Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Автоматизированное производство человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных корковых и дофаминергических нейронов с интегрированным мониторингом live-Cell

Published: August 6, 2020 doi: 10.3791/61525
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 2, 1,3
1Genome Biology of Neurodegenerative Diseases, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 2Applied Genomics for Neurodegenerative Diseases, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 3Department for Neurodegenerative Diseases, Hertie Institute for Clinical Brain Research, University of Tübingen
* These authors contributed equally

Summary

Мы показываем автоматизацию человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) культур и нейрональных дифференциаций, совместимых с автоматизированной визуализацией и анализом.

Abstract

Ручные протоколы культуры и дифференциации для индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) трудно стандартизировать, показывают высокую изменчивость и подвержены спонтанной дифференциации на нежелательные типы клеток. Методы являются трудоемкими и не легко поддаются крупномасштабным экспериментам. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали автоматизированную систему культуры клеток в сочетании с высокой пропускной способностью системы визуализации и внедрили протоколы для поддержания нескольких линий hiPSC параллельной и нейрональной дифференциации. Мы описываем автоматизацию краткосрочного протокола дифференциации с использованием нейрогенина-2 (NGN2) чрезмерного выражения для производства корковых нейронов, полученных из hiPSC, в течение 6-20128 дней, а также реализацию долгосрочного протокола дифференциации для генерации нейронов средней концентрации среднего мозга (mDA) на основе hiPSC. Кроме того, мы применили подход NGN2 к небольшой молекулы полученных нейронных клеток-предшественников (smNPC) трансндуцированных с GFP лентивируса и создана живая клетка автоматизированного нейрита нарастание анализа. Мы представляем автоматизированную систему с протоколами, подходящими для обычной культуры hiPSC и дифференциации в корковые и дофаминергические нейроны. Наша платформа подходит для долгосрочной культуры громкой связи и высокого содержания / высокой пропускной способности hiPSC основе соединения, РНК и CRISPR/ Cas9 скрининги для выявления новых механизмов заболевания и наркотиков целей.

Introduction

Человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (hiPSC) самообновляются и могут дифференцироваться практически в любом взрослом типе клеток. Эти характеристики делают hiPSC полезным инструментом для моделирования заболеваний в фундаментальных исследованиях и обнаружении лекарств1. Человеческий iPSC сохраняет генетический фон донора, который позволяет получать заболевания соответствующих типов клеток, которые наиболее пострадавших / участвующих в курсе заболевания, например, различные нейрональные подтипы для нейродегенеративныхзаболеваний 2,3. Кроме того, hiPSC преодолевает некоторые ограничения животных и клеточных моделей чрезмерного выражения путем моделирования заболеваний в контексте человека и физиологических уровней экспрессии белка, и оказались ценным активом в моделировании заболеваний, начиная от моногенных, сложных и эпигенетических расстройств, а также поздних заболеваний4.

Несмотря на эти преимущества и возможности, еще предстоит решить ряд ограничений hiPSC. Нынешние протоколы hiPSC культуры и дифференциации не являются экономически эффективными, трудными для стандартизации и трудоемкими. Шаги ручной культуры могут привести к высокой изменчивости урожайности и фенотипов из-за различий в росте и спонтанной дифференциации hiPSC. Таким образом, экспериментатор-зависимые изменения должны быть уменьшены путем внедрения более стандартизированных методов обработки и упрощения протоколов, которые могут быть достигнуты с помощьюавтоматизации 5. Создание автоматизированных протоколов культуры и дифференциации hiPSC установит общие стандарты как для академических, так и для промышленных исследовательских проектов, а также позволит создать биологически релевантные модели заболеваний и более воспроизводимые результаты.

Предыдущая работа была предпринята попытка автоматизации hiPSCкультур 6,7,8, но их протоколы были ограничены конкретными форматами пластины культуры клеток зависит от системы и не хватает адаптации к различным форматам анализа. Такие системы полезны в ссыпаях клеток, но не могут быть пригодны для автоматической дифференциации на желаемые типы клеток, фенотипирование заболеваний и скрининговые цели. Кроме того, крупномасштабная автоматизированная платформа для фибробластового производных, генерации и дифференциации hiPSCбыла описана 9, но в масштабе, который может быть достигнут только высокой пропускной способностью лабораторий, посвященных производству линий, которые кажутся привлекательными, но могут быть недоступными для многих академических лабораторий.

Мы разработали полностью автоматизированную систему культуры клеток, основанную на жидкостной обработке станции в высокой эффективности твердых частиц воздуха (HEPA)-фильтрованной среде в сочетании с инкубатором CO2 большой емкости, цитометром изображения яркого поля и роботизированной рукой для транспортировки пластин. Эти компоненты обеспечивают основу для стабильной и воспроизводимой культуры и дифференциации hiPSC. Мы дополнили систему автоматизированной системой хранения данных -20 градусов по Цельсию для хранения соединений или вирусов и высокоскоростным вращающимся диском конфокального живоклеточного изображения. Пользовательские протоколы были созданы позволяет автоматизированного посева клеток, изменения средств массовой информации, проверки слияния, расширение клеток и анализа пластин с обработкой образца и пластины изображения, что делает систему совместимой с высоким содержанием / высокой пропускной способности скринингов. Автоматизированная культура клеток и система визуализации работают с использованием программного обеспечения управления и пользовательского графического пользовательского интерфейса (GUI). GUI позволяет пользователям импортировать CSV-файлы, содержащие специфические параметры сотовой линии, необходимые для выполнения метода. Кроме того, графический интерфейс позволяет планировать многочисленные эксперименты в любой последовательности с использованием встроенного представления календаря, что позволяет полностью контролировать время, когда каждый метод начинается.

Наша автоматизированная система культуры клеток использует стандартизированные скорости пипетки, время прохода, пороговые значения слияния, плотность посева и средние объемы с гибкостью для культуры клеток в различных форматах пластин (96-, 48-, 24-, 12-, 6- или 1-колодец формат пластины). Мы адаптировали недавно опубликованный краткосрочный протокол дифференциации для преобразования hiPSC в нейроны, которые могут дать ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ нейроны TUBB3 в течение 6дней 10,11. Мы также установили автоматизированную дифференциацию и визуализацию малых молекул нейронных клеток-предшественников (smNPC) в нейроны constitutively выражая GFP под EF1a промоутер12 и iPSC в среднебрайновых дофаминергических (mDA) нейронов, адаптируя ранее опубликованный двойной SMAD протоколингибирования 13, который дает mDA нейронов в течение 65 дней.

Protocol

1. Основные процедуры автоматизации клеточных культур и визуализации

  1. Загрузите новые пластины культуры и советы
    1. Откройте графический интерфейс и нажмите на кнопку просмотра процесса ресурсов/инструментов. Для запуска любого процесса ресурса/инструмента выберите процесс ресурса/инструмента и нажмите кнопку процесса Run Instrument.
    2. Запустите процесс ресурса RunHepaHood и перезагрузки (см. шаг 1.1.1). Откройте дверь, загрузите пластины культуры ячейки и одноразовые подсказки в соответствующем положении, как указано на всплывающем изображении на управляющем ПК.
    3. Протрите дверь 70% этанола для обеззараживания и закройте его. Вы запустите процесс обеззараживания приборов из графического интерфейса (см. шаг 1.1.1). Система стерилизуется ультрафиолетовым излучением в течение 30 минут.
  2. Пополнение культурных средств массовой информации и/или реагентов диссоциации
    1. Выполните шаг инструмента RunHepahood (см. шаг 1.1.1). Откройте входную дверь станции обработки жидкости. Обеззараживать резервуары (содержащие средства массовой информации, PBS и/или реагент диссоциации) с 70% этанола и поместить их на палубу в назначенный positon (как определено в файле cfg.csv). Де-крышка резервуаров.
    2. Обеззараживать дверь 70% этанола и закрыть его. Свяжай капот HEPA, запуская процесс ресурса/инструмента "InitHepaHood" от GUI.
  3. Создание новой "Линии ячеей" и проект в графическом интерфейсе
    1. Создание/изменение пользовательских файлов "Cell line", состоящих из файлов Config (.cfg.csv No1), импорта (.imp.csv), ресурса (No.rsv.csv) и рабочего процесса (.wfl.csv) файлов.
    2. Откройте графический интерфейс и создайте новую «линию ячейки», нажав на кнопку линии «Добавить» в представлении «Редактор сотовой линии». Мастер открывается там, где необходимо выбрать файл Config и введать имя проекта с коротким описанием.
    3. Перейдите через этот мастер с помощью зеленой наконечника стрелки и подтвердить настройки, нажав на зеленый штемпель. Создайте новый проект для генерируемой "Линии ячейки", нажав на кнопку проекта Add.
    4. Введите название и описание проекта и определите цвет проекта, который будет виден в представлении календаря графического интерфейса. Перейдите на следующую страницу мастера, нажав на наконечник стрелки.
    5. Создайте новую партию, нажав на кнопку Добавить пакет и дав короткое имя и описание во всплывающем окне. Выберите все этапы процесса и запланивте время начала для каждого из этапов процесса. Закройте окно, нажав на OK.
  4. Выполнить автоматизированный метод с помощью графического интерфейса
    1. Перейдите к представлению календаря графического интерфейса и нажмите кнопку шага процесса добавления.
    2. Выберите линию ячейки и после навигации на следующую страницу мастера выберите проект. Отметайте пакет, который будет использоваться, и нажмите на наконечник стрелки, указывающий направо. В зависимости от используемого метода партии должны быть либо пустыми (для получения новых пластин), либо содержать пластины культуры или анализные пластины (все остальные процессы).
    3. Перейдите на следующую страницу мастера и выберите этап процесса, который должен быть выполнен. Перейдите на последнюю страницу этого мастера и запланируйте эксперимент. В разделе "Детали параметра" переменные, необходимые для запуска метода, могут быть изменены. Подтвердите, нажав OK.
  5. Загрузка культурных и анализных пластин в инкубатор CO2
    ПРИМЕЧАНИЕ: 1-ну пластины определяются как культуры пластин, поскольку они обычно используются для навалом клеток. Все многофункциональные пластины определяются как анализные пластины.
    1. Выполнить инструмент процесс "RunHepaHood" из графического интерфейса, как описано в шаге 1.1.1. и откройте дверь перед роботизированной рукой.
    2. Протрите дно анализных пластин 70% этанолом и тканью без ворса, если пластины загружаются для автоматической визуализации. Поместите культуру или анализные пластины на левой полке. Убедитесь, что ориентация пластины является правильной. Для анализа пластин, а A1 должен указать на роботизированную руку в то время как края культуры пластин должны указывать вправо.
    3. Протрите дверь 70% этанола для обеззараживания и закройте его.
    4. Выполнить метод "Загрузка культуры плиты" для импорта 1-колодец пластин или "Загрузка анализ пластин" для импорта многофункциональных пластин, как описано в шаге 1.4. Используйте пустую партию для запуска обоих методов. Если штрих-коды пластин уже присутствуют в этой партии, отойдайте их, нажав на флажки.
    5. Перевозите отдельные пластины с полки на платформу инкубатора CO2 с помощью роботизированной руки. Встроенная станция шаттла получает тарелку и хранит их в одной из стой инкубатора CO2. Клетки поддерживаются при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.
  6. Разгрузка пластин из инкубатора CO2
    1. Выполнить метод "Разгрузочных пластин" (см. шаг 1.4). Выберите партию, содержащую пластины, которые должны быть экспортированы. Индивидуальные пластины могут быть выбраны их штрих-кодами.
    2. Транспорт пластин из инкубатора CO2 на левую полку с помощью роботизированной руки.
    3. Запустите капот HEPA с помощью инструмента процесса "RunHepaHood", как описано в шаге 1.1.1. и откройте дверь перед роботизированной рукой. Удалите пластины, обеззараживать дверь 70% этанола перед закрытием и питания вниз HEPA капот.

2. Протоколы автоматизации

  1. Посев пластин из трубок
    1. Запустите капот HEPA, выполняя процесс инструмента RunHepaHood (см. шаг 1.1.1). Откройте дверь перед станцией обработки жидкости. Вввеку 50 мл трубки, содержащей подвеску клетки и де-крышки трубки.
    2. Откройте дверь перед роботизированной рукой и загрузите покрытые культурой пластины для приема клеток на полке. Обеззараживать и закрывать обе двери. Выполнить метод "Посев пластин из труб" (см. шаг 1.4).
    3. Подсчитайте клетки на цитометре изображения brightfield используя сразу функцию отсчета клетки. Для подсчета ячеей используйте 16 скважин в качестве реплицирует в формате пластины 384 скважины.
    4. Транспорт 384-хорошо подсчета пластины с палубы на яркое поле изображения цитометра через проигрыватель с помощью роботизированной руки и начать процесс визуализации. Цитометр автоматически определяет количество клеток на миллилитр. Принесите счетную пластину обратно в исходное положение с помощью роботизированной руки.
    5. Транспорт покрытием культуры или анализа пластины от полки до трубной палубе с помощью роботизированной руки. Удалите покрытие и семенные ячейки в определяемом пользователем количестве и объеме, подходящем для формата пластины (см. таблицу 1). Переместите пластину на шейкер на палубе на 10 с при 500 об/мин для распределения клеток и перенесите в инкубатор CO2.
  2. Автоматизированная оценка слияния
    1. Выполнить метод "Проверить слияние", как описано в шаге 1.4. Выберите партию, которая содержит по крайней мере одну культурную пластину и никаких анализных пластин. В разделе "Детали параметра" вводится "iPSCf_2020" для создания настроек получения изображений и анализа изображений.
    2. Транспортировка первой пластины из инкубатора CO2 в цитометр изображения яркого поля через проигрыватель с помощью роботизированной руки.
    3. Выполните визуализацию клеток в цитометре изображения яркого поля для проверки слияния колоний hiPSC. Используйте приложение "слияние" и изображение 13 полей 1-хорошо паштет и автоматически вычислить среднюю площадь, занятую клетками.
    4. Транспорт пластины обратно в инкубатор CO2 с помощью роботизированной руки. Повторите шаги 2.2.2. до 2.2.4. для остальных пластин.
  3. Медиа-смена культурных пластин или анализных пластин
    1. Выполнить метод "Медиа Изменение культуры плиты", как описано в шаге 1.4. и выберите партию, содержащую только культурные пластины. Установите переменную с указанием того, используются ли наконечники или иглы для трубопроводных шагов в разделе "Детали параметра". Для изменения мультимедиа любой пластины с мульти-хорошо, выполнить метод "Медиа Изменение анализных пластин" и выбрать партию, содержащую анализ пластин.
    2. Транспорт отдельных пластин из инкубатора CO2 на палубу с помощью роботизированной руки и де-крышки пластин. Автоматически наклоните пластины и аспирировать старые средства массовой информации и выбросить его в модуль сбора отходов. Добавьте 12 мл свежих средств массовой информации. Повторно закройте пластину и транспортуйте пластины обратно в инкубатор CO2 с помощью роботизированной руки.
  4. Субкультивация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнить инструмент процесс "RunHepaHood" из графического интерфейса, как описано в 1.1.1. и откройте входную дверь станции обработки жидкости. Загрузите средства массовой информации и реагент диссоциации на требуемых позициях (см. шаг 1.2). Если советы необходимо пополнить, используйте "Перезагрузка", как описано в шаге 1.1. Вввемите трубку 50 мл для получения клеточной подвески и снимите крышку трубки.
    1. Выполнить метод "Субкультивация адепт-клеток" (см. шаг 1.4). Выберите пакет, содержащий культурные пластины, которые нуждаются в субкултивации.
    2. Транспорт пластин из инкубатора CO2 на палубу с помощью роботизированной руки и де-крышки пластин. Автоматически наклоните пластины и удалите старые средства массовой информации и выбросьте их в модуль сбора отходов. Вымойте клетки один раз с 8 мл PBS. Добавьте 8 мл 0,5 мм EDTA для комков на основе прохода. Инкубировать на палубе в течение 8 минут.
    3. Удалите раствор EDTA из пластин и выбросьте его в модуль сбора отходов. Добавьте 12 мл свежей среды и транспортуйте пластины в шейкер. Встряхните при 2000 об/мин в течение 1 мин, чтобы выбить колонии.
    4. Тритурат клеточной подвески в течение пяти циклов пипетки, чтобы разбить колонии iPSC на меньшие размеры (50-u201280 мкм). Перенесите подвеску ячейки в трубку 50 мл на палубе. Семенные клетки автоматически, как описано в шаге 2.1.5, используя разделение 1 к 7.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Факультативно, одноклеточный пропуск. Создание одноклеточной подвески с использованием одного реагента диссоциации клеток (см. таблицу материалов). Вместо 0,5 мМ EDTA в шаге 2.4.2., используйте 8 мл реагента разной диссоциации клеток и инкубировать в течение 20 мин при 37 градусах Цельсия. Соберите подвеску ячейки в трубку объемом 50 мл и добавьте равный объем мультимедиа. Диссоциация с использованием одноклеточного реагента диссоциации требует ручного шага, чтобы гранулы клеток. Клетки центрифуги по 300 х г в течение 3 мин. Удалите супернатант и повторно посовелите клеточные гранулы в 12 мл требуемого средства массовой информации и приступайте к "посеву пластин из труб" (см. шаг 2.1). Дополнить средства массовой информации с 2 хиазовивин в день посева при использовании одноклеточной подвески hiPSCs.
  5. Автоматизированная высококонтентная, высокая пропускная способность изображения
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка измерения должна быть доступна (см. Дополнительный файл 1: шаг 1.1). Анализные пластины, которые будут изображены, доступны в инкубаторе.
    1. Выполнить метод "Imaging" (см. шаг 1.4). Выберите пакет, который содержит по крайней мере одну тарелку анализа и не культурную пластину. В разделе "Детали параметра" введите тип пластины, определения пластины (для стандартных 96-хорошо изображений пластин: "Плита-96-20170918113842") и название параметра измерения.
    2. Транспорт анализ пластины через проигрыватель к автоматизированному конфокальный микроскоп с помощью роботизированной руки, чтобы начать процесс визуализации. Восстановите пластину в конце изображения из микроскопа и транспортировать его обратно в инкубатор CO2. Повторите процесс оставшихся пластин в партии.

3. Автоматизированное техническое обслуживание и расширение hiPSC

  1. Последовательность автоматизированных проверок слияний, изменений мультимедиа и субкультивации
    1. Семенные клетки на пластинах 1-колодец с использованием метода "Посев пластин из трубок" (см. шаг 2.1). Кроме того, импорт вручную посеянные пластины 1-колодец с использованием метода "Загрузка культуры пластины" (см. шаг 1.5).
    2. Расписание автоматизированных проверок слияния ежедневно для мониторинга роста колонии с 1-го дня до 6-го дня культуры iPSC (см. шаг 2.2).
    3. Обновляйте средства массовой информации каждый второй день с помощью метода «Медиа-изменение культурных пластин» (см. шаг 2.3). На тарелку используется 12 мл среды.
    4. На 6-й день запустите процесс «Субкультивации» (см. шаг 2.4.).

4. Автоматизированная дифференциация

  1. IPSC человека к корковым нейронам NGN2
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ручная подготовка hiPSC. Протокол включает в себя чрезмерное выражение NGN2 с использованием лентивирусных векторов для доставки. Трансдуц hiPSC с NGN2 до rTTA3 лентивируса в соотношении 1:2 (No 107 TU/mL). Клетки затем выбираются для одного прохода с пуромицином 0,5 мкг/мл. Подробный протокол для генерации стабильных линий hiPSC-NGN2 находится в дополнительном файле 1: шаг 2.
    1. Продолжить процесс "Субкультивации", описанный с использованием одного реагента диссоциации клеток, описанного в примечании к шагу 2.4.4. когда hiPSC достигнет 70-u201280% слияния
    2. Удалите супернатант и повторно посовестийте клеточные гранулы в 12 мл NGN2 media(Таблица материалов),содержащий 2,5 мкг/мл доксициклина (докс) и 2 МК тьязовивина.
    3. Начните дифференциацию с помощью метода «Посев пластин изтруб» (см. шаг 2.1). Установите желаемую плотность посева iPSC до 30 000/см2 (см. таблицу 1). IPSC покрыться на предварительно покрытые пластины с 0,1 мг / мл поли-L-орнитин (ООП) и 5 мкг / мл ламинина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1-хорошо пластины являются предпочтительными для РНК и протеомических основе исследований в то время как 96-ну формат пластины является предпочтительным для визуализации экспериментов. Другие форматы анализных пластин, такие как 48-, 24-, 12- или 6-хорошо пластины также могут быть использованы.
    4. На 1 день дифференциации, Освежите средства массовой информации с помощью "Медиа-изменения анализных пластин (см. шаг 2.3) с использованием NGN2 среды, дополненной 2,5 мкг/мл докс и 10 МК N-2S-(3,5-дифторофенил)ацетил-L-аланил-2-фенилглицин, 1,1-dimethylethyl ester (DAPT). Продолжайте с изменениями в средствах массовой информации каждые 2'u20123 дней до желаемого дня дифференциации (см. шаг 2.3).
    5. На 4-й день дифференциации, провести еще одно изменение средств массовой информации (см. шаг 2.3.) с использованием NGN2 среды дополняется 10 нг / мл мозга полученных нейротрофический фактор (BDNF), 10 нг / мл глиальных клеток, полученных нейротрофический фактор (GDNF) и 10 нг / мл нейротрофический фактор 3 (NT-3) для повышения созревания. В конце эксперимента экспортируйте культурные пластины из системы для экспериментов ниже по течению (см. шаг 1.6).
  2. Небольшие молекулы нейронных клеток-предшественников (smNPC) к нейронам NGN2
    ПРИМЕЧАНИЕ: Получить smNPC после адаптированной версии опубликованного протокола12 (см. Дополнительный файл 1: шаг 5). Изменение smNPC с ngN2 и вирусом rTTA3 (см. Дополнительный файл 1: шаг 2). Одного раунда трансдукции NGN2 и rTTA достаточно для создания стабильной популяции. Дальнейшее изменение smNPC с pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 лентивирус позволяет выполнять мониторинг живых клеток. Множество инфекции (МВД) 10 используется для GFP лентивирусной трансдукции.
    1. Прохождение SMNPC по достижению слияния с использованием одного реагента диссоциации клеток, как описано в шаге 2.4. Примечание.
    2. Семенные клетки, использующие автоматизированную систему клеточной культуры при плотности клеток 50 000/см2 с использованием метода «Посев пластин из труб» (см. шаг 2.1.) на предварительно покрытых пластинах с 0,1 мг/мл ООП, и 5 мкг/мл ламинина в среде NGN2, дополненной 2,5 мкг/мл докса.
    3. На 3-й день выполните изменение носителя (см. шаг 1.3.) с использованием свежей среды NGN2, содержащей 2,5 мкг/мл докса и 10 МКМ ДАПТ. После третьего дня, выполнять изменения мультимедиа каждый третий день со свежей средой NGN2, содержащей 2,5 мкг /мл докс, BDNF, GDNF и NT-3 по 10 нг/мл каждый.
    4. Ячейки изображений ежедневно используют метод «Автоматизированное высокое содержание, высокая пропускная способность изображения» (см. шаг 2.5) для мониторинга статуса дифференциации с использованием GFP в качестве считывания для нейритного нараста. Установите мощность лазера до 80% и используйте время экспозиции 30 мс. Приобретайте большое количество полей (например, 25 полей) с использованием 20-х целей.
  3. Анализ пакетных изображений
    1. Выполните анализ изображений с помощью программного обеспечения для анализа изображений 1, используя шаблон нейрита.
    2. Откройте программное обеспечение. Выберите опцию "Данные" и просмотрите папку данных изображений, нажмите кнопку нормально, чтобы загрузить данные для анализа. Нажмите открытым и из верхней планки меню, выберите протокол и из меню приложения выберите neurite outgrowth. Перейдите к "алгоритмам" и используйте канал "488" для определения ядра, клеточного тела и нейрита. Отрегулируйте пороговые параметры для каждого из них.
    3. Выберите скважины, которые будут использоваться для анализа изображений. В правом нижнем углу нажмите ссылку и выберите функции, которые будут проанализированы, такие как среднее количество ячеек, общая длина скелета всего. Продолжить "предварительный анализ", а затем "предварительный просмотр".
    4. Проверьте, приемлемы ли настройки предварительного просмотра, и начните анализ в пакетном режиме. Результаты доступны в родительской папке под "отчетами" в .csv файле, который может быть открыт в Excel.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сценарий анализа изображений доступен по запросу.
    5. Участок средней длины нейрита, полученного общей длиной нейрита, нормализуется до числа клеток.

5. Автоматизированная дифференциация нейронов hiPSC на нейроны среднего мозга дофаминергического (mDA)

  1. Ручная подготовка hiPSC
    1. Разъедение 70-u201280% стечения hiPSC в одиночные клетки с помощью одного реагента диссоциации клеток. Короче говоря, инкубировать клетки с одноклеточным реагентом диссоциации (100 мкл/см2) втечение 30 мин при 37 градусов по Цельсию, собирать клеточной подвески в конической трубки, центрифуги на 200 х г в течение 5 мин и повторного перерасхода клеток гранулы в iPSC культуры среды.
    2. Семя 200 000клеток/см 2 на внеклеточных матричных пластинах с 1 колодец и iPSC культурная среда дополнена 10 МК Y-27632. Культурные клетки на ночь при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.
  2. Автоматизированная дифференциация: Фаза 1
    1. Подготовь автоматизированную систему культуры, описанную в шаге 1.1-u20121.2.
    2. Загрузите пластины культуры, содержащие клетки, в инкубатор CO2 автоматизированной системы культуры (см. шаг 1.5).
    3. Подготовка СРЕДЫ KSR (см. таблицу материалов)и дополнение к небольшим молекулам (см. таблицу 2), необходимых для стартового дня 0 дифференциации. Используйте только свежеприготовленные средства массовой информации с небольшими молекулами и факторами роста.
    4. Выполняем медиа-изменения культурных пластин, описанные в шаге 2.3 в дни 0 и 1 дифференциации, а затем каждый второй день до 25-го дня.
    5. С 5-го дня, сдвиг формулировки средств массовой информации постепенно, как описано подробно в таблице 3.
    6. На 11-й день добавьте среду дифференциации нейронов mDA, дополненную CHIR (до 13-го дня), BDNF, AA1, GDNF, db-cAMP, TGF-3 и DAPT (см. таблицу материалов).
    7. На 25-й день разгрузите пластины (см. шаг 1.6.)
  3. Ручная переплютовки 1
    1. Диссоциат день 25 mDA предшественников в одиночные клетки, используя одноклеточный реагент диссоциации. Короче говоря, инкубировать клетки с одноклеточной диссоциации реагента (100 йл /см 2) в течение 40 мин при 37 градусов по Цельсию, собирать клеточной подвески в конической трубки, центрифуги на 200 х г в течение 5 мин и повторного деления ячейки гранулы в mDA нейрон дифференциации среды.
    2. Семя 400 000 клеток/см2 в пластинах культуры 1-колодец, предварительно покрытых ООП 0,1 мг/мл, 10 мкг/мл ламинина и 2 мкг/мл фибронектина в среде дифференциации нейронов mDA, дополненной 10 МКМ Y-27632 (до 26-го дня) и небольшими молекулами и факторами роста, описанными в таблице 2. Культурные клетки на ночь при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.
  4. Автоматизированная дифференциация: Фаза 2
    1. Загрузите пластины культуры, содержащие нейроны mDA, в инкубатор CO2 автоматизированной системы культуры, описанный в шаге 1.5
    2. Подготовка mDA нейрон дифференциации среды (см. Таблица материалов) и дополнить с небольшими молекулами и факторами роста, необходимых для окончательной дифференциации от дня 26 года (см. таблицу 2).
    3. Выполняем медиа-изменения культурных пластин, как описано в шаге 2.3 на 26-й день дифференциации, а затем каждые 3'u20124 дней до 65-го дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для целей визуализации с высокой пропускной способностью рекомендуется реаляцию нейронов mDA в 96-колодец пластин при низкой плотности на день 32 дифференциации, как описано в шаге 5.5.
  5. Ручная переплютовки 2
    1. Выгрузите культурные пластины, описанные в шаге 1.6. Разобщить день 32 mDA нейронов в одиночные клетки, как описано в шаге 5.3.1.
    2. Семя 100 000 клеток/см2 в пластинах 96-колодец предварительно покрыты 0,1 мг/мл ООП, 10 мкг/мл ламинина и 2 мкг/мл фибронектина в среде дифференциации нейронов mDA, дополненной 10 МКМ Y-27632 (до 33-го дня) и небольшими молекулами и факторами роста (см. таблицу 2). Культурные клетки на ночь при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.
    3. На 33-й день замените среду свежеприготовленной дифференциацией нейронов DA, дополненной небольшими молекулами и факторами роста (без Y-27632). Изменение среды вручную каждые 3'u20124 дней до 65-го дня.

6. Иммуностиминг, автоматизированное получение и анализ изображений с высокой пропускной способностью

  1. Окрашивание флуоресценции
    1. Выполните флуоресцентный иммуностимулятор, как описано в дополнительном файле 1: шаг 4.
    2. Ячейки изображения, описанные в Дополнительном файле 1: шаг 1.2.
    3. Загрузите файлы изображений, генерируемые системой визуализации, в программное обеспечение для анализа изображений 2 (см.таблицу материалов) для дальнейшего анализа изображений, как описано в шаге 6.2.
  2. Анализ изображений с использованием программного обеспечения для анализа изображений 2
    1. Как только файлы изображений загружаются в программное обеспечение для анализа изображений 2, перейдите на функцию «анализа изображений» и создайте алгоритм анализа с помощью меню drop down.
    2. Выберите ядра с помощью задачи "найти ядра", которая обнаруживает области на изображении, принадлежащих к ядрам клеток (здесь окрашенные Hoechst). Исключите ядра из мертвых клеток (пикнотических ядер), установив порог для ядерной области или диаметра.
    3. Выберите цитоплазму клетки, используя задачу «найти цитоплазму». Эта задача обнаруживает области вокруг ядер, принадлежащих к цитоплазме клеток. Включите только хорошо сегментированные ячейки. Исключите митотические, апоптотические и плохо сегментированные клетки. Удалите ячейки, касаясь границы изображения.
    4. Добавьте задачи "рассчитать морфологические свойства" и "рассчитать свойства интенсивности". Параметры морфологии включают расчет морфологических свойств, таких как область для области, представляющие интерес. Параметры интенсивности включают расчет свойств интенсивности, таких как средняя интенсивность для области интереса (например, цитоплазма нейронов).
    5. Выберите субпопуляцию (например, положительные нейроны TH) входной популяции (все отобранные цитоплазмы) с использованием одного или нескольких условий, морфологии и/или интенсивности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно интенсивность выбирается для нейронов. Основываясь на негативном контроле, можно определить, выше какой порог интенсивности нейроны считаются положительными для TH.
    6. Определите результаты вывода. Это последний строительный блок каждого анализа. Он определяет значения считывания анализа для каждого колодец плиты культуры (результаты на колодец).
    7. Вы запустите анализ партии и экспортите результаты. Нормализует количество положительных ячеек до общего числа ядер и представляет данные в процентах от положительных клеток.

7. Количественная цепная реакция полимеразы в реальном времени (qRT-PCR)

  1. Выполните протокол qRT-PCR, описанный в дополнительном файле 1: шаг 3.

Representative Results

Наша автоматизированная клеточная культура и система визуализации была разработана, чтобы свести к минимуму вмешательство человека, что позволило нам стандартизировать выращивание hiPSC и дифференциации на различные типы клеток, таких как корковые или среднебрайновые дофаминергические (mDA) нейроны. Схематический обзор нашей автоматизированной системы культуры клеток со встроенными устройствами визуализации изображен на рисунке 1. Первоначальное введение клеточных культур в эту автоматизированную систему культуры клеток может быть сделано путем автоматического посева клеток из 50 мл трубки или с помощью "Загрузка культуры плиты" или "Загрузка анализных пластин" метод для импорта культуры или анализа пластин. Центральным компонентом нашей системы является станция обработки жидкостей, где выполняются все этапы передачи жидкости, такие как изменения мультимедиа или субкультивации. На рисунке 2 представлена изготовленная на заказ планировка палубы жидкого обработчика. Станция обработки жидкостей оборудована четырьмя позициями. Из инкубатора на палубу можно перенести до четырех пластин, что позволяет параллельно менять мультимедиа. В виду того что в методе subcultivation, и плиты культуры родителя и доки должны быть приспособлены на палубе, максимальное количество плит культуры обработанных в параллели ограничено до 2. Важной особенностью станции обработки жидкости является возможность наклона пластин во время изменения мультимедиа для полного удаления супернатанта клеточной культуры. Кроме того, жидкая станция обработки оснащена шейкерами для благоприятствования энзиматической диссоциации клеток во время выполнения протокола субкультивации. Наша автоматизированная система культуры также оснащена двумя системами визуализации: цитометром изображения яркого поля для выполнения проверки подсчета клеток и слияния и, следовательно, мониторингом роста клеток с течением времени, и двойным вращающимся диском конфокального микроскопа для быстрого, высокого содержания и изображения клеток с высоким разрешением.

Культуры hiPSC контролируются ежедневно для роста на цитометре изображения brightfield и проанализированы для процента слияния. Яркое изображение в левой панели и в правой панели зеленая маска из анализа яркого поля изображения, полученного с цитометра(рисунок 3A). Однородный рост hiPSC наблюдается с течением времени, как показано на процентном соотношении слияния двух линий hiPSC (n No 4 пластины), выращенных параллельно и подвергнутых проверке на слияние с 1-го дня до дня 6 (Рисунок 3B). По достижении установленного порога, hiPSC проплескются. Клеточные линии были отслучены вручную (м) или системой автоматизации (а) и наблюдались для поддержания типичной морфологии стволовых клеток, по крайней мере, для двух проходов, репрезентативных изображенийяркого поля (рисунок 4A). HiPSC культурный вручную (не показано) или в автоматизированной системе выставлены типичные маркер стволовых клеток OCT4 (красный) и SSEA4 (зеленый), как показано на анализе иммунофлуоресценции (Рисунок 4B). Выражение маркеров плюрипотенции OCT4, NANOG и REX1 также оценивалось на уровне мРНК по qRT-PCR(рисунок 4C). Относительная количественная оценка проводилась с помощью образцов, собранных из одной клеточной линии, выращенной вручную (м) и в автоматизированной системе культуры (a) в дубликатах (реплицирует 1 и 2). Уровни экспрессии всех трех маркеров плюрипотентности в репликациях, культивируемых в автоматизированной системе культуры, аналогичны выражению маркеров после ручной культуры. На 8-й день (D8) выражение маркеров плюрипотентности отсутствовало в корковых нейронах, дифференцированных (Diff) от hiPSC.

Одним из важных применений автоматизированной системы культуры является дифференциация hiPSC на различные типы клеток, включая нейроны. Здесь мы показываем дифференциацию hiPSC на нейроны, используя стратегию NGN2, которая производит чистую культуру корковых нейронов в очень короткое время (приблизительно 6 дней). Нейроны, дифференцированные в автоматизированной системе культуры (a) представили аналогичную морфологию и организацию нейронной сети, как нейроны, культивируемые вручную(м) (рисунок 5A). Автоматизированные дифференцированные корковые нейроны были положительными для TUBB3 (нейрон-специфический класс III β-тубулин, красный) и BRN2 (верхний маркер коркового слоя, зеленый) (Рисунок 5B), сопоставимый с вручную дифференцированных нейронов (данные не показаны). Выражение нейронных маркеров, включая микротрубокон связанный белок 2 (MAP2), молекулы адгезии нервных клеток (NCAM1) и Synapsin-1 (SYN1), а также корковые маркеры нейронов BRN2 и CUX1 (верхний корковый слой) были обогащены в нейронах в день 8 (D8) дифференциации (рисунок 5C). Очень низкое или нет выражение этих маркеров наблюдалось в hiPSC. Относительная количественная оценка проводилась с помощью образцов, собранных из одной клеточной линии, выращенной вручную (м) и в автоматизированной системе культуры (a) в дубликатах (реплицирует 1 и 2). Уровни экспрессии в репликациях показывают аналогичные различия между вручную и автоматизированными дифференциациями.

Интегрированные возможности визуализации автоматизированной системы культуры позволяют громкой сбора данных для здоровья культур, что позволяет долгосрочное автоматизированное приобретение фенотипических считывания. Используя подход NGN2 к небольшой молекуле, полученной нервным прекурсором (smNPC) линии, вызванной GFP лентивирусом, мы создали живую клетку автоматизированного нейритного анализа, в котором длина нейрита измерялась в течение 11 дней дифференциации без какого-либо ручного вмешательства. Сложность нейрита со временем увеличивалась, о чем свидетельствует область, занятая невритами на 1, 3 и 11 день, выражение GFP и замаскированные изображения из анализа(рисунок 6A, B). Увеличение длины нейрита с 1-го по 11-й день дифференциации было количественно оценено и показало аналогичное развитие в различных скважинах. Для простоты, данные только из 3 столбцов с 6 скважин каждый из 96-хорошо пластины изображен на репрезентативном графике, хотя все внутренние 60 скважин были проанализированы (Рисунок 6C).

Еще одно применение автоматизированной системы культуры показано здесь дифференциации hiPSC в MDA нейронов. Дифференциация основана на изменениях в средствах массовой информации в соответствии с заранее установленным протоколом и проводилась на автоматизированной системе культуры с 0 по 65 дней. Автоматизированные изменения мультимедиа не вызывают отслоения клеток или каких-либо других визуально обнаруживаемых изменений в дифференциации. В конце дифференциации, на 65-й день, нейроны MDA показывают клеточную организацию и морфологию (сферическая сома, длинные и колючие дендриты), сравнимые с ручнойдифференциацией (рисунок 7A, B). На уровне мРНК нейроны mDA, дифференцированные в автоматизированной системе культуры, показывают экспрессию нейрональных и mDA маркеров, MAP2 и TH (гидроксилаза тирозина),соответственно (рисунок 7C). Обе дифференциации породили значительное количество положительных нейронов TH и MAP2(рисунок 7D).

Figure 1
Рисунок 1: Схематический обзор автоматизированной клеточной культуры и платформы визуализации.
Система была разработана с поликарбонатным корпусом и двумя капотами HEPA (A и B), оснащенными четырьмя ультрафиолетовыми лампами, обеспечивающими стерильную среду для применения клеточной культуры. Пластины культуры клеток загружаются на полки перед роботизированной рукой, к которой можно получить доступ через входную дверь (C). Пластины загружаются в инкубатор CO2 (D) емкостью 456 пластин. Цитометр ярко-полевых клеток (E) используется для проверки слияний и подсчета клеток во время подкултивации. Станция обработки жидкости находится ниже одного из капотов HEPA (B). Макет палубы жидкого обработчика описан на рисунке 2. Трубная рука жидкостной станции обработки несет 96 каналов трубной головки, восемь 1 мл трубных каналов и четыре 5 мл трубных каналов. В случае 1 мл трубоувязки каналов, советы или иглы могут быть использованы для жидких переводов. Для целей скрининга клетки, посеянные в анализных пластинах, могут быть обработаны образцами, хранящимися при -20 градусов по Цельсию в автоматизированной системе хранения (F) после оттаивания этих образцов во втором инкубаторе (G). Высокая пропускная способность изображения выполняется в автоматизированном конфокального микроскопа (H), предлагая приобретать изображения в конфокальной режиме с помощью двух вращающихся дисков или в режиме эпифлуоресценции. Камера живых клеток, интегрированная в микроскоп, позволяет выполнять долгосрочную визуализацию культурных клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Расположение палубы жидкостной станции обработки.
Позиции наконечника указываются советами «50 йЛ» для 50 советов, «стандартными» для 300 наконечников, «высокими» для 1 мл наконечников и «5 мл» для 5 мл наконечников. Компоненты палубы: (A) Четыре позиции с подогревом шейкера (максимальная скорость: 2500 об/мин), которые могут быть использованы для любой культуры пластины или формата анализа пластины. Позиции шейкера оснащены зажимными захватами, которые также используются для выравнивания пластин после транспортировки на палубу. Кроме того, позиции шейкера функционируют как положение стоянки крышки для пластин во время шагов по передаче жидкости. Для представительных целей все позиции шейкера занимают 96 хорошо анализных пластин. (B)Четыре модуля наклона для обработки четырех пластин любого формата одновременно расположены на вершине. Самое низкое положение обозначает камеру сбора отходов для культуры и анализных пластин и 96-й канал трубной головки. Для репрезентативных целей все модули наклона заняты 96-ну анализными пластинами. (C)На верхнем положении находится пластина 384 хорошо для подсчета клеток. Ниже приведены две позиции для пластин, которые заняты 96-хорошо пластин для представительных целей и стойка для четырех 50 мл и четыре 15 мл труб. Самая низкая позиция занята 5 мл наконечников. (D)Три медиа-линии с позициями для медиа-резервуаров. Медиа-линии обладают датчиками уровня жидкости, которые позволяют автоматически заполнять медиа-резервуар до 250 мл мультимедиа. (E)Два модуля жидких отходов с активным стоком основаны на верхней части, ниже контролируемого температурой модуля с положением для одного контейнера (белый) и 5 мл наконечник стойки расположены. (F)Пять позиций для 1 мл советы. (G)Два контролируемых температурой модуля расположены внизу и положение для парковки одной из их крышей сверху. (H) Позиции для двух 50 йл вложенных стойки наконечник (NTR) в верхней следуют две позиции для одноканальной и 96-канал забрать 300 йл советы и 5 мл наконечник стойки в нижней части. (I) укладщик для 384-хорошо подсчета пластин в верхней следуют три 300 йл NTR и 5 мл наконечник стойки в нижней части. (J)Хранение и мытье станции для трех наборов из восьми многоразовых металлических 1 мл иглы. (K)Положение отходов для 1 мл и 5 мл трубных каналов и пустой NTR (серый), а также блок захвата для 1 и 5 мл каналов (белый), используемых для на палубе транспортных шагов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Автоматизированная проверка слияния hiPSC.
(A) Представитель брайтфилд (BF) изображения hiPSC, принятые цитометра клеток (слева) и после автоматизированного анализа слияния (справа) с указанием пропорциональной площади, занимаемой клетками в зеленом цвете; (B) Проценты влияния, записанные с двух линий hiPSC (iPS #1 и #2) с 1 по 6 день культуры, n No 4 1-хорошо пластин на линию ячейки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Пропуск hiPSC.
(A)BF изображение одной линии hiPSC, выращенной вручную (слева) и используя автоматизированную систему культуры (справа). Изображения были сделаны через 6 дней после второго прохода; (B)Репрезентативные изображения hiPSC, окрашенные для маркеров плюрипотентности OCT4 и SSEA4, и противопоявленные Hoechst 33342 (Nuclei); (C) Результаты qRT-PCR для маркеров плюрипотенции OCT4, NANOG и REX1 в одной линии hiPSC культивируется в дубликатах (1 и 2) вручную (м) и в автоматизированной системе культуры (a), и соответствующих hiPSC полученных корковых нейронов (Diff) в день 8 (D8) дифференциации. Данные представлены в качестве относительного количества (РЗ), используя iPS_a_1 в качестве эталонной выборки. Бары ошибок представляют собой стандартное отклонение (SD) от 3 технических репликаций реакции qRT-PCR. GAPDH, RPL13A1 и RPLPO были использованы в качестве генов домашнего хозяйства. Шкала бар: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Человеческие iPSC-производные корковые нейроны.
(A) Яркие изображения дня 6, вручную (м) и автоматизированные (а) дифференцированные корковые нейроны, показывающие аналогичные нейронные сети; (B) Репрезентативные изображения клеток, окрашенных для TUBB3 (пан нейронов), BRN2 (корковые нейроны) и Hoechst 33342 (ядра) на 8-й день дифференциации; (C)Результаты qRT-PCR для маркерных генов корковых нейронов (MAP2, BRN2, CUX2, NCAM1 и SYN1) обогащены в день 8 (D8) дифференциации. Данные представлены в качестве относительного количества (РЗ), используя iPS_a_1 в качестве эталонной выборки. Бары ошибок представляют SD из 3 технических репликаций реакции qRT-PCR. GAPDH, RPL13A1 и RPLPO были использованы в качестве генов домашнего хозяйства. Шкала бар: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Высокая пропускная способность анализа на нейрит нарастание.
A)репрезентативные изображения GFP, выражают ячейки в дни 1, 3 и 11 дифференциации; (B)Представитель бинарных изображений невритов в дни 1, 3 и 11 дифференциации. Нарастание нейрита было количественно оценено с помощью программного обеспечения для анализа изображений высокого содержания 1 и представлено как длина нойрита; (B) Графический отображает увеличение длины нейрита в нейронах NGN2, полученных из NPC, и формирование плотной сети. Изображены три пластины 96 скважин с клетками во внутренних 60 скважинах. Для простоты, только три колонны скважин на 96-хорошо пластины показаны в качестве примера с n и 6 скважин на столбец. В среднем 1308 клеток были проанализированы на колодец. Бары ошибок представляют собой стандартную ошибку среднего (S.E.M.). Масштабная планка 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 7
Рисунок 7: Нейроны mDA, полученные человеком iPSC.
Нейроны Midbrain DA дифференцируются вручную (м) и в автоматизированной (а) системе культуры. (A, B) Представитель флуоресцентных изображений нейронов mDA, окрашенных в гидроксилазу тирозина (TH, mDA neuron marker; зеленый), MAP2 (нейронный маркер; красный) и Hoechst 33342 (ядра; синий); (C) Репрезентативные результаты qRT-PCR для маркерных генов нейронов mDA, дифференцированных вручную и в автоматизированной системе культуры. Уровни экспрессии TH и MAP2 представлены как относительное количество (РЗ), нормализуемое для геновдомашнего хозяйства (ОАЗ1 и ГАДДХ); (D)Проценты положительных нейронов TH и MAP2, генерируемых ручной и автоматизированной дифференциацией. Бары ошибок представляют SD двух независимых дифференциаций, выполненных с двумя различными линиями iPSC (#1 и #2). Масштабная планка 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Тип ячейки Цель Шаг протокола Плотность клеток Формат плиты Номер ячейки/хорошо
Дифференциация NGN2
Ipsc Стабильная генерация линий NGN2 С.2.3. 30 000 ячеек/см2 12-хорошо 1,17,000
Ipsc Дифференциация нейронов NGN2 3.1.3. 30 000 ячеек/см2 1-хорошо 25,20,000
Ipsc Дифференциация нейронов NGN2 3.1.3. 30 000 ячеек/см2 96-ну 9,600
smNPC поколения
smNPC Replating день 12 и 16 S5.9. и S5.11. 70 000 ячеек/см2 6-ну 6,72,000
smNPC Replating от прохода 5 5.11. 50 000 ячеек/см2 6-ну 4,80,000
smNPC smNPC к нейронам NGN2 3.2.2 50 000 ячеек/см2 96-ну 16,000
дифференциация mDA
Ipsc дифференциация нейронов mDA 4.1.2. 200 000 ячеек/см2 1-хорошо 1,68,00,000
Нейроны DA День 25 replating 4.3.2. 400 000 ячеек/см2 1-хорошо 3,36,00,000
Нейроны DA День 25 replating 4.5.2. 100 000 ячеек/см2 96-ну 32,000
Покрытие Цель Шаг протокола Концентрация/
Разбавления		 Формат плиты Детали покрытия
Культура iPS
Внеклеточная матрица iPSC, линия NGN2,
нейроны mDA		 1.5.7. и S2.3. 1 алицита;
25 мл DMEM/F-12		 1-/12-хорошо 8/0,5 мл/колодец; 1 ч на RT
Дифференциация NGN2
Поли-Л-Орнитин Дифференциация нейронов NGN2 3.1.3. и 3.2.2. 0,1 мг/мл; Pbs 1-/96-хорошо 8/0,1 мл/колодец; 12 ч при 37 градусов по Цельсию;
3x PBS мыть
Ламинин Дифференциация нейронов NGN2 3.1.3. и 3.2.2. 5 мкг/мл; Pbs 1-/96-хорошо 8/0,1 мл/колодец; 4 ч при 37 градусов по Цельсию
smNPC поколения
Внеклеточная матрица smNPC поколения и культуры S5.6., S5.9.,
S5.11.		 1 алицита;
25 мл DMEM/F-12		 6-ну 1 мл; 2 ч на RT
дифференциация mDA
Внеклеточная матрица дифференциация mDA 4.1.2. 1 алицита;
25 мл DMEM/F-12		 1-хорошо 12 мл; 12 ч при 37 градусов по Цельсию
Поли-Л-Орнитин дифференциация mDA 4.3.2. и 4.5.2. 0,1 мг/мл; Pbs 1-/96-хорошо 12/0,1 мл/колодец;
12 ч при 37 градусов по Цельсию; 3x PBS мыть
Ламинин дифференциация mDA 4.3.2. и 4.5.2. 10 мкг/мл; Pbs 1-/96-хорошо 12/0,1 мл/колодец; 12 ч при 37 градусов по Цельсию
Фибронектин дифференциация mDA 4.3.2. и 4.5.2. 2 мкг/мл; Pbs 1-/96-хорошо 12/0,1 мл/колодец; 12 ч при 37 градусов по Цельсию
«Экстраклеточная матричная алицита определяется как фактор разбавления (в ОЛ), присутствующий в Сертификате анализа этого продукта.

Таблица 1: Плотность посевных клеток и покрытие, соответствующее формату пластины.

День Реагента
День 0 - 1 100 нМ LDN193189, 10 МКМ SB431542
День 1 - 3 100 нМ LDN193189, 10 МКГ SB431542, 1 мМ SHH, 2 мМ Пурморфамин,
100ng/mL FGF-8b
День 3 - 5 100 нМ LDN193189, 10 МКГ SB431542, 1 мМ SHH, 2 мМ Пурморфамин,
100ng/mL FGF-8b, 3 МК CHIR99021
День 5 - 7 100 нМ LDN193189, 1 мМ SHH, 2 мм Пурморфамин, 100нг/mLFGF-8b,
3 МК ЧИР99021
День 7 - 9 100 нМ LDN193189, 1 мМ SHH, 3 МК CHIR99021
День 9 - 11 100 нМ LDN193189, 1 мМ SHH, 3 МК CHIR99021
День 11 - 13 3 МКМ ЧИР99021, 20 нг/мл БДНФ, 0,2 м л аскорбиновой кислоты (АА1), 20 нг/мл
GDNF, 1 мМ дБ-CAMP, 1 нг/мл TGF-3, 10 МК ДАПТ
День 13 - 65 20 нг/мл BDNF, 0,2 мМ L-аскорбиновая кислота (AA1), 20 нг/мл GDNF, 1 м ДБ-ХАМП,
1 нг/мл ТГФЗ3, 10 МК ДАПТ

Таблица 2: Небольшое добавление молекулы для дифференциации дофаминергических нейронов.

День КСР средний N2 средний Дифференциация среды
День 0 - 1 100% 0 0
День 1 - 3 100% 0 0
День 3 - 5 100% 0 0
День 5 - 7 75% 25% 0
День 7 - 9 50% 50% 0
День 9 - 11 25% 75% 0
День 11 - 13 0 0 100%
День 13 - 65 0 0 100%

Таблица 3: Медиа-градиент для дифференциации дофаминергических нейронов.

Дополнительный файл 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Мы вводим автоматизированную систему культуры клеток с интегрированными возможностями визуализации для стандартизации культуры hiPSC и дифференциации нейронов. Из-за минимального вмешательства пользователя, экспериментальные изменения низкой обеспечения воспроизводимости клеточных фенотипов во время дифференциации. Планировщик на основе календаря поддерживает организацию и параллелизацию экспериментов и обеспечивает высокую степень гибкости во время времени времени экспериментов. Существующие методы можно легко адаптировать и увеличить спектр доступных методов. Кроме того, большое количество форматов анализных пластин может быть использовано в дополнение к гибкости этой системы. Минимальная система, состоящая из инкубатора CO2, роботизированной руки, цитометра ярко-клеточных клеток и жидкостной станции обработки, образует базовый блок, необходимый для культуры и дифференциации hiPSC, с доступными затратами для академических исследовательских лабораторий. Сочетание автоматизированной системы культуры клеток с автоматизированной системой хранения данных -20 градусов по Цельсию для хранения соединений, библиотек РНК или библиотек CRISPR/Cas9, а также интеграция микроскопа с высоким содержанием/высокой пропускной способностью позволяют проводить фенотипические скрининги.

В текущем исследовании автоматизированная система культуры клеток использовала одноразовые советы, а культурные средства массовой информации пополнялись вручную в резервуар, что ограничивало использование станции обработки жидкости для изменения средств массовой информации и других культурных процессов, особенно в одночасье. Чтобы обойти это ограничение, методы могут быть скорректированы с использованием иглы вместо одноразовых советов и, после установки трубных соединений между медиа-линиями и медиа-мешки, хранящиеся в холодильнике, медиа-резервуары могут быть автоматически пополнены свежими средствами массовой информации предварительно разогреты нагревательными элементами. Это позволит уменьшить помехи пользователей, вызванные ручной заправкой советов, культурных средств массовой информации и обменов резервуарами.

Наша автоматизированная система клеточной культуры предлагает ряд преимуществ. Одним из них является система отслеживания штрих-кодов. Пластины, загруженные в систему, идентифицируются уникальным штрих-кодом, который считывается и сохраняется системой, позволяющей отслеживать образцы во время и после выполнения метода. Еще одним преимуществом является возможность создания пользовательских проектов. Здесь пластины культуры, загруженные в систему, могут быть назначены конкретному проекту и сгруппированы в пакеты. Структурирование партиями упрощает выполнение одной и той же процедуры для всех пластин определенной партии, поскольку отдельные пластины не должны быть выбраны. Кроме того, редактор жидкого класса позволяет регулировать скорость и высоту труб, а также параметры аспирации и распределения для каждого шага передачи жидкости. Каждый процесс документируется в файлах журналов, что позволяет проследить, какие задачи были выполнены для данной культуры или анализа пластины.

Нейроны и другие типы клеток, полученных из человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) являются полезными инструментами in vitro для изучения механизмов нейродегенеративных заболеваний в конкретных популяциях пациентов (например, дофаминергических нейронов для болезни Паркинсона), предлагая возможность для персонализированных скринингов наркотиков. Культивирование hiPSC является очень трудоемким и требует обученных людей для выполнения сложных протоколов дифференциации, как правило, ограничивается низкомасштабного производства. Мы адаптировали фидер-свободной культуры hiPSC к автоматизированной культуре и реализованы два нейронных протоколов дифференциации, быстрый протокол дифференциации корковых нейронов на основе NGN2 чрезмерного выражения под tet-on промоутер10,11, и долгосрочный небольшой молекулы на основе протокола для генерации среднего мозга дофаминергических (MDA)нейронов 13. Простая передача и воспроизводимость протоколов ручной культуры и дифференциации делает автоматизированную систему культуры очень полезной. Человеческий iPSC, культурный в автоматизированной системе культуры клеток, показал последовательную морфологию стволовых клеток и выразил важные маркеры плюрипотенции, воспроизводимые между независимыми экспериментами. Кроме того, автоматизация протокола культуры hiPSC благоприятствовала культуре и параллельному расширению большего числа клеточных линий. Автоматизированные проверки на слияние, запланированные для времени, сэкономленного на ночь, оставляя систему свободной в течение дня для этапов процесса ниже по течению, выполняемых, когда пользователь был в лаборатории (например, сбор ячеек или ручная перезапись для дифференциаций). По достижении установленного пользователем порога слияния ячейки проносяты и перекладываются во внеклеточные матричные пластины, доступные на стекере автоматизированной системы культуры клеток. Каждый проход раунда занимает около 70 минут и генерирует четыре 1-хорошо пластины из одной родительской пластины, что переводится как емкость 20 проходов в день.

Автоматизация протокола дифференциации NGN2 была успешно выполнена и позволила генерации однородной популяции нейронных клеток через различные проходы и сопоставимы с ручной дифференциации. Кроме того, экспериментальные затраты на крупномасштабные скрининговые исследования, включающие несколько клеточных линий или скрининговые эксперименты с тысячами испытательных условий/соединений, будут сокращены из-за быстрой дифференциации. Экономически эффективные и высокой пропускной способности считывания, включая живые клетки neurite измерения вырастание может быть легко разработаны, реализованы и использованы в качестве фенотипических считывания для моделирования заболеваний, какпоказано ранее 14,15,16. Таким образом, мы дополнительно адаптировали протокол NGN2, используя небольшие молекулы, полученные нервными прекурсорами (smNPC) клетки, которые составляют чрезмерно экспресс GFP. Ячейки smNPC предлагают дополнительные преимущества, включая снижение затрат с культурными средствами массовой информации (одна треть стоимости с культурой iPSC) и время, необходимое для масштабирования экспериментов. Доходность ячеек от smNPC в 7-10 раз выше, чем у iPSC. Дифференциация нейронов была успешно проверена и изображена в течение нескольких дней с использованием полностью автоматизированного процесса визуализации без необходимости ручного окрашивания антител или химической маркировки, экономя затраты и время, необходимое для ручных процедур, включая визуализацию сама по себе. Текущая визуализация внутренних 60 скважин пластины из 96 скважин занимает около 16 минут на тарелку, когда 25 полей на скважину изображены, а это означает, что данные для скрининга на основе изображений для 1000 соединений, могут быть приобретены и проанализированы в день. В будущем, это считывание может быть использовано в сложных скрининговых исследований для спасения дефектов нейрита нарой.

Кроме того, мы также демонстрируем передачу ручного протокола дифференциации для генерации среднебрайновых дофаминергических (mDA) нейронов из iPSC. Этот небольшой протокол дифференциации на основе молекул занимает 65 дней и является трудоемким из-за многочисленных шагов replating и частые изменения средств массовой информации, в основном каждые 2 дня, что ограничивает производство нейронов MDA до нескольких линий iPSC в то же время. Автоматизированный протокол дифференциации MDA имеет большое преимущество масштабирования дифференциации до десятков линий iPSC. Параллельно можно дифференцировать до 30 клеточных линий. Поскольку дифференциация в основном основана на изменениях в средствах массовой информации, почти весь процесс дифференциации может быть проведен без вмешательства человека. Используя календарь на основе планировщика автоматизированной системы, мы могли бы планировать изменения мультимедиа в соответствии с этапами дифференциации. Одним из ограничений работы с таким большим количеством клеточных линий и культурных пластин является невозможность проведения ночных изменений в средствах массовой информации. Основная причина заключается в том, что наша система настроена на использование одноразовых советов и ручной заправки культурных средств массовой информации, требующих пользователя в лаборатории для выполнения этого ручного шага. Для облегчения процесса изменения мультимедиа пластины, загруженные в систему, были назначены проекту и сгруппированы партиями. Затем размер партии был адаптирован к количеству одноразовых советов и объему доступных культурных средств массовой информации. Как уже говорилось выше, это ограничение можно легко преодолеть путем внедрения многоразовых/моюемых игл и автоматической заправки средств массовой информации. Автоматизированное пропуск/реплатирование ячеек, как показано на iPSC, является одним из удобств, предлагаемых нашей автоматизированной системой культуры клеток. Мы протестировали автоматическое покрытие нейронов mDA на 25-й день дифференциации. Тем не менее, диссоциация нейронов MDA требует более длительной инкубации (40 мин) с диссоциациацией фермента, чем iPSC (8 мин), расширяя автоматизированный процесс переплавки до более чем 1 ч на клеточные линии. Как следствие, автоматическое перезапись 30 клеточных линий в один и тот же день стало невозможным. Ускорение других шагов при автоматическом переплетии (перевозка пластин, трубопроводов) и адаптация системы к использованию игл и медиа-линии, что делает ночную работу возможной, позволит устранить это ограничение. Несмотря на недостатки, мы могли бы успешно перенести ручной протокол на автоматизированную дифференциацию нейронов mDA, производящих культуры со значительным количеством MAP2 (нейрон) и TH (нейроны mDA) положительных клеток.

Дифференциация десятков клеточных линий iPSC параллельно представляет большой интерес в проектах, которые исследуют молекулярные механизмы нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Паркинсона. Тем не менее, для выполнения задач быстрее с меньшим количеством ошибок и при сниженных затратах является большой проблемой. Благодаря автоматизации представленных здесь протоколов (iPSC, smNPC и mDA neuron), мы могли бы ускорить, снизить затраты и увеличить воспроизводимость в наших проектах. Разработка таких проектов, как FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) с участием сотен линий клеток пациентов, свидетельствует о необходимости автоматизированной культуры и протоколов дифференциации. Наши будущие перспективы включают передачу ручных трехмерных (3D) моделей культуры клеток в автоматизированную систему. Незначительные адаптации в настройках определения пластин и использование адаптеров позволят использовать коммерческие или изготовленные на заказ пластины и микрофлюидные камеры, необходимые для 3D культур. Кроме того, внедрение автоматизированной модели изображения без меток позволит нам отслеживать рост нейронов в режиме реального времени и переводить изменения в нейритном нарое, организации нейронов и клеточной смерти в лучшее понимание механизмов заболевания.

Disclosures

Нам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы с благодарностью признают пациентов и их семьи, которые внесли свой вклад биоматериала для этого исследования. Линии клеток, используемые в исследовании, были из коллекции NINDS с Rutgers (ND41865 как iPS-1) и лаборатории доктора Тило Куната (iPS-2). Эта работа частично поддерживается Фондом NOMIS (PH), RiMod-FTD, Совместной программой ЕС - Neurodegenerative Disease Research (JPND) (PH); Инициатива «ДЗНЕ I2A» (AD); PD-Strat, финансируемый ERA-Net ERACoSysMed (PH) и Инициатива по сбору данных по болезни Паркинсона (FOUNDIN-PD) (PH, EB). FOUNDIN-PD является частью Path Фонда Майкла Джей Фокса в PD программы. Авторы благодарят Стивена Финкбейнер и Мелани Кобб (Gladstone Institutes) за вклад в создание ручного протокола дифференциации нейронов mDA и Махоми Судзуки (Yokogawa Electric Corporation) за помощь в установке анализа наройтов neurite.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies Distributor Catalog Number Dilution
iPSC pluripotency marker
Mouse anti-SSEA4 Abcam ab16287 1 to 33
Rabbit anti-Oct3/4 Abcam ab19857 1 to 200
NGN2 neuron markers
Mouse anti- TUBB3 R & D MAB1195 1 to 500
Rabbit anti-BRN2 NEB 12137 1 to 1,000
mDA neuron markers
Chicken anti-TH Pel-Freez Biologicals 12137 1 to 750
Mouse anti-MAP2 Santa Cruz sc-74421 1 to 750
Secondary antibodies
Goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11039 1 to 2,000
Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11029 1 to 2,000
Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594 Invitrogen A11032 1 to 2,000
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008 1 to 2,000
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008 1 to 2,000
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 594 Invitrogen A11012 1 to 2,000
Nuclei counterstaining
Hoechest 33342 Invitrogen H3570 1 to 8,000
Instruments Distributor Catalog Number Description/Application
Agilent TapeStation system Agilent technologies 4200 Automated electrophoresis
for DNA and RNA samples
Automated -20 °C storage system Hamilton Storage
Technologies		 Sample Access Manager
(SAM -20C, 3200 series)		 Storage of reagents
Barcode reader Honeywell Barcode Reader Orbit Barcode scanner
Brightfield cell cytomat Nexcelom Celigo Confluence check and
cell counting
CellVoyager 7000 Yokogawa CellVoyager 7000 Automated confocal
microscope
Cytomat for cell cultures Thermo Fisher Scientific Cytomat 24 C, CU 12 stackers pitch 28 mm,
12 stackers pitch 23 mm
(total of 456 plates)
Cytomat for thawing samples Thermo Fisher Scientific Cytomat 2-LIN, 60 DU
(Drying Unit)		 2 stackers pitch 28 mm
(total of 42 plates)
HEPA filters Hamilton Robotics Hood Flow Star UV Modified by Hamilton
Robotics
Liquid handling station Hamilton Robotics Microlab Star Channels: 8x 1-ml, 4x 5 ml
and 96 Channel MPH
Media reservoir Hamilton Robotics 188211APE Media/reagents reservoir
Pure water system Veolia Water ELGA PURELAB Classic Provides pure water for
needle wash station
QuantStudio 12K Flex Real-Time
PCR System		 Thermo Fisher Scientific QSTUDIO12KOA Real-time PCR machine
Robotic arm Hamilton Robotics Rackrunner Transport of plates
Turn table Hamilton Robotics Turn Table Adjust plate orientiation
Uninterruptible power supply APC Smart UPS RT Unit,
10000 VA Power supply		 Backup power supply
VIAFLO-pipettes Integra 4500 Electronic pipette
ViiA 7 Real-Time PCR System Applied Biosystems 4453545 Real-time PCR machine
Materials Distributor Catalog Number Notes
1-well culture plate (84 cm2) Thermo Fischer Scientific 165218 Nunc OmniTray
6-well culture plates (9.6 cm2) Greiner Bio-One 657160 TC treated with lid
12-well culture plate (3.9 cm2) Greiner Bio-One 665180 TC treated with lid
96-well culture plate (0.32 cm2) Perkin Elmer 6005558 CellCarrier-96 Black plate
Tips, 50-µL Hamilton Robotics 235987 50-uL tips
Tips, 300-µL Hamilton Robotics 235985 300-µL tips
Tips, 1000-µL Hamilton Robotics 235939 1000-µL tips
Tips, 5-mL Hamilton Robotics 184022 5-mL tips
Tubes, 15-mL Greiner Bio-One 188271 15-mL tubes
Tubes, 50-mL Greiner Bio-One 227261 50-mL tubes
Nalgene cryogenic 2.0 mL vials Sigma Aldrich V5007 Cryovials
Plasmids Distributor Catalog Number Notes
pLV_hEF1a_rtTA3 Addgene 61472 Kind gift from Ron Weiss
pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro Addgene 61474 Kind gift from Ron Weiss
pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus Takara Bio 631983
Primers Sequence (forward) Sequence (reverse) Source
iPSC pluripotency
OCT4 (ID 4505967a1) CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC PrimerBank
NANOG (ID 153945815c3) CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC PrimerBank
REX1 (ID 89179322c1) AGAAACGGGCAAAGACAAGAC GCTGACAGGTTCTATTTCCGC PrimerBank
NGN2 neurons
MAP2 (ID 87578393c1) CTCAGCACCGCTAACAGAGG CATTGGCGCTTCGGACAAG PrimerBank
BRN2 (ID 380254475c1) CGGCGGATCAAACTGGGATTT TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT PrimerBank
CUX2 (ID 291045458c2) CGAGACCTCCACACTTCGTG TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG PrimerBank
NCAM1 (ID 336285437c3) TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC CTCACAGCGATAAGTGCCCTC PrimerBank
SYNAPSIN1 (ID 91984783c3) TGCTCAGCAGTACAACGTACC GACACTTGCGATGTCCTGGAA PrimerBank
mDA neurons
TH CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA NCBI primer-BLAST
MAP2 GGATCAACGGAGAGCTGAC TCAGGACTGCTACAGCCTCA NCBI primer-BLAST
Housekeeping genes
GAPDH GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG GAGCCCCAGCCTTCTCCATG NCBI primer-BLAST
OAZ1 AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT ATGAAGACATGGTCGGCTCG NCBI primer-BLAST
RPLPO CCTCATATCCGGGGGAATGTG GCAGCAGCTGGCACCTTATTG NCBI primer-BLAST
RPL13A GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC NCBI primer-BLAST
Media and Reagents Distributor Catalog Number Use concentration
Coating matrix
Extracellular matrix (Matrigel) Corning 354277 10 μg/mL
Fibronectin Corning 356008 2 μg/mL
Laminin Sigma L2020 5 - 10 μg/mL
Poly-L-Ornithine (PLO) Sigma P3655 0.1 mg/mL
Culture media
iPSC culture medium
(Essential 8 Flex medium)		 Gibco A2858501
NGN2 neurons - NGN2 medium
2-mercaptoethanol Gibco 21985023 0.909 mL (50 µM)
B27 supplement Gibco 12587010 10 mL (1%)
DMEM/F-12, GlutaMAX Gibco 31331093 484.75 mL
GlutaMAX Gibco 35050038 5 mL ( 2 mM)
Insulin Sigma I9278 0.25 mL (2.5 µg/mL)
MEM Non-Essential Amino Acids Gibco 11140050 5 mL (0.5%)
N2 supplement Gibco 17502048 5 mL (0.5%)
Neurobasal medium Gibco 21103049 485 mL
mDA neurons - SRM medium
2-mercaptoethanol Gibco 21985023 0.5 mL (55 µM)
GlutaMAX Gibco 35050038 5 mL (2 mM)
Knockout DMEM/F-12 Gibco 12660012 409.5 mL
Knockout serum replacement
(serum replacement)		 Gibco 10828028 75 mL (15%)
MEM Non-Essential Amino Acids Gibco 11140050 5 mL (1%)
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 5 mL (1%)
mDA neurons - N2 medium
B27 supplement Gibco 12587010 10 mL (2%)
GlutaMAX Gibco 35050038 5 mL (2 mM)
N2 supplement Gibco 17502048 5 mL (1%)
Neurobasal medium Gibco 21103049 475 mL
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 5 mL(1%)
mDA neurons - Differentiation medium
B27 supplement Gibco 12587010 10 mL (2%)
Neurobasal medium Gibco 21103049 485 mL
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 5 mL (1%)
NGN2 neurons - Supplements
Brain-Derived Neurotrophic Factor
(BDNF)		 Peprotech 450-02 10 ng/mL
CHIR99021 (CHIR) R&D 4423/10 2 μM
Doxycyline (dox) Sigma D9891 2.5 μg/mL
Glial-Derived Neurotrophic Factor
(GDNF)		 Peprotech 450-10 10 ng/mL
L-ascorbic acid 2-phosphate
magnesium (AA2)		 Sigma A8960 64 mg/L
Neurotrophic factor-3 (NT-3) Peprotech 450-10 10 ng/mL
Purmorphamine (PMA) Cayman 10009634 0.5 μM
Puromycin Sigma P8833-10MG 0.5 μg/mL
Thiazovivin Merk Millipore 420220-10MG 2 μM
mDA neurons - Supplements
Brain-Derived Neurotrophic Factor
(BDNF)		 Peprotech 450-02 20 ng/mL
CHIR99021 (CHIR) R&D 4423/10 3 μM
DAPT Cayman 13197 10 µM
Dibutyryl-cAMP (db-cAMP) Sigma D0627 1 mM
Fibroblast Growth Factor 8B (FGF-8b) Peprotech 100-25 100 ng/mL
Glial-Derived Neurotrophic Factor
(GDNF)		 Peprotech 450-10 20 ng/mL
L-ascorbic acid (AA1) Sigma A4403 0.2 mM
LDN193189 (LDN) Cayman 11802 100 nM
Purmorphamine (Purm) Cayman 10009634 2 μM
Sonic Hedgehog/Shh (C24II)
N-Terminus (SHH)		 R&D 1845-SH 100 ng/mL
SB431542 (SB) Cayman 13031 10 μM
Transforming Growth Factor type ß3
(TGFß3)		 R&D 243-B3 1 ng/mL
Y-27632 Cayman 10005583 10 µM
Dissociation reagents
Single cell dissociation reagent
(StemPro Accutase)		 Gibco A1110501 1x
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Gibco 11575020 0.5 mM
RNA isolation and cDNA kit
RNA isolation kit Qiagen 74106 Rneasy MiniKit
RNA lysis buffer Thermo Fisher Scientific 15596018 Trizol lysis buffer (RNA
lysis buffer)
Reverse transcriptase (kit) Thermo Fisher Scientific 18080-085 SuperScript III Reverse
Transcriptase
Software Company Catalog Number Description/Application
Cell Culture Framework (CCF)
(Graphical user interface, GUI)		 Hamilton Robotics Custom-made User interface for the automated system
CellPathFinder software
(image analysis software 1)		 Yokogawa CellPathfinder HCS Software Image analysis tool
CellVoyager Measurement System Yokogawa Included with
CellVoyager 7000		 Microscope controlling
software
Columbus software
(image analysis software 2)		 Perkin Elmer Columbus Image analysis tool
Cloud based qPCR app Thermo Fisher Scientific Themo Fisher cloud Analysis software for
qRT-PCR data
Venus software Hamilton Robotics VENUS Two Dynamic
Schedular 5.1 Software		 Controlling software for the
automated system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Payne, N. L., Sylvain, A., O'Brien, C., Herszfeld, D., Sun, G., Bernard, C. C. A. Application of human induced pluripotent stem cells for modeling and treating neurodegenerative diseases. New biotechnology. 32 (1), 212-228 (2015).
  3. Wu, Y. Y., Chiu, F. L., Yeh, C. S., Kuo, H. C. Opportunities and challenges for the use of induced pluripotent stem cells in modelling neurodegenerative disease. Open Biology. 9 (1), 180177 (2019).
  4. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular cell biology. 17 (3), 170-182 (2016).
  5. Jain, S., Heutink, P. From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease. Neuron. 68 (2), 207-217 (2010).
  6. Soares, F. A. C., Chandra, A., Thomas, R. J., Pedersen, R. A., Vallier, L., Williams, D. J. Investigating the feasibility of scale up and automation of human induced pluripotent stem cells cultured in aggregates in feeder free conditions. Journal of biotechnology. 173, 53-58 (2014).
  7. Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific reports. 5, 16647 (2015).
  8. Conway, M. K., et al. Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System. Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52755 (2015).
  9. Paull, D., et al. high-throughput derivation, characterization and differentiation of induced pluripotent stem cells. Nature methods. 12 (9), 885-892 (2015).
  10. Busskamp, V., et al. Rapid neurogenesis through transcriptional activation in human stem cells. Molecular systems biology. 10, 760 (2014).
  11. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  12. Reinhardt, P., et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PloS one. 8 (3), 59252 (2013).
  13. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
  14. Koch, J. C., et al. Alpha-Synuclein affects neurite morphology, autophagy, vesicle transport and axonal degeneration in CNS neurons. Cell death & disease. 6, 1811 (2015).
  15. Korecka, J. A., et al. Neurite Collapse and Altered ER Ca2+ Control in Human Parkinson Disease Patient iPSC-Derived Neurons with LRRK2 G2019S Mutation. Stem cell reports. 12 (1), 29-41 (2019).
  16. Mehta, S. R., et al. Human Huntington's Disease iPSC-Derived Cortical Neurons Display Altered Transcriptomics, Morphology, and Maturation. Cell reports. 25 (4), 1081-1096 (2018).
  17. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC bioinformatics. 13, 134 (2012).
  18. Spandidos, A., Wang, X., Wang, H., Seed, B. PrimerBank: a resource of human and mouse PCR primer pairs for gene expression detection and quantification. Nucleic acids research. 38, Database issue 792 (2010).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 162 Автоматизированная культура клеток человека индуцированной плюрипотентной стволовой клетки высокой пропускной способности изображения нейродегенеративные заболевания корковые и дофаминергические нейроны
Автоматизированное производство человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных корковых и дофаминергических нейронов с интегрированным мониторингом live-Cell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dhingra, A., Täger, J.,… More

Dhingra, A., Täger, J., Bressan, E., Rodriguez-Nieto, S., Bedi, M. S., Bröer, S., Sadikoglou, E., Fernandes, N., Castillo-Lizardo, M., Rizzu, P., Heutink, P. Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring. J. Vis. Exp. (162), e61525, doi:10.3791/61525 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter