Vi viser automatisering av menneskelige induserte pluripotente stamcellekulturer (hiPSC) og nevronal differensieringer som er kompatible med automatisert bildebehandling og analyse.
Manuell kultur og differensieringsprotokoller for humane induserte pluripotente stamceller (hiPSC) er vanskelige å standardisere, vise høy variasjon og er utsatt for spontan differensiering i uønskede celletyper. Metodene er arbeidskrevende og er ikke lett mottagelige for store eksperimenter. For å overvinne disse begrensningene utviklet vi et automatisert cellekultursystem koblet til et bildesystem med høy gjennomstrømning og implementerte protokoller for å opprettholde flere hiPSC-linjer parallelt og nevronal differensiering. Vi beskriver automatiseringen av en kortsiktig differensieringsprotokoll ved hjelp av Neurogenin-2 (NGN2) overuttrykk for å produsere hiPSC-avledede kortikale nevroner innen 6\u20128 dager, og implementeringen av en langsiktig differensieringsprotokoll for å generere hiPSC-avledede midbrain dopaminerge (mDA) nevroner innen 65 dager. Vi brukte også NGN2-tilnærmingen på en liten molekylavledet nevrale forløperceller (smNPC) transdusert med GFP lentivirus og etablerte en live-celle automatisert neuritt utvekstanalyse. Vi presenterer et automatisert system med protokoller egnet for rutinemessig hiPSC kultur og differensiering i kortikale og dopaminerge nevroner. Vår plattform er egnet for langsiktig håndfri kultur og høy-innhold / høy gjennomstrømning hiPSC-baserte sammensatte, RNAi og CRISPR / Cas9 screenings for å identifisere nye sykdomsmekanismer og narkotikamål.
Humane induserte pluripotente stamceller (hiPSC) er selvfornyende og kan differensiere i nesten alle voksne celletyper. Disse egenskapene gjør hiPSC til et nyttig verktøy for sykdomsmodellering i grunnleggende forskning og narkotikaoppdagelse1. Human iPSC beholder donorgenetisk bakgrunn som gjør det mulig å utlede sykdomsrelevante celletyper som er mest berørt / involvert i sykdomsforløpet, for eksempel forskjellige nevronale undertyper for nevrodegenerativesykdommer 2,3. HiPSC overvinner også noen av begrensningene i dyre- og cellulære overuttrykksmodeller ved å modellere sykdommer i menneskelig sammenheng og fysiologiske proteinuttrykksnivåer, og har vist seg å være en verdifull ressurs i modellering av sykdommer som spenner fra monogene, komplekse og epigenetiske lidelser, samt sene sykdommer4.
Til tross for disse fordelene og mulighetene, må flere begrensninger av hiPSC fortsatt tas opp. Nåværende hiPSC-kultur- og differensieringsprotokoller er ikke kostnadseffektive, vanskelige å standardisere og er arbeidsintensive. Manuelle kulturtrinn kan føre til høy variasjon i utbytter og fenotyper på grunn av forskjeller i vekst og spontan differensiering av hiPSC. Derfor må eksperimenteringsavhengig variasjon reduseres ved å implementere mer standardiserte håndteringsteknikker og forenkle protokoller som kan oppnås ved hjelp av automatisering5. Etableringen av automatisert hiPSC kultur og differensiering protokoller vil sette felles standarder for både akademiske og industrielle forskningsprosjekter, og tillate generering av biologisk relevante sykdomsmodeller og mer reproduserbare resultater.
Tidligere arbeid har forsøkt automatisering av hiPSCkulturer 6,7,8 menderes protokoller har vært begrenset til bestemte celle kultur plate formater avhengig av systemet og mangler tilpasningsevne til ulike analyseformater. Slike systemer er nyttige i sveising av celler, men kan ikke være egnet for automatisert differensiering i ønskede celletyper, sykdomphenotyping og screeningformål. I tillegg har en storskala automatisert plattform for fibroblastavledning, hiPSC-generering og differensiering blittbeskrevet 9, men på en skala som bare kan oppnås ved høy gjennomstrømningslaboratorier dedikert til produksjon av linjer som virker attraktive, men kan være uoverkommelige for mange akademiske laboratorier.
Vi utviklet et helautomatisk cellekultursystem basert på en væskehåndteringsstasjon i et høyeffektivt partikkelluft (HEPA)-filtrert miljø sammen med en storkapasitets CO 2-inkubator, et brightfield imaging cytometer og en robotarm for platetransport. Disse komponentene gir grunnlag for stabil og reproduserbar hiPSC-kultur og differensiering. Vi supplerte systemet med et automatisert -20 ° C lagringssystem for sammensatt eller viruslagring og en høyhastighets spinnende disk confocal live-cell imager. Skreddersydde protokoller ble generert slik at automatisert cellesåing, medieendringer, samløpet sjekker, celleutvidelse og analyseplategenerering med prøvebehandling og plateavbildning, noe som gjør systemet kompatibelt med høyinnhold / høy gjennomstrømningsscreening. Det automatiserte cellekultur- og bildesystemet drives ved hjelp av kontrollerende programvare og det skreddersydde grafiske brukergrensesnittet (GUI). Gui lar brukerne importere CSV-filer som inneholder cellelinjespesifikke parametere som trengs for metodekjøring. I tillegg gjør GUI det mulig å planlegge mange eksperimenter i en hvilken som helst rekkefølge ved hjelp av den innebygde kalendervisningen, slik at full kontroll over tiden når hver metode starter.
Vårt automatiserte cellekultursystem bruker standardiserte pipetteringshastigheter, passagingstider, samløpetsterskler, såetettheter og middels volumer med fleksibilitet til kulturceller i en rekke plateformater (96-, 48-, 24-, 12-, 6- eller 1-brønns plateformat). Vi tilpasset en nylig publisert kortsiktig differensieringsprotokoll for å konvertere hiPSC til nevroner som kan gi TUBB3 positive nevroner i 6 dager10,11. Vi etablerte også den automatiserte differensiasjonen og avbildningen av små molekylnerale forløperceller (smNPC) til nevroner som uttrykker GFP under EF1a promoter12 og iPSC i midbrain dopaminerge (mDA) nevroner, og tilpasser en tidligere publisert dual-SMAD hemmingsprotokoll13 som gir mDA nevroner innen 65 dager.
Vi introduserer et automatisert cellekultursystem med integrerte bildefunksjoner for standardisering av hiPSC-kultur og nevronal differensiering. På grunn av minimal brukerintervensjon er eksperimentell variasjon lav som sikrer reproduserbarhet av cellulære fenotyper under differensiering. Den kalenderbaserte planleggeren støtter organiseringen og parallelliseringen av eksperimenter og gir høy grad av fleksibilitet når eksperimentene utføres. Eksisterende metoder kan enkelt tilpasses og spekteret av tilgjengelige metoder kan økes. I tillegg kan et stort antall analyseplateformater brukes til å legge til fleksibiliteten til dette systemet. Det minimale systemet som består av en CO2 inkubator, en robotarm, et brightfield cellecytometer og en flytende håndteringsstasjon danner den grunnleggende enheten som trengs for hiPSC-kultur og differensiering, med rimelige kostnader til akademiske forskningslaboratorier. Kombinasjonen av det automatiserte cellekultursystemet med et automatisert -20 °C lagringssystem for lagring av forbindelser, RNAi-biblioteker eller CRISPR/Cas9-biblioteker, og integrering av et mikroskop med høy innhold/høy gjennomstrømning gjør det mulig å utføre fenotypiske screeninger.
I den nåværende studien brukte det automatiserte cellekultursystemet engangstips, og kulturmediene ble fylt på manuelt inn i reservoaret, og dermed begrenset bruken av væskehåndteringsstasjonen for medieendringer og andre kulturprosesser spesielt over natten. For å omgå denne begrensningen kan metodene justeres til nålebruk i stedet for engangsspisser, og etter å ha installert rørforbindelser mellom medielinjer og medieposer lagret i kjøleskap, kan mediereservoarer automatisk fylles med friske medier forhåndsvarmet av varmeelement. Dette vil redusere brukerforstyrrelser forårsaket av manuell påfylling av tips, kulturmedier og reservoarutveksling.
Vårt automatiserte cellekultursystem gir flere fordeler. Den ene er strekkodesporingssystemet. Platene som lastes i systemet identifiseres av en unik strekkode som leses og lagres av systemet som tillater sporing av prøver under og etter metodekjøring. En annen fordel er muligheten til å opprette brukerspesifikke prosjekter. Her kan kulturplater lastet i systemet tilordnes til et bestemt prosjekt og grupperes i grupper. Struktureringen i grupper forenkler utførelsen av samme prosedyre til alle plater av en bestemt batch siden ingen individuelle plater må velges. I tillegg gjør en redigeringsprogram for flytende klasse det mulig å justere pipetteringshastigheten og høyden, samt aspirasjons- og dispenseringsparametrene for hvert væskeoverføringstrinn. Hver prosess er dokumentert i loggfiler som tillater å spore hvilke oppgaver som er utført for en gitt kultur eller analyseplate.
Nevroner og andre celletyper avledet fra humane induserte pluripotente stamceller (hiPSC) er nyttige in vitro-verktøy for å studere mekanismene for nevrodegenerative sykdommer i bestemte pasientpopulasjoner (f.eks. dopaminerge nevroner for Parkinsons sykdom) som gir mulighet for personlig legemiddelscreening. Culturing hiPSC er svært tidkrevende og krever trente mennesker til å utføre komplekse differensieringsprotokoller, vanligvis begrenset til lavskala produksjon. Vi tilpasset den materfrie kulturen i hiPSC til en automatisert kultur og implementerte to nevronale differensieringsprotokoller, en rask kortikal neuron differensieringsprotokoll basert på NGN2-overuttrykk under en tet-on promotor10,11og en langsiktig liten molekylbasert protokoll for generering av midbrain dopaminerge (mDA) nevroner13. Den enkle overføringen og reproduserbarheten til manuell kultur og differensieringsprotokoller gjør det automatiserte kultursystemet svært nyttig. Menneskelig iPSC dyrket i det automatiserte cellekultursystemet viste konsekvent stamcellemorfologi og uttrykte viktige pluripotensmarkører, reproduserbare mellom uavhengige eksperimenter. I tillegg favoriserte automatiseringen av hiPSC-kulturprotokollen kulturen og utvidelsen av et større antall cellelinjer parallelt. Automatiserte samløpet kontroller planlagt å bli utført over natten spart tid forlater systemet gratis i løpet av dagen for nedstrøms prosesstrinn utført når brukeren var i laboratoriet (f.eks høsting av celler eller manuell replating for differensiering). Når de når den brukerdefinerte samløpetsterskelen, blir cellene passasjer og omset til ekstracellulære matrisebelagte plater som er tilgjengelige på stableren til det automatiserte cellekultursystemet. Hver passasje runde tar ca 70 min og genererer fire 1-brønns plater fra en overordnet plate, noe som oversettes til en kapasitet på 20 passasjer på en dag.
Automatiseringen av NGN2 differensieringsprotokollen ble gjort med hell og tillot generering av en homogen populasjon av nevronale celler på tvers av forskjellige passasjer og sammenlignbar med manuelle differensieringer. Videre vil de eksperimentelle kostnadene for store screeningstudier som involverer flere cellelinjer eller screeningeksperimenter med tusenvis av testforhold / forbindelser bli redusert på grunn av raske differensieringer. Kostnadseffektive og høy gjennomstrømmingavlesninger, inkludert live-celle neurite utvekst målinger kan enkelt utvikles, implementeres og brukes som fenotypisk avlesninger for sykdom modellering, som vist tidligere14,15,16. Dermed tilpasset vi videre NGN2-protokollen ved hjelp av små molekylavledede nevrale forløperceller (smNPC) celler som utgjør over-express GFP. SmNPC-cellene gir ytterligere fordeler, inkludert reduserte kostnader med kulturmedier (en tredjedel av kostnaden med iPSC-kultur) og tid som kreves for å skalere opp eksperimenter. Celleavlingene fra smNPC er 7 til 10 ganger høyere enn det som oppnås med iPSC. Differensieringsnevronene ble vellykket overvåket og avbildet i flere dager ved hjelp av en helautomatisk bildebehandlingsprosess uten behov for manuelle antistoffflekker eller kjemisk merking, noe som sparer kostnader og tid som kreves for manuelle prosedyrer, inkludert avbildningen av seg selv. Den nåværende bildebehandling av indre 60 brønner av en 96-brønns plate tar rundt 16 min per plate når 25 felt per brønn er avbildet, noe som betyr at dataene for en bildebasert screening for 1000 forbindelser, kan anskaffes og analyseres på en dag. I fremtiden kan denne avlesningen brukes i sammensatte screeningstudier for redning av neuritt utvekstdefekter.
Videre demonstrerer vi også overføringen av en manuell differensieringsprotokoll for generering av midbrain dopaminerge (mDA) nevroner fra iPSC. Denne lille molekylbaserte differensieringsprotokollen tar 65 dager og er arbeidsintensiv på grunn av flere replating trinn og hyppige medieendringer, for det meste hver 2 dager, noe som begrenser produksjonen av mDA nevroner til få iPSC-linjer samtidig. Den automatiserte mDA differensieringsprotokollen har den store fordelen av å skalere opp differensieringen til dusinvis av iPSC-linjer. Opptil 30 cellelinjer kan differensieres parallelt. Siden differensieringen for det meste er basert på medieendringer, kan nesten hele differensieringsprosessen utføres uten menneskelig innblanding. Ved hjelp av den kalenderbaserte planleggeren for det automatiserte systemet, kan vi planlegge medieendringene i henhold til differensieringstrinnene. En begrensning av å jobbe med et så stort antall cellelinjer og kulturplater var umuligheten til å utføre over nattens medieendringer. Hovedårsaken er at systemet vårt er satt opp for bruk av engangstips og manuell påfylling av kulturmedier som krever at en bruker i laboratoriet utfører dette manuelle trinnet. For å forenkle medieendringsprosessen ble plater lastet inn i systemet tilordnet til et prosjekt og gruppert i grupper. Batchstørrelsen ble deretter tilpasset antall engangstips og volum av kulturmedier tilgjengelig. Som beskrevet ovenfor, kan denne begrensningen lett overvinnes ved implementering av gjenbrukbare / vaskbare nåler og automatisert påfylling av medier. Automatisert passaging / replating av celler, som vist for iPSC, er en av bekvemmelighetene som tilbys av vårt automatiserte cellekultursystem. Vi har testet den automatiserte replating av mDA nevroner på dag 25 av differensiering. Dissosiasjonen av mDA-nevroner krever imidlertid lengre (40 min) inkubasjon med dissosiasjonsenzymet enn iPSC (8 min) som utvider den automatiserte replatingsprosessen til mer enn 1 time per cellelinjer. Som en konsekvens ble den automatiserte omplatingen av 30 cellelinjer på samme dag umulig. Påstålelse av andre trinn under automatisert omplating (transport av plater, pipettering) og tilpasning av systemet til bruk av nåler og medielinje som gjør et overnattingsarbeid mulig, ville løse denne begrensningen. Til tross for ulempene, kunne vi med hell overføre den manuelle protokollen til en automatisert differensiering av mDA-nevroner som produserer kulturer med betydelige mengder MAP2 (neuron) og TH (mDA nevroner) positive celler.
Differensiering dusinvis av iPSC cellelinjer parallelt er av stor interesse for prosjekter som undersøker molekylære mekanismer av nevrodegenerative sykdommer, inkludert Parkinsons sykdom. Men å fullføre oppgaver raskere med færre feil og til reduserte kostnader er en stor utfordring. På grunn av automatisering av protokollene som presenteres her (iPSC, smNPC og mDA neuron), kunne vi fremskynde, redusere kostnadene og øke reproduserbarheten i våre prosjekter. Utviklingen av prosjekter som FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) som involverer hundrevis av pasientcellelinjer viser behov for automatisert kultur og differensieringsprotokoller. Våre fremtidige perspektiver inkluderer overføring av manuelle 3-dimensjonale (3D) cellekulturmodeller til det automatiserte systemet. Mindre tilpasninger i platedefinisjonsinnstillingene og bruk av adaptere vil tillate bruk av kommersielle eller skreddersydde plater og mikrofluidiske kamre som kreves for 3D-kulturene. Videre vil implementeringen av en automatisert etikettfri bildemodell tillate oss å spore den nevronale veksten i sanntid og oversette endringer i neurittvekst, nevronorganisasjon og celledød til bedre forståelse av sykdomsmekanismene.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkjenner takknemlig pasientene og deres familier som bidro med biomateriale for denne studien. Cellelinjer som brukes i studien var fra NINDS samling med Rutgers (ND41865 som iPS # 1) og laboratoriet til Dr. Tilo Kunath (iPS # 2). Dette arbeidet støttes delvis av NOMIS Foundation (PH), RiMod-FTD, et EU-felles program – Neurodegenerative Disease Research (JPND) (PH); DZNE I2A-initiativet (AD); PD-Strat, et ERA-Net ERACoSysMed-finansiert prosjekt (PH) og Foundational Data Initiative for Parkinsons Disease (FOUNDIN-PD) (PH, EB). FOUNDIN-PD er en del av Michael J. Fox Foundations PATH to PD-program. Forfatterne takker Steven Finkbeiner og Melanie Cobb (Gladstone Institutes) for å ha bidratt til etableringen av den manuelle mDA neuron differensieringsprotokollen og Mahomi Suzuki (Yokogawa Electric Corporation) for hjelp i neurite outgrowth analyse oppsett.
Antibodies | Distributor | Catalog Number | Dilution |
iPSC pluripotency marker | |||
Mouse anti-SSEA4 | Abcam | ab16287 | 1 to 33 |
Rabbit anti-Oct3/4 | Abcam | ab19857 | 1 to 200 |
NGN2 neuron markers | |||
Mouse anti- TUBB3 | R & D | MAB1195 | 1 to 500 |
Rabbit anti-BRN2 | NEB | 12137 | 1 to 1,000 |
mDA neuron markers | |||
Chicken anti-TH | Pel-Freez Biologicals | 12137 | 1 to 750 |
Mouse anti-MAP2 | Santa Cruz | sc-74421 | 1 to 750 |
Secondary antibodies | |||
Goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11039 | 1 to 2,000 |
Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | 1 to 2,000 |
Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | 1 to 2,000 |
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1 to 2,000 |
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1 to 2,000 |
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | 1 to 2,000 |
Nuclei counterstaining | |||
Hoechest 33342 | Invitrogen | H3570 | 1 to 8,000 |
Instruments | Distributor | Catalog Number | Description/Application |
Agilent TapeStation system | Agilent technologies | 4200 | Automated electrophoresis for DNA and RNA samples |
Automated -20 °C storage system | Hamilton Storage Technologies |
Sample Access Manager (SAM -20C, 3200 series) |
Storage of reagents |
Barcode reader | Honeywell | Barcode Reader Orbit | Barcode scanner |
Brightfield cell cytomat | Nexcelom | Celigo | Confluence check and cell counting |
CellVoyager 7000 | Yokogawa | CellVoyager 7000 | Automated confocal microscope |
Cytomat for cell cultures | Thermo Fisher Scientific | Cytomat 24 C, CU | 12 stackers pitch 28 mm, 12 stackers pitch 23 mm (total of 456 plates) |
Cytomat for thawing samples | Thermo Fisher Scientific | Cytomat 2-LIN, 60 DU (Drying Unit) |
2 stackers pitch 28 mm (total of 42 plates) |
HEPA filters | Hamilton Robotics | Hood Flow Star UV | Modified by Hamilton Robotics |
Liquid handling station | Hamilton Robotics | Microlab Star | Channels: 8x 1-ml, 4x 5 ml and 96 Channel MPH |
Media reservoir | Hamilton Robotics | 188211APE | Media/reagents reservoir |
Pure water system | Veolia Water | ELGA PURELAB Classic | Provides pure water for needle wash station |
QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System |
Thermo Fisher Scientific | QSTUDIO12KOA | Real-time PCR machine |
Robotic arm | Hamilton Robotics | Rackrunner | Transport of plates |
Turn table | Hamilton Robotics | Turn Table | Adjust plate orientiation |
Uninterruptible power supply | APC | Smart UPS RT Unit, 10000 VA Power supply |
Backup power supply |
VIAFLO-pipettes | Integra | 4500 | Electronic pipette |
ViiA 7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4453545 | Real-time PCR machine |
Materials | Distributor | Catalog Number | Notes |
1-well culture plate (84 cm2) | Thermo Fischer Scientific | 165218 | Nunc OmniTray |
6-well culture plates (9.6 cm2) | Greiner Bio-One | 657160 | TC treated with lid |
12-well culture plate (3.9 cm2) | Greiner Bio-One | 665180 | TC treated with lid |
96-well culture plate (0.32 cm2) | Perkin Elmer | 6005558 | CellCarrier-96 Black plate |
Tips, 50-µL | Hamilton Robotics | 235987 | 50-uL tips |
Tips, 300-µL | Hamilton Robotics | 235985 | 300-µL tips |
Tips, 1000-µL | Hamilton Robotics | 235939 | 1000-µL tips |
Tips, 5-mL | Hamilton Robotics | 184022 | 5-mL tips |
Tubes, 15-mL | Greiner Bio-One | 188271 | 15-mL tubes |
Tubes, 50-mL | Greiner Bio-One | 227261 | 50-mL tubes |
Nalgene cryogenic 2.0 mL vials | Sigma Aldrich | V5007 | Cryovials |
Plasmids | Distributor | Catalog Number | Notes |
pLV_hEF1a_rtTA3 | Addgene | 61472 | Kind gift from Ron Weiss |
pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro | Addgene | 61474 | Kind gift from Ron Weiss |
pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus | Takara Bio | 631983 | |
Primers | Sequence (forward) | Sequence (reverse) | Source |
iPSC pluripotency | |||
OCT4 (ID 4505967a1) | CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG | GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC | PrimerBank |
NANOG (ID 153945815c3) | CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA | CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC | PrimerBank |
REX1 (ID 89179322c1) | AGAAACGGGCAAAGACAAGAC | GCTGACAGGTTCTATTTCCGC | PrimerBank |
NGN2 neurons | |||
MAP2 (ID 87578393c1) | CTCAGCACCGCTAACAGAGG | CATTGGCGCTTCGGACAAG | PrimerBank |
BRN2 (ID 380254475c1) | CGGCGGATCAAACTGGGATTT | TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT | PrimerBank |
CUX2 (ID 291045458c2) | CGAGACCTCCACACTTCGTG | TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG | PrimerBank |
NCAM1 (ID 336285437c3) | TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC | CTCACAGCGATAAGTGCCCTC | PrimerBank |
SYNAPSIN1 (ID 91984783c3) | TGCTCAGCAGTACAACGTACC | GACACTTGCGATGTCCTGGAA | PrimerBank |
mDA neurons | |||
TH | CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA | CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA | NCBI primer-BLAST |
MAP2 | GGATCAACGGAGAGCTGAC | TCAGGACTGCTACAGCCTCA | NCBI primer-BLAST |
Housekeeping genes | |||
GAPDH | GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG | GAGCCCCAGCCTTCTCCATG | NCBI primer-BLAST |
OAZ1 | AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT | ATGAAGACATGGTCGGCTCG | NCBI primer-BLAST |
RPLPO | CCTCATATCCGGGGGAATGTG | GCAGCAGCTGGCACCTTATTG | NCBI primer-BLAST |
RPL13A | GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC | TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC | NCBI primer-BLAST |
Media and Reagents | Distributor | Catalog Number | Use concentration |
Coating matrix | |||
Extracellular matrix (Matrigel) | Corning | 354277 | 10 μg/mL |
Fibronectin | Corning | 356008 | 2 μg/mL |
Laminin | Sigma | L2020 | 5 – 10 μg/mL |
Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | P3655 | 0.1 mg/mL |
Culture media | |||
iPSC culture medium (Essential 8 Flex medium) |
Gibco | A2858501 | |
NGN2 neurons – NGN2 medium | |||
2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 0.909 mL (50 µM) |
B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (1%) |
DMEM/F-12, GlutaMAX | Gibco | 31331093 | 484.75 mL |
GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL ( 2 mM) |
Insulin | Sigma | I9278 | 0.25 mL (2.5 µg/mL) |
MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140050 | 5 mL (0.5%) |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | 5 mL (0.5%) |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 485 mL |
mDA neurons – SRM medium | |||
2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 0.5 mL (55 µM) |
GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL (2 mM) |
Knockout DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | 409.5 mL |
Knockout serum replacement (serum replacement) |
Gibco | 10828028 | 75 mL (15%) |
MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140050 | 5 mL (1%) |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL (1%) |
mDA neurons – N2 medium | |||
B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (2%) |
GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL (2 mM) |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | 5 mL (1%) |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 475 mL |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL(1%) |
mDA neurons – Differentiation medium | |||
B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (2%) |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 485 mL |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL (1%) |
NGN2 neurons – Supplements | |||
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) |
Peprotech | 450-02 | 10 ng/mL |
CHIR99021 (CHIR) | R&D | 4423/10 | 2 μM |
Doxycyline (dox) | Sigma | D9891 | 2.5 μg/mL |
Glial-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) |
Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL |
L-ascorbic acid 2-phosphate magnesium (AA2) |
Sigma | A8960 | 64 mg/L |
Neurotrophic factor-3 (NT-3) | Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL |
Purmorphamine (PMA) | Cayman | 10009634 | 0.5 μM |
Puromycin | Sigma | P8833-10MG | 0.5 μg/mL |
Thiazovivin | Merk Millipore | 420220-10MG | 2 μM |
mDA neurons – Supplements | |||
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) |
Peprotech | 450-02 | 20 ng/mL |
CHIR99021 (CHIR) | R&D | 4423/10 | 3 μM |
DAPT | Cayman | 13197 | 10 µM |
Dibutyryl-cAMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | 1 mM |
Fibroblast Growth Factor 8B (FGF-8b) | Peprotech | 100-25 | 100 ng/mL |
Glial-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) |
Peprotech | 450-10 | 20 ng/mL |
L-ascorbic acid (AA1) | Sigma | A4403 | 0.2 mM |
LDN193189 (LDN) | Cayman | 11802 | 100 nM |
Purmorphamine (Purm) | Cayman | 10009634 | 2 μM |
Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus (SHH) |
R&D | 1845-SH | 100 ng/mL |
SB431542 (SB) | Cayman | 13031 | 10 μM |
Transforming Growth Factor type ß3 (TGFß3) |
R&D | 243-B3 | 1 ng/mL |
Y-27632 | Cayman | 10005583 | 10 µM |
Dissociation reagents | |||
Single cell dissociation reagent (StemPro Accutase) |
Gibco | A1110501 | 1x |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Gibco | 11575020 | 0.5 mM |
RNA isolation and cDNA kit | |||
RNA isolation kit | Qiagen | 74106 | Rneasy MiniKit |
RNA lysis buffer | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | Trizol lysis buffer (RNA lysis buffer) |
Reverse transcriptase (kit) | Thermo Fisher Scientific | 18080-085 | SuperScript III Reverse Transcriptase |
Software | Company | Catalog Number | Description/Application |
Cell Culture Framework (CCF) (Graphical user interface, GUI) |
Hamilton Robotics | Custom-made | User interface for the automated system |
CellPathFinder software (image analysis software 1) |
Yokogawa | CellPathfinder HCS Software | Image analysis tool |
CellVoyager Measurement System | Yokogawa | Included with CellVoyager 7000 |
Microscope controlling software |
Columbus software (image analysis software 2) |
Perkin Elmer | Columbus | Image analysis tool |
Cloud based qPCR app | Thermo Fisher Scientific | Themo Fisher cloud | Analysis software for qRT-PCR data |
Venus software | Hamilton Robotics | VENUS Two Dynamic Schedular 5.1 Software |
Controlling software for the automated system |