。iPSCは、0.1 mg/mLポリL-オルニチン(PLO)および5μg/mLラミニンを用いて、プレコーティングされたプレートにメッキされます。
注:1ウェルプレートは、イメージング実験に96ウェルプレート形式が好ましい一方で、RNAおよびプロテオミクスベースの研究に好ましい。48-、24-、12-または6-ウェルプレートなどの他のアッセイプレートフォーマットも使用され得る。 - 分化の1日目に、2.5 μg/mLドットと10 μM N-[3,5-ジフルオロフェニル)アセチル]-L-アラニル-2-フェニル-グリシン、1,1-ジメチルエステル(DPT)を使用して「アッセイプレートのメディア交換(ステップ2.3を参照)を使用してメディアをリフレッシュする。メディアの変更を 2\u20123 日ごとに、希望の日の分化まで続行します (手順 2.3 を参照)。
- 分化の4日目に、10ng/mL脳由来神経栄養因子(BDNF)、10ng/mLグリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)および10ng/mL神経栄養因子3(NT-3)を添加したNGN2培地を使用して、別の培地変化(ステップ2.3を参照)を行う。実験の最後に、下流実験のためにシステムから培養プレートをエクスポートします(ステップ1.6を参照)。
- NGN2ニューロンに対する低分子神経前駆細胞(smNPC)
注: 公開されたプロトコル12 の適合バージョンに従って smNPC を派生させます ( 補足ファイル 1: ステップ 5 を参照)。NGN2 および rTTA3 ウイルスを使用して smNPC を変更します ( 補足ファイル 1: ステップ 2 を参照)。NGN2およびrTTAの伝達の1ラウンドは、安定した集団を生成するのに十分である。さらに、pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 レンチウイルスを用いてsmNPCを変更し、生細胞モニタリングを行うことができます。GFPレンチウイルス導入には10の多重感染(MOI)が使用されます。- ステップ2.4に記載した単細胞解離試薬を用いて合流に達する上のsmNPCを通過する。メモ。
- 「チューブからのプレートの播種」法(ステップ2.1を参照)を用いて50,000/cm2の細胞密度で細胞密度の自動化細胞を用いた種子細胞を、0.1mg/mL PLOを用いたプレコーティングされたプレートに、NGN2培地では5μg/mLラミニンを2.5μg/mLドークスで補った。
- 3日目に、2.5 μg/mLのドークスと10 μM DAPTを含む新しいNGN2培地を使用して、メディア交換(ステップ1.3.を参照)を実行します。3日目以降、2.5 μg/mLのドックス、BDNF、GDNF、NT-3をそれぞれ10 ng/mLで含む新しいNGN2培地で、3日目ごとにメディアの変更を行います。
- 画像細胞は、GFPを使用してノイライト伸長の読み出しとして分化状態をモニタリングするための「自動高含有、高スループットイメージング」法(ステップ2.5を参照)を使用して毎日使用する。レーザーパワーを80%に設定し、露出時間を30msにします。20xの目的を使用して、多数のフィールド(例えば、25フィールド)を取得します。
- バッチ画像解析
- 画像解析ソフトウェア1で画像解析を行い、神経突起伸長テンプレートを使用する。
- ソフトウェアを開きます。「データ」オプションを選択し、イメージングデータフォルダを参照し、解析するデータをロードするためにOKをクリック します 。[ 開く ] をクリックし、上部のメニュー バーから プロトコル を選択し、アプリケーション メニューから [neurite 伸び]を選択します。「アルゴリズム」に移動し、核、細胞体および神経突起を定義するために「488」チャネルを使用します。それぞれのしきい値パラメータを調整します。
- 画像解析に使用するウェルを選択します。右下 のリンクを クリックし、セル数平均、総スケルトン長さなどの解析対象のフィーチャを選択します。「事前分析」に続いて「プレビュー」を進めます。
- プレビュー設定が許容できるかどうかを確認し、バッチ モードで解析を開始します。結果は、Excel で開くことができるファイル形式で「レポート」.csv下の親フォルダーで使用できます。
注: 画像解析スクリプトは、要求に応じて利用できます。 - 全ノイライト長で得られた平均ニューライト長をプロットセル数に正規化した。
5. 中脳ドーパミン作動性(mDA)ニューロンへのhiPSCの自動分化
- 手動の hiPSC 準備
- 単一細胞解離試薬を用いて、70\u201280%コンフルエントhiPSCを単一細胞に解離する。簡単に言えば、37°Cで30分間単細胞解離試薬(100μL/cm2)を用いた細胞をインキュベートし、円錐管に細胞懸濁液を集め、200xgで5分間遠心分離し、iPSC培地中の細胞ペレットを再懸濁させる。
- 10 μMY-27632 を添加した細胞外マトリックスコーティング 1 ウェルプレートおよび iPSC 培養培地上のシード 200,000 細胞/cm 2。培養細胞は、一晩で37°Cおよび5%CO2で培養する。
- 自動分化: フェーズ 1
- 手順 1.1\u20121.2 の説明に従って、自動化されたカルチャ システムを準備します。
- 細胞を含む培養プレートを自動培養システムのCO2 インキュベーターにロードする(ステップ1.5参照)。
- KSR培地( 材料表を参照)を準備し、分化開始0日目に必要な小分子( 表2を参照)を補います。小分子と成長因子を含む、作りたての培地のみを使用してください。
- 分化の0日目と1日目にステップ2.3に記載されているように培養プレートの培地変更を行い、25日目まで2日目まで毎日変更する。
- 5日目から、シフトメディア製剤は 、表3に詳述されるように徐々に。
- 11日目に、CHIR(13日目まで)、BDNF、AA1、GDNF、db-cAMP、TGFß3およびDAPTを添加するmDAニューロン分化培地を追加する( 材料表を参照)。
- 25日目にプレートをアンロードします(ステップ1.6を参照)。
- 手動再めっき1
- 25日目mDA前駆体を単細胞解離試薬を用いて単一細胞に解離する。簡単に言えば、37°Cで40分間単一細胞解離試薬(100μL/cm2)を用いた細胞をインキュベートし、円錐管に細胞懸濁液を集め、200xgで5分間遠心分離し、mDAニューロン分化培地中の細胞ペレットを再懸濁させる。
- 1ウェル培養プレートに400,000個の細胞/cm2 を1ウェル培養プレートにあらかじめコーティングし、10μg/mLラミニン、mDAニューロン分化培地2μg/mLフィブロネクチン10μM Y-27632(26日目まで)を添加し、表2に記載された小分子および成長因子を表 2に記載した。培養細胞は、一晩で37°Cおよび5%CO2で培養する。
- 自動分化: フェーズ 2
- ステップ1.5で説明したように、自動化培養システムのCO2 インキュベーターにmDAニューロンを含む培養プレートをロードする
- mDAニューロン分化培地( 材料表を参照)を準備し、26日目以降の最終的な分化に必要な低分子と成長因子を補う( 表2参照)。
- 分化の 26 日目のステップ 2.3 で説明したとおりに、培養プレートのメディア変更を行い、65 日目まで 3\u20124 日ごとに変更します。
注: ハイスループットイメージングの目的で、ステップ 5.5 で説明したように、分化の 32 日目に低密度で 96 ウェルプレートの mDA ニューロンを再プレートすることをお勧めします。
- 手動再めっき2
- ステップ 1.6 で説明したように、培養プレートをアンロードします。ステップ5.3.1で説明したように、32日目のmDAニューロンを単一細胞に解振する。
- 0.1 mg/mL PLO、10 μg/mLラミニン、mDAニューロン分化培地中の2μg/mLフィブロネクチンを10μM Y-27632(33日目まで)および小分子および成長因子であらかじめコーティングした96ウェルプレートのシード100,000細胞/cm 2を参照してください( 表 2)。培養細胞は、一晩で37°Cおよび5%CO2で培養する。
- 33日目に、小分子および成長因子(Y-27632なし)を添加した新たに調製されたDAニューロン分化培地によって培地を交換する。65 日目まで 3\u20124 日ごとに手動でメディアを変更します。
6. 免疫染色、自動化されたハイスループット画像の取得と分析
-
蛍光染色
- 補足ファイル1:ステップ4に記載されているように蛍光免疫染色を行う。
- 補足ファイル 1: ステップ 1.2 で説明されているイメージ セル。
- イメージングシステムによって生成されたイメージングファイルを、ステップ6.2で説明したように、さらなる画像解析のために画像解析ソフトウェア2( 材料表を参照)にアップロードする。
-
画像解析ソフト2を用いた画像解析
- 画像解析ソフト2で画像ファイルをアップロードしたら、「画像解析」機能に進み、ドロップダウンメニューを使用して解析アルゴリズムを構築します。
- 細胞核に属する画像上の領域を検出する「核を見つける」タスクを使用して核を選択する(ここではHoechstで染色)。核領域または直径の閾値を設定することにより、死んだ細胞(ピノスティック核)から核を除外します。
- 「細胞質を見つける」というタスクを使用して細胞細胞質を選択します。このタスクは細胞質に属する核の周りの領域を検出します。適切にセグメント化されたセルのみを含めます。有糸分裂、アポトーシスおよび悪いセグメント化された細胞を除外する。画像の境界に接するセルを削除します。
- タスクを追加する"モルフォロジープロパティを計算"と"強度プロパティを計算"。モルフォロジーパラメータには、対象領域の面積などの形態特性の計算が含まれます。強度パラメータには、対象領域の平均強度(例えばニューロンの細胞質)などの強度特性の計算が含まれます。
- 1つ以上の条件、形態および/または強度を使用して、入力集団(選択されたすべての細胞質)の亜集団(例えば、TH陽性ニューロン)を選択する。
注:通常、強度はニューロンに対して選択されます。負のコントロールに基づいて、ニューロンがTHに対して正であると考えられる強度の閾値を上に定義することが可能である。 - 出力結果を定義します。これは、各解析の最後の構成要素です。これは、培養プレートの各ウェルのアッセイ読み出し値(ウェル当たりの結果)を定義する。
- バッチ分析を実行し、結果をエクスポートします。正の数を核の総数に正規化し、データを正のセルの割合として表します。
定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)
- 補足ファイル 1: ステップ 3 で説明されているように、qRT-PCR プロトコルを実行します。
Representative Results
当社の自動細胞培養およびイメージングシステムは、hiPSCの培養と分化を皮質または中脳ドーパミン作動性(mDA)ニューロンなどの異なる細胞タイプに標準化することを可能にする、人間の介入を最小限に抑えるように設計されました。図 1に、統合イメージング デバイスを使用した自動細胞培養システムの概略図を示します。この自動化された細胞培養システムへの細胞培養の最初の導入は、50 mLチューブから細胞を自動的に播種するか、培養プレートまたはアッセイプレートのインポートに「培養プレートのローディング」または「アッセイプレートのローディング」方法を使用して行うことができます。当社のシステムの中心的なコンポーネントは、メディアの変更や亜栽培などのすべての液体転送ステップが行われる液体処理ステーションです。液体ハンドラのカスタムメイドのデッキレイアウトを 図2に示します。液体の取扱いの場所は4つの位置が装備されている。最大4枚のプレートをインキュベーターからデッキに移すことができるため、パラレルなメディアの変更が可能です。サブ栽培法では、親と娘の両方の培養プレートをデッキに収容する必要があるため、並行して処理される培養プレートの最大数は2個に制限される。液体処理ステーションの重要な特徴は、細胞培養上清を完全に除去するために、媒体交換時にプレートを傾ける可能性である。また、液体処理ステーションには、サブ栽培プロトコルの実行中に細胞の酵素的解離を好むシェーカーが装備されている。当社の自動培養システムには、細胞の計数と合流性チェックを行う明視野イメージングサイトメーターと、時間の経過に伴う細胞成長のモニタリング、細胞の迅速で高い含有量と高解像度のイメージングのためのデュアルスピニングディスク共焦点顕微鏡の2つのイメージングシステムも装備されています。
hiPSC培養は、明視野画像サイトメーターでの成長を毎日監視し、合流率を分析します。左パネルと右パネルの明視野画像は、サイトメーターで得られた明視野画像の解析から緑色のマスクを使用します(図3A)。2つのhiPSCライン(n=4プレート)の合流率が平行に成長し、1日目から6日目までの合流チェックを受けたことによって示されるように、均質なhiPSCの成長が時間の経過とともに観察される(図3B)。設定されたしきい値に達すると、hiPSC が通過します。細胞株を手動(m)または自動化(a)系により培養し、少なくとも2つの通路に対する典型的な幹細胞形態の維持のために観察した、代表的な明視野画像(図4A)。手動で培養したhiPSC(図示せず)または自動化システムにおいて、典型的な幹細胞マーカーOCT4(赤色)およびSSEA4(緑色)を示した、免疫蛍光アッセイ(図4B)に示す。多能性マーカー OCT4、ナノGおよびREX1の発現もqRT-PCRによってmRNAレベルで評価した(図4C)。相対定量は、手動で増殖した1つの細胞株(m)および自動培養系(a)中の重複(複製1および2)から採取したサンプルで行った。自動化培養系で栽培される複製物における3つの多能性マーカーの発現レベルは、手動培養後のマーカー発現と類似している。8日目(D8)に、hiPSCと区別する皮質ニューロン(Diff)には多能性マーカーの発現が存在しなかった。
自動化培養システムの重要な応用の1つは、hiPSCをニューロンを含む異なる細胞タイプに分化することです。ここでは、非常に短い時間(約6日間)で純粋な皮質ニューロン培養を生み出すNGN2戦略を用いて、hiPSCのニューロンへの分化を示す。自動培養系で分化したニューロン(a)は、手動で培養したニューロンと同様の形態およびニューロンネットワーク組織を提示した(図5A)。自動分化皮質ニューロンは、TUBB3(ニューロン固有クラスIII βチューブリン、赤)およびBRN2(上皮層マーカー、緑色)(図5B)に対して陽性であった(データは示されていない)。微小管関連タンパク質2(MAP2)、神経細胞接着分子(NCAM1)、シナプシン-1(SYN1)、皮質ニューロンマーカー BRN2およびCUX1(上皮層)を含むニューロンマーカーの発現は、8日目(D8)の分化時にニューロンに富んでいた(図5C)。これらのマーカーの発現が非常に低いか、または全くhiPSCで観察されなかった。相対定量は、手動で増殖した1つの細胞株(m)および自動培養系(a)中の重複(複製1および2)から採取したサンプルで行った。反復の式レベルは、手動と自動の区別の間で同様の変動を示します。
自動化された培養システムの統合されたイメージング機能により、培養物の健康のためのハンズフリーデータ収集が可能になり、この結果、風向きの読み出しを長期的に自動化できます。GFPレンチウイルスを導入した低分子由来神経前駆体(smNPC)ラインに対するNGN2アプローチを用いて、11日間にわたってノイライト長を手動で介在することなく測定する生細胞自動神経突起伸長アッセイを確立しました。1日目、3日目、11日目に神経突起を占める領域、GFP表現、および分析からのマスク画像によって示されるように、Neuriteの複雑さは時間の経過とともに増加しました(図6A,B)。分化の1日目から11日目までの神経突起長の増加は定量化され、異なる井戸間で同様の発達を示した。単純にするために、96ウェルプレートからそれぞれ6つのウェルを持つ3つの列からのデータのみが代表的なグラフに示されていますが、すべての内側60のウェルが分析されました(図6C)。
ここに示す自動化培養システムのもう一つの応用は、hiPSCのmDAニューロンへの分化である。この差別化は、事前に確立されたプロトコルに基づくメディアの変更に基づいており、0日から65日までの自動化培養システムで実行された。自動メディアの変更により、細胞の分離や、その他の視覚的に検出可能な区別の変更は発生しませんでした。分化の終わりに、65日目に、mDAニューロンは、手動分化に匹敵する細胞組織および形態(スフェリックソーマ、長および棘デンドライト)を示す(図7A、B)。mRNAレベルでは、自動化培養系で分化したmDAニューロンは、それぞれニューロンおよびmDAマーカー 、MAP2およびTH(チロシンヒドロキシラーゼ)の発現を示す(図7C)。両方の分化は、THとMAP2陽性ニューロンのかなりの量を生成しました (図7D).
図1:自動化された細胞培養およびイメージングプラットフォームの概略図。
このシステムは、ポリカーボネートハウジングと2つのHEPAフード(AとB)に4つのUVランプを装備し、細胞培養用途の無菌環境を保証するように設計されました。細胞培養プレートは、前面ドア(C)を介してアクセスできるロボットアームの前の棚に積み込まれます。プレートは456プレートの容量を持つCO2 インキュベーター(D)に積み込まれます。明視野細胞計(E)は、サブ栽培ルーチン中の合流性チェックおよび細胞カウントに使用されます。液体の取扱いの場所はHEPAフードの1つ下にある(B)。液体ハンドラのデッキレイアウトは 図2に説明されています。液体の処理の場所のピペットの腕は96チャネルのピペットリングヘッド、8つの1 mLのピペットチャネルおよび4つの5 mLのピペットチャネルを運ぶ。1 mL ピペットチャネルの場合、チップまたは針は液体の移動に使用できます。スクリーニング目的で、アッセイプレートに播種した細胞は、第2インキュベーター(G)でこれらのサンプルを解凍した後、自動-20°C貯蔵システム(F)に-20°Cで保存されたサンプルで処理することができます。高スループットイメージングは、自動共焦点顕微鏡(H)で行われ、2つのスピニングディスクまたは発蛍光モードを使用して共焦点モードで画像を取得します。顕微鏡に統合された生細胞の部屋は培養細胞の長期のイメージ投射を行う。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:液体ハンドリングステーションのデッキレイアウト。
チップ位置は、50 μLチップの「50 μL」、300 μLチップの「標準」、1 mLチップの「高」、5 mLチップの「5 mL」で示されます。デッキコンポーネント:(A)任意の培養プレートまたはアッセイプレートフォーマットに使用できる4つの加熱シェーカー位置(最大速度:2500 rpm)。シェーカーの位置はデッキへの輸送に続く版の直線のためにまた使用されるクランプ可能なグリッパーが装備されている。さらに、シェーカーの位置は液体の移動のステップの間に版のためのふたの駐車位置として機能する。代表的な目的のために、すべてのシェーカーの位置は96のよくアッセイの版によって占めされる。(B)任意のフォーマットの4枚のプレートを同時に処理するための4つのチルトモジュールが上に配置されています。最も低い位置は、培養およびアッセイプレート用の廃棄物回収室と96チャネルピペットヘッドを示しています。代表的な目的のために、すべての傾斜モジュールは96ウェルアッセイプレートによって占められます。(C)上位置に、セルカウント用の 384 ウェルプレートが配置されます。代表的な用途で96ウェルプレートが占めるプレートと、50mL4本の15mLチューブ用のラックを以下に示します。最も低い位置は5 mLの先端によって占められる。(D) メディアリザーバの位置を持つ 3 つのメディアライン。メディアラインには、最大250 mLのメディアを自動的に埋める液体レベルセンサーがあります。(E) アクティブドレインを備えた 2 つの液体廃棄物モジュールは上部に基づき、1 つのコンテナ(白)の位置を持つ温度制御モジュールの下に、5 mL のチップ ラックが配置されています。(F) 1 mL チップの 5 つの位置。(G)2つの温度制御モジュールは底部に配置され、1つの蓋を上に駐車する位置です。(H)上部に 2 つの 50 μL ネストチップラック(NTR)の位置と、シングルチャンネル用の 2 つの位置と、300 μL チップの 96 チャネルピックアップと下部の 5 mL チップ ラック。(I) 上部に 384 ウェルカウントプレートのスタッカー、下に 300 μL NTR が 3 0 0 個、先端ラックが 5 mL です。(J)8つの再使用可能な金属1 mLの針の3つのセットのための貯蔵および洗浄装置。(K)1 mLおよび5 mLピペットチャネルおよび空のNTR(灰色)のための無駄な位置および1および5 mLチャネルのためのグリッパーブロック(白)オンデッキ輸送ステップのために使用される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:hiPSCの自動合流性チェック
(A)細胞細胞計(左)および自動合流度解析(右)の後に採取されたhiPSCの代表的な明視野(BF)画像は、緑色の細胞が占める比例領域を示す。(B) 培養1日目から6日目までの2つのhiPSC線(iPS#1および#2)から記録された高流量パーセンテージ、n = 細胞株当たり4つの1ウェルプレート。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:hiPSCの合格
(A) 手動で成長した 1 つの hiPSC ラインの BF イメージ (左) と自動培養システムを使用する (右)。画像は2回目の受け取りから6日後に撮影されました。(B) 多能性マーカー OCT4 および SSEA4 に染色された hiPSC の代表的な画像、および Hoechst 33342 (核) で染色されたカウンター;(C)多能性マーカー OCT4、NANOGおよびREX1のqRT-PCRの結果は、重複(1および2)手動(m)および自動化培養系(a)で栽培された1つのhiPSCラインで、そして各hiPSC由来皮質ニューロン(Diff)が分化の8日目(D8)にする。データは、参照サンプルとしてiPS_a_1を使用して、相対量 (RQ) として表されます。誤差範囲は、qRT-PCR反応の3つの技術的反復からの標準偏差(SD)を表します。GAPDH、RPL13A1およびRPLPOは、ハウスキーピング遺伝子として使用された。 スケールバー:100 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5 ヒトiPSC由来皮質ニューロン
(A) 6日目のブライトフィールド画像、手動(m)と自動(a)類似のニューロンネットワークを示す分化皮質ニューロン。(B) 8日目のTUBB3(汎神経細胞)、BRN2(皮質ニューロン)およびHoechst 33342(核)に染色された細胞の代表的な画像。(C) 分化8日目(D8)に富化した皮質ニューロン(MAP2、BRN2、CUX2、NCAM1、SYN1)のマーカー遺伝子に対するqRT-PCRの結果データは、参照サンプルとしてiPS_a_1を使用して、相対量 (RQ) として表されます。誤差範囲は、qRT-PCR反応の3つの技術的複製からのSDを表します。GAPDH、RPL13A1およびRPLPOは、ハウスキーピング遺伝子として使用された。 スケールバー:50 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:神経突起成長のためのハイスループットアッセイ。
(A) 分化の1日目、3日目、11日目に細胞を発現するGFPの代表的な画像。(B) 分化の日 1、3、11 の神経突起の代表的なバイナリ画像。神経突起の伸長は、高内容画像解析ソフトウェア1を用いて定量化され、ニューライト長として表されます。(B) NPC由来NGN2ニューロンの神経突起長の増加と高密度ネットワークの形成を示す図。内側の60の井戸に細胞を持つ3つの96ウェルプレートが画像化されています。簡単にするために、96ウェルプレートあたりウェルの3つの列のみが、列あたりn = 6ウェルを持つ例として示されています。1ウェル当たり平均1308個の細胞を分析した。誤差範囲は、平均の標準誤差(S.E.M.)を表します。スケールバー= 50 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7 ヒトiPSC由来mDAニューロン
中脳DAニューロンは、手動(m)および自動化された(a)培養系で分化した。(A, B)チロシンヒドロキシラーゼ(TH、mDAニューロンマーカー;緑)、MAP2(ニューロンマーカー;赤)およびHoechst 33342(核;青)のために染色されたmDAニューロンの代表的な蛍光画像;(C) mDAニューロンのマーカー遺伝子に対する代表的なqRT-PCR結果は、手動で、また自動化培養系で分化した。 TH および MAP2 発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子(OAZ1 および GAPDH)に正規化された相対量(RQ)として表されます。(D) 手動および自動分化によって生成されるTHおよびMAP2陽性ニューロンの割合。誤差範囲は、2 つの異なる iPSC 行 (#1 と #2) で実行される 2 つの独立した分化の SD を表します。スケールバー= 50 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| セルタイプ | 目的 | プロトコルのステップ | 細胞密度 | プレートフォーマット | セル番号/ウェル |
| NGN2 分化 | |||||
| Ipsc | NGN2安定ライン生成 | S.2.3. | 30,000細胞/cm2 | 12-ウェル | 1,17,000 |
| Ipsc | NGN2ニューロン分化 | 3.1.3. | 30,000細胞/cm2 | 1-ウェル | 25,20,000 |
| Ipsc | NGN2ニューロン分化 | 3.1.3. | 30,000細胞/cm2 | 96-ウェル | 9,600 |
| smNPC 世代 | |||||
| スマネンPC | 再めっき 12 日目と 16 日目 | S5.9. および S5.11. | 70,000細胞/cm2 | 6-ウェル | 6,72,000 |
| スマネンPC | 通路5から再めっき | 5.11. | 50,000細胞/cm2 | 6-ウェル | 4,80,000 |
| スマネンPC | smNPC から NGN2 ニューロン | 3.2.2 | 50,000細胞/cm2 | 96-ウェル | 16,000 |
| mDA 差別化 | |||||
| Ipsc | mDAニューロン分化 | 4.1.2. | 200,000細胞/cm2 | 1-ウェル | 1,68,00,000 |
| DAニューロン | 25日目再めっき | 4.3.2. | 400,000細胞/cm2 | 1-ウェル | 3,36,00,000 |
| DAニューロン | 25日目再めっき | 4.5.2. | 100,000セル/cm2 | 96-ウェル | 32,000 |
| コーティング | 目的 | プロトコルのステップ | 集中力/ 希釈 |
プレートフォーマット | コーティングの詳細 |
| iPS文化 | |||||
| 細胞外マトリックス | iPSC, NGN2 ライン, mDAニューロン |
1.5.7. および S2.3. | 1アリコート*; 25 mL DMEM/F-12 |
1-/12-ウェル | 8/0.5 mL/well;RT で 1 時間 |
| NGN2 分化 | |||||
| ポリ-L-オルニチン | NGN2ニューロン分化 | 3.1.3. および 3.2.2. | 0.1 mg/mL;Pbs | 1-/96-ウェル | 8/0.1 mL/well;37°Cで12時間。 3x PBS洗浄 |
| ラミニン | NGN2ニューロン分化 | 3.1.3. および 3.2.2. | 5 μg/mL;Pbs | 1-/96-ウェル | 8/0.1 mL/well;37°Cで4時間 |
| smNPC 世代 | |||||
| 細胞外マトリックス | smNPC の生成と文化 | S5.6., S5.9. S5.11. |
1アリコート*; 25 mL DMEM/F-12 |
6-ウェル | 1 mL;RTで2時間 |
| mDA 差別化 | |||||
| 細胞外マトリックス | mDA 差別化 | 4.1.2. | 1アリコート*; 25 mL DMEM/F-12 |
1-ウェル | 12 mL;37°Cで12時間 |
| ポリ-L-オルニチン | mDA 差別化 | 4.3.2. および 4.5.2. | 0.1 mg/mL;Pbs | 1-/96-ウェル | 12/0.1 mL/well; 37°Cで12時間。3x PBS洗浄 |
| ラミニン | mDA 差別化 | 4.3.2. および 4.5.2. | 10 μg/mL;Pbs | 1-/96-ウェル | 12/0.1 mL/well;37°Cで12時間 |
| フィブロネクチン | mDA 差別化 | 4.3.2. および 4.5.2. | 2 μg/mL;Pbs | 1-/96-ウェル | 12/0.1 mL/well;37°Cで12時間 |
| *細胞外マトリックスアリコートは、本製品の分析証明書に存在する希釈係数(μL)として定義されます。 | |||||
表1:プレートフォーマットに対してそれぞれ細胞密度及びコーティングをシーディングする。
| 日 | 試薬 | ||
| 0 日目 ~ 1 日目 | 100 nM LDN193189、10 μM SB431542 | ||
| 1日目~3日目 | 100 nM LDN193189,10 μM SB431542,1 mM SHH, 2 mM プルモルハミン, 100ng/mL FGF-8b |
||
| 3日目~5日目 | 100 nM LDN193189,10 μM SB431542,1 mM SHH, 2 mM プルモルハミン, 100ng/mL FGF-8b,3 μM CHIR99021 |
||
| 5日目~7日目 | 100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 2 mM プルモルファミン, 100ng/mLFGF-8b, 3 μM CHIR99021 |
||
| 7日目~9日目 | 100 nM LDN193189、1 mM SHH、3 μM CHIR99021 | ||
| 9日目~11日目 | 100 nM LDN193189、1 mM SHH、3 μM CHIR99021 | ||
| 11日目~13日目 | 3 μM CHIR99021,20 ng/mL BDNF,0.2 mM L-アスコルビン酸(AA1),20 ng/mL GDNF, 1 mM db-cAMP, 1 ng/mL TGFß3, 10 μM DAPT |
||
| 13日目~65日目 | 20 ng/mL BDNF、0.2 mM L-アスコルビン酸(AA1)、20 ng/mL GDNF、1 mM db-cAMP、 1 ng/mL TGFß3、10 μM DAPT |
||
表2:ドーパミン作動性ニューロン分化のための小分子添加
| 日 | KSR培地 | N2培地 | 分化媒体 |
| 0 日目 ~ 1 日目 | 100% | 0 | 0 |
| 1日目~3日目 | 100% | 0 | 0 |
| 3日目~5日目 | 100% | 0 | 0 |
| 5日目~7日目 | 75% | 25% | 0 |
| 7日目~9日目 | 50% | 50% | 0 |
| 9日目~11日目 | 25% | 75% | 0 |
| 11日目~13日目 | 0 | 0 | 100% |
| 13日目~65日目 | 0 | 0 | 100% |
表3:ドーパミン作動性ニューロン分化のための培地勾配
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Discussion
hiPSC培養と神経分化の標準化のための統合画像化機能を備えた自動細胞培養システムを導入します。ユーザーの介入が最小限であるため、実験変動は低く、分化中の細胞型の再現性を保証します。カレンダーベースのスケジューラは、実験の編成と並列化をサポートし、実験を行う時に高い柔軟性を可能にします。既存の方法は容易に合わせることができ、利用可能な方法のスペクトルを高めることができる。さらに、多数のアッセイプレートフォーマットを使用することができ、このシステムの柔軟性を高めることができます。CO2インキュベーター、ロボットアーム、明視野細胞サイトメーター、液体ハンドリングステーションからなる最小システムは、hiPSC培養と分化に必要な基本ユニットを形成し、学術研究所へのコストを手頃な価格で形成します。化合物の貯蔵のための自動化された-20 °Cの貯蔵システム、RNAiライブラリまたはCRISPR/Cas9ライブラリとの自動細胞培養システムの組み合わせ、および高含有/ハイスループットの顕微鏡の統合は、表向きスクリーニングの実行を可能にする。
現在の研究では、自動化された細胞培養システムは使い捨てチップを使用し、培養培地を手動でリフィルしてリバーザーに補充し、特に一晩での媒体変更やその他の培養プロセスのための液体取り扱いステーションの使用を制限した。この制限を回避するために、方法は使い捨ての先端の代わりに針の使用法に調整することができ、そして、冷蔵庫に保管された媒体ラインとメディアバッグ間のチューブ接続を取り付けた後、メディア貯留器はヒーター要素によって事前に温めた新鮮な媒体で自動的に補充することができる。これにより、チップ、培養メディア、貯水池交換の手動補充によるユーザーの干渉が軽減されます。
当社の自動細胞培養システムには、いくつかの利点があります。1つはバーコード追跡システムです。システムにロードされたプレートは、システムによって読み取られ、保存され、メソッドの実行中および実行後にサンプルを追跡できる一意のバーコードによって識別されます。もう 1 つの利点は、ユーザー固有のプロジェクトを作成する可能性です。ここでは、システムにロードされた培養プレートを特定のプロジェクトに割り当て、バッチでグループ化することができます。バッチでの構造化は、個々のプレートを選択する必要がないため、特定のバッチのすべてのプレートに対して同じ手順の実行を簡素化します。さらに、液体クラスエディタは、ピペットの速度と高さだけでなく、各液体転送ステップの吸引と分配パラメータを調整することができます。すべてのプロセスは、特定のカルチャまたはアッセイプレートに対して実行されたタスクを追跡できるように、ログ ファイルに記録されます。
ヒト人工多能性幹細胞に由来するニューロンや他の細胞型(hiPSC)は、特定の患者集団(パーキンソン病のドーパミン作動性ニューロンなど)における神経変性疾患のメカニズムを研究するためのインビトロツールとして有用であり、個別の薬物スクリーニングの可能性を提供する。hiPSCの培養は非常に時間のかかるものであり、訓練を受けた人々は複雑な分化プロトコルを実行することを要求します。我々は、hiPSCのフィーダーフリー培養を自動化培養に適応させ、2つのニューロン分化プロトコル、テトオンプロモーター10、11の下でNGN2過剰発現に基づく急速な皮質ニューロン分化プロトコル、および中脳ドーパミン作動性(mDA)ニューロンの生成のための長期的な低分子ベースのプロトコルを実装した。手動培養と分化プロトコルの簡単な転送と再現性により、自動化された培養システムは非常に便利です。自動細胞培養システムで培養したヒトiPSCは、一貫した幹細胞形態を示し、独立実験の間で再現可能な重要な多能性マーカーを発現した。さらに、hiPSC培養プロトコルの自動化は、より多くの細胞株の培養と拡張を並行して好んだ。夜間に実施予定の自動合流性チェックは、ユーザーが研究室にいたときに行われる下流プロセスステップ(例えば、分化のための細胞の収穫または手動再めっき)のために、日中にシステムを空き状態にしておく時間を節約しました。ユーザー定義の合流閾値に達すると、細胞は継代され、自動化された細胞培養システムのスタッカー上で利用可能な細胞外マトリックスコーティングされたプレートに再入れ替えられます。各通路のラウンドは約70分を取り、1つの親の版から4つの1ウェルの版を生成し、1日に20の通路の容量に変換する。
NGN2分化プロトコルの自動化は正常に行われ、異なる通路を越えてニューロン細胞の均質な集団の生成を可能にし、手動分化に匹敵する。さらに、複数の細胞株を含む大規模スクリーニング研究や、数千の試験条件/化合物を用いたスクリーニング実験の実験にかかる実験費用は、急激な分化により削減される。ライブ細胞神経突起伸長測定を含む費用対効果が高く、高スループットの読み出しは、前述の14、15、16のように、疾患モデリングのための表現型読み出しとして容易に開発、実装、使用することができる。このように、GFPを構成的に過剰発現する低分子由来神経前駆体(smNPC)細胞を用いてNGN2プロトコルをさらに適応させました。smNPC細胞は、培養培地によるコスト削減(iPSC培養によるコストの3分の1)や、実験のスケールアップに必要な時間など、さらなる利点を提供します。smNPCからの細胞収量は、iPSCで得られたものより7〜10倍高い。分化ニューロンは、手動での抗体染色や化学標識を必要とせずに完全に自動化されたイメージングプロセスを使用して数日間、正常に監視およびイメージングを行い、単独でのイメージングを含む手動手順に必要なコストと時間を節約しました。96ウェルプレートの内部60ウェルの現在のイメージングは、ウェルあたり25のフィールドがイメージングされるとプレートあたり約16分かかり、これは1000化合物のイメージングベーススクリーニングのデータを1日で取得して分析できることを意味します。将来的には、この読み出しは、神経突起の成長欠陥の救助のための複合スクリーニング研究に使用される可能性があります。
また、iPSCから中脳ドーパミン作動性(mDA)ニューロンを生成するための手動分化プロトコルの伝達も実証する。この低分子ベースの分化プロトコルは65日かかり、多くの再めっきステップと頻繁なメディアの変更のために、mDAニューロンの産生を同時に少数のiPSCラインに制限する2日ごとに、労働集約的です。自動化された mDA 分化プロトコルには、数十の iPSC 回線への分化を拡大するという大きな利点があります。最大 30 個のセル ラインを並列で区別できます。分化は主にメディアの変化に基づいているため、人間の干渉なしにほぼ全ての分化プロセスを行うことができます。自動化システムのカレンダーベースのスケジューラを使用して、差別化手順に従ってメディアの変更を計画することができました。このような多数の細胞株や培養プレートを用いて作業する1つの制限は、一晩の培地変更を行うことが不可能であった。主な理由は、私たちのシステムは、使い捨てのヒントを使用し、この手動ステップを実行するために実験室のユーザーを必要とする培養メディアの手動補充を使用するために設定されているという事実です。メディア変更プロセスを容易にするために、システムにロードされたプレートはプロジェクトに割り当てられ、バッチでグループ化されました。その後、バッチサイズは、使い捨てのヒントの数と利用可能な培養培地の量に適応しました。前述のように、この制限は、再利用可能/洗える針の実装とメディアの自動補充によって簡単に克服することができます。iPSCに示すように、細胞の自動通過/再めっきは、当社の自動細胞培養システムが提供する利便性の1つです。分化の25日目にmDAニューロンの自動再めっきをテストしました。しかし、mDAニューロンの解離には、iPSC(8分)よりも解離酵素によるインキュベーションが長く(40分)必要であり、自動再めっき処理を細胞株当たり1h以上に延長する。その結果、同じ日に30個の細胞株の自動再めっきが不可能になった。自動再めっき(プレートの輸送、ピペット)中の他のステップをスピードアップし、一晩の作業を可能にする針とメディアラインの使用にシステムを適応させることは、この制限を解決します。欠点にもかかわらず、MAP2(ニューロン)およびTH(mDAニューロン)陽性細胞の相当量を有する培養を産生するmDAニューロンの自動分化に手動プロトコルを正常に移すことができた。
数十個のiPSC細胞株を並行して分化することは、パーキンソン病を含む神経変性疾患の分子メカニズムを調査するプロジェクトで大きな関心を持っています。ただし、エラーが少なく、コストを削減してタスクを迅速に完了することは、大きな課題です。ここで紹介するプロトコル(iPSC、smNPC、mDAニューロン)の自動化により、私たちはスピードアップし、コストを削減し、プロジェクトの再現性を高めることができました。何百もの患者細胞株を含むFOUNDIN-PD(https://www.foundinpd.org/wp/)のようなプロジェクトの開発は、自動化された培養および分化プロトコルの必要性を示している。今後の視点としては、手動3次元(3D)細胞培養モデルを自動化システムに移す。プレート定義設定とアダプタの使用にマイナーな適応と、3D培養に必要な商業用またはカスタムメイドのプレートとマイクロ流体室の使用が可能になります。さらに、自動ラベルフリーイメージングモデルの実装により、神経細胞の成長をリアルタイムで追跡し、神経突起の成長、ニューロン組織、細胞死の変化を疾患メカニズムのより良い理解に変換することができます。
Disclosures
開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、この研究のために生体材料を寄稿した患者とその家族を感謝して認めている。研究で使用された細胞株は、ラトガース(ND41865をiPS#1としてND41865)とティロ・クナト博士(iPS#2)の研究室でNINDSコレクションからでした。この研究は、NOMIS財団(PH)、RiMod-FTD、EU共同プログラム - 神経変性疾患研究(JPND)(PH)によって部分的にサポートされています。DZNE I2Aイニシアチブ(AD);PD-Strat、ERA-Net ERACoSysMed資金提供プロジェクト(PH)とパーキンソン病のための基礎データイニシアチブ(FOUNDIN-PD)(PH、EB)。ファウンディン-PDは、マイケル・J・フォックス財団のPDプログラムへのパスの一部です。著者らは、マニュアルmDAニューロン分化プロトコルの確立に貢献してくれたスティーブン・フィンクビーナーとメラニー・コブ(グラッドストーン研究所)と、ノイライトアウトグロース分析のセットアップに関する支援を求めた鈴木まみ(横川電機)に感謝する。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | Distributor | Catalog Number | Dilution |
| iPSC pluripotency marker | |||
| Mouse anti-SSEA4 | Abcam | ab16287 | 1 to 33 |
| Rabbit anti-Oct3/4 | Abcam | ab19857 | 1 to 200 |
| NGN2 neuron markers | |||
| Mouse anti- TUBB3 | R & D | MAB1195 | 1 to 500 |
| Rabbit anti-BRN2 | NEB | 12137 | 1 to 1,000 |
| mDA neuron markers | |||
| Chicken anti-TH | Pel-Freez Biologicals | 12137 | 1 to 750 |
| Mouse anti-MAP2 | Santa Cruz | sc-74421 | 1 to 750 |
| Secondary antibodies | |||
| Goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11039 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | 1 to 2,000 |
| Nuclei counterstaining | |||
| Hoechest 33342 | Invitrogen | H3570 | 1 to 8,000 |
| Instruments | Distributor | Catalog Number | Description/Application |
| Agilent TapeStation system | Agilent technologies | 4200 | Automated electrophoresis for DNA and RNA samples |
| Automated -20 °C storage system | Hamilton Storage Technologies |
Sample Access Manager (SAM -20C, 3200 series) |
Storage of reagents |
| Barcode reader | Honeywell | Barcode Reader Orbit | Barcode scanner |
| Brightfield cell cytomat | Nexcelom | Celigo | Confluence check and cell counting |
| CellVoyager 7000 | Yokogawa | CellVoyager 7000 | Automated confocal microscope |
| Cytomat for cell cultures | Thermo Fisher Scientific | Cytomat 24 C, CU | 12 stackers pitch 28 mm, 12 stackers pitch 23 mm (total of 456 plates) |
| Cytomat for thawing samples | Thermo Fisher Scientific | Cytomat 2-LIN, 60 DU (Drying Unit) |
2 stackers pitch 28 mm (total of 42 plates) |
| HEPA filters | Hamilton Robotics | Hood Flow Star UV | Modified by Hamilton Robotics |
| Liquid handling station | Hamilton Robotics | Microlab Star | Channels: 8x 1-ml, 4x 5 ml and 96 Channel MPH |
| Media reservoir | Hamilton Robotics | 188211APE | Media/reagents reservoir |
| Pure water system | Veolia Water | ELGA PURELAB Classic | Provides pure water for needle wash station |
| QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System |
Thermo Fisher Scientific | QSTUDIO12KOA | Real-time PCR machine |
| Robotic arm | Hamilton Robotics | Rackrunner | Transport of plates |
| Turn table | Hamilton Robotics | Turn Table | Adjust plate orientiation |
| Uninterruptible power supply | APC | Smart UPS RT Unit, 10000 VA Power supply |
Backup power supply |
| VIAFLO-pipettes | Integra | 4500 | Electronic pipette |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4453545 | Real-time PCR machine |
| Materials | Distributor | Catalog Number | Notes |
| 1-well culture plate (84 cm2) | Thermo Fischer Scientific | 165218 | Nunc OmniTray |
| 6-well culture plates (9.6 cm2) | Greiner Bio-One | 657160 | TC treated with lid |
| 12-well culture plate (3.9 cm2) | Greiner Bio-One | 665180 | TC treated with lid |
| 96-well culture plate (0.32 cm2) | Perkin Elmer | 6005558 | CellCarrier-96 Black plate |
| Tips, 50-µL | Hamilton Robotics | 235987 | 50-uL tips |
| Tips, 300-µL | Hamilton Robotics | 235985 | 300-µL tips |
| Tips, 1000-µL | Hamilton Robotics | 235939 | 1000-µL tips |
| Tips, 5-mL | Hamilton Robotics | 184022 | 5-mL tips |
| Tubes, 15-mL | Greiner Bio-One | 188271 | 15-mL tubes |
| Tubes, 50-mL | Greiner Bio-One | 227261 | 50-mL tubes |
| Nalgene cryogenic 2.0 mL vials | Sigma Aldrich | V5007 | Cryovials |
| Plasmids | Distributor | Catalog Number | Notes |
| pLV_hEF1a_rtTA3 | Addgene | 61472 | Kind gift from Ron Weiss |
| pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro | Addgene | 61474 | Kind gift from Ron Weiss |
| pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus | Takara Bio | 631983 | |
| Primers | Sequence (forward) | Sequence (reverse) | Source |
| iPSC pluripotency | |||
| OCT4 (ID 4505967a1) | CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG | GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC | PrimerBank |
| NANOG (ID 153945815c3) | CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA | CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC | PrimerBank |
| REX1 (ID 89179322c1) | AGAAACGGGCAAAGACAAGAC | GCTGACAGGTTCTATTTCCGC | PrimerBank |
| NGN2 neurons | |||
| MAP2 (ID 87578393c1) | CTCAGCACCGCTAACAGAGG | CATTGGCGCTTCGGACAAG | PrimerBank |
| BRN2 (ID 380254475c1) | CGGCGGATCAAACTGGGATTT | TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT | PrimerBank |
| CUX2 (ID 291045458c2) | CGAGACCTCCACACTTCGTG | TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG | PrimerBank |
| NCAM1 (ID 336285437c3) | TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC | CTCACAGCGATAAGTGCCCTC | PrimerBank |
| SYNAPSIN1 (ID 91984783c3) | TGCTCAGCAGTACAACGTACC | GACACTTGCGATGTCCTGGAA | PrimerBank |
| mDA neurons | |||
| TH | CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA | CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA | NCBI primer-BLAST |
| MAP2 | GGATCAACGGAGAGCTGAC | TCAGGACTGCTACAGCCTCA | NCBI primer-BLAST |
| Housekeeping genes | |||
| GAPDH | GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG | GAGCCCCAGCCTTCTCCATG | NCBI primer-BLAST |
| OAZ1 | AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT | ATGAAGACATGGTCGGCTCG | NCBI primer-BLAST |
| RPLPO | CCTCATATCCGGGGGAATGTG | GCAGCAGCTGGCACCTTATTG | NCBI primer-BLAST |
| RPL13A | GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC | TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC | NCBI primer-BLAST |
| Media and Reagents | Distributor | Catalog Number | Use concentration |
| Coating matrix | |||
| Extracellular matrix (Matrigel) | Corning | 354277 | 10 μg/mL |
| Fibronectin | Corning | 356008 | 2 μg/mL |
| Laminin | Sigma | L2020 | 5 - 10 μg/mL |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | P3655 | 0.1 mg/mL |
| Culture media | |||
| iPSC culture medium (Essential 8 Flex medium) |
Gibco | A2858501 | |
| NGN2 neurons - NGN2 medium | |||
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 0.909 mL (50 µM) |
| B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (1%) |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Gibco | 31331093 | 484.75 mL |
| GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL ( 2 mM) |
| Insulin | Sigma | I9278 | 0.25 mL (2.5 µg/mL) |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140050 | 5 mL (0.5%) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | 5 mL (0.5%) |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 485 mL |
| mDA neurons - SRM medium | |||
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 0.5 mL (55 µM) |
| GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL (2 mM) |
| Knockout DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | 409.5 mL |
| Knockout serum replacement (serum replacement) |
Gibco | 10828028 | 75 mL (15%) |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140050 | 5 mL (1%) |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL (1%) |
| mDA neurons - N2 medium | |||
| B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (2%) |
| GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL (2 mM) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | 5 mL (1%) |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 475 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL(1%) |
| mDA neurons - Differentiation medium | |||
| B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (2%) |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 485 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL (1%) |
| NGN2 neurons - Supplements | |||
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) |
Peprotech | 450-02 | 10 ng/mL |
| CHIR99021 (CHIR) | R&D | 4423/10 | 2 μM |
| Doxycyline (dox) | Sigma | D9891 | 2.5 μg/mL |
| Glial-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) |
Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL |
| L-ascorbic acid 2-phosphate magnesium (AA2) |
Sigma | A8960 | 64 mg/L |
| Neurotrophic factor-3 (NT-3) | Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL |
| Purmorphamine (PMA) | Cayman | 10009634 | 0.5 μM |
| Puromycin | Sigma | P8833-10MG | 0.5 μg/mL |
| Thiazovivin | Merk Millipore | 420220-10MG | 2 μM |
| mDA neurons - Supplements | |||
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) |
Peprotech | 450-02 | 20 ng/mL |
| CHIR99021 (CHIR) | R&D | 4423/10 | 3 μM |
| DAPT | Cayman | 13197 | 10 µM |
| Dibutyryl-cAMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | 1 mM |
| Fibroblast Growth Factor 8B (FGF-8b) | Peprotech | 100-25 | 100 ng/mL |
| Glial-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) |
Peprotech | 450-10 | 20 ng/mL |
| L-ascorbic acid (AA1) | Sigma | A4403 | 0.2 mM |
| LDN193189 (LDN) | Cayman | 11802 | 100 nM |
| Purmorphamine (Purm) | Cayman | 10009634 | 2 μM |
| Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus (SHH) |
R&D | 1845-SH | 100 ng/mL |
| SB431542 (SB) | Cayman | 13031 | 10 μM |
| Transforming Growth Factor type ß3 (TGFß3) |
R&D | 243-B3 | 1 ng/mL |
| Y-27632 | Cayman | 10005583 | 10 µM |
| Dissociation reagents | |||
| Single cell dissociation reagent (StemPro Accutase) |
Gibco | A1110501 | 1x |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Gibco | 11575020 | 0.5 mM |
| RNA isolation and cDNA kit | |||
| RNA isolation kit | Qiagen | 74106 | Rneasy MiniKit |
| RNA lysis buffer | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | Trizol lysis buffer (RNA lysis buffer) |
| Reverse transcriptase (kit) | Thermo Fisher Scientific | 18080-085 | SuperScript III Reverse Transcriptase |
| Software | Company | Catalog Number | Description/Application |
| Cell Culture Framework (CCF) (Graphical user interface, GUI) |
Hamilton Robotics | Custom-made | User interface for the automated system |
| CellPathFinder software (image analysis software 1) |
Yokogawa | CellPathfinder HCS Software | Image analysis tool |
| CellVoyager Measurement System | Yokogawa | Included with CellVoyager 7000 |
Microscope controlling software |
| Columbus software (image analysis software 2) |
Perkin Elmer | Columbus | Image analysis tool |
| Cloud based qPCR app | Thermo Fisher Scientific | Themo Fisher cloud | Analysis software for qRT-PCR data |
| Venus software | Hamilton Robotics | VENUS Two Dynamic Schedular 5.1 Software |
Controlling software for the automated system |
References
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- Payne, N. L., Sylvain, A., O'Brien, C., Herszfeld, D., Sun, G., Bernard, C. C. A. Application of human induced pluripotent stem cells for modeling and treating neurodegenerative diseases. New biotechnology. 32 (1), 212-228 (2015).
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