Summary
우리는 자동화된 화상 진찰 및 분석과 호환되는 인간 유도만능 줄기 세포 (hiPSC) 배양 및 신경 분화의 자동화를 보여줍니다.
Abstract
인간 유도만능 줄기세포(hiPSC)에 대한 수동 배양 및 분화 프로토콜은 표준화가 어렵고, 가변성을 나타내며, 원치 않는 세포 유형으로 자발적으로 분화하는 경향이 있다. 이 방법은 노동 집약적이며 대규모 실험에 쉽게 순종할 수 없습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 고처리량 이미징 시스템과 결합된 자동화된 세포 배양 시스템을 개발하고 여러 hiPSC 라인을 병렬 및 뉴런 분화로 유지하기 위한 프로토콜을 구현했습니다. 6\u20128일 이내에 hiPSC 유래 피질 뉴런을 생성하기 위해 Neurogenin-2(NGN2)를 이용한 단기 분화 프로토콜의 자동화를 설명하고, 65일 이내에 hiPSC 유래 중뇌 도파민기믹(mDA) 뉴런을 생성하는 장기 분화 프로토콜의 구현을 기술한다. 또한, 우리는 GFP 렌즈바이러스로 유도된 작은 분자 유래 신경 전구체 세포(smNPC)에 NGN2 접근법을 적용하고 살아있는 세포 자동화된 neurite 아웃growth 분석법을 확립했습니다. 우리는 일상적인 hiPSC 문화와 피질 및 도파민성 뉴런으로 분화에 적합한 프로토콜이있는 자동화 된 시스템을 제시합니다. 우리의 플랫폼은 새로운 질병 메커니즘 및 약물 목표를 식별하기 위해 장기적인 핸즈프리 문화와 고함량/고처리량 hiPSC 기반 화합물, RNAi 및 CRISPR/Cas9 스크리닝에 적합합니다.
Introduction
인간 유도만능 줄기 세포 (hiPSC)는 자기 갱신하고 거의 모든 성인 세포 유형에서 분화 할 수 있습니다. 이러한 특성은 hiPSC를 기초 연구 및 약물 발견1에서질병 모델링을위한 유용한 도구입니다. 인간 iPSC는 질병 과정에 가장 영향을 받음/관여하는 질병 관련 세포 유형을 유도할 수 있는 기증자 유전적 배경을 유지하며, 예를 들어, 신경퇴행성 질환에 대한 상이한 뉴런아류형(2,3). 또한, hiPSC는 인간의 문맥과 생리적 단백질 발현 수준에서 질병을 모델링하여 동물 및 세포 과잉 발현 모델의 일부 한계를 극복하고, 단원성, 복잡하고 후성유전학적 질환뿐만 아니라 후기 발병질환4에이르는 질병을 모델링하는 데 귀중한 자산이 되는 것으로 입증되었다.
이러한 혜택과 기회에도 불구하고 hiPSC의 몇 가지 제한 사항은 여전히 해결해야 합니다. 현재 hiPSC 문화 권양 및 차별화 프로토콜은 비용 효율적이지 않고 표준화하기 어렵고 노동 집약적입니다. 수동 배양 단계는 성장의 차이와 hiPSC의 자발적인 차별화로 인해 수율및 표현형의 가변성이 높을 수 있습니다. 따라서 자동화5를사용하여 달성할 수 있는 보다 표준화된 처리 기술을 구현하고 프로토콜을 단순화하여 실험자 의존적 변동을 줄여야 합니다. 자동화 된 hiPSC 문화 및 차별화 프로토콜의 설립은 학술 및 산업 연구 프로젝트 모두에 대한 공통 표준을 설정하고 생물학적으로 관련된 질병 모델의 생성과 더 재현 가능한 결과를 허용합니다.
이전 작품은 hiPSC 배양6,7,8의 자동화를 시도했지만, 그들의 프로토콜은 시스템에 의존하고 다른 분석 형식에 적응성이 부족 특정 세포 배양 판 형식으로 제한되었습니다. 이러한 시스템은 세포의 벌크링에 유용하지만 원하는 세포 유형, 질병 표현 및 스크리닝 목적으로 자동화된 분화에 적합하지 않을 수 있습니다. 또한, 섬유아세포 파생, hiPSC 생성 및 차별화를 위한 대규모 자동화 플랫폼은9에 설명되었지만, 많은 학술 실험실에서 매력적이지만 저렴할 수 있는 라인의 생산에 전념하는 고처리량 실험실에서만 달성할 수 있는 규모로 설명되었습니다.
고효율 미립자 공기(HEPA)의 액체 처리 스테이션을 기반으로 한 완전 자동화된 세포 배양 시스템을 개발하여 대용량 CO2 인큐베이터, 브라이트필드 이미징 사이토미터 및 플레이트 수송용 로봇 암과 함께 여과된 환경을 개발했습니다. 이러한 구성 요소는 안정적이고 재현 가능한 hiPSC 배양 및 분화를 위한 기초를 제공합니다. 우리는 화합물 또는 바이러스 저장을위한 자동화 된 -20 ° C 스토리지 시스템과 고속 방적 디스크 공초점 라이브 셀 이미저로 시스템을 보완했습니다. 맞춤형 프로토콜을 통해 자동화된 세포 시딩, 미디어 변경, 인플루엔트 검사, 세포 확장 및 분석 플레이트 생성을 샘플 처리 및 플레이트 이미징과 함께 생성하여 시스템이 고함량/고처리량 스크리닝과 호환됩니다. 자동화된 세포 배양 및 이미징 시스템은 제어 소프트웨어 및 맞춤형 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 사용하여 작동합니다. GUI를 사용하면 메서드 실행에 필요한 셀 라인 별 매개 변수가 포함된 CSV 파일을 가져올 수 있습니다. 또한 GUI를 사용하면 기본 제공 캘린더 보기를 사용하여 모든 시퀀스에서 수많은 실험을 예약할 수 있으므로 각 메서드가 시작되는 시간을 완전히 제어할 수 있습니다.
당사의 자동화된 세포 배양 시스템은 표준화된 파이펫팅 속도, 패싱 시간, 연결 임계값, 종자 밀도 및 중간 볼륨을 다양한 플레이트 형식(96, 48, 24-, 12-6 또는 1-웰 플레이트 형식)으로 배양하는 유연성을 사용합니다. 우리는 6 일10,11에서TUBB3 양성 뉴런을 얻을 수있는 뉴런으로 hiPSC를 변환하기위한 최근 발표 된 단기 분화프로토콜을조정했다. 또한 EF1a 프로모터12 및 iPSC에서 GFP를 중뇌 도파민기(mDA) 뉴런으로 통합하여 65일 이내에 mDA 뉴런을 산출하는 이중 SMAD 억제프로토콜(13)을 적용하여 작은 분자 신경 전구체 세포(smNPC)의 자동 분화 및 이미징을 뉴런으로 확립했습니다.
Protocol
1. 세포 배양 및 이미징 자동화를 위한 기본 절차
- 새로운 문화 접시와 팁로드
- GUI를 열고 리소스/계측기 프로세스 보기 버튼을 클릭합니다. 리소스/계측기 프로세스를 실행하려면 리소스/계측기 프로세스를 선택하고 실행 계측기 프로세스 버튼을 클릭합니다.
- 리소스 프로세스 RunHepaHood 및 다시 로드실행(1.1.1 단계 참조). 도어를 열고 제어 PC의 팝업 이미지에 표시된 바와 같이 셀 배양 플레이트 및 일회용 팁을 해당 위치에 로드합니다.
- 오염 제거를 위해 70% 에탄올로 문을 닦고 닫습니다. GUI에서 오염 제거 를 해제하는 계측기 공정을 실행합니다(1.1.1 단계 참조). 이 시스템은 30 분 동안 UV 방사선에 의해 멸균됩니다.
- 리필 문화 매체 및/또는 해리 시약
- 계측기 단계 RunHepahood를 실행합니다(1.1.1 단계 참조). 액체 취급 스테이션의 정문을 엽니다. 70%에탄올로 저수지(미디어, PBS 및/또는 해리 시약 포함)를 오염 제거하고 덱에 배치(cfg.csv 파일에 정의된 대로). 저장소를 디뚜껑을 닫습니다.
- 70%의 에탄올로 문을 오염제거하고 닫습니다. GUI에서 리소스/계측기 프로세스 "InitHepaHood"를 실행하여 HEPA 후드를 전원을 공급합니다.
- GUI에서 새 "셀라인" 및 프로젝트 만들기
- 컨피그(*.cfg.csv), 가져오기(*.imp.csv), 리소스(*.rsv.csv) 및 워크플로(*.wfl.csv) 파일로 구성된 사용자 정의 "셀 라인" 파일을 생성/수정합니다.
- GUI를 열고 "셀라인 편집기" 보기에서 셀라인 추가 버튼을 클릭하여 새 "셀라인"을 만듭니다. Config 파일을 선택해야 하는 마법사가 열리고 설명이 짧은 프로젝트 이름을 입력해야 합니다.
- 녹색 화살표헤드를 사용하여 이 마법사를 탐색하고 녹색 체크표시를 클릭하여 설정을 확인합니다. 프로젝트 추가 단추를 클릭하여 생성된 "셀라인"에 대한 새 프로젝트를 만듭니다.
- 프로젝트 이름과 설명을 입력하고 GUI의 캘린더 뷰에 표시되는 프로젝트 색상을 정의합니다. 화살표헤드를 클릭하여 마법사의 다음 페이지로 이동합니다.
- 배치 추가 단추를 클릭하고 팝업 창에 짧은 이름과 설명을 제공하여 새 배치를 만듭니다. 모든 프로세스 단계를 선택하고 각 프로세스 단계에 대한 시작 시간을 예약합니다. 확인을클릭하여 창을 닫습니다.
- GUI를 사용하여 자동화된 메서드 실행
- GUI의 캘린더 보기로 이동하여 프로세스 추가 단계 버튼을 클릭합니다.
- 셀줄을 선택하고 마법사의 다음 페이지로 이동한 후 프로젝트를 선택합니다. 사용할 배치를 표시하고 오른쪽을 가리키는 화살표헤드를 클릭합니다. 사용되는 방법에 따라 일괄 처리는 비어 있거나(새 플레이트 수신을 위해) 배양 판 또는 분석 플레이트(다른 모든 프로세스)를 포함해야 합니다.
- 마법사의 다음 페이지로 이동하여 실행해야 하는 프로세스 단계를 선택합니다. 이 마법사의 마지막 페이지로 이동하여 실험을 예약합니다. 메서드를 실행하는 데 필요한 "매개 변수 세부 정보" 변수 섹션에서 수정할 수 있습니다. 확인을클릭하여 확인을 클릭하여 확인합니다.
- CO2 인큐베이터에 문화 및 분석 플레이트를 적재
참고: 1웰 플레이트는 일반적으로 대량 세포에 사용되기 때문에 배양 판으로 정의됩니다. 모든 멀티웰 플레이트는 분석 플레이트로 정의됩니다.- 1.1.1 단계에서 설명된 대로 GUI에서 계측기 공정 "RunHepaHood"를 실행합니다. 로봇 팔 앞에서 문을 엽니다.
- 자동 이미징을 위해 플레이트를 적재하면 70% 에탄올과 보풀이 없는 조직으로 분석 플레이트의 바닥을 닦아냅니다. 왼쪽 선반에 문화권 이나 분석 판을 놓습니다. 플레이트의 방향이 올바른지 확인합니다. 분석 판의 경우, 잘 A1은 배양 판의 가장자리가 오른쪽을 가리키는 동안 로봇 팔을 가리킨다.
- 오염 제거를 위해 70% 에탄올로 문을 닦고 닫습니다.
- 1.4 단계에서 설명된 다중 웰 플레이트를 가져오기 위한 1웰 플레이트 또는 "분석 플레이트로드"를 가져오기 위한 "배양 플레이트 로드"를 실행합니다. 빈 배치를 사용하여 두 메서드를 모두 실행합니다. 플레이트 바코드가 이 배치에 이미 있는 경우 확인란을 클릭하여 선택 해제합니다.
- 로봇 팔을 사용하여 선반에서 CO2 인큐베이터 플랫폼으로 개별 플레이트를 운반합니다. 내장 플레이트 셔틀 스테이션은 접시를 회수하고 CO2 인큐베이터의 랙 중 하나에 저장합니다. 세포는 37°C 및 5% CO2로유지된다.
- CO2 인큐베이터에서 플레이트 하역
- 메서드 "언로드 플레이트"를 실행합니다(1.4단계 참조). 내보내야 하는 플레이트가 포함된 일괄 처리를 선택합니다. 개별 플레이트는 바코드로 선택할 수 있습니다.
- 로봇 팔을 사용하여 CO2 인큐베이터에서 왼쪽 선반으로 플레이트를 운반합니다.
- 1.1.1 단계에서 설명한 대로 계측기 공정 "RunHepaHood"를 사용하여 HEPA 후드를 시작합니다. 로봇 팔 앞에서 문을 엽니다. 접시를 제거하고 문을 70% 에탄올로 오염제거한 후 닫고 HEPA 후드를 전원을 공급합니다.
2. 자동화 프로토콜
- 튜브에서 플레이트 의 씨앗
- 계측기 프로세스 RunHepaHood를 실행하여 HEPA 후드를 시작합니다(1.1.1 단계 참조). 액체 처리 스테이션 앞의 문을 엽니다. 셀 서스펜션을 포함하는 50mL 튜브를 입력하고 튜브를 디뚜껑을 디리드한다.
- 로봇 팔 앞의 문을 열고 선반에 셀을 수신하기 위해 코팅 된 배양 판을로드합니다. 오염을 제거하고 두 문을 닫습니다. "튜브에서 플레이트 의 파싱"메서드를 실행합니다(1.4단계 참조).
- 직접 세포 계수 기능을 사용하여 밝은 필드 이미징 세포계에서 세포를 계산합니다. 셀 계산의 경우 16개의 웰을 384웰 플레이트 형식으로 복제하는 것처럼 사용하십시오.
- 384웰 카운팅 플레이트를 로봇 팔을 사용하여 턴테이블을 통해 밝은 필드 이미징 사이토미터로 운반하고 이미징 프로세스를 시작합니다. 사이토미터는 밀리리터당 세포 수를 자동으로 결정합니다. 로봇 팔을 사용하여 카운팅 플레이트를 원래 위치로 되돌려 놓습니다.
- 코팅된 배양 또는 분석판을 선반에서 로봇 팔을 사용하여 파이프팅 데크로 운반합니다. 사용자 정의 번호및 플레이트 포맷에 적합한 부피에서 코팅 및 종자 세포를 제거합니다(표 1참조). 전지 분배를 위해 500rpm에서 10s의 온데크 셰이커로 플레이트를 이동하고 CO2 인큐베이터로 옮김합니다.
- 자동 합류 평가
- 1.4 단계에서 설명된 대로 "인플루엔시확인"메서드를 실행합니다. 하나 이상의 배양 판과 분석 플레이트가 없는 일괄 처리를 선택합니다. 섹션에서 이미지 수집 및 이미징 분석 설정에 대한 "매개 변수 세부 사항"입력 "iPSCf_2020".
- 첫 번째 플레이트를 CO2 인큐베이터에서 로봇 암을 사용하여 턴테이블을 통해 밝은 필드 이미징 사이토미터로 운반합니다.
- hiPSC 식민지의 합류 검사를 위한 밝은 필드 화상 진찰 세포계에 있는 세포의 화상 진찰을 수행합니다. "합류" 응용 프로그램 및 이미지 13 1-잘 파테의 필드를 사용 하 여 자동으로 셀에 의해 점유 평균 영역을 계산 합니다.
- 로봇 암을 사용하여 플레이트를 CO2 인큐베이터로 다시 운반합니다. 2.2.2 단계를 반복합니다. 2.2.4. 나머지 플레이트의 경우.
- 문화 판 또는 분석 판의 미디어 변경
- 1.4 단계에서 설명한 대로 "문화 판의 미디어 변경"을 실행합니다. 배양판만 포함하는 일괄 처리를 선택합니다. "매개 변수 세부 정보"섹션의 파이프팅 단계에 팁이나 바늘이 사용되는지 여부를 나타내는 변수를 설정합니다. 멀티웰 플레이트의 미디어 변경을 위해 "분석 플레이트의 미디어 변경" 메서드를 실행하고 분석 플레이트가 포함된 배치를 선택합니다.
- CO2 인큐베이터에서 로봇 팔을 사용하여 개별 플레이트를 갑판으로 운반하고 플레이트를 디뚜껑을 닫습니다. 플레이트를 자동으로 기울이고 오래된 미디어를 흡인하고 폐기하여 폐기 수거 모듈에 버리십시오. 신선한 미디어의 12 mL을 추가합니다. 플레이트를 다시 뚜껑을 닫고 로봇 암을 사용하여 플레이트를 CO2 인큐베이터로 다시 운반합니다.
- 하위 육성
참고: 1.1.1에 설명된 대로 GUI에서 계측기 프로세스 "RunHepaHood"를 실행합니다. 액체 처리 스테이션의 정문을 엽니다. 필요한 위치에서 미디어 및 해리 시약을 로드합니다(1.2단계 참조). 팁을 다시 작성해야 하는 경우 1.1단계에서 설명한 대로 "다시 로드"를 사용합니다. 셀 서스펜션을 수신하기 위한 50mL 튜브를 입력하고 튜브를 디뚜껑을 디리드한다.- 메서드 "준수 셀의 하위 재배"를 실행합니다(1.4단계 참조). 하위 배양이 필요한 배양 판이 포함된 배치를 선택합니다.
- CO2 인큐베이터에서 로봇 팔을 사용하여 플레이트를 갑판으로 운반하고 플레이트를 디뚜껑을 닫습니다. 플레이트를 자동으로 기울이고 오래된 미디어를 제거하고 폐기 회수 모듈에 버리십시오. PBS8mL로 한 번 세척합니다. 0.5mM EDTA의 8mL를 추가하여 덩어리 기반 의 패싱을 합니다. 갑판에서 8 분 동안 배양하십시오.
- 플레이트에서 EDTA 용액을 제거하고 폐기 회수 모듈에 폐기하십시오. 신선한 중간 크기의 12mL를 추가하고 접시를 셰이커로 옮킨다. 2000 rpm에서 1 분 동안 흔들어 식민지를 제거하십시오.
- iPSC 콜로니를 더 작은 크기(~50\u201280 μm)로 나누기 위해 5주기의 파이펫팅 셀 서스펜션을 트리튜트합니다. 셀 서스펜션을 데크의 50mL 튜브로 옮기습니다. 종자 셀은 7에서 1의 분할 비율을 사용하여 2.1.5 단계에 설명된 바와 같이 자동으로.
참고: 선택적 단일 셀 패시징. 단일 세포 해리 시약을 사용하여 단일 셀 서스펜션을 생성합니다(재료 표참조). 2.4.2.단계에서 0.5 mM EDTA 대신, 단일 세포 해리 시약 8mL을 사용하고 37 °C에서 20 분 동안 배양하십시오. 셀 서스펜션을 50mL 튜브로 수집하고 동일한 양의 미디어를 추가합니다. 단일 세포 해리 시약을 사용하여 해리화하려면 세포를 펠렛하는 수동 단계가 필요합니다. 3 분 동안 300 x g의 원심 분리기 세포. 상체를 제거하고 필요한 매체의 12mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 "튜브에서 플레이트의 파싱"을 진행한다(2.1단계 참조). hiPSC의 단일 세포 현탁액을 사용할 때 파종 당일 2 μM 티아조비빈으로 미디어를 보충하십시오.
- 자동화된 고함량, 높은 처리량 이미징
참고: 측정 설정을 사용할 수 있어야 합니다(보충 파일 1: 1.1 단계 참조). 이미지할 분석 플레이트는 인큐베이터에서 사용할 수 있습니다.- 메서드 "이미징"을 실행합니다(1.4단계 참조). 적어도 하나의 분석 플레이트와 배양 판이 없는 배치를 선택합니다. 섹션 "매개 변수 세부 사항"에서 플레이트 유형, 플레이트 정의 (표준 96-웰 이미징 플레이트: "플레이트-96-2017091813842") 및 측정 설정의 이름을 입력합니다.
- 턴테이블을 통해 분석 판을 로봇 암을 사용하여 자동화된 공초점 현미경으로 전송하여 이미징 프로세스를 시작합니다. 현미경에서 이미징의 끝에 있는 플레이트를 복구하고 CO2 인큐베이터로 다시 운반합니다. 배치에 남은 플레이트의 프로세스를 반복합니다.
3. hiPSC의 자동 유지 보수 및 확장
-
자동 통합 검사, 미디어 변경 및 하위 배분 시퀀스
- "튜브에서 플레이트의 파종"방법을 사용하여 1 웰 플레이트의 종자 세포 (2.1 단계 참조). 또는 "배양판 로드" 방법을 사용하여 수동으로 시드된 1웰 플레이트를 가져옵니다(1.5단계 참조).
- iPSC 문화권의 1일부터 6일까지 식민지 성장을 모니터링하기 위해 매일 자동 합류 점검을 예약합니다(2.2단계 참조).
- "문화 판의 미디어 변경" 방법을 사용하여 매 2일마다 미디어를 새로 고칩니다(2.3단계 참조). 12 mL의 매체는 플레이트 당 사용된다.
- 6일째에는 "하위 육성" 프로세스를 시작합니다(2.4단계 참조).
4. 자동 차별화
- 인체 iPSC에서 피질 NGN2 뉴런
참고 : 수동 hiPSC 준비. 프로토콜은 납품을 위한 렌티바이러스 벡터를 사용하여 NGN2의 과발현을 포함합니다. 1:2 비율로 NGN2 ~ rTTA3 렌티바이러스를 가진 성우 hiPSC (> ~107 TU/mL). 그런 다음 세포는 0.5 μg/mL 푸로마이신을 가진 한 구절에 대해 선택됩니다. 안정적인 hiPSC-NGN2 라인을 생성하기위한 자세한 프로토콜은 보충 파일 1: 2 단계에 있습니다.- 단계 2.4.4의 노트에 기재된 단일 세포 해리 시약을 사용하여 설명된 바와 같이 "하위 배양" 과정을 진행한다. hiPSC가 70\u201280% 합류에 도달하면
- 2.5 μg/mL 독시사이클린(dox) 및 2 μM 티아조비빈을 함유한 NGN2매체(재료표)의12mL에서 상체를 제거하고 세포 펠릿을 재연한다.
- "튜브에서 플레이트 의파종"방법을 사용하여 차별화를 시작합니다 (단계 2.1 참조). iPSC의 원하는 시드 밀도를 30,000/cm2로 설정합니다(표 1 참조). iPSC는 0.1 mg/mL 폴리 L-오르니틴(PLO) 및 5 μg/mL 라미닌으로 미리 코팅된 플레이트에 도금됩니다.
참고: 1웰 플레이트는 RNA 및 프로테오믹스 기반 연구에서 선호되며 96웰 플레이트 포맷은 이미징 실험에 선호됩니다. 48-, 24, 12 또는 6웰 플레이트와 같은 다른 분석 플레이트 형식도 사용될 수 있다. - 차별화 첫날, 리프레시 미디어는 NGN2 배지를 사용하여 "분석 판의 미디어 변경(2.3단계 참조) 2.5 μg/mL 독스와 10 μM N-[2S-(3,5-디플루오로페닐)]아세틸]-L-alanyl-2-phenyl-글리신,디메일 1,1,디메틸(1,1,1,dpta)을 사용합니다. 원하는 분화일까지 2\u20123일마다 미디어 변경을 계속합니다(2.3단계 참조).
- 분화 4일째에, 10ng/mL 뇌 유래 신경영양인자(BDNF), 10 ng/mL 신경신경세포 유래 신경영양인자(GDNF) 및 10ng/mL 신경영양계자(NT-3)로 보충된 NGN2 배지를 사용하여 또 다른 미디어 변화(단계 2.3.참조)를 수행한다. 실험이 끝나면 다운스트림 실험을 위해 시스템에서 배양 판을 내보냅니다(1.6단계 참조).
- NGN2 뉴런에 작은 분자 신경 전구체 세포 (smNPC)
참고: 게시된 프로토콜12의 적응된 버전에 따라 smNPC를 파생합니다(보충 파일 1: 5단계 참조). NGN2 및 rTTA3 바이러스로 smNPC를 수정합니다(보충 파일 1: 2단계 참조). NGN2 및 rTTA 트랜스듀션의 한 라운드는 안정적인 인구를 생성하기에 충분합니다. 또한 라이브 셀 모니터링을 수행 할 수 있도록 pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 렌티 바이러스와 smNPC를 수정합니다. 감염의 복합성 (MOI) 10 GFP 렌즈 바이러스 변환에 사용 됩니다.- 2.4단계에서 설명된 바와 같이 단일 세포 해리 시약을 사용하여 합류성에 도달하는 통로 smNPC. 참고.
- 종자 세포는 50,000/cm2의 세포 밀도에서 자동 세포 배양 시스템을 사용하여 "튜브에서 플레이트의 파종"방법 (단계 2.1.참조) 0.1 mg / mL PLO와 사전 코팅 플레이트에, NGN2 배지에서 5 μg /mL 라미닌 2.5 μg/mL dox로 보충.
- 3일째에는 2.5 μg/mL 독스와 10μM DAPT를 함유한 신선한 NGN2 배지를 사용하여 미디어 변경(1.3단계 참조)을 수행합니다. 3일째 이후, 각각 10ng/mL에서 2.5 μg/mL 독스, BDNF, GDNF 및 NT-3을 포함하는 신선한 NGN2 배지로 3일마다 미디어 변경을 수행합니다.
- 이미지 셀매일 "자동 고함량, 높은 처리량 이미징" 방법(2.5단계 참조)을 사용하여 GFP를 사용하여 중성기 아웃성장을 위한 판독값으로 모니터링합니다. 레이저 전력을 80%로 설정하고 30ms의 노출 시간을 사용합니다. 20배 목표를 사용하여 많은 수의 필드(예: 25필드)를 획득합니다.
- 배치 이미지 분석
- 중성염 아웃성장 템플릿을 사용하여 이미지 분석 소프트웨어 1을 사용하여 이미지 분석을 수행합니다.
- 소프트웨어를 엽니다. "데이터" 옵션을 선택하고 이미징 데이터 폴더를 탐색하고 확인을 클릭하여 분석할 데이터를 로드합니다. 상단 메뉴 표시줄에서 열고 프로토콜을 선택하고 응용 프로그램 메뉴에서 중성기 아웃성장을선택합니다. "알고리즘"으로 이동하여 "488" 채널을 사용하여 핵, 세포 체 및 중성염을 정의합니다. 각각의 임계값 매개 변수를 조정합니다.
- 이미지 분석에 사용할 우물을 선택합니다. 하단 오른쪽 클릭 링크에서 셀 수 평균, 총 골격 길이 합계와 같이 분석할 피처를 선택합니다. "사전 분석"을 진행한 다음 "미리 보기"를 진행합니다.
- 미리 보기 설정이 허용되는지 확인하고 배치 모드에서 분석을 시작합니다. 결과는 excel에서 열 수 있는 .csv 파일 형식으로 "보고서"아래 의 부모 폴더에서 사용할 수 있습니다.
참고: 요청 시 이미지 분석 스크립트를 사용할 수 있습니다. - 총 중성염 길이에 의해 얻어진 평균 중성기 길이를 셀 수로 정규화한다.
5. 중뇌 도파민기 (mDA) 뉴런으로 hiPSC의 자동 분화
- 수동 hiPSC 준비
- 단일 세포 해리 시약을 사용하여 단일 세포로 70\u201280% confluent hiPSC를 해리. 간략하게, 단일 세포 해리 시약(100 μL/cm2)으로세포를 37°C에서 30분 동안 배양하고, 원추형 튜브로 세포 현탁액을 수거하고, 원심분리기는 200 x g에서 5분 동안 및 iPSC 배양 배지에서 세포 펠릿을 재중단한다.
- 종자 200,000 세포 매트릭스 코팅 1 웰 플레이트및 iPSC 배양 배지에 200,000 세포 /cm2 10 μM Y-27632로 보충. 배양 세포는 하룻밤 사이에 37°C 및 5% CO2에서.
- 자동화된 차별화: 1단계
- 1.1\u20121.2 단계에서 설명한 대로 자동화된 배양 시스템을 준비합니다.
- 자동 배양 시스템의 CO2 인큐베이터에 세포를 포함하는 배양 판을 적재한다(1.5단계 참조).
- KSR 배지 준비(재료 표참조) 및 소분자 보충제(표 2참조)를 분화의 시작 일에 필요한 경우 0일 분화하는 데 필요한 제품입니다. 작은 분자와 성장 인자를 가진 갓 준비된 매체만 사용하십시오.
- 0일과 1일 0일과 1일에 설명된 바와 같이 배양판의 미디어 변경을 수행하고 25일까지 매일 씩 수행한다.
- 5일째부터, 표 3에상세히 설명된 바와 같이 서서히 시프트 미디어 제형.
- 11일차면 CHIR(13일까지), BDNF, AA1, GDNF, db-cAMP, TGFß3 및 DAPT로 보충된 mDA 뉴런 분화 매체를 추가합니다(재료표참조).
- 25일째, 언로드 플레이트(1.6단계 참조)
- 수동 레타칭 1
- 단일 세포 해리 시약을 사용하여 단일 세포로 25 mDA 전구체를 해리. 간략하게, 단일 세포 해리 시약 (100 μL/cm2)으로세포를 37 °C에서 40 분 동안 배양하고, 원면 튜브로 세포 현탁액을 수집하고, 원심분리기는 200 x g에서 5 분 동안 200 x g로 수집하고 mDA 뉴런 분화 배지에서 세포 펠릿을 재중단한다.
- 종자 400,000 세포/cm2 에 1-웰 배양 플레이트에 0.1 mg/mL PLO, 10 μg/mL 라미닌 및 2 μg/mL 라미닌 및 mDA 뉴런 분화 배지에서 2 μg/mL fibronectin (26 일까지) 및 작은 분자 및 성장 인자 설명 2. 배양 세포는 하룻밤 사이에 37°C 및 5% CO2에서.
- 자동화된 차별화: 2단계
- mDA 뉴런을 함유한 적재배양판은 1.5단계에서 설명된 바와 같이 자동화된 배양 시스템의CO2 인큐베이터에
- mDA 뉴런 분화 배지를 준비(재료표참조) 및 26일 이후최종 분화에 필요한 소분자 및 성장인자를 보충한다(표 2참조).
- 26일 2.3단계에서 설명한 바와 같이 문화판의 미디어 변경을 수행한 다음, 65일까지 3\u20124일마다 수행한다.
참고: 고처리량 이미징 을 위해, 5.5 단계에서 설명된 바와 같이, 분화의 32일째에 저밀도에서 96웰 플레이트에서 mDA 뉴런을 재플레이트하는 것이 좋습니다.
- 수동 레볼레이팅 2
- 1.6 단계에서 설명된 바와 같이 배양 판을 언로드합니다. 단계 5.3.1에 기술된 바와 같이 단일 세포로 32mDA 뉴런을 해리한다.
- 종자 100,000 세포/cm2 에 0.1 mg/mL PLO, 10 μg/mL 라미닌 및 2 μg/mL 라미닌 및 2 μg/mL fibronectin mDA 뉴런 분화 매체에 10 μM Y-27632 (33 일까지) 및 작은 분자 및 성장 인자 (표 2참조). 배양 세포는 하룻밤 사이에 37°C 및 5% CO2에서.
- 33일째에, 소량 분자 및 성장 인자(Y-27632 없이)로 보충된 갓 준비된 DA 뉴런 분화 매체에 의해 배지를 교체하십시오. 65일까지 3\u20124일마다 수동으로 중간을 변경합니다.
6. 면역 스테인닝, 자동화된 고처리량 이미지 수집 및 분석
-
형광 염색
- 보충 파일 1: 단계 4에 설명 된 바와 같이 형광 면역 염색을 수행합니다.
- 보충 파일 1에설명 된 이미지 셀 1 : 단계 1.2.
- 영상 시스템에 의해 생성된 이미징 파일을 이미지 분석 소프트웨어 2(재료 표참조)에 업로드하여 6.2 단계에서 설명된 바와 같이 추가 이미지 분석을 위해 한다.
-
이미지 분석 소프트웨어를 이용한 이미지 분석 2
- 이미징 파일이 이미지 분석 소프트웨어 2에 업로드되면 "이미지 분석" 함수로 이동하여 드롭다운 메뉴를 사용하여 분석 알고리즘을 빌드합니다.
- 세포 핵에 속하는 이미지의 영역을 감지하는 작업 "핵 찾기"를 사용하여 핵을 선택하십시오 (여기 Hoechst로 염색). 핵 영역 또는 직경에 대한 임계값을 설정하여 죽은 세포 (pyknotic 핵)에서 핵을 제외하십시오.
- "세포질 찾기"라는 작업을 사용하여 세포질을 선택합니다. 이 작업은 세포 세포질에 속하는 핵 의 주위에 지구를 검출합니다. 잘 분할된 셀만 포함합니다. 미토틱, 세포 세포 및 심하게 세분화된 세포를 제외합니다. 이미지의 테두리를 터치하는 셀을 제거합니다.
- "형태 속성 계산"과 "강도 속성 계산"작업을 추가합니다. 형태 매개 변수에는 관심 영역에 대한 영역과 같은 형태 속성의 계산이 포함됩니다. 강도 매개 변수는 관심 영역(예: 뉴런의 세포질)에 대한 평균 강도와 같은 강도 특성의 계산을 포함한다.
- 하나 이상의 조건, 형태 및/또는 강도를 사용하여 입력 모집단(예를 들어, TH 양성 뉴런)을 선택한다.
참고 : 일반적으로, 강도는 뉴런을 위해 선택됩니다. 부정적인 컨트롤에 기초하여, 뉴런이 TH에 대해 양성으로 간주되는 강도의 임계 값을 위에 정의 할 수 있습니다. - 출력 결과를 정의합니다. 이것은 각 분석의 마지막 구성 요소입니다. 배양판의 각 웰에 대한 분석 판독 값(음당 결과)을 정의합니다.
- 일괄 처리 분석을 실행하고 결과를 내보냅니다. 양수 세포의 수를 총 핵 수로 정규화하고 데이터를 양수 세포의 백분율로 나타낸다.
7. 정량 적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 (qRT-PCR)
- 보충 파일 1: 3 단계에 설명 된 바와 같이 qRT-PCR 프로토콜을 수행합니다.
Representative Results
당사의 자동화된 세포 배양 및 이미징 시스템은 인체 의 개입을 최소화하여 hiPSC의 재배와 피질 또는 중뇌 도파민제(mDA) 뉴런과 같은 다른 세포 유형으로 분화할 수 있도록 설계되었습니다. 통합 이미징 장치를 갖춘 자동화된 세포 배양 시스템의 회로도 개요는 그림 1에묘사되어 있습니다. 이러한 자동화된 세포 배양 시스템에 세포 배양을 처음 도입한 것은 50mL 튜브에서 세포를 자동으로 파종하거나 배양 또는 분석 플레이트의 가져오기를 위한 "배양 판의 적재" 또는 "분석 플레이트의 적재" 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 우리 시스템의 핵심 구성 요소는 미디어 변경 또는 하위 재배와 같은 모든 액체 전송 단계가 수행되는 액체 처리 스테이션입니다. 액체 처리기의 사용자 지정 데크 레이아웃은 그림 2로표시됩니다. 액체 처리 스테이션에는 4개의 위치가 장착되어 있습니다. 최대 4개의 플레이트를 인큐베이터에서 데크로 전송하여 병렬 미디어 변경을 허용할 수 있습니다. 하위 재배 방법에서, 부모와 딸 문화 판은 모두 갑판에 수용되어야하기 때문에, 병렬로 처리 된 배양 플레이트의 최대 수는 2로 제한됩니다. 액체 처리 스테이션의 중요한 특징은 세포 배양 상류체의 완전한 제거를 위해 미디어 변화 중에 플레이트를 기울일 수 있다는 것입니다. 또한, 액체 처리 스테이션은 하위 배양 프로토콜의 실행 중에 세포의 효소 해리를 선호하는 셰이커가 장착되어 있습니다. 당사의 자동화된 배양 시스템에는 세포 계산 및 합류 검사를 수행하기 위한 브라이트필드 이미징 사이토미터와 시간이 지남에 따라 세포 성장을 모니터링하는 브라이트필드 이미징 사이토미터, 세포의 신속하고 높은 함량 및 고해상도 이미징을 위한 이중 회전 디스크 공초점 현미경의 두 가지 이미징 시스템이 장착되어 있습니다.
hiPSC 배양은 밝은 필드 화상 진찰 세포계에서 성장을 위해 매일 감시되고 합류의 백분율로 분석됩니다. 왼쪽 패널과 오른쪽 패널의 밝은 필드 이미지는 사이토미터(그림3A)로얻은 브라이트필드 이미지의 분석에서 녹색 마스크를 한다. 동질적인 hiPSC 성장은 1일부터 6일까지 2개의 hiPSC 라인(n= 4 플레이트)의 합류 비율에 의해 도시된 바와 같이 시간이 지남에 따라 관찰된다(그림3B). 설정된 임계값에 도달하면 hiPSC가 통과됩니다. 세포주(m) 또는 자동화(a) 시스템에 의해 수동으로 배양되었고, 적어도 두 개의 구절에 대한 전형적인 줄기 세포 형태의 유지를 위해 관찰되었다, 대표적인 브라이트필드이미지(도 4A). hiPSC는 면역형광분석(도 4B)에도시된 바와 같이, 전형적인 줄기세포 마커 OCT4(빨간색) 및 SSEA4(green)를 나타내기 위해 수동으로 배양(도시되지 않음) 또는 자동화된 시스템에서 나타낸 것이다. 100월4일, 나노G 및 REX1의 발현은 qRT-PCR(도4C)에의해 mRNA 수준에서평가되었다. 상대적 정량화는 수동으로 재배된 세포주(m) 및 자동화된 배양 시스템(a)에서 수집된 샘플(1 및 2 복제)으로 수행하였다. 자동화된 배양 시스템에서 배양된 복제본내의 3개의 pluripotency 마커의 발현 수준은 수동 배양 후 마커 발현과 유사하다. 8일째(D8)에, 구막성 마커의 발현은 hiPSC로부터 분화된 피질 뉴런(Diff)에 결석하였다.
자동화된 배양 시스템의 한 가지 중요한 적용은 hiPSC를 뉴런을 포함한 다른 세포 유형으로 분화하는 것입니다. 여기서 우리는 매우 짧은 시간 (약 6 일)에 순수한 피질 뉴런 배양을 생산하는 NGN2 전략을 사용하여 신경으로 hiPSC의 분화를 보여줍니다. 자동화된 배양 시스템에서 분화된 뉴런(a)은 뉴런이 수동으로 재배되는 것과 유사한 형태및 뉴런 네트워크 조직을 제시하였다(도5A). 자동 분화 피질 뉴런은 TUBB3(뉴런 특이적 클래스 III β-튜룰린, 레드) 및 BRN2(상부 피질 층 마커, 녹색)(도 5B)에대해 양성이었다. 마이크로투블러 관련 단백질2(MAP2),신경세포 접착분자(NCAM1)및 시냅신-1(SYN1) 뿐만 아니라피질 뉴런 마커 BRN2 및 CUX1(상부 피질 층)을 포함하는 뉴런 마커의 발현은 8일째(D8)의 뉴런으로 농축되었다(5C). 이러한 마커의 발현이 매우 낮거나 전혀 hiPSC에서 관찰되지 않았다. 상대적 정량화는 수동으로 재배된 세포주(m) 및 자동화된 배양 시스템(a)에서 수집된 샘플(1 및 2 복제)으로 수행하였다. 복제의 식 수준은 수동으로 및 자동화된 차별화 간에 유사한 변형을 보여 준다.
자동화된 배양 시스템의 통합 이미징 기능을 통해 문화 건강을 위한 핸즈프리 데이터 수집을 통해 페노티픽 판독을 장기적으로 자동화할 수 있습니다. GFP 렌티바이러스로 유래된 작은 분자 유래 신경 전구체(smNPC) 라인에 대한 NGN2 접근법을 사용하여, 우리는 중성자 길이가 수동 개입 없이 11일 이상 분화되는 살아있는 세포 자동화 된 neurite 아웃growth 분석법을 확립했습니다. 1일, 3일 및 11일째에 중성염을 점유한 부위에 의해 입증된 바와 같이,분석(그림 6A, B)에서GFP 발현 및 마스크된 이미지에 의해 입증된 바와 같이, 시간이 지남에 따라 중성성 복잡성이 증가했다. 1일째부터 11일까지 의 중성자 길이의 증가는 정량화되었고 다른 우물에서 유사한 발전을 보였다. 단순성을 위해, 96웰 플레이트에서 각각 6개의 우물이 있는 3개의 컬럼의 데이터는 모두 내부 60개의 우물을 분석했음에도 대표 그래프에 묘사된다(도6C).
여기에 표시된 자동화 된 배양 시스템의 또 다른 응용 프로그램은 mDA 뉴런으로 hiPSC의 분화입니다. 차별화는 사전 설정된 프로토콜에 따른 미디어 변경 사항을 기반으로 하며 0일부터 65일까지 자동화된 문화 시스템에서 수행되었습니다. 자동화된 미디어 변경으로 인해 세포 분리 또는 다른 시각적으로 감지가능한 분화 변화가 발생하지 않았습니다. 분화의 끝에서, 65일째에, mDA 뉴런은 수동 분화에 필적하는 세포 조직 및 형태(스푸릭 소마, 길고 가시적인 원점)를보여줍니다(도 7A, B). mRNA 수준에서, 자동화된 배양 시스템에서 분화된 mDA 뉴런은 각각 뉴런 및 mDA 마커, MAP2 및 TH(티로신 하이드록실라제)의 발현을 나타내고 있다(도7C). 두 분화 모두 상당한 양의 TH와 MAP2 양성 뉴런(도7D)을생성하였다.
그림 1: 자동화된 세포 배양 및 이미징 플랫폼에 대한 회로도 개요.
이 시스템은 폴리카보네이트 하우징과 4개의 UV 램프가 장착된 2개의 HEPA 후드(A 및 B)로 설계되어 세포 배양 애플리케이션을 위한 멸균 환경을 보장합니다. 세포 배양 판은 정문(C)을 통해 접근할 수 있는 로봇 팔 앞 선반에 적재된다. 플레이트는 456 플레이트의 용량으로 CO2 인큐베이터 (D)에 로드됩니다. 브라이트필드 세포 세포계(E)는 하위 배양 루틴 동안 의결도 검사 및 세포 계수에 사용됩니다. 액체 처리 스테이션은 HEPA 후드(B) 중 하나 이하입니다. 액체 처리기의 데크 레이아웃은 도 2에설명되어 있습니다. 액체 처리 스테이션의 파이펫 팅 암은 96 채널 파이펫 헤드, 8 개의 1 mL 파이펫 팅 채널 및 4 개의 5 mL 파이펫 팅 채널을 운반합니다. 1 mL 파이펫팅 채널의 경우, 팁이나 바늘은 액체 전송에 사용할 수 있습니다. 스크리닝을 위해, 분석 플레이트에 시드된 세포는 제2 인큐베이터(G)에서 이러한 샘플을 해동한 후 자동화된 -20°C 저장 시스템(F)에서 -20°C에 저장된 시료로 처리될 수 있다. 높은 처리량 이미징은 두 개의 회전 디스크 또는 상피 형광 모드를 사용하여 공초점 모드에서 이미지를 획득하기 위해 제공하는 자동 공초점 현미경 (H)에서 수행됩니다. 현미경에 통합된 살아있는 세포 챔버는 배양된 세포의 장기 화상 진찰을 능력을 발휘할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 액체 처리 스테이션의 데크 레이아웃입니다.
팁 위치는 50 μL 팁의 경우 "50 μL"로 표시되며, 300 μL 팁의 "표준"에 의해 1mL 팁의 경우 "높음", 5mL 팁의 경우 "5mL"로 표시됩니다. 갑판 구성 요소 :(A)모든 배양 판 또는 분석 플레이트 형식에 사용할 수있는 4 개의 가열 셰이커 위치 (최대 속도 : 2500 rpm). 셰이커 포지션에는 클램블 그립거가 장착되어 있어 갑판으로 이동한 다음 플레이트 정렬에도 사용됩니다. 또한 셰이커 위치는 액체 이송 단계에서 플레이트용 뚜껑 주차 위치로 작동합니다. 대표적인 목적을 위해, 모든 셰이커 위치는 96 및 분석 플레이트에 의해 점유된다. (B)모든 형식의 4플레이트를 동시에 처리하기 위한 4개의 틸트 모듈이 상단에 배치된다. 가장 낮은 위치는 문화 및 분석 플레이트및 96 채널 파이펫 헤드의 폐기물 수거 챔버를 표시합니다. 대표적인 목적을 위해 모든 틸트 모듈은 96웰의 분석 플레이트로 점유됩니다. (C)상단 위치에, 세포 계수에 대한 384 웰 플레이트가 위치된다. 다음은 대표목적을 위해 96웰 플레이트가 차지하는 플레이트의 2개 위치와 4개의 50mL 및 4개의 15mL 튜브용 랙입니다. 가장 낮은 위치는 5mL 팁으로 점유됩니다. (D)미디어 저장소에 대한 위치가있는 세 개의 미디어 라인. 미디어 라인에는 최대 250mL의 미디어 저장소를 자동으로 채울 수 있는 액체 레벨 센서가 있습니다. (E)활성 드레인이 있는 두 개의 액체 폐기물 모듈은 상단을 기반으로 하며, 한 개의 용기(흰색)와 5mL 팁 랙에 대한 위치가 있는 온도 제어 모듈 아래에 있습니다. (F)1 mL 팁에 대한 5 개의 위치. (G)두 개의 온도 제어 모듈이 하단에 위치하고 상단에 뚜껑 중 하나를 주차할 수 있는 위치가 됩니다. (H)상단에 있는 50μL 중첩 팁 랙(NTR) 2개와 단일 채널96채널 픽업에 대한 2개의 위치, 300μL 팁의 96채널 픽업, 하단의 5mL 팁 랙에 대한 위치가 있습니다. (I)상단에 384웰 카운팅 플레이트를 위한 스태커가 그 뒤를 이어 300 μL NTR과 하단에 5mL 팁 랙이 있습니다. (J)재사용 가능한 금속 1mL 바늘 8개 세트의 보관 및 세척스테이션. (K)1mL 및 5mL 파이펫 채널 및 빈 NTR(회색)에 대한 폐기물 위치와 데크 운송 단계에 사용되는 1~ 5mL 채널(흰색)에 대한 그리퍼 블록이 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: hiPSC의 자동 통합 검사.
(A)세포 세포 세포계(왼쪽)와 자동 인플루언스 분석 후(오른쪽)의 대표적인 브라이트필드(BF) 이미지는 녹색의 세포에 의해 점유되는 비례 영역을 나타내는 단계; (B)1일부터 6일까지 2개의 hiPSC 라인(iPS #1 및 #2)에서 기록된 컨플루언시 백분율, n=4 1-웰 플레이트는 세포주당 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: hiPSC의 패싱.
(A)1개의 hiPSC 라인의 BF 이미지(왼쪽)를 수동으로 재배하고 자동화된 배양 시스템(오른쪽)을 사용한다. 이미지는 두 번째 통과 후 6 일 촬영; (B)104및 SSEA4를 위해 염색된 hiPSC의 대표적인 이미지, Hoechst 33342(Nuclei)로 대응; (C) 1차(1)및 2번의 hiPSC 라인에서 1개의 hiPSC 라인에서 1차(1) 및 렉스1을 위한 qRT-PCR의 결과(m) 및 자동화된 배양 시스템(a), 및 각각의 hiPSC 유래 피질 뉴런(Diff)은 8일째(D8)에 이릅니다. 데이터는 참조 샘플로 iPS_a_1 사용하여 상대 수량(RQ)으로 표시됩니다. 오류 막대는 qRT-PCR 반응의 3가지 기술 복제에서 표준 편차(SD)를 나타냅니다. GAPDH, RPL13A1 및 RPLPO는 하우스키핑 유전자로 사용되었습니다. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 인간 iPSC 유래 피질 뉴런.
(A)6일째의 브라이트필드 영상, 수동(m) 및 자동화된 (a) 유사한 뉴런 네트워크를 보여주는 분화피질 뉴런; (B)TUBB3(팬 뉴런), BRN2(피질 뉴런) 및 Hoechst 33342(핵)를 위해 염색된 세포의 대표적인 이미지(8일째 분화; (C)피질 뉴런(MAP2, BRN2, CUX2, NCAM1 및 SYN1)의마커 유전자에 대한 qRT-PCR의 결과는 8일째(D8)에 분화된다. 데이터는 참조 샘플로 iPS_a_1 사용하여 상대 수량(RQ)으로 표시됩니다. 오류 막대는 qRT-PCR 반응의 3가지 기술 복제에서 SD를 나타냅니다. GAPDH, RPL13A1 및 RPLPO는 하우스키핑 유전자로 사용되었습니다. 스케일 바: 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 중성염 아웃성장을 위한 높은 처리량 분석.
(A)1일, 3일, 11일 분화에 세포를 발현하는 GFP의 대표적인 이미지; (B)1일, 3일, 11일 의 중성염의 대표적인 이진이미지. 상기 중성염 아웃성장은 고함량 영상 분석 소프트웨어 1을 이용하여 정량화되고 중성기 길이로 표현된다; (b) 그래픽은 NPC 유래 NGN2 뉴런의 중성기 길이의 증가와 조밀한 네트워크의 형성을 표시한다. 내부 60 개의 우물에 셀이있는 3 개의 96 웰 플레이트가 이미지됩니다. 단순성으로 96웰 플레이트당 3개의 우물 열만 열당 n = 6개의 우물이 있는 예로 표시됩니다. 평균 1308세포를 잘 분석하였다. 오류 막대는 평균(S.E.M)의 표준 오류를 나타냅니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 인간 iPSC 유래 mDA 뉴런.
미드브레인 DA 뉴런은 수동으로 분화 (m) 및 자동화 된 (a) 배양 시스템에서. (A, B) 티로신 하이드록실라제(TH, mDA 뉴런 마커; 그린), MAP2(뉴런 마커; 레드) 및 호흐트스트 33342(핵; 블루)를 위해 염색된 mDA 뉴런의 대표적인 형광 이미지; (C)mDA 뉴런의 마커 유전자에 대한 대표적인 qRT-PCR 결과는 수동 및 자동화된 배양 시스템에서 분화된다. TH 및 MAP2 발현 수준은 가사 유전자(OAZ1 및 GAPDH)로정규화된 상대수량(RQ)으로 표현된다. (D)수동 및 자동화된 분화에 의해 생성된 TH 및 MAP2 양성 뉴런의 백분율. 오류 막대는 두 개의 고유한 iPSC 라인(#1 및 #2)으로 수행된 두 개의 독립적인 차별화SD를 나타냅니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 셀 타입 | 목적 | 프로토콜 단계 | 세포 밀도 | 플레이트 형식 | 셀 번호/웰 |
| NGN2 차별화 | |||||
| Ipsc | NGN2 안정라인 생성 | S.2.3. | 30,000 세포/cm2 | 12웰 | 1,17,000 |
| Ipsc | NGN2 뉴런 분화 | 3.1.3. | 30,000 세포/cm2 | 1-웰 | 25,20,000 |
| Ipsc | NGN2 뉴런 분화 | 3.1.3. | 30,000 세포/cm2 | 96웰 | 9,600 |
| smNPC 생성 | |||||
| smNPC | 12일과 16일 | S5.9. 및 S5.11. | 70,000 세포/cm2 | 6-웰 | 6,72,000 |
| smNPC | 5번 통로에서 제외 | 5.11. | 50,000 세포/cm2 | 6-웰 | 4,80,000 |
| smNPC | smNPC에서 NGN2 뉴런까지 | 3.2.2 | 50,000 세포/cm2 | 96웰 | 16,000 |
| mDA 차별화 | |||||
| Ipsc | mDA 뉴런 분화 | 4.1.2. | 200,000 세포/cm2 | 1-웰 | 1,68,00,000 |
| DA 뉴런 | 25일 간의 상대 | 4.3.2. | 400,000 세포/cm2 | 1-웰 | 3,36,00,000 |
| DA 뉴런 | 25일 간의 상대 | 4.5.2. | 100,000 세포/cm2 | 96웰 | 32,000 |
| 코팅 | 목적 | 프로토콜 단계 | 농도/ 희석 |
플레이트 형식 | 코팅의 세부 사항 |
| iPS 문화 | |||||
| 세포 외 매트릭스 | iPSC, NGN2 라인, mDA 뉴런 |
1.5.7. 및 S2.3. | 1 알리쿼트*; 25 mL DMEM/F-12 |
1/12 웰 | 8/0.5 mL/웰; 1 h AT RT |
| NGN2 차별화 | |||||
| 폴리 L-오르니틴 | NGN2 뉴런 분화 | 3.1.3. 및 3.2.2. | 0.1 mg/mL; Pbs | 1/96 웰 | 8/0.1 mL/웰; 37°C에서 12시간; 3배 PBS 워시 |
| 라미닌 () | NGN2 뉴런 분화 | 3.1.3. 및 3.2.2. | 5 μg/mL; Pbs | 1/96 웰 | 8/0.1 mL/웰; 37°C에서 4시간 |
| smNPC 생성 | |||||
| 세포 외 매트릭스 | smNPC 세대 및 문화 | S5.6., S5.9., S5.11. |
1 알리쿼트*; 25 mL DMEM/F-12 |
6-웰 | 1 mL; 2 h AT RT |
| mDA 차별화 | |||||
| 세포 외 매트릭스 | mDA 차별화 | 4.1.2. | 1 알리쿼트*; 25 mL DMEM/F-12 |
1-웰 | 12 mL; 37°C에서 12시간 |
| 폴리 L-오르니틴 | mDA 차별화 | 4.3.2. 및 4.5.2. | 0.1 mg/mL; Pbs | 1/96 웰 | 12/0.1 mL/웰; 37°C에서 12시간; 3배 PBS 워시 |
| 라미닌 () | mDA 차별화 | 4.3.2. 및 4.5.2. | 10 μg/mL; Pbs | 1/96 웰 | 12/0.1 mL/웰; 37°C에서 12시간 |
| 섬유네틴 | mDA 차별화 | 4.3.2. 및 4.5.2. | 2 μg/mL; Pbs | 1/96 웰 | 12/0.1 mL/웰; 37°C에서 12시간 |
| *세포외 매트릭스 알리쿼트(μL)가 이 제품의 분석 인증서에 존재하는 희석계수(μL)로 정의됩니다. | |||||
표 1: 플레이트 포맷에 각각 종전 세포 밀도 및 코팅.
| 하루 | 시약 | ||
| 0일차 - 1일 | 100 nM LDN193189, 10 μM SB431542 | ||
| 1일차 - 3일차 | 100 nM LDN193189, 10 μM SB431542, 1 mM SHH, 2 mM 퍼모르파민, 100ng/mL FGF-8b |
||
| 3일차 - 5일 | 100 nM LDN193189, 10 μM SB431542, 1 mM SHH, 2 mM 퍼모르파민, 100ng/mL FGF-8b, 3 μM CHIR99021 |
||
| 5일차 - 7일 | 100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 2 mM 퍼모르파민, 100ng/mLFGF-8b, 3 μM CHIR99021 |
||
| 7일차 - 9일 | 100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 3 μM CHIR99021 | ||
| 9일 - 11일 | 100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 3 μM CHIR99021 | ||
| 11일 - 13일 | 3 μM CHIR99021, 20 ng/mL BDNF, 0.2 mM L-아스코르브산 (AA1), 20 ng/mL GDNF, 1 mM db-cAMP, 1 ng/mL TGFß3, 10 μM DAPT |
||
| 13일 - 65일 | 20 ng/mL BDNF, 0.2 mM L-아스코르빅산(AA1), 20 ng/mL GDNF, 1mM db-cAMP, 1 ng/mL TGFß3, 10 μM DAPT |
||
표 2: 도파민성 뉴런 분화를 위한 작은 분자 첨가.
| 하루 | KSR 매체 | N2 매체 | 분화 매체 |
| 0일차 - 1일 | 100% | 0 | 0 |
| 1일차 - 3일차 | 100% | 0 | 0 |
| 3일차 - 5일 | 100% | 0 | 0 |
| 5일차 - 7일 | 75% | 25% | 0 |
| 7일차 - 9일 | 50% | 50% | 0 |
| 9일 - 11일 | 25% | 75% | 0 |
| 11일 - 13일 | 0 | 0 | 100% |
| 13일 - 65일 | 0 | 0 | 100% |
표 3: 도파민성 뉴런 분화를 위한 미디어 그라데이션.
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Discussion
hiPSC 배양 및 뉴런 분화의 표준화를 위한 통합 이미징 기능을 갖춘 자동화된 세포 배양 시스템을 소개합니다. 최소한의 사용자 개입으로 인해 실험적 변화는 분화 중에 세포 표현형의 재현성을 보장합니다. 캘린더 기반 스케줄러는 실험의 조직 및 병렬화를 지원하며 실험이 수행되는 시점에서 높은 수준의 유연성을 허용합니다. 기존 방법을 쉽게 조정할 수 있으며 사용 가능한 방법의 스펙트럼을 늘릴 수 있습니다. 또한 많은 수의 분석 플레이트 형식을 사용하여 이 시스템의 유연성을 추가할 수 있습니다. CO2 인큐베이터, 로봇 암, 브라이트필드 셀 사이토미터 및 액체 처리 스테이션으로 구성된 최소한의 시스템은 hiPSC 문화와 분화에 필요한 기본 단위를 형성하며 학술 연구 실험실에 저렴한 비용을 지불합니다. 화합물, RNAi 라이브러리 또는 CRISPR/Cas9 라이브러리의 저장을 위한 자동화된 -20°C 저장 시스템과 자동 세포 배양 시스템의 조합과 고함량/고처리량 현미경의 통합을 통해 페노티픽 스크리닝의 실행을 가능하게 한다.
현재 연구에서는, 자동 세포 배양 시스템은 일회용 팁과 배양 매체를 사용하여 저수지로 수동으로 리필되어 미디어 변경 및 기타 배양 공정을 위해 액체 처리 스테이션의 사용을 특히 하룻밤 동안 제한했다. 이러한 한계를 피하기 위해 일회용 팁 대신 바늘 사용으로 조정할 수 있으며, 냉장고에 저장된 미디어 라인과 미디어 백 간의 튜브 연결을 설치한 후, 미디어 저장소는 히터 요소에 의해 미리 따뜻하게 된 신선한 매체로 자동으로 리필할 수 있습니다. 이렇게 하면 팁, 문화 미디어 및 저장소 교환의 수동 리필로 인한 사용자 간섭이 줄어듭니다.
당사의 자동화된 세포 배양 시스템은 몇 가지 이점을 제공합니다. 하나는 바코드 추적 시스템입니다. 시스템에 로드된 플레이트는 메서드 실행 중 및 후 샘플을 추적할 수 있도록 시스템에서 읽고 저장하는 고유한 바코드로 식별됩니다. 또 다른 장점은 사용자 특정 프로젝트를 만들 수 있다는 점입니다. 여기서 시스템에 로드된 배양 플레이트는 특정 프로젝트에 할당하고 일괄 그룹으로 그룹화할 수 있습니다. 일괄 구조화는 개별 플레이트를 선택할 필요가 없으므로 특정 일괄 처리의 모든 플레이트에 동일한 절차의 실행을 단순화합니다. 또한 액체 클래스 편집기를 사용하면 각 액체 이송 단계에 대한 포부 및 분배 매개 변수뿐만 아니라 파이펫팅 속도와 높이를 조정할 수 있습니다. 모든 프로세스는 로그 파일에 문서화되어 지정된 문화권 또는 분석 판에 대해 수행된 작업을 되짚어볼 수 있습니다.
인간 유도만능 줄기세포(hiPSC)에서 유래된 뉴런 및 기타 세포 유형은 특정 환자 집단(예: 파킨슨병용 도파민성 뉴런)에서 신경 퇴행성 질환의 메커니즘을 연구하기 위한 체외 도구에서 유용하며, 이는 개인화된 약물 검진의 가능성을 제공한다. hiPSC를 배양하는 것은 매우 시간 집약적이며 일반적으로 저용량 생산으로 제한되는 복잡한 차별화 프로토콜을 실행하도록 훈련된 사람들에게 요구합니다. 우리는 hiPSC의 피더 없는 문화를 자동화된 배양에 적용하고 2개의 신경 분화 프로토콜, 테트온 프로모터10,11,및 중뇌 도파민기의 세대를 위한 장기 소형 분자 기반 프로토콜(mDA) 뉴런13에서NGN2 과잉 발현을 기반으로 하는 신속한 피질 뉴런 분화 프로토콜을 구현하였다. 수동 문화 및 차별화 프로토콜의 간단한 전송 및 재현성은 자동화 된 문화 시스템을 매우 유용하게 만듭니다. 자동화된 세포 배양 시스템에서 배양된 인간 iPSC는 일관된 줄기 세포 형태를 보여주었으며 독립적인 실험 간에 재현가능한 중요한 흉병 마커를 표현하였다. 또한, hiPSC 배양 프로토콜의 자동화는 더 많은 수의 세포주를 병렬로 배양하고 확장하는 것을 선호했다. 사용자가 실험실에 있을 때 수행된 다운스트림 공정 단계(예: 셀 의 수확 또는 분화를 위한 수동 레타칭)에 대해 하루 동안 시스템을 무료로 상태로 두고 밤새 도록 예정된 자동 병합 검사. 사용자 정의 인플루엔트 임계값에 도달하면, 세포는 자동화된 세포 배양 시스템의 스태커에서 사용할 수 있는 세포외 매트릭스 코팅 판으로 통과되고 보충된다. 각 통로 라운드는 약 70분이 소요되며 한 부모 판에서 4개의 1웰 플레이트를 생성하며, 이는 하루에 20개의 구절을 수용할 수 있습니다.
NGN2 분화 프로토콜의 자동화는 성공적으로 수행되었으며 서로 다른 구절에 걸쳐 뉴런 세포의 균일 한 인구의 생성을 허용하고 수동 분화에 필적. 더욱이, 다중 세포주 또는 수천 개의 시험 조건/화합물을 가진 검열 실험을 관련시키는 대규모 검열 연구를 위한 실험 비용은 급속한 분화 때문에 감소될 것입니다. 라이브 셀 중성염 아웃성장 측정을 포함한 비용 효율적이고 높은 처리량 판독값은이전에14,15,16에도시된 바와 같이 질병 모델링을 위한 페노티픽 판독값으로 쉽게 개발, 구현 및 사용될 수 있다. 따라서, 우리는 GFP를 과도하게 발현하는 작은 분자 유래 신경 전구체(smNPC) 세포를 사용하여 NGN2 프로토콜을 더욱 적응시켰다. smNPC 세포는 배양 매체(iPSC 배양 비용의 1/3)와 실험을 확장하는 데 필요한 시간(iPSC 배양 비용의 1/3)을 포함한 추가 이점을 제공합니다. smNPC의 세포 수율은 iPSC로 얻은 것보다 7~10배 높습니다. 분화 뉴런은 수동 항체 염색이나 화학 라벨링 없이 완전히 자동화된 이미징 프로세스를 사용하여 며칠 동안 성공적으로 모니터링및 이미지화되어 이미징을 포함한 수동 절차에 필요한 비용과 시간을 절약했습니다. 96웰 플레이트의 60개 웰 내부의 현재 이미징은 우물당 25개의 필드가 이미지될 때 플레이트당 약 16분정도 걸리며, 이는 1000개의 화합물에 대한 이미징 기반 스크리닝을 위한 데이터를 하루에 획득하고 분석할 수 있음을 의미합니다. 미래에, 이 판독은 neurite 아웃성장 결함의 구출을 위한 복합 검열 연구 결과에서 이용될 수 있었습니다.
또한, 우리는 또한 iPSC에서 중뇌 도파민학 (mDA) 뉴런을 생성하기위한 수동 분화 프로토콜의 전송을 시연한다. 이 작은 분자 기지를 둔 분화 프로토콜은 65 일이 걸리고 다중 투감 단계 및 빈번한 미디어 변경 때문에 노동 집약적이며, 주로 매 2 일마다 mDA 뉴런의 생산을 동시에 몇 iPSC 라인으로 제한합니다. 자동화된 mDA 차별화 프로토콜은 수십 개의 iPSC 라인으로 차별화를 확장하는 데 큰 이점이 있습니다. 최대 30개의 세포주를 병렬로 분화할 수 있습니다. 분화는 주로 미디어 변화에 기초하기 때문에 거의 모든 분화 과정을 인간의 간섭없이 수행 할 수 있습니다. 자동화된 시스템의 일정 기반 스케줄러를 사용하여 차별화 단계에 따라 미디어 변경 내용을 계획할 수 있습니다. 이러한 많은 수의 세포주 및 배양 판으로 작업하는 한 가지 제한은 하룻밤 미디어 변화를 수행 할 수 없다는 것이었습니다. 주된 이유는 우리의 시스템이 일회용 팁과 이 수동 단계를 실행하는 실험실의 사용자를 필요로 하는 문화 미디어의 수동 리필을 사용하기 위해 설정되어 있다는 사실입니다. 미디어 변경 프로세스를 용이하게 하기 위해 시스템에 로드된 플레이트가 프로젝트에 할당되고 일괄 그룹으로 그룹화되었습니다. 그런 다음 배치 크기는 일회용 팁수와 사용 가능한 문화 미디어 볼륨에 맞게 조정되었습니다. 위에서 설명한 바와 같이, 이러한 제한은 재사용 가능/세척 가능한 바늘의 구현과 미디어의 자동 리필에 의해 쉽게 극복할 수 있다. iPSC에 표시된 바와 같이 세포의 자동 패혈증/결합은 당사의 자동화된 세포 배양 시스템에서 제공하는 편의 시설 중 하나입니다. 우리는 차별화의 25 일에 mDA 뉴런의 자동화 된 replating을 테스트했습니다. 그러나, mDA 뉴런의 해리는 iPSC(8분)보다 해리 효소를 가진 더 긴(40분) 배양을 필요로 하며, 이는 세포주당 1시간 이상으로 자동 투석 과정을 연장한다. 그 결과, 같은 날 30개의 세포주를 자동 투하하는 것은 불가능해졌습니다. 자동화된 레볼라팅(플레이트 전송, 파이펫팅) 동안 다른 단계를 가속화하고 시스템을 바늘과 미디어 라인의 사용에 맞게 조정하여 야간 작업을 가능하게 하는 이 제한을 해결할 수 있습니다. 단점에도 불구하고, 우리는 성공적으로 MAP2 (뉴런) 및 TH (mDA 뉴런) 양성 세포의 상당한 양으로 배양을 생산하는 mDA 뉴런의 자동화 된 분화로 수동 프로토콜을 전송 할 수 있습니다.
수십 개의 iPSC 세포주를 병렬로 구분하는 것은 파킨슨 병을 포함한 신경 퇴행성 질환의 분자 메커니즘을 조사하는 프로젝트에 큰 관심을 가지고 있습니다. 그러나 오류 수가 적고 비용 절감으로 작업을 더 빠르게 완료하는 것은 큰 과제입니다. 여기에 제시 된 프로토콜의 자동화 (iPSC, smNPC 및 mDA 뉴런)의 자동화로 인해 우리는 속도를 높이고 비용을 절감하며 프로젝트의 재현성을 높일 수 있습니다. 수백 개의 환자 세포주를 포함하는 FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/)와 같은 프로젝트의 개발은 자동화 된 배양 및 분화 프로토콜에 대한 필요성을 보여줍니다. 우리의 미래 관점은 자동화 된 시스템에 수동 3 차원 (3D) 세포 배양 모델의 전송을 포함한다. 플레이트 정의 설정과 어댑터의 사용에 사소한 적응은 3D 배양에 필요한 상업 또는 맞춤형 플레이트 및 미세 유체 챔버의 사용을 허용합니다. 더욱이, 자동화된 라벨 없는 화상 진찰 모형의 구현은 우리가 실시간으로 신경 성장을 추적하고 neurite 성장, 신경 조직 및 세포 죽음에 있는 변경을 질병 기계장치의 더 나은 이해로 번역하는 것을 허용할 것입니다.
Disclosures
우리는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 감사하게이 연구를 위한 생물 물질을 기여한 환자와 그들의 가족을 인정합니다. 연구에 사용된 세포 선은 Rutgers (nd41865 iPS#1로 ND41865)와 틸로 쿠나스 박사의 실험실 (iPS#2)와 NINDS 컬렉션에서 했다. 이 작품은 NOMIS 재단 (PH), RiMod-FTD, EU 공동 프로그램 - 신경 퇴행성 질환 연구 (JPND) (PH)에 의해 부분적으로 지원됩니다. DZNE I2A 이니셔티브 (AD); PD-Strat, ERA-Net ERACoSysMed 자금 조달 프로젝트 (PH) 및 파킨슨 병 (FOUNDIN-PD) (PH, EB)에 대한 기초 데이터 이니셔티브. FOUNDIN-PD는 마이클 J. 폭스 재단의 PD 프로그램에 대한 경로의 일부입니다. 저자는 스티븐 핀크베이너와 멜라니 콥 (글래드 스톤 연구소)이 수동 mDA 뉴런 차별화 프로토콜의 설립에 기여한 것에 대해 감사하고 마호미 스즈키 (요코가와 전기 공사)는 중성자 아웃 성장 분석 설정에 도움을 주었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | Distributor | Catalog Number | Dilution |
| iPSC pluripotency marker | |||
| Mouse anti-SSEA4 | Abcam | ab16287 | 1 to 33 |
| Rabbit anti-Oct3/4 | Abcam | ab19857 | 1 to 200 |
| NGN2 neuron markers | |||
| Mouse anti- TUBB3 | R & D | MAB1195 | 1 to 500 |
| Rabbit anti-BRN2 | NEB | 12137 | 1 to 1,000 |
| mDA neuron markers | |||
| Chicken anti-TH | Pel-Freez Biologicals | 12137 | 1 to 750 |
| Mouse anti-MAP2 | Santa Cruz | sc-74421 | 1 to 750 |
| Secondary antibodies | |||
| Goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11039 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | 1 to 2,000 |
| Nuclei counterstaining | |||
| Hoechest 33342 | Invitrogen | H3570 | 1 to 8,000 |
| Instruments | Distributor | Catalog Number | Description/Application |
| Agilent TapeStation system | Agilent technologies | 4200 | Automated electrophoresis for DNA and RNA samples |
| Automated -20 °C storage system | Hamilton Storage Technologies |
Sample Access Manager (SAM -20C, 3200 series) |
Storage of reagents |
| Barcode reader | Honeywell | Barcode Reader Orbit | Barcode scanner |
| Brightfield cell cytomat | Nexcelom | Celigo | Confluence check and cell counting |
| CellVoyager 7000 | Yokogawa | CellVoyager 7000 | Automated confocal microscope |
| Cytomat for cell cultures | Thermo Fisher Scientific | Cytomat 24 C, CU | 12 stackers pitch 28 mm, 12 stackers pitch 23 mm (total of 456 plates) |
| Cytomat for thawing samples | Thermo Fisher Scientific | Cytomat 2-LIN, 60 DU (Drying Unit) |
2 stackers pitch 28 mm (total of 42 plates) |
| HEPA filters | Hamilton Robotics | Hood Flow Star UV | Modified by Hamilton Robotics |
| Liquid handling station | Hamilton Robotics | Microlab Star | Channels: 8x 1-ml, 4x 5 ml and 96 Channel MPH |
| Media reservoir | Hamilton Robotics | 188211APE | Media/reagents reservoir |
| Pure water system | Veolia Water | ELGA PURELAB Classic | Provides pure water for needle wash station |
| QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System |
Thermo Fisher Scientific | QSTUDIO12KOA | Real-time PCR machine |
| Robotic arm | Hamilton Robotics | Rackrunner | Transport of plates |
| Turn table | Hamilton Robotics | Turn Table | Adjust plate orientiation |
| Uninterruptible power supply | APC | Smart UPS RT Unit, 10000 VA Power supply |
Backup power supply |
| VIAFLO-pipettes | Integra | 4500 | Electronic pipette |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4453545 | Real-time PCR machine |
| Materials | Distributor | Catalog Number | Notes |
| 1-well culture plate (84 cm2) | Thermo Fischer Scientific | 165218 | Nunc OmniTray |
| 6-well culture plates (9.6 cm2) | Greiner Bio-One | 657160 | TC treated with lid |
| 12-well culture plate (3.9 cm2) | Greiner Bio-One | 665180 | TC treated with lid |
| 96-well culture plate (0.32 cm2) | Perkin Elmer | 6005558 | CellCarrier-96 Black plate |
| Tips, 50-µL | Hamilton Robotics | 235987 | 50-uL tips |
| Tips, 300-µL | Hamilton Robotics | 235985 | 300-µL tips |
| Tips, 1000-µL | Hamilton Robotics | 235939 | 1000-µL tips |
| Tips, 5-mL | Hamilton Robotics | 184022 | 5-mL tips |
| Tubes, 15-mL | Greiner Bio-One | 188271 | 15-mL tubes |
| Tubes, 50-mL | Greiner Bio-One | 227261 | 50-mL tubes |
| Nalgene cryogenic 2.0 mL vials | Sigma Aldrich | V5007 | Cryovials |
| Plasmids | Distributor | Catalog Number | Notes |
| pLV_hEF1a_rtTA3 | Addgene | 61472 | Kind gift from Ron Weiss |
| pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro | Addgene | 61474 | Kind gift from Ron Weiss |
| pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus | Takara Bio | 631983 | |
| Primers | Sequence (forward) | Sequence (reverse) | Source |
| iPSC pluripotency | |||
| OCT4 (ID 4505967a1) | CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG | GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC | PrimerBank |
| NANOG (ID 153945815c3) | CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA | CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC | PrimerBank |
| REX1 (ID 89179322c1) | AGAAACGGGCAAAGACAAGAC | GCTGACAGGTTCTATTTCCGC | PrimerBank |
| NGN2 neurons | |||
| MAP2 (ID 87578393c1) | CTCAGCACCGCTAACAGAGG | CATTGGCGCTTCGGACAAG | PrimerBank |
| BRN2 (ID 380254475c1) | CGGCGGATCAAACTGGGATTT | TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT | PrimerBank |
| CUX2 (ID 291045458c2) | CGAGACCTCCACACTTCGTG | TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG | PrimerBank |
| NCAM1 (ID 336285437c3) | TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC | CTCACAGCGATAAGTGCCCTC | PrimerBank |
| SYNAPSIN1 (ID 91984783c3) | TGCTCAGCAGTACAACGTACC | GACACTTGCGATGTCCTGGAA | PrimerBank |
| mDA neurons | |||
| TH | CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA | CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA | NCBI primer-BLAST |
| MAP2 | GGATCAACGGAGAGCTGAC | TCAGGACTGCTACAGCCTCA | NCBI primer-BLAST |
| Housekeeping genes | |||
| GAPDH | GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG | GAGCCCCAGCCTTCTCCATG | NCBI primer-BLAST |
| OAZ1 | AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT | ATGAAGACATGGTCGGCTCG | NCBI primer-BLAST |
| RPLPO | CCTCATATCCGGGGGAATGTG | GCAGCAGCTGGCACCTTATTG | NCBI primer-BLAST |
| RPL13A | GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC | TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC | NCBI primer-BLAST |
| Media and Reagents | Distributor | Catalog Number | Use concentration |
| Coating matrix | |||
| Extracellular matrix (Matrigel) | Corning | 354277 | 10 μg/mL |
| Fibronectin | Corning | 356008 | 2 μg/mL |
| Laminin | Sigma | L2020 | 5 - 10 μg/mL |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | P3655 | 0.1 mg/mL |
| Culture media | |||
| iPSC culture medium (Essential 8 Flex medium) |
Gibco | A2858501 | |
| NGN2 neurons - NGN2 medium | |||
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 0.909 mL (50 µM) |
| B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (1%) |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Gibco | 31331093 | 484.75 mL |
| GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL ( 2 mM) |
| Insulin | Sigma | I9278 | 0.25 mL (2.5 µg/mL) |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140050 | 5 mL (0.5%) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | 5 mL (0.5%) |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 485 mL |
| mDA neurons - SRM medium | |||
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 0.5 mL (55 µM) |
| GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL (2 mM) |
| Knockout DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | 409.5 mL |
| Knockout serum replacement (serum replacement) |
Gibco | 10828028 | 75 mL (15%) |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140050 | 5 mL (1%) |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL (1%) |
| mDA neurons - N2 medium | |||
| B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (2%) |
| GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL (2 mM) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | 5 mL (1%) |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 475 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL(1%) |
| mDA neurons - Differentiation medium | |||
| B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (2%) |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 485 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL (1%) |
| NGN2 neurons - Supplements | |||
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) |
Peprotech | 450-02 | 10 ng/mL |
| CHIR99021 (CHIR) | R&D | 4423/10 | 2 μM |
| Doxycyline (dox) | Sigma | D9891 | 2.5 μg/mL |
| Glial-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) |
Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL |
| L-ascorbic acid 2-phosphate magnesium (AA2) |
Sigma | A8960 | 64 mg/L |
| Neurotrophic factor-3 (NT-3) | Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL |
| Purmorphamine (PMA) | Cayman | 10009634 | 0.5 μM |
| Puromycin | Sigma | P8833-10MG | 0.5 μg/mL |
| Thiazovivin | Merk Millipore | 420220-10MG | 2 μM |
| mDA neurons - Supplements | |||
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) |
Peprotech | 450-02 | 20 ng/mL |
| CHIR99021 (CHIR) | R&D | 4423/10 | 3 μM |
| DAPT | Cayman | 13197 | 10 µM |
| Dibutyryl-cAMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | 1 mM |
| Fibroblast Growth Factor 8B (FGF-8b) | Peprotech | 100-25 | 100 ng/mL |
| Glial-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) |
Peprotech | 450-10 | 20 ng/mL |
| L-ascorbic acid (AA1) | Sigma | A4403 | 0.2 mM |
| LDN193189 (LDN) | Cayman | 11802 | 100 nM |
| Purmorphamine (Purm) | Cayman | 10009634 | 2 μM |
| Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus (SHH) |
R&D | 1845-SH | 100 ng/mL |
| SB431542 (SB) | Cayman | 13031 | 10 μM |
| Transforming Growth Factor type ß3 (TGFß3) |
R&D | 243-B3 | 1 ng/mL |
| Y-27632 | Cayman | 10005583 | 10 µM |
| Dissociation reagents | |||
| Single cell dissociation reagent (StemPro Accutase) |
Gibco | A1110501 | 1x |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Gibco | 11575020 | 0.5 mM |
| RNA isolation and cDNA kit | |||
| RNA isolation kit | Qiagen | 74106 | Rneasy MiniKit |
| RNA lysis buffer | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | Trizol lysis buffer (RNA lysis buffer) |
| Reverse transcriptase (kit) | Thermo Fisher Scientific | 18080-085 | SuperScript III Reverse Transcriptase |
| Software | Company | Catalog Number | Description/Application |
| Cell Culture Framework (CCF) (Graphical user interface, GUI) |
Hamilton Robotics | Custom-made | User interface for the automated system |
| CellPathFinder software (image analysis software 1) |
Yokogawa | CellPathfinder HCS Software | Image analysis tool |
| CellVoyager Measurement System | Yokogawa | Included with CellVoyager 7000 |
Microscope controlling software |
| Columbus software (image analysis software 2) |
Perkin Elmer | Columbus | Image analysis tool |
| Cloud based qPCR app | Thermo Fisher Scientific | Themo Fisher cloud | Analysis software for qRT-PCR data |
| Venus software | Hamilton Robotics | VENUS Two Dynamic Schedular 5.1 Software |
Controlling software for the automated system |
References
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- Payne, N. L., Sylvain, A., O'Brien, C., Herszfeld, D., Sun, G., Bernard, C. C. A. Application of human induced pluripotent stem cells for modeling and treating neurodegenerative diseases. New biotechnology. 32 (1), 212-228 (2015).
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