Summary
هنا، نقدم بروتوكول لإعداد واستزراع حاجز الدم في الدماغ الورم النقيلي البيئة الدقيقة ومن ثم تحديد حالته باستخدام التصوير confocal والذكاء الاصطناعي (التعلم الآلي).
Abstract
الانبثاث الدماغية هي الآفات السرطانية الأكثر فتكا; 10-30٪ من جميع السرطانات تنتشر إلى الدماغ، مع متوسط البقاء على قيد الحياة فقط ~ 5-20 أشهر، اعتمادا على نوع السرطان. للحد من عبء الورم النقيلي في الدماغ، يجب معالجة الثغرات في المعرفة الأساسية والترجمة. وتشمل التحديات الرئيسية ندرة النماذج السابقة للتكرار والأدوات المرتبطة بها. يمكن أن تسفر النماذج ثلاثية الأبعاد من الانبثاث الدماغي عن البيانات الجزيئية والذينة ذات الصلة المستخدمة لتلبية هذه الاحتياجات عند دمجها مع أدوات التحليل المخصصة. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع نماذج مورين، نماذج الجهاز على رقاقة من الخلايا السرطانية المريض عبور حاجز الدم في الدماغ في البيئة الدقيقة تولد نتائج بسرعة وأكثر قابلية للتفسير مع الأساليب الكمية، وبالتالي قابلة لاختبار الإنتاجية عالية. هنا وصف ونوضح استخدام رواية 3D ميكروفلورويديك الدماغ منصة (μmBBN) حيث عناصر متعددة من مكانة يمكن أن تكون تربية لفترة طويلة (عدة أيام), صورت الفلورسنت عن طريق المجهر confocal, والصور التي أعيد بناؤها باستخدام تقنية التصوير المقطعي confocal مبتكرة; تهدف جميع لفهم تطور الانبثاث الدقيق والتغيرات في البيئة الدقيقة الورم (TME) بطريقة متكررة وكمية. نحن نُوضح كيفية تصنيع، البذور، الصورة، وتحليل الخلايا السرطانية ومكونات TME الخلوية والخلطية، وذلك باستخدام هذه المنصة. وعلاوة على ذلك، فإننا نظهر كيف يتم استخدام الذكاء الاصطناعي (الذكاء الاصطناعي) لتحديد الاختلافات الظاهرية الجوهرية للخلايا السرطانية القادرة على العبور من خلال نموذج μmBBN وتعيينها على مؤشر موضوعي لإمكانات النقيلي الدماغ. يمكن استخدام مجموعات البيانات الناتجة عن هذه الطريقة للإجابة على الأسئلة الأساسية والترجمة حول الانبثاث، وفعالية الاستراتيجيات العلاجية، ودور TME في كليهما.
Introduction
الانبثاث الدماغية هي الآفات السرطانية الأكثر فتكا; 10-30٪ من جميع السرطانات تنتشر إلى الدماغ، مع بقاء متوسط فقط ~ 5-20 أشهر، اعتمادا على نوع السرطان1،2. والسؤال الرئيسي الذي يطرح نفسه عند دراسة الانبثاث السرطان هو كيف هجرة المستنسخات الفرعية من بيئة فكية من مجرى الدم إلى جهاز مثل الدماغ3،4. وقد أدى هذا السؤال إلى العديد من الاختلافات من الهجرة والغزو، والجرايس البذخ. كل هذه الأساليب حصة الخطوة الحاسمة من عد أو قياس خصائص الخلايا التي تنتقل من موقع إلى آخر استجابة للحافز. معظم الهجرات المتاحة بسهولة تستخدم لدراسة هجرة ثنائية الأبعاد للخلايا السرطانية. وقد أوضحت هذه الثروة من المعرفة؛ ومع ذلك ، فإنها لا تُلخي الطبيعة ثلاثية الأبعاد لنظام vivo الذي يمكن أن توفره طرق أخرى5. لذلك ، من الضروري دراسة البيئة الدقيقة للورم (TME) في الأنظمة ثلاثية الأبعاد (3D) ، ولكن طرق التحليل المتاحة للهياكل ثلاثية الأبعاد محدودة وغير متسقة في كثير من الأحيان.
واحدة من الأدوات 3D الأكثر شعبية هي غرفة بويدن التي تتكون من غشاء معلق في الجزء السفلي من بئر، وفصل اثنين من المناطق المتميزة. قدم بويدن المقايسة لدراسة الكريات البيض chemotaxis4. قد تختلف المناطق السفلية عن طريق الكيمياء أو وسائل أخرى6،7 لحث الخلايا في المنطقة العليا على الهجرة إلى المنطقة السفلى. النهج الأكثر شيوعا لتحديد عدد الخلايا التي هاجرت هو تحرير الخلايا من أسفل الغشاء باستخدام محلول عازل، وزل منها، ومن ثم عدها على أساس كمية محتوى الحمض النووي في الحل7. هذا النهج غير المباشر عرضة لخطأ المشغل بسبب تنوع التقنية ويدمر الإجراء المعلومات حول النمط الظاهري للسرطان والبيئة الدقيقة. الاختلافات في غرفة Boyden فحص تنطوي على تثبيت الخلايا المهاجرة التي تبقى على الغشاء, ولكن يوفر فقط عدد الخلايا التي لم تعد قابلة للتطبيق لمواصلة الدراسة6,8,9.
بسبب القيود المفروضة على غرفة بويدن ونمو الابتكارات في المجتمع microfluidic، وقد وضعت رقائق فحص الهجرة التي مراقبة حركة الخلايا استجابة لحافز في اتجاه واحد بدلا من ثلاثة10،11،12. تسهل هذه المقايسات الهجرة السيطرة على عوامل مثل التدفق أو فصل خلية واحدة13،14 التي تمكن من تفسير أفضل للنتائج؛ ومع ذلك، فإن تنسيقها 2D يفقد حتما بعض المعلومات الحيوية. وقد ركزت الدراسات الحديثة على البذخ (أي، حركة الخلايا من الدورة الدموية إلى الأنسجة، مثل حاجز الدم في الدماغ) في بيئة 3D14،15. المسافة البذخ في الأنسجة والسلوك التحقيق الذي يحدث في الحاجز الخلوي / الغشاء هو أكثر دقة من القياسات التي تم جمعها باستخدام إما غرفة بويدن أو جهاز الهجرة microfluidic 2D16. وبالتالي، فإن الأجهزة التي تمكن التصوير المناسب وتحليل البذخ ثلاثي الأبعاد هي حاسمة لالتقاط هذه القياسات المتطورة ولكنها تفتقر إلى المؤلفات.
مستقلة عن عمليات الفحص الهجرة، وقد تم تطوير تقنيات التصوير القوية للتصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي) والتصوير المقطعي التي هي قادرة على تحديد وإعادة بناء الأنسجة بدقة في الفضاء 3D17،18. هذه التقنيات الحصول على الصور في مداخن ض وأجزاء جزء من الصورة على أساس خصائص الأنسجة ومن ثم تحويل الصور مجزأة إلى شبكات ثلاثية الأبعاد19،20،21. وهذا يسمح للأطباء تصور في 3D الفردية والعظام والأوعية للمساعدة في التخطيط الجراحي أو المساعدة في تشخيص السرطان أو أمراض القلب22,23. هنا، سوف نظهر أن هذه النهج يمكن تكييفها للاستخدام على العينات المجهرية وأجهزة البذخ 3D.
وتحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير تقنية التصوير المقطعي confocal المبتكرة، التي قدمت هنا، والتي توفر المرونة لدراسة البذخ من الخلايا السرطانية عبر غشاء من خلال تكييف أدوات التصوير المقطعي القائمة. هذا النهج يتيح دراسة سلسلة كاملة من السلوكيات الخلايا السرطانية لأنها تتفاعل مع حاجز الخلوية, مثل طبقة الخلايا البطانية. تظهر الخلايا السرطانية سلوكيات التحقيق. قد يغزو البعض ولكن تبقى قريبة من الغشاء، في حين أن البعض الآخر اجتياز الحاجز بسهولة. هذه التقنية قادرة على تقديم معلومات حول النمط الظاهري للخلية في جميع الأبعاد24. استخدام هذا النهج لدراسة TME على حد سواء غير مكلفة نسبيا، وسهلة التفسير، وقابلة للتكرار، بالمقارنة مع أكثر تعقيدا في نماذج مارين الجسم الحي. وينبغي أن توفر المنهجية المقدمة أساسا قويا لدراسة أنواع كثيرة من الأورام والبيئات الصغرى من خلال تكييف منطقة السترومال.
نحن وصف وإثبات استخدام 3D ميكروفلويديك الدماغ منصة (μmBBN) منصة(الشكل 1)حيث العناصر الحرجة من الحاجز والمتخصصة (خلايا الدماغ البطانية الدقيقة الأوعية الدموية والخلايا الفلكية) يمكن أن تكون استزراع لفترة طويلة (ما يصل إلى 9 أيام تقريبا)، صورت الفلورسنت عن طريق المجهر confocal، والصور التي أعيد بناؤها باستخدام لدينا تقنية التصوير المقطعي confocal(الشكل 2). تهدف جميع لفهم تطور الانبثاث الجزئي والتغيرات في البيئة الدقيقة الورم بطريقة متكررة وكمية. وتتألف واجهة حاجز الدماغ الدم مع مكانة الدماغ من خلايا البطانية الدقيقة الدماغ التي يتم تعزيزها بواسطة غشاء الطابق السفلي, أقدام استروسيتي, و25. ركزنا بشكل انتقائي على مكونات الأسترويتي والبطانية نظراً للأهمية التي لها في تشكيل وتنظيم حاجز الدم في الدماغ. نحن نُوضح كيفية تصنيع، البذور، الصورة، وتحليل الخلايا السرطانية والورم الجزئي البيئة الخلوية والمكونات الخلطية، وذلك باستخدام هذه المنصة. وأخيرا، فإننا نظهر كيف يمكن استخدام التعلم الآلي لتحديد الاختلافات الظاهرية الجوهرية للخلايا السرطانية التي هي قادرة على العبور من خلال نموذج μmBBN، وتعيين لهم مؤشرا موضوعيا من إمكانات النقيلي الدماغ24. يمكن استخدام مجموعات البيانات الناتجة عن هذه الطريقة للإجابة على الأسئلة الأساسية والتوانية حول الانبثاث والاستراتيجيات العلاجية ودور TME في كليهما.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الدم الدماغ حاجز المتخصصة العفن
ملاحظة: جهاز زراعة المستخدمة في هذه المنصة هو سقالة تستند PDMS التي نبني على حاجز الدم الخلوية على مكانة الدماغ. وهي مصنوعة من جزأين مفصولة بغشاء مسامي. لإعداد حاجز الدم المتخصصة في الدماغ اثنين من القوالب SU-8 التي تم إجراؤها باستخدام التصوير الضوئي ضرورية26,27. وسيتم وصف البروتوكول ل 100 ميكرومتر سميكة العفن أولا ثم سيتم إعطاء ملاحظات ل200 μm العفن سميكة.
- لإعداد القالب، وتنظيف رقاقة السيليكون 4 "باستخدام الأسيتون مع زجاجة ضغط ومن ثم تجفيفه مع بندقية النيتروجين.
- خبز رقاقة السيليكون على الساخن لمدة 10 دقيقة في 200 درجة مئوية لإزالة جميع المذيبات المتبقية.
- بدوره مركز رقاقة السيليكون على تشاك من اللفة والتدوير 1 مل من SU8-2075 لقالب أعلى. تدور لمدة 5 ق في 500 دورة في الدقيقة (تسارع 300 دورة في الدقيقة / ث) لتفريق photoresist ثم 30 s في 2200 دورة في الدقيقة (تسارع 300 دورة في الدقيقة / ث) للحصول على 100 ميكرومتر سميكة SU-8 طلاء. قد يكون التحسين ضروريًا لتحقيق السماكة المحددة.
- الناعمة خبز رقاقة على الساخن في 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ثم على الفور في 98 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- ضع الرقاقة في مصباح التصوير الضوئي ووضع القناع الذي تم توسيطه على الرقاقة وفقًا للإجراءات القياسية. فضح الويفر المغلفة SU-8 مع اشعاع من 230 mJ/cm2 من UVB (360 نانومتر ± 10 نانومتر). ويمكن إجراء تجربة مصفوفة التعرض لتحديد الجرعة المثلى. تتوفر تصاميم القناع في ملف إضافي 1.
- قم بإجراء خبز ما بعد التعرض عند 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ثم مباشرة عند 98 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتحسين التصاق. تبريد رقاقة إلى 50 درجة مئوية.
- إزالة مقاومة غير مكشوفة باستخدام SU-8 مطور الصور. شطف رقاقة في المطور لمدة 5 دقائق في حمام ومن ثم استخدام زجاجة رذاذ مليئة المطور SU-8 في غطاء محرك السيارة الكيميائية لتهيج وإزالة المتبقية UNCURED SU-8. ويمكن استخدام مجهر 4x لمراقبة ما إذا كان قد تم إزالة جميع SU-8 uncured. يشير خط أبيض على حواف ميزات الضوئي إلى أن SU-8 لم تتم إزالتها بالكامل.
- قم بإجراء خبز ثابت نهائي في فرن عند 110 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
- اتبع نفس الإجراء ل200 μm سميكة العفن باستخدام SU -8 2075 ولكن ضبط البروتوكول على ما يلي:
- إعدادات المغطي تدور: تدور لمدة 5 s في 500 دورة في الدقيقة (تسارع 300 دورة في الدقيقة / ثانية) لتفريق photoresist ثم 30 s في 1300 دورة في الدقيقة (تسارع 300 دورة في الدقيقة / ثانية) للحصول على 200 ميكرومتر سميكة طلاء.
- خبز ناعم عند 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ثم عند 98 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
- وقت التعرض من 340 mJ / سم2.
- آخر التعرض خبز: 2 دقيقة في 65 درجة مئوية، ثم 98 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- وأخيرا، silanize كل رقاقة عن طريق وضعها في غرفة فراغ داخل غطاء محرك السيارة الكيميائية مع حاوية بلاستيكية التي 3 قطرات (~ 150 ميكرولتر) من محلول سيلانينغ (Trichloro perfluoro أوكتينيل سيلان) وقد وضعت. سحب فراغ وترك بين عشية وضحاها للسماح للبخار لمعطف رقاقة. هذه الخطوة يقلل من الالتصاق بين SU-8 و PDMS، وزيادة حياة القالب.
تنبيه: يجب التعامل مع سيلاني البيرفلوروكل ثلاثي الكلورو في غطاء الدخان والاحتفاظ به بعيدًا عن مصادر المياه. - ضع قوالب رقاقة فردية في أطباق بيتري مقاس 150 مم باستخدام شريطين من الشريط على الوجهين. تأكد من أن الرقاقة مسطحة. بديل هو تصنيع قالب الألومنيوم الذي يمكن أن توضع رقاقة. لأن يتم إحاطة قالب الألومنيوم أنها سوف تنتج يلقي مع سمك موحدة، في حين أن طريقة طبق بيتري حساس لإمالة السطح هو وضعها على. يقلل التسطيح المحسّن لـ PDMS من وقت التصوير المُنغلق.
2. تشكيل وتجميع حاجز الدم الدم PDMS (BBB) الجهاز
- مزيج 75 غرام من PDMS بنسبة 1:10 (Crosslinker: قاعدة) حسب الوزن في كوب من البلاستيك.
- صب PDMS على القوالب (1 مم سميكة ل200 ميكرومتر سميكة العفن و 4 مم لل 100 ميكرومتر سميكة العفن) ، وديغا في الظّامات فراغ لمدة ساعة واحدة أو حتى جميع الفقاعات قد أزيلت. وضع في فرن 65 °C بين عشية وضحاها. ويمكن تعديل سمك 1 ملم على أساس مسافة العمل من الهدف 10x في المجهر confocal.
- بعد أن شفى PDMS استخدام شفرة لقطع بلطف ضد رقاقة من خلال PDMS حول الحواف. قشر PDMS قبالة واستخدام شفرة لقطع على طول أدلة مستطيلة و1.5 ملم لكمة خزعة لفتح المداخل ومنافذ على الجهاز. غطي أجزاء جهاز PDMS بشريط تعبئة بعرض 48 مم للحفاظ على نظافته من الغبار والحطام.
- المقبل استخدام مقص تشريح لقطع 5 مم × 50 مم مستطيل من غشاء البولي مع 5 ميكرومتر المسام وتخزينها داخل طبق بيتري لاستخدامها في وقت لاحق.
- جمع ما يلي: 200 ميكرولتر ماصة تلميح، 2 مل من 1:10 PDMS مختلطة مع toluene بنسبة 2:3 من قبل الوزن في قارورة الزجاج، ماصة باستور مع لمبة الضغط، و PDMS استعداد الأجزاء العليا والسفلى، والغشاء، وثلاث 50 مم × 75 شرائح الزجاج ونقل كل شيء إلى معطف تدور. يتم تصوير الخطوات التالية لتجميع وبذر الخلية من الجهاز في الشكل 1.
- استخدام ماصة باستور لنقل 1 مل من PDMS:toluene الحل الغراء في شريحة الزجاج 50 مم × 75 ملم على تشاك من اللفاف. الدوران لمدة 5 ثوان عند 100 دورة في الدقيقة (التسارع 300 دورة في الدقيقة في الثانية) و 30 ثانية عند 2000 دورة في الدقيقة (التسارع 300 دورة في الدقيقة/ثانية).
- ضع الشريحة على طاولة واغطيها بغرفة عليا واحدة من نظام إدارة المباني وغرفة أدنى واحدة بحيث تكون وجوه PDMS مع ميزات مصبوبة فيها تتصل بالشريحة ويتم نقل الغراء إلى وجه PDMS ، مما يحدد محيط جميع الميزات.
- اقلب الغرفة العليا لـ PDMS على شريحة أخرى مع طلاء الغراء الذي يواجه لأعلى ووضع الغشاء عبر الجهاز عبر الجهاز بين المداخل ومنافذ البيع. وضع تلميح 200 μL في الحل الغراء PDMS:toluene حتى أنه قد الأشرار بعض في طرف. المس الطرف بين كل مدخل ومأخذ لوضع قطرة صغيرة بالقرب من حافة الغشاء حيث يتصل بـ PDMS.
- إزالة النصف الآخر من الجهاز ووضعها على مع الغراء طلاء أسفل في حين محاذاة المداخل ومنافذ على جزأين.
- ضع الجهاز المجمع في فرن عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها لعلاج الغراء. نقل إلى جرة جرس فراغ مع المجففة والسماح للجفاف لمدة يومين. هذه خطوة حاسمة للسماح للتيوين بالتبخر وتحسين اتساق البذر الجهاز من خلال تنظيم بخار الماء الممتص في الهواء المختبري.
3. بذور البيئة الدقيقة الدماغ في الجهاز
- خلية تربية والكواشف: قبل البدء في هذا البروتوكول، الحصول على الكواشف والخلايا التالية. زراعة جميع خطوط الخلية في حاضنة تعيين في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2.
- الحفاظ على الإنسان الثلاثي السلبية سرطان سرطان الجلد الخلية MDA-MB-231 (ATCC HTB-26) وMDA-231-BR-GFP الخلايا (التي تم الحصول عليها من باتريشيا ستيغ, دكتوراه) في DMEM مع 4.5 غرام / لتر الجلوكوز, تستكمل مع 2 M L-الجلوتامين, 10% FBS و 1x مضاد حيوي مضاد للحم. إنشاء خلايا الفلورسنت MDA-MB-231-GFP عن طريق transducing MDA-MB-231 خلية مع ناقل فارغ pLL-EV-GFP فيروس العدس. فرز إجمالي البيانات المُنَزَرَععليه + السكان باستخدام فرز الخلايا المُنشَّط بالفلور (FACS) قبل التجريب.
- الحفاظ على الدماغ البشري الخلايا البطاخلية الدقيقة هسيك / D3 في المتوسط EGM-2. إنشاء خلايا فلورية hCMEC/D3-DsRed عن طريق transducing hCMEC/D3 مع ناقلات فارغة pLL-3.7-dsRed فيروس العدسي. إزالة جميع الخلايا غير المستحثة وغير الفلورية من الاستزراع باستخدام FACS قبل الاستخدام التجريبي.
- الحفاظ على الخلايا الفلكية البشرية العادية (NHA) في DMEM تكمل مع 4.5 غرام / لتر الجلوكوز, 10% FBS, 2 mM Glutamax, 1 mM بيروفات الصوديوم, 1x N-2 تكملة النمو, و 1x مضاد للمضادات الحيوية. تخليد الخلايا الفلكية عن طريق transducing pLOX-TERT-iresTK متجه العدسي (Addgene 12245). إنشاء ناقلات باستخدام psPAX2 psPAX2 ومغلف pMD2.G (أدجين 12260 و 12259).
- إزالة جهاز μmBBN من الديسكات فراغ ووضعها على سطح المعدن أو الورق (أي الشريط) مع المداخل التي تواجه لأسفل ووضعها في غرفة البلازما. أيضا وضع 50 مم × 75 مم شريحة الزجاج في غرفة البلازما. سحب فراغ ومن ثم علاج مع البلازما في 80 W لمدة 30 s.
- بسرعة إزالة الشريحة الزجاجية والجهاز من غرفة البلازما ووضع الجهاز مع مداخل التي تواجه حتى على الشريحة الزجاجية الانحياز باستخدام دليل (ملف تكميلية 2). سيؤدي ذلك إلى إنشاء ارتباط دائم بين نظام إدارة المباني والشريحة الزجاجية ولا يمكن إعادة وضعه.
- المقبل قطع نصائح قبالة 16، 200 نصائح ماصة μL، 2 مم من طرف. أدخل نصائح الماصات في جميع المداخل ومنافذ البيع. يمكن وضع الجهاز مرة أخرى في الديسكات فراغ في هذه المرحلة إذا لم تكن مستعدة لذر الخلايا.
- وضع الجهاز مرة أخرى في غرفة البلازما وعلاج مع البلازما لمدة 8 دقائق في 200 W. بعد أن يبرد الجهاز (5 دقائق) من علاج البلازما وضعه داخل حاوية ثانوية معقمة، مثل صندوق تلميح ماص شفاف. تنفيذ الخطوة التالية في غضون ~ 15 دقيقة أو قد يتم تقليل فعالية العلاج البلازما مما يؤدي إلى انسداد.
- قبل عدة أيام من تجربة ثقافة بيتري أطباق من 1 ×10 6 الخلايا البطانية (hCMEC/D3-DsRed) و 1 × 106 استروبات (NHA). في حين أن الجهاز يخضع لعلاج البلازما 8 دقيقة, إعداد حل الكولاجين تتكون من 0.5 مل من 3 ملغ/ مل PureCol نوع أنا بوفين الكولاجين مع 64 ميكرولتر من 0.8 M NaHCO3 و 20 ميكرولتر من 10x عالية الجلوكوز (250 mM) MEM. تعليق 5.0 × 105 NHA الخلايا في الحل الكولاجين. الحفاظ على الحل على الجليد في حين لا قيد الاستخدام.
- نقل 120 μL من الكولاجين / astrocyte / microglia حل في الجهاز من خلال تلميح ماصة للغرفة السفلية (الشكل 1 السهام الحمراء). السماح للحل لافتاة عبر الغرفة في الطرف الماص المعاكس. بعد أن تم ملء جميع القنوات الأربع للجهاز ضع الرقاقة في حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لـ 1 h أو حتى يتم تعيين الكولاجين.
- بعد مجموعات الكولاجين، ملء جميع نصائح ماصة تغذية الغرفة السفلية مع مزيج من وسائل الإعلام كاملة. بالنسبة للرقائق التي تحتوي على الخلايا البطانية والدراجات الفلكية ، يتم استخدام مزيج 50:50 من endothelial: وسائل الإعلام الفلكية.
- معطف الغرفة العليا مع 2٪ عامل النمو خفضت Matrigel في وسائل الإعلام كامل endothelial باستخدام طرف ماصة الغرفة العليا(الشكل 1 الأسهم الزرقاء)ومكان في الحاضنة لمدة 1 ساعة.
- شطف الغرفة العليا مع الخليط وسائل الإعلام المشار إليها وبديل الذي هو مبذر تلميح مع الخلايا البطانية (الشكل 1 السهام الخضراء). تعليق 1 × 106 الخلايا البطانية في 1 مل من وسائل الإعلام البطانية والبذور 30 ميكرولتر كل 15 دقيقة في بالتناوب نصائح الغرفة العليا لتغطية حتى. بذور الخلايا البطانية في كل طرف الغرفة العليا مرتين، ما مجموعه 4 مرات لكل غرفة.
- بعد البذر النهائي للخلايا البطانية، ملء جميع النصائح مع خليط وسائل الإعلام ووضع الجهاز في الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2،وتغيير وسائل الإعلام في كل غرفة كل 12 ح.
4. رصد تطور تشكيل طبقة البطانية
- يتم ملاحظة التغطية الكاملة للقناة من قبل طبقة البطانية بعد 3 أيام. استخدم إحدى طريقتين لمراقبة تغطية الحاجز البطانية: الفلورانس أو TEER. hCMEC/D3-DsRed fluorescence وفقا ل- يمكن أن تكون كمية التغطية عبر منطقة القناة باستخدام ImageJ.
- افتح ملف TIFF في ممثل ImageJ من حاجز hCMEC/D3-DsRed. في برنامج ImageJ، انقر فوق ملف > فتح لتحديد الملف.
- دمج جميع الطبقات Z من الصورة باستخدام أقصى كثافة التالية هذه الأوامر الرئيسية والخيارات: صورة > مكدسات > Z المشروع > جميع شرائح Z، أقصى كثافة.
- تنفيذ عتبة اللون الذي هو نفسه عبر جميع رقائق microfluidic تقييم باستخدام هذا الأسلوب. بالنسبة للدراسة المقدمة استخدمنا عتبة 450. استخدم قائمة العتبة في ImageJ عند: صورة > ضبط > عتبة.
- قم بتعيين القياسات التي سيتم تسجيلها باستخدام الأوامر والخيارات التالية: تحليل > تعيين القياسات > الحد إلى الحد، كسر المنطقة.
- حدد منطقة تمثيلية من قناة microfluidic لقياس عن طريق رسم مربع. توجد أداة المربع في القائمة الرئيسية لـ ImageJ. القياس 3 يكرر التقنية المتمركزة في البداية، الأوسط، ونهاية كل قناة microfluidic باستخدام نفس حجم مربع.
- تحليل كل قناة وتسجيل كسر المنطقة، الذي يمثل تغطية البطانية النسبة المئوية. تصدير هذه القياسات كملفات جدول بيانات لرسم وتصور البيانات باستخدام الأوامر التالية: تحليل > قياس.
- كبديل، استخدم TEER المطياف القائم على المعاوقة لقياس الوصلات الضيقة البطانية لكل منطقة. إن القياس الكمي للحاجز البطيني باستخدام TEER هو وكيل عن سلامة الطبقة البطانية كحاجز.
- ضع قطبين كهربائيين في مدخل ومخرج الغرف العلوية والسفلى.
- كميا مقاومة أحادية البطانية كمزيج من المقاومات، الحث، والقدرات في رقاقة وفقا لنموذج اقترح من قبل Srinivasan وآخرون28،29.
5. الخلايا السرطانية البذور في الجهاز
- بعد أن نضجت طبقة البطانية، بذور الخلايا السرطانية في الجهاز. إعداد حل 1 مل من 1 × 106 الخلايا السرطانية في وسائل الإعلام خلية سرطانية كاملة.
- تبادل وسائل الإعلام في رقاقة لتجديد المواد الغذائية ثقافة الخلية.
- بذور كل قناة غرفة أعلى مع 30 ميكرولتر من الخلايا السرطانية في التعليق ومن ثم وضع الجهاز مرة أخرى في الحاضنة لمدة 15 دقيقة. بذور دائما الخلايا السرطانية على نفس الجانب من جميع القنوات الأربع غرفة أعلى داخل جهاز واحد.
- تبادل الجهاز مع وسائل الإعلام الجديدة وإعادة ملء النصائح كل 12 ساعة حتى يتم تصوير الجهاز لسلوك النقيلي.
6. صورة الورم الصغرى البيئة عن طريق التصوير confocal
- عند النقطة الزمنية التجريبية المرغوبة (1 أو 2 أو 9 أيام)، استخدم التصوير confocal لالتقاط صورة ثلاثية الأبعاد للقناة. نقوم بهذه الخطوة على نيكون A1 باستخدام الإعدادات الموضحة هنا. هذه الخطوة هي آلية، وتتطلب كل قناة 20-40 دقيقة للصورة اعتمادا على عدد القنوات الفلورية التي يتم تضمينها والعمق Z اللازمة لتغطية مواقف جميع الخلايا.
- تشغيل المجهر، وفتح البرنامج ووضع غطاء الحاضنة على المجهر.
- تعيين سخان مرحلة المجهر إلى 37 درجة مئوية CO2 إلى 5٪ إذا كان متوفرا.
- بعد استقرار حاضنة المجهر، ضع الجهاز في مرحلة المجهر باستخدام جبل 50 مم × 75 ملم.
- التركيز على جانب واحد من الجهاز (على اليسار إذا كان ليتم استخدامها مع برنامج التحليل المقدمة) مع هدف 10x وتعيين ارتفاع Z على أنها صفر. تحت إعدادات المكدس z، وتشمل مجموعة من 100 ميكرومتر فوق و 200 ميكرومتر تحت مستوى التركيز. ثم استخدم إعداد خياطة لتعيين عدد من الحقول س و ص إلى 1 و 9 على التوالي مع 15% تراكب. تعيين الثقب إلى الحد الأدنى الموصى به وارتفاع الطبقة z إلى 9 ميكرومتر. ضبط التعرض الميداني مشرق بحيث غشاء مسامية مرئية. تشغيل أشعة الليزر الإثارة للقنوات dsRed (561 نانومتر) و GFP (488 نانومتر) وضبط القوى الليزر الفلورسنت وقطع بحيث كل قناة مرئية دون الإفراط في بكسل.
- تحقق من أن كافة الحقول في التركيز عند تجاوزها. إذا كان الأمر كذلك، أدخل اسم ملف إخراج (001.nd2) للصورة وابدأ التجربة لالتقاط الصورة confocal 3D تلقائياً.
7. قياس الورم البيئة الدقيقة عن طريق التصوير المقطعي confocal
- استخدم التصوير المقطعي confocal منهجًا لتقدير مجموعة من المقاييس والقياسات التي تصف الخلايا الفردية وبيئة الورم الدقيقة داخل الجهاز. تحليل الmomographic Confocal (الشكل 2) يحول الكوام ز المكدس إلى تمثيل ثلاثي الأبعاد للخلايا. باستخدام البرنامج النصي بيثون مخصصة داخل Jupyter المحمول / بيئة مختبر، ثم يتم مطابقة الطائرة إلى طبقة من الخلايا التي تشكل حاجز الدم في الدماغ مثلغشاء 30. وأخيراً، قم بإجراء قياسات فينوتيبيك لفئات الخلايا السرطانية(الجدول 1).
- إجراء هذا التحليل في نهاية تجربة أو خلال دورة زمنية. تثبيت بيثون والمكتبات المناسبة وفقا لدليل البرمجيات المشار إليها، ثم فتح البرنامج من ويندوز موجه الأوامر من خلال تشغيل الأمر "conda تنشيط"، تليها "jupyter مختبر". سيتم تحميل بيئة Jupyter ضمن المستعرض الافتراضي.
- من ملف Jupyter مستكشف انقر مرتين على Jupyter دفتر الملاحظات "contom.ipynb" لفتحه. تشغيل الخلية تحت عنوان استيراد المكتبات والفئات المخصصة / وظائف وإعداد دفتر الملاحظات عن طريق النقر فوق خلية دفتر الملاحظات ثم النقر فوق زر التشغيل. يتم تنفيذ كافة خلايا دفتر الملاحظات أدناه باستخدام نفس الطريقة. لاحظ أن دفتر الملاحظات هنا "خلية" يشير إلى كتلة من رمز بيثون داخل دفتر Jupyter.
- إعداد البيانات. تستخدم هذه الخوارزمية مجموعة أدوات المرئيات (VTK) لمعالجة وعرض مكدس z والبيانات ثلاثية الأبعاد17.
- ضع . XLSX ("تعقب التجربة.xlsx") في نفس مجلد الإطارات كدفتر ملاحظات Jupyter. يتتبع الملف التجارب والواجهات مع دفتر Jupyter. ضع الملف ND2 من المقطع 6 في مجلد فرعي يسمى "\Experiment_XXX\Confocal\" أسفل موقع دفتر الملاحظات Jupyter. يمكن إضافة مجلدات إضافية للتجربة في داخل عن طريق ضبط "XXX" إلى المعرف العددي المعين إلى المجلدات الجديدة.
- تسمية المجلد التجربة الأولى "Experiment_001" وملف ND2 "001.nd2". أولاً، قم بتحويل ملف التصوير ND2 إلى ملف TIFF متعدد الصور المخيط مفصولة بقناة ملونة. قم بذلك عن طريق تنفيذ الخلية الدفترية أسفل العنوان "قراءة المكدس z confocal في الذاكرة" مع وظيفة Save_tiff_from_ND2 () غير مُتَرَكَّد30. الملف ND2 هو شكل التصوير الملكية من نيكون ، وبالتالي فمن الضروري لتحويله إلى تنسيق أن البرمجيات مفتوحة المصدر متوافق مع.
ملاحظة: يتم استخدام TIFF (تنسيق ملف صورة العلامة) لأنه موجود في كل مكان، متوافق مع 16 بت، ويسهل استيراده إلى VTK، ويمكن تخزين صور متعددة في ملف واحد، وهو مناسب لصور مكدس z. تنفيذ الخلية الدفترية سوف تقرأ في صورة من الملف ND2، واستخراج المعلومات من اللون وXYZ المواضع ثم تخزين تلك الصورة في صفيف نومبي وفقا لبنية محددة مسبقا. ثم سيتم حفظ الصفيف كملف TIFF باستخدام ملف tiff file مكتبة python.
- تحويل بيانات التصوير إلى نموذج ثلاثي الأبعاد
- استيراد ملف TIFF إلى VTK (vtkTIFFReader) باستخدام تقديم ثلاثي الأبعاد لتصور الخلايا (الشكل 2). حدد عتبة استناداً إلى لون الخلايا في الصورة. لتوضيح، كائن VTK يمثل كتلة من بكسل (س، ص، Z) في الفضاء (وحدة التخزين) ولكن فقط بكسل معينة (الأخضر أو الأحمر) يمثل الخلايا، والباقي هي الخلفية أو الضوضاء (أسود).
- لذلك، تعيين عامل تصفية التعتيم على وحدة التخزين الذي يزيل الخلفية تأكيد أن ما تبقى من الفلوريسانس هو الخلايا فقط. القيام بذلك باستخدام الخلية الدفتري Jupyter بعنوان ، تغيير قيم التعتيم لكل قناة المجهر عن طريق ضبط متغيرات القيمة Channel_alpha (أي ، GFP_alpha). تصور التأثير باستخدام خلية دفتر الملاحظات بعنوان عرض عرض ثلاثي الأبعاد للتحقق من العتبة يتم تعيينها بشكل صحيح.
- حفظ قيم العتامة في جدول البيانات لاستخدامها في الخطوة التالية. تحويل بيانات وحدة التخزين إلى كائنات 3D فردية، كل منها يمثل خلية في الصورة باستخدام تقنية تسمى "مكعبات المسيرة31. تستخرج هذه الخوارزمية شبكة متعددة الأضلاع من ايسوسورس من حقول تحجيمية منفصلة ثلاثية الأبعاد من voxels.
- استخدم قيمة العتامة في خوارزمية cubeing لفصل كل خلية عن الخلفية. أكمل هذه الخطوة لجميع الخلايا الفلورية التي تم تحديدها في كل قناة مجهرية عن طريق تشغيل تحويل صورة voxel إلى شبكة مثلثة وحفظ كملف VTK في دفتر الملاحظات.
- تركيب الطائرة إلى الغشاء
- تناسب الطائرة إلى الحاجز endothelial عن طريق تحديد أول المركزية الخلية (خلية دفتر الملاحظات: تحليل قناة RFP (حاجز endothelial)). تكرار خلال شبكة القائمة في وحدة التخزين واستخراج المناطق غير المتصلة باستخدام "تصفية اتصال متعددة من VTK". حساب المركزية لكل شبكة وإضافة القياس إلى قائمة من فلترة المركزية للشبكات التي هي كبيرة جدا أو صغيرة جدا (<50، > 1000000 voxels).
- تناسب الطائرة إلى قائمة من المركزية للخلايا البطانية باستخدام أدنى طريقة خطأ (خلية دفتر الملاحظات: تناسب الطائرة إلى fp centroids (حاجز بطانة)) (الشكل 2، الشكل 3)32. فحص تناسب من الطائرة عن طريق رسم الطائرة وcentroids وضبط يدويا إذا لزم الأمر (باستخدام ثيتا، بيتا و ض) عن طريق تشغيل خلية دفتر الملاحظات بعنوان تصور RFP centroids وتناسب الطائرة.
- بعد تركيب الطائرة بشكل صحيح، حفظ العادي من الطائرة إلى ملف تعقب التجربة . XLSX للاستخدام في المستقبل.
- تحليل السمات الوصفية لفرادى الخلايا السرطانية للواصفات التالية (الجدول 1).
ملاحظة: إذا كان الكمبيوتر الذي يقوم بإجراء التحليل متخلفاً، فإن تحليل الإنتاجية العالية عبر الحوسبة عالية الأداء هو أحد الخيارات. هذه الخوارزمية مفيدة على أجهزة الكمبيوتر المحمولة القياسية لتحليل أعداد صغيرة من الخلايا، ولكن لا يناسب VTK بشكل جيد لعدد كبير من الكائنات الفردية (> 1000). لذلك، من الاختياري استخدام خوارزمية adapted إلى الدالة على كتلة الحوسبة عالية الأداء. وهذا يتيح التحليل السريع للتجارب مع العديد من الخلايا (الشكل 2). يتم إنجاز كل من 7.5 من خلال تشغيل الخلايا الدفترية بعنوان تحليل قنوات المجهر المتبقية للواصفات phenotypic وقراءة في Experiment_tracker المعلومات وتحليل القنوات الموجودة.- قياس البذخ من الخلايا السرطانية: بعد توصيف طبقة البطانية مع الطائرة، وقياس حجم كل خلية السرطان التي هاجرت من خلال الغشاء. مقطع كل خلية (منطقية) بحيث يتم الاحتفاظ شبكة تحت الغشاء والجزء أعلاه الغشاء يتم إزالة33. ثم أغلق الشبكة المفتوحة (vtkFillHoles).
- إعادة حساب العادي وcentroid جديدة من شبكة قص. قياس حجم وموقف كل خلية سرطان قص للتحليل. حجم ما يعادل عدد voxels يملأ شبكة من كل خلية واحدة. حساب المسافة بين الطائرة البطانية وموقف كل خلية سرطانية.
- قياس النمط الظاهري الخلوي: حساب مورفولوجيا كل خلية سرطانية عن طريق احتساب شكلها وحجمها وموقعها.
- قياس البذخ من الخلايا السرطانية: بعد توصيف طبقة البطانية مع الطائرة، وقياس حجم كل خلية السرطان التي هاجرت من خلال الغشاء. مقطع كل خلية (منطقية) بحيث يتم الاحتفاظ شبكة تحت الغشاء والجزء أعلاه الغشاء يتم إزالة33. ثم أغلق الشبكة المفتوحة (vtkFillHoles).
- التحقق من صحة القياسات وحفظها في جدول البيانات أو مؤامرة. تشغيل خلية دفتر الملاحظات بعنوان التحقق من أن تم قياس المركزية بدقة وستعرض عرض منبثقة تظهر المركزيةات التي تم تحديدها أعلى حجم الصورة حسب نوع الخلية. بعد الانتهاء من جميع التجارب تصدير مجموعة البيانات كاملة كملف جدول بيانات واحد عن طريق كتابة التجارب التي سيتم تضمينها من قبل معرف في خلية دفتر الملاحظات بعنوان تصدير البيانات كبيانات واحدة.XLSX ملف للتجارب المتغيرات استبدال معرفات التجارب المعطاة. إذا تحقق من مجموعة البيانات المكتملة، قم برسمها باستخدام خلية دفتر الملاحظات بعنوان مسافة الرسم الشريطي البذخ. سوف تظهر المؤامرة في بيئة دفتر الملاحظات وحفظها إلى ملف.
8. تحليل الخصائص ذات الصلة باستخدام الذكاء الاصطناعي
ملاحظة: تحديد ميزات الظاهريات النقيلي باستخدام خوارزميات الذكاء الاصطناعي.
- تنفيذ التصنيف الثنائي باستخدام أورانج وفقا للمخطط هو مبين في الشكل 5 والملف التكميلي 3. بدء تشغيل برتقالي من موجه الأوامر الثاني Windows بكتابة "conda تنشيط" متبوعة "بيثون -م Orange.canvas" وانقر فوق جديد من موجه. البرتقالي هو السحب وإسقاط البرمجيات القائمة، لذلك ترتيب وظائف عن طريق سحب كل بند من القائمة اليسرى على قماش لتتناسب مع ملف تكميلية 3. بعد ذلك هو كامل انقر نقرا مزدوجا فوق رمز الملف وحدد البيانات .XLSX الملف.
- تصفية البيانات لإزالة القياسات غير صحيح، معرفة بأنها تلك التي فشلت عملية منطقية أو إعطاء قيم متغير بارامتري خارج حدود معروفة باستخدام رمز "تحديد الصفوف". انقر نقراً مزدوجاً فوق الرمز وتعيين الشروط التي تتوافق مع عامل التصفية مثل "الـ"الـ"0 و 1" إنشاء شروط لـ 8.2.1 و 8.2.2 و 8.2.3.
- تصفية بعد القياسات البذخ تتراوح بين -100-200 μm.
- قياسات الفلتر للصفة من شكل الخلية إلى مدى يتراوح من 0-1.
- قم بفرز قياسات حجم الخلايا السرطانية تتراوح بين 0-2000 voxels.
- استخدام جميع المتغيرات parametric(الجدول 1)لتصنيف الدماغ النقيلي MDA-MB-231-BR-GFP وغير الدماغ النقيلي MDA-MB-231-GFP. انقر نقراً مزدوجاً فوق أيقونة تحديد أعمدة من اللوحة القماشية. استخدام الزر > لنقل المتغيرات المتوفرة إلى إما الميزاتأو متغيرات الهدفأو سمات التعريف. المتغير الوحيد الذي يجب أن يكون متغير الهدف هو تسمية النقيلي الذي يحدد إذا كانت الخلايا في مجموعة البيانات تعتبر النقيلي (1) أو لا (0). يمكن وضع متغيرات التجربة في قسم سمات التعريف.
- عينة البيانات في التدريب (80٪ ) ومجموعة اختبار (20٪). انقر نقراً مزدوجاً فوق رمز Sampler البيانات وحدد نوع أخذ عينات من نسبة ثابتة من البيانات: تعيين إلى 80% وحدد خانات الاختيار القابلة للتكرار والطبقات. تصنيف وعبر التحقق من صحة مجموعة التدريب باستخدام 10 طيات ضد كل نموذج / مصنف. انقر مرتين اختبار & نقاط وحدد التحقق من الصليب مع عدد من طيات: تعيين إلى 10 وطبقية فحص. تعيين الفئة الهدف إلى 1.
- في هذه الطريقة، استخدم الشبكات العصبية وخوارزميات التعلم الغابات العشوائية كما أنها قوية للبيانات. ضمن رمز غابة عشوائية، اختر عدد الأشجار لتكون 50 ولا تقم بتحديد أي خيارات أخرى. ضمن رمز الشبكة العصبية اختيار الخلايا العصبية في laye المخفيةص: 100, التنشيط: ReLu, Solver: آدم, ألفا: 0.0001, و Max Iterations: 200. ومع ذلك، سوف تختلف هذه الإعدادات بشكل كبير حسب الدراسة ويجب أن تكون مفهومة جيدا قبل التطبيق.
- بعد إعداد اللوحة انقر نقرا مزدوجا فوق كل رمز من ملف إلى عينة البيانات وإما ضرب تطبيق أو إرسال البيانات. انقر مرتين فوق اختبار & نقاط وسوف تبدأ بيانات التدريب لاستخدامها في تطوير نموذج باستخدام الخوارزميات. بعد تدريب نموذج التعلم الآلي، وإعادة فتح اختبار & نقاط وحدد اختبار على بيانات الاختبار وإغلاق نافذة منبثقة لتسجيل أداء النموذج عن طريق تصنيف الخلايا في رقاقة وفقا لاحتمال أنها هي النقيلي الدماغ من 0 إلى 1.
- حفظ أداء نموذج التعلم الآلي إلى ملف (الجدول 2). وتشمل المنطقة تحت المنحنى (AUC) من ROC، ودقة ودرجة F1. حفظ ملف ثاني يحتوي على الفهارس النقيلي الفردية واحتمالات التصنيف. انقر نقراً مزدوجاً فوق أيقونة حفظ وانقر فوق حفظ باسم للكتابة إلى ملف احتمالات التصنيف. وبالمثل، يمكن عرض منحنى ROC بالنقر المزدوج فوق رمز تحليل ROC ويمكن حساب أداء النموذج بالنقر المزدوج على رمز مصفوفة الارتباك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام هذه التقنية، قمنا بتحليل أنواع الخلايا التي تحمل اسم بروتينات أو أصباغ فلورية مختلفة. نحن نبرهن على استخدام هذا النهج مع شريحة μmBBN التي وضعت مع hCMEC/D3-DsRed وغير الفلورسنت الخلايا الفلكية. تم زرع الخلايا البطانية الدقيقة في الدماغ على غشاء مسامي (5 ميكرومتر مسار المسام المحفورة) ووضعها في حاضنة34 في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2. بعد ثلاثة أيام تم تأكيد التقاء الطبقة البطانية عن طريق المجهر ثم تم وضع الخلايا السرطانية على قمة طبقة البطانية. اثنين من خطوط خلايا سرطان الثدي، واستنساخ يبحث عن الدماغ يسمى MDA-MB-231-BR-GFP، والوالدين MDA-MB-231-GFP كانت تدخل في رقاقة μmBBN التي تحتوي على مكانة الدماغ الفلكية35،36،37،38،,4040،41. تم تصوير رقائق μmBBN في 1 و 2 و 9 أيام باستخدام مجهر confocal مع 3 قنوات (dsRed وGFP و Brightfield) باستخدام هدف 10x ، مع شرائح Z كل 9 ميكرومتر و 1x9 XY خياطة لتغطية منطقة الغشاء بأكملها. حافظ هذا المجهر على درجة حرارة 37 درجة مئوية أثناء عملية التصوير لتقليل الضغط على الخلايا.
تظهر صورة تمثيلية لرقاقة μmBBN كاملة(الشكل 3A)والتغطية البطانية(الشكل 3B-D). يتم تحديد العوائق البطانية ذات التغطية العالية والمنخفضة كمياً للتأكد من أن رقائق μmBBN مناسبة لإضافة الخلايا السرطانية (الشكل 3B). يتم توفير صور تمثيلية لرقاقة μmBBN مع حاجز بطانةي التقاء مقبول للتجريب(الشكل 3C)ورقاقة μmBBN مع تغطية البطانية الفقيرة بشكل خاص غير مناسبة لإضافة الخلايا السرطانية (الشكل 3D). يمكن أن يؤدي الاستزراع طويل الأجل للخلايا البطانية إلى تغطية تمتد إلى ما وراء الغشاء الذي يفصل بين غرف شرائح μmBBN العلوية والسفلية. الخلايا البطانية غالبا ما تنمو على حد سواء على رأس وتحت الغشاء مباشرة، والتي لا تؤثر على حركة الخلايا السرطانية في الفضاء المتخصصة الدماغ ولكن يمكن أن تجعل الطائرة تناسب صعبة. نظرا لتقلبات تصنيع رقاقة μmBBN وتغطية البطانية للغشاء، والطائرات التمثيلية تناسب حاجز بطانة مسطحة عادية(الشكل 3E)،ويتم عرض غشاء منحني غير نمطي للرجوع إليها (الشكل 3F). قد يؤدي تجفيف الجهاز في فرن في درجة حرارة أعلى من 40 درجة مئوية إلى غشاء منحني كما هو مبين.
لاحظنا الاختلافات الظاهرية من MDA-MB-231-BR-GFP والوالدية MDA-MB-231-GFP خط الخلية عند مواجهة μmBBN الفلكية التي تم قياسها كميا باستخدام تحليل التموجرافيك الخلطي المتقدمة. يتم عرض واصفات 4 فينونتيبيك المستخدمة لإدخالها في خوارزمية التعلم الآلي(الجدول 1)في الشكل 4.
المسافة البذخ تمثل المسافة في μm بين الحاجز البطانية ووضع كل خلية سرطانية في رقاقة μmBBN (الشكل 4A). ويقع الحاجز البطانية عند 0 ميكرومتر. تمثل المسافات <0 ميكرومتر الخلايا السرطانية التي بقيت في غرفة التدفق. المسافات > 0 μm تشير إلى الخلايا السرطانية التي افسحت من خلال حاجز البطانية ودخلت الفضاء المتخصصة في الدماغ. بعد يوم واحد من التعرض للميك أم بي إن تم وضع كل من MDA-MB-231-BR-GFP وMDA-MB-231-GFP داخل الحاجز البطانية. ومع ذلك، بعد 2 و 9-أيام من التفاعل مجموعة فرعية من MDA-MB-231-BR-GFP هاجرت > 100 ميكرومتر في مكانة الدماغ الفلكية، في حين أن MDA-MB-231-GFP- الخلايا الأبوية ظلت على مقربة من الحاجز البطانية. قمنا بحل أوضاع الخلايا السرطانية في الحاجز البطانية / واجهة المتخصصة في الدماغ عن طريق حساب حجم كل خلية سرطانية مرت عبر الحاجز البطانية. وتمثل النسبة المئوية الناتجة خلية سرطانية بذخ بحجم(الشكل 4B). 0٪ إسراف حجم الخلية يشير إلى الخلايا السرطانية التي لا تزال على رأس الحاجز البطانية, تتراوح إلى 100% عندما خلية سرطانية قد اخر تماما من خلال حاجز البطانية ويقيم في الفضاء المتخصصة الدماغ. تتفاعل خلايا MDA-MB-231-GFP الأبوية في البداية مع الحاجز البطانية بعد يوم واحد من التعرض لرقاقة μmBBN التي كانت < 50٪ من حجم البذخ. في 2، و 9 أيام، تحتفظ خلايا MDA-MB-231-GFP بنسبة كبيرة من الخلايا التي ظلت على قمة الحاجز بعيدًا عن مساحة الدماغ المتخصصة. حافظت خلايا MDA-MB-231-BR-GFP على نسبة من الخلايا التي كانت بذخًا بنسبة 100٪، خاصةً في نقطة الوقت 2-Day.
تغير شكل الخلايا السرطانية بشكل كبير خلال مدة التعرض للميك إم بي إن. صور تمثيلية للخلايا السرطانية في كل نقطة زمنية هي مبينة في الشكل 4C. تم حساب القياس الكمي المورفولوجي لشكل الخلايا السرطانية باستخدام الفرجة ، التي تمثل حجم الخلية ومساحة السطح (الشكل 4D). يتراوح مقياس التنافر من 0-1، مع 1 يمثل كرة مثالية. وكانت كل من MDA-MB-231-BR-GFP وMDA-MB-231-GFP خلايا كروية للغاية 1-day post البذر في رقاقة μmBBN. بعد 2- و 9 أيام من التفاعل في رقاقة μmBBN، اتجهت كل من خطوط الخلايا السرطانية إلى تقليل شكلها الكروي، وإن كان ذلك بمعدلات مختلفة. بالإضافة إلى شكل الخلايا السرطانية، يتم أيضًا تحديد حجم كل خلية سرطانية باستخدام تحليل الmomographic confocal. تم وضع كل خط الخلايا السرطانية في فئتين في الشكل 4E-F:"خارج"، تمثل الخلايا السرطانية التي تعبر من خلال حاجز البطانية (>90٪ إسرافت من خلال الحاجز) و "في"، سكان الخلايا التي تتفاعل مع حاجز البطانية ولكن لا البذخ من خلال (<90% إسراف). كانت التخصصات الفرعية للخلايا السرطانية التي اُصبحت في المتخصصة الفلكية أصغر حجمًا مقارنة بالخلايا السرطانية التي ظلت في تفاعل مع الحاجز البطاخلي ولكنها لم تُخرَج تمامًا حتى الدماغ.
وكشفت MDA-MB-231-BR-GFP الباحثة عن نمط فيينوبي في رقائق μmBBN متميزة عن MDA-MB-231-GFP الأبوية التي يمكن استغلالها للتمييز بين خلايا سرطان الدماغ النقيلي وغير الدماغ النقيلي باستخدام التعلم الآلي. وتم فصل البيانات عشوائياً إلى مجموعات بيانات للتدريب والتحقق من الصحة لتدريب النموذج وإجراء اختبارات التحقق من الصحة. وتدرب على هذا النموذج، تم استخدام ما مجموعه 859 38 خلية بعد تصفية البيانات، وتم اختبار النموذج مقابل 714 9 خلية فردية. تم تطبيق النموذج المدرب على خطوط الخلايا السرطانية والخلايا السرطانية التي تم إنشاؤها بواسطة PDX التي تم تحليلها في رقائق μmBBN الفلكية (4 معزولة عن الانبثاث الدماغي للمريض من مجموعة متنوعة من أنواع الأورام الأولية، و 1 ورم سرطان الثدي الأولية) لتوليد مؤشر لاحتمال النقيلي الدماغ(الشكل 5). تم اختبار ثماني طرق مختلفة لتصنيف التعلم الآلي: البايات السذاجة، والغابات العشوائية، وشجرة القرار، وk-أقربالجار(kNN)، هبوط الانحدار العشوائي، والشبكة العصبية، وAdaboost. تظهر نتيجة كل أسلوب في الجدول 2. وكانت الشبكة العصبية وAdaboost أفضل 2 طرق التصنيف التي أوصى لاستخدامها مع البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام منصة μmBBN مع AUC من 0.920 و 0.928، على التوالي. وعلاوة على ذلك، أظهرت دقة 0.833 و 0.853. وكان متوسط الدقة والتذكر (F1) للشبكة العصبية وطرق Adaboost 0.847 و 0.860. من العمل السابق حيث طبقنا هذا النهج على عينات PDX من ورم الثدي غير النقيلي وعينات النقيلي المعروفة (الثدي والرئة والمبيض واللسان) وجدنا أن نفس النهج المطبق على عينات PDX مكنت التحديد الدقيق للخلايا النقيلي من تلك غير النقيلي. ويبين الجدول 2 نتائج كل خوارزمية للتعلم الآلي تطبق على بيانات PDX حيث أثبتت نفس الطرق أنها الأقوى (الشبكة العصبية و Adaboost (الغابات العشوائية). ومن بين 143 خلية استخدمت في مجموعة الاختبارات لعينات PDX، كانت 71 خلية غير النقيلي، و46 من الثدي النقيلي، و11 لساناً النقيلي، و13 رئة النقيلي، و2 مبيضة. أنتجت كل نوع من أنواع الخلايا دقة إجمالية قدرها 0.88 ولكن كان للفرد الدقة التقريبية التالية: الثدي غير النقيلي: 0.96، الثدي النقيلي: 0.80، اللسان النقيلي: 0.80، الرئة النقيلي: 0.92، المبيض النقيلي: 1.0
الشكل 1: سير العمل التجريبي. (أ) التمثيل التخطيطي لعملية تجميع الجهاز microfluidic. ويستخدم الدوار لإيداع طبقة رقيقة من PDMS: الغراء toluene على شريحة الزجاج 50 مم × 75 ملم. كل نصف جهاز μmBBN هو جانب قناة مختومة تواجه الغراء ومن ثم تجميعها مع غشاء البولي (5 ميكرومتر المسام) بين أجزاء الجهاز μmBBN. يتم وضع أجهزة μmBBN في فرن 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة لعلاج الغراء. ثم يتم تجفيف الأجهزة في جهاز تجفيف فراغي لمدة 48 ساعة على الأقل قبل الاستخدام التجريبي. يتم تنشيط جهاز μmBBN وشريحة زجاجية 50 مم × 75 مم مع معالجة البلازما ومستعبدين معا. يتم إدراج ماصات P200 القياسية قطع في النصائح في جميع مداخل الجهاز μmBBN ومنافذ. ثم يتم تعقيم جهاز μmBBN المكتمل بواسطة معالجة بلازما 8 دقائق (200 واط) ثم يتم نقلها إلى حاوية ثانوية معقمة. (ب) نظرة عامة تخطيطية من الاستفادة من microfluidic جهاز السقالات لخلق حاجز الدم الخلوية في الدماغ ومحالطة الدماغ البيئة الصغيرة. داخل مجلس الوزراء السلامة الحيوية، يتم بذر خليط من الخلايا الفلكية في الكولاجين في غرفة الجهاز μmBBN السفلي ويسمح لتوطد لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية. يستخدم Matrigel لمعطف الغشاء من خلال غرفة تدفق أعلى ل 1 ساعة في 37 درجة مئوية. ثم يتم البذور الخلايا البطانية في طرف واحد من الغرفة العليا ويسمح للتدفق وتسوية لمدة 15 دقيقة. هذا البذر هو x4 المتكررة، بالتناوب الجانبين من غرفة تدفق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نظرة عامة على التحليل الوموغرافي Confocal. يبدأ البرنامج بتحويل صورة مكدس Z مجهرية إلى نموذج ثلاثي الأبعاد للخلايا باستخدام الشبكات 3D وتجزئة. ثم يقوم البرنامج بحساب موضع مركز كل خلية (تمركزية) ويناسب مستوى إلى الحاجز البطاني. ثم يتم جدولة قياسات فينبتيبيك لكل خلية مفردة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تغطية الحاجز الـ Endothelial وتركيب الطائرة. (أ) تخطيطي تمثيلي وصورة لجهاز μmBBN. يشير الخط الأبيض المتقطع داخل المخطط العرض العلوي إلى مساحة الجهاز الممثلة في طريقة العرض المقطعية. (B) مقارنة التغطية الواهية العالية والمنخفضة للأجهزة μmBBN قبل تطبيق الخلايا السرطانية. ويلش اثنين من عينة t-test، *** ف < 0.1*10-4. (C) صورة تمثيلية من تغطية عالية endothelial. يشير المربع الأبيض المتقطع داخل المخطط الداخلي لجهاز μmBBN إلى موقع الخلايا البطانية داخل الجهاز. أشرطة مقياس من نظرة عامة والصور inset = 200 μm.(D) صورة تمثيلية من تغطية بطانة منخفضة. أشرطة مقياس من نظرة عامة والصور inset = 200 μm. (E) نموذج الطائرة تناسب حاجز بطانةي مسطح. المستطيل الأخضر يمثل موضع الطائرة البطانية. وتمثل النقاط خلايا واحدة من الخلايا البطانية التي تشكل الحاجز. النقاط الصفراء هي الخلايا البطانية فوق الطائرة، والنقاط الأرجوانية هي الخلايا التي تقع تحت الطائرة. تظهر الخلايا البطانية فوق الطائرة (النقاط الصفراء) ميلًا إلى النمو في الجدران الجانبية وأعلى الجهاز لتشكيل أنبوب. (F) مثال على مستوى مناسب لجهاز μmBBN مع مستوى منحني. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: القياس الكمي للنمط الظاهري الخلوي للنوعات الظاهرية للخلايا المصدرية للدماغ والوالدية في رقائق ميكروفلورويديك في الدماغ بالدم الفلكي. (أ) قطعة من مسافة في μm من الخلايا السرطانية من حاجز البطانية في 1, 2, و 9-أيام. الخط الأسود المتقطع عند 0 ميكرومتر يمثل حاجز البطانية. تشير المربعات الحمراء إلى مجموعة فرعية من خلايا MDA-MB-231-BR-GFP التي هاجرت إلى مكان الدماغ. (ب) مؤامرة الكمان من حجم في المئة من الخلايا السرطانية اخلى من خلال حاجز البطاني في 1, 2, و 9-أيام. تمثل الخطوط المتقطعة القصيرة الربعية، ويمثل الخط الأطول متقطعاً الوسط. (C) صور تمثيلية لمورفولوجيا الخلايا السرطانية في جهاز μmBBN. شريط مقياس = 25 ميكرومتر (D) كمان مؤامرة من كروية الخلايا السرطانية في الجهاز μmBBN في 1, 2, و 9-أيام. تتراوح الـ "كروية" من 1: كروية إلى 0: لا كروية. (E) مربع مؤامرة من MDA-MB-231-GFP حجم الخلية في الجهاز μmBBN في voxels للخلايا يستريح خارج الحاجز البطانية (خارج) والخلايا التي بذخ من خلال الحاجز (في). (F) مربع مؤامرة من MDA- MB-231-BR-GFP حجم الخلية في الجهاز μmBBN في voxels للخلايا يستريح خارج الحاجز البطانية (خارج) والخلايا التي بذخ من خلال الحاجز (في). يعرض المربع الربعين وتمتد شعيرات لإظهار نسبة النطاق بين الربعين بعد الربعين المنخفض والعالي. Pairwise ويلكوكسيون رتبة سوم وكروسكال واليس مع مقارنات متعددة دن، *** ف < 0.1 *10-4. مستنسخة من المرجع24 بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: النتائج التمثيلية لتصنيف التعلم الآلي للخلايا السرطانية. (A)نظرة عامة على التعلم الآلي. يوضح عملية تقسيم البيانات التي تم جمعها من التصوير المقطعي confocal ، وتصفية البيانات ، وتدريب خوارزمية التعلم الآلي باستخدام التحقق من صحة 10 أضعاف ومن ثم اختبار النموذج مقابل عينة عشوائية من 20 ٪ من البيانات التي تم حجزها. ويمكن بعد ذلك تطبيق النموذج المحدد على بيانات جديدة لجمع الفهرس النقيلي للخلايا الفردية. (B) منحنيات ROC تظهر أداء 8 خوارزميات مختلفة للتعلم الآلي لMDA-231-BR-GFP وMDA-231-GFP ثقافة الخلايا لمدة 1 و 2 و 9 أيام قبل التصوير. هذا هو ممثل لنوع المنحنى الذي سيتم تحليله لفهم أداء النموذج المدرب. (C) منحنيات ROC ل 8 خوارزميات التعلم الآلي المختلفة المطبقة على xenograft مشتقة من المريض (PDX) الخلايا المنفصلة المستزرعة لمدة 2-أيام. هذا هو ممثل لنوع المنحنى الذي سيتم تحليله لفهم أداء النموذج المدرب. مستنسخة من المرجع24 بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| ميزه | واصف |
| الخلايا السرطانية | % إسراف في مكانة |
| الخلايا السرطانية | حجم |
| الخلايا السرطانية | التجمّد |
| الخلايا السرطانية | المسافة الإسراف |
| الخلايا السرطانية | ترحيل الخلية 2D المباشر |
| الانبثاث الجزئي | المساميه |
| الانبثاث الجزئي | التفاعل السترومال |
| الانبثاث الجزئي | العمر |
| الانبثاث الجزئي | معدل النمو |
| خلية سترومال | حجم |
| خلية سترومال | المسافة من الخلايا السرطانية القريبة |
| خلية سترومال | المسافة من الحاجز البطيني |
| خلية سترومال | الشكل |
الجدول 1: قائمة واصفات حسب نوع الميزة. يتم تمثيل توصيف فينوتيبيك للخلايا السرطانية باستخدام لوحة من واصفات. يشير المربع الأحمر إلى الواصفات التي تم استخدامها للتنبؤ باحتمالات النقيلي للدماغ عن طريق التعلم الآلي.
| الخلايا السرطانية | |||
| الاسلوب | AUC | دقه | F1 |
| الشبكة العصبية | 0.925 | 0.84 | 0.847 |
| أدابوست | 0.928 | 0.853 | 0.86 |
| غابة عشوائية | 0.925 | 0.849 | 0.855 |
| شجرة القرار | 0.898 | 0.817 | 0.827 |
| kNN | 0.775 | 0.702 | 0.718 |
| الانحدار اللوجستي | 0.769 | 0.735 | 0.751 |
| بايز الساذجة | 0.745 | 0.715 | 0.73 |
| Sgd | 0.73 | 0.73 | 0.737 |
| خلايا سرطان PDX | |||
| الاسلوب | AUC | كاليفورنيا | F1 |
| الشبكة العصبية | 0.972 | 0.881 | 0.878 |
| غابة عشوائية | 0.964 | 0.888 | 0.887 |
| أدابوست | 0.957 | 0.881 | 0.879 |
| شجره | 0.954 | 0.867 | 0.865 |
| الانحدار اللوجستي | 0.897 | 0.832 | 0.831 |
| بايز الساذجة | 0.896 | 0.846 | 0.849 |
| kNN | 0.882 | 0.818 | 0.814 |
| Sgd | 0.861 | 0.86 | 0.853 |
الجدول 2: مقارنة طرق التعلم الآلي لتصنيف الخلايا السرطانية والخلايا السرطانية PDX حسب إمكانات النقيلي الدماغ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد طورنا وقدمنا طريقة جديدة تكيّف الأدوات التي تستخدم في كثير من الأحيان في تحليلات التصوير السريري لقياس البذخ وهجرة الخلايا السرطانية من خلال حاجز البطانية في أنسجة الدماغ. ونحن نثير هذا النهج يمكن أن تكون مفيدة لكل من قياسات في المختبرات والمحنتين. لقد أظهرنا استخدامه على نظام microfluidic 3D خلاصة الأوعية الدموية في الدماغ. قياسات الخلايا السرطانية بما في ذلك المسافة البذخ، في المئة البذخ من حيث الحجم، والزخرف، وحجم الكمي باستخدام هذه التقنية. المسافة البذخ و البذخ في المئة من حجم تسمح للمستخدم لإعادة بناء موقف الخلايا السرطانية داخل رقاقة لتقييم البذخ عبر الحاجز والهجرة داخل الأنسجة. ترتبط قياسات شكل الخلية مثل الزخريفة والحجم بالحركات الديناميكية أو الدالة الخاصة بالخلية في كل نقطة زمنية. 11- تظهر خلايا MDA-MB-231-BR-GFP المهاجرة مستوى عالياً من المرونة عند إدخالها في البداية إلى جهاز μmBBN وتصبح أقل كروية في الشكل لأنها تقلل من حركتها وتبدأ في استعمار المكانة. اختلف إجمالي حجم الخلية MDA-MB-231-GFP و MDA-MB-231-BR-GFP بسبب الاختلاف في شكل خطوط الخلية. الخلايا السرطانية التي تعبر الحاجز البطانية هي أكثر تقريبًا من الخلايا التي لا تجتاز الحاجز ، وبالتالي قد تكون الخلايا المستديرة الأصغر قادرة على البذخ عبر الطبقة البطانية بشكل أكثر كفاءة.
توجد خطوتان حاسمتان ضمن البروتوكول تسهلان النجاح. يحدث الأول أثناء تجميع الجهاز μmBBN الأجزاء العلوية والسفلى التي يتم فصلها بواسطة الغشاء المسامي. يجب أن تكون الأجزاء العلوية والسفلى الجهاز تزاوج بحيث تتداخل مداخل ومنافذ ولكن لا يتم انسدادها من قبل الغشاء في ما بين لتعزيز تدفق السليم. يتم تجاهل جميع أجهزة μmBBN مع التزاوج الضعيف للأجزاء العلوية والسفلى أو محاذاة الغشاء لتقليل التقلبات في الجودة. الخبز اللاحقة لعلاج PDMS:toluene الغراء لتجميع الجهاز أمر بالغ الأهمية لأداء في 37 درجة مئوية لإنتاج أجهزة μmBBN مع الأغشية التي هي مسطحة. تميل درجات حرارة الخبز التي تتجاوز 37 درجة مئوية إلى إنتاج أجهزة ذات غشاء منحني يجعل تحليل الصور صعبًا ، خاصة عند تركيب الطائرة إلى الحاجز البطانية. الخطوة الحاسمة الثانية تحدث أثناء البذر من الحاجز البطانية. يجب أن تحدث البذرات على فترات زمنية على الأقل من خمسة عشر دقيقة بين مدخلين تغذية الجزء العلوي من الجهاز لضمان التوزيع العشوائي للخلايا البطانية على غشاء الجهاز. قد يتطلب بذر خليط الكولاجين الذي يحتوي على الخلايا الفلكية في الشريحة استكشاف الأخطاء وإصلاحها وتعديلها على البروتوكول الخاص بالمختبر. إذا كان سطح الغشاء من الجهاز ليس مُزهِم، فإن الكولاجين سيملأ الجزءين السفلي والعلوي من الجهاز، ويُضبط بحيث يُسدّس كلّه من خلال الجزء العلوي من الجهاز. الغرض من معالجة الغاز البلازما النهائي هو جعل الجهاز سطح الماء. في هذه الحالة ، نوصي بتعديل معالجة غاز البلازما للجهاز لزيادة استهلاك الماء.
وقد لاحظنا بعض القيود على هذا النهج. على سبيل المثال، يمكن أن يؤثر النهج المستخدم في تحفيز الفلورس الخلوي على جودة التصوير. عند استخدام الخلايا الحية تتبع الأصباغ، يتم إجراء نمط الفلورسنت من بقع صغيرة، في حين أن التعبير عن العدوى أو المنقولة من الفلوروفوريس تنتج نمطا موحدا. نمط متقطع يتطلب إضافية وأحيانا خطأ عرضة المجموعات من بكسل. بالإضافة إلى ذلك، تعتمد حساسية القياس على العناية التي يتم اتخاذها أثناء التصوير. صور ذات دقة أعلى والمزيد من شرائح z يحسن القرار، ولكن أيضا يأخذ المزيد من الوقت لصورة وتحليل. يمكن أيضاً تحليل الخلايا التي يتم لمسها بشكل غير صحيح كخلية مفردة كبيرة. هذه مشكلة للعديد من أنظمة التصوير الآلي ولكن يمكن معالجتها بطريقتين. الأول هو أن طبقة البطانية لديها العديد من الخلايا لمس، ولكن مزيج لها تأثير لا يذكر على الموقع النهائي للطائرة القطع. والثاني هو عدد الخلايا السرطانية منخفضة بما فيه الكفاية أنه من النادر أنها لمس. يمكن أن تحدث الأخطاء التي يتم إدخالها عند تركيب الطائرة لعدة أسباب. الأول هو أن بعض الخلايا البطانية قد هاجرت بعيدا عن الغشاء المركزي أثناء زراعة الخلية. وهذا يمكن أن يؤدي إلى الخلايا البطانية طلاء القناة بأكملها أو غزو مساحة الكولاجين شغلها، وبالتالي انحراف القياس. ومن المفارقات أن هناك مصدرا آخر للخطأ هو ضبط الطائرة يدويا لإصلاح الخطأ السابق. ومع ذلك، وجدت دراسات قابلية التكرار وقابلية التكاثر أن هذا له تأثير ضئيل. وأخيراً، لاحظنا أنه في ظل ظروف معينة قد يفشل القطع المنطقي لشبكة الخلايا أو قد تفشل الخوارزمية لإغلاق شبكة القطع أيضًا. التقنيات المستخدمة هنا هي "حالة الفن" الحالية ، وهذه المشاكل يتم معالجتها حاليا من قبل العلماء الخوارزميين.
نتائج تدريب خوارزميات التعلم الآلي (الذكاء الاصطناعي) ضد البيانات التي تم جمعها بواسطة التصوير المقطعي confocal من μmBBN تثبت أن العدد الكبير من الخلايا الفردية التي حللتها هذه الطريقة قد تساعد في معالجة قضايا التقاط التغايرية الموجودة في الخلايا السرطانية. AUC أكبر من 0.9 يعتبر مصنف عالية الأداء. هنا أظهرنا AUC من 0.928. ونحن نتوقع أن كما يتم تحسين الأسلوب على الأداء سوف تستمر في الزيادة. وكما هو الحال في جميع الأساليب الذكاء الاصطناعي، يجب الحرص على اختيار مجموعة بيانات التدريب بعناية بحيث تمثل على نطاق واسع نوع البيانات المتوقع اختبارها على نحو محدد. لهذا السبب، قد نتوقع أن الأداء سوف تتدهور، إذا تم تطبيق النموذج مباشرة على عينات المريض على سبيل المثال دون تعريض النموذج أولا إلى مجموعة قوية من عينات المرضى. نبرهن على ذلك هنا إلى حد ما من خلال تضمين قياسات يوم واحد و2-Day و 9-Day للخلايا السرطانية في النموذج مقارنة باليوم 2-اليوم المستخدم في العمل السابق. ونشير إلى أن أخذ العينات الواسعة يقلص أداء النموذج قليلاً ويبين مدى حساسية بعض أساليب الأداء الأفقر، مما يشير إلى أن المستخدمين قد يرغبون في اختبار عدة نماذج على بياناتهم. ويبين الجدول 2 الذي يصف نتائج PDX أداء جيداً بشكل عام. ومع ذلك، فإن أنواع PDX الفردية توضح أن نسبة الخلايا التي تقاس من كل عينة تختلف وقد تؤثر على الأداء لكل موقع من مواقع المنشأ. على سبيل المثال، أنتجت عينة المبيض خليتين فقط لمجموعة الاختبار. في المقابل، سرطان الثدي النقيلي الذي كان أكبر عدد السكان. وكان الغرض من مجموعة البيانات هذه هو إثبات أن الخلايا تبقى في مكانة ويمكن تحليلها، ولكنها تسلط الضوء أيضا على الحاجة إلى الرعاية التفسيرية. قد تؤدي التعديلات في المتغير المستهدف أيضًا إلى توجيه الباحثين في تحديد المستنسخات الفرعية ذات السمات الأخرى مثل التفاعلات مع الخلايا القوية أو السلوك غير المُتزح.
هذا النهج مهم كما أكثر المختبرات اعتماد غشاء على رقاقة أنظمة مثل حاجز الدم في الدماغ على رقاقة، الرئة على رقاقة والأمعاء على رقاقة11،42. يتم تجميع غالبية هذه الرقائق بحيث يكون الغشاء موازياً مع نظام التصوير، والذي يعني حتى الآن أنه سيكون من الصعب قياس متى وكم عدد الخلايا التي انتقلت من جانب واحد من الغشاء إلى15،28الأخرى . وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع رقائق موجهة أفقيا، ورقائق موجهة عموديا توفير مساحة غشاء أكبر بكثير زيادة النطاق الديناميكي للتجربة. بالإضافة إلى ذلك، لأن اتجاه الغشاء ليس أمرًا حاسمًا بالنسبة لتقنية التحليل هذه، فإن التصوير المقطعي confocal يمكن أن يمكّن من إجراء تجارب جديدة في المختبر. على سبيل المثال، فإن تصوير البذخ من خلايا سرطان الثدي من لوحة الدهون مورين في مجرى الدم تكون من الممكن الاقتراب من هذه الطرق. وهذا يمكن أن يساعد الباحثين على تحديد كيفية الخلايا السرطانية التحقيق في التفاعل بين ECM الثدي والأوعية.
في الختام، عرضنا منهجية لبناء جهاز microfluidic 3D أن يلخص مكانة الدماغ الدم وتبين كيفية استخدام التصوير المقطعي confocal والتعلم الآلي للتحليل. باستخدام هذه المنصة، حددنا خصائص خلايا السرطان النقيلي الدماغ التي تفرق بين خلايا سرطانية في الدماغ وغير النقيلي PDX استناداً إلى سلوكهم داخل جهاز μmBBN. العمل المستقبلي سوف يحسن التطبيق السريري لهذه المنصة كتشخيص نحو التنبؤ بأنبثاث الدماغ. ونحن نعتقد أن بعد أن قدم هذه المنصة ستكون مفيدة ومثيرة للاهتمام للمختبرات التي تحتاج إلى قياس الخلايا من أي نوع المهاجرة أو البذخ عبر غشاء. هذا هو من أهمية ونماذج ما قبل السريرية من الورم الصغرى البيئة تصبح متطورة على نحو متزايد حتى لا بد من هندسة النماذج ودعم البرمجيات. للمساعدة في تحليل قوي للبيانات قمنا حزم هذه الأداة باعتبارها بسيطة للاستخدام، شارك بيثون الكمبيوتر المحمول مع تعليمات التثبيت30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا توجد إفصاحات للإعلان عنها.
Acknowledgments
نشكر مختبر شتيغ، في المعهد الوطني للسرطان على التبرع السخي من خلايا MDA-MB-231-BR-GFP. تم إجراء المجهر Confocal في جامعة ميشيغان معهد Biointerfaces (BI). تم إجراء عملية استئصال cytometry التدفق في جامعة ميشيغان تدفق Cytometry الأساسية. تم إنشاء ناقلات الفيروسية من قبل جامعة ميشيغان النواة الناقلة. كما نشكر كيلي كيدويل على التوجيه في التحليل الإحصائي لهذه البيانات.
التمويل:
تم دعم C.R.O. جزئيًا من قبل زمالة التدريب المعاهد القومية للصحة T-32 (T32CA009676) و 1R21CA245597-01. تم دعم T.M.W. جزئيًا من قبل 1R21CA245597-01 والمركز الوطني للنهوض بالعلوم الانتقالية في المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة UL1TR002240. تم توفير التمويل للمواد وتوصيف من قبل المعهد الوطني للسرطان التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة 1R21CA245597-01، P30CA046592، 5T32CA009676-23، CA196018، AI116482، مؤسسة ميتافيور، ومؤسسة أبحاث سرطان الثدي. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 1.5 mm biopsy punch with plunger | Integra LifeSciences Corporation | 33-31A-P/25 | |
| 10x MEM | Thermo Fisher Scientific | 11430030 | |
| 150 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 1x DPBS, without Ca and Mg | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| 200uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| 4 inch silicon wafer | University Wafer | 452 | |
| 48 mm wide packing tape | Fisher Scientific | 19-072-097 | |
| 50 x 75 mm glass slide | Fisher Scientific | 12-550C | |
| A1 confocal microscope | Nikon | ||
| acetone | Fisher Scientific | A9-20 | |
| antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin) | Gibco | 15240062 | |
| box cutter blade | Fisher Scientific | NC1721575 | |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| DMEM with 4.5 g/L glucose | Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| double sided tape | Fisher Scientific | NC0879005 | |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat inactivated | Corning | MT35011CV | |
| Fiji software | ImageJ | ||
| glass vial | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| hCMEC/D3 | EMD Millipore | SCC066 | |
| Jupyter notebook | Anaconda | ||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Matrigel - growth factor reduced with phenol red | Corning | CB-40230A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MDA-MB-231-BR-GFP | Dr. Patricia Steeg, NIH | ||
| N-2 growth supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| normal human astrocytes (NHA) | Lonza | CC-2565 | |
| Orange software | University of Ljubljana | ||
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Photolithography masks | Photosciences Incorporated | ||
| pLL3.7-dsRed | University of Michigan Vector Core | ||
| pLL-EV-GFP | University of Michigan Vector Core | ||
| pLOX-TERT-iresTK | Addgene | 12245 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polycarbonate membrane, 5um pore size | Millipore | TMTP04700 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| PureCol, 3 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5005 | Type I bovine collagen |
| sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | 25080094 | |
| sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Solo cup | Fisher Scientific | NC1416545 | |
| SU-8 2075 | MicroChem Corporation | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 developer | MicroChem Corporation | Y020100 4000L1PE | |
| Sylgard 184 | Ellsworth Adhesive Company | NC0162601 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 179965-1L | |
| Tricholoro perfluoro octyl silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G |
References
- Rastogi, K., et al. Palliation of Brain Metastases: Analysis of Prognostic Factors Affecting Overall Survival. Indian Journal of Palliative Care. 24 (3), 308-312 (2018).
- Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
- Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
- Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. 294, 15-22 (2005).
- Poissonnier, A., Legembre, P. Boyden Chamber Assay to Study of Cell Migration Induced by Metalloprotease Cleaved-CD95L. Methods in Molecular Biology. 1557, 117-123 (2017).
- Li, X., Yang, H., Huang, H., Zhu, T. CELLCOUNTER: novel open-source software for counting cell migration and invasion in vitro. BioMed Research International. 2014, 863564 (2014).
- Little, A. C., et al. IL-4/IL-13 Stimulated Macrophages Enhance Breast Cancer Invasion Via Rho-GTPase Regulation of Synergistic VEGF/CCL-18 Signaling. Frontiers in Oncology. 9, 456 (2019).
- Allen, S. G., et al. Macrophages Enhance Migration in Inflammatory Breast Cancer Cells via RhoC GTPase Signaling. Scientific Reports. 6, 39190 (2016).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
- Choi, Y. P., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
- Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. Journal of Neuroscience Methods. 232, 165-172 (2014).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
- Schroeder, W., Martin, K., Lorenson, B. The Visualization Toolkit. 4th edn. , Kitware. (2006).
- Wells, W. M., Grimson, W. L., Kikinis, R., Jolesz, F. A. Adaptive segmentation of MRI data. IEEE Transactions on Medical Imaging. 15 (4), 429-442 (1996).
- Agarwal, S. K., Singh, S., Ghuman, S. S., Sharma, S., Lahiri, A. K. Radiological assessment of the Indian children with congenital sensorineural hearing loss. International Journal of Otolaryngology. 2014, 808759 (2014).
- Mansfield, P., Maudsley, A. A. Medical imaging by NMR. The British Journal of Radiology. 50 (591), 188-194 (1977).
- Plewes, D. B., Kucharczyk, W. Physics of MRI: a primer. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 35 (5), 1038-1054 (2012).
- Batteux, C., Haidar, M. A., Bonnet, D. 3D-Printed Models for Surgical Planning in Complex Congenital Heart Diseases: A Systematic Review. Frontiers in Pediatrics. 7, 23 (2019).
- Thibault, F., et al. MRI for surgical planning in patients with breast cancer who undergo preoperative chemotherapy. American Journal of Roentgenology. 183 (4), 1159-1168 (2004).
- Oliver, C. R., et al. A platform for artificial intelligence based identification of the extravasation potential of cancer cells into the brain metastatic niche. Lab on a Chip. 19 (7), 1162-1173 (2019).
- Gril, B., et al. Reactive astrocytic S1P3 signaling modulates the blood-tumor barrier in brain metastases. Nature Communications. 9 (1), 2705 (2018).
- Badilescu, S., Packirisamy, M. BioMEMS: Science And Engineering Perspectives. , Taylor & Francis/CRC Press. (2011).
- Liu, C. Foundations of MEMS. 2nd edn. , Prentice Hall. (2012).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab on a Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
- Lockman, P. R., et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (23), 5664-5678 (2010).
- Ryan Oliver, C., W, T. M. Con-tom: A Jupyter Notebook for Analyzing the tumor micro-environment in confocal images. Zenodo. , Version 0.8, 3825719 (2020).
- Lorensen, W. E., Johnson, C., Kasik, D., Whitton, M. C. History of the Marching Cubes Algorithm. IEEE Computer Graphics and Applications. 40 (2), 8-15 (2020).
- Kleinbaum, D. G., Kupper, L. L. Applied regression analysis and other multivariable methods. , Duxbury Press. (1978).
- Berg, M. d Computational geometry : algorithms and applications, 2nd rev. edn. , Springer. (2000).
- Esch, M. B., Post, D. J., Shuler, M. L., Stokol, T. Characterization of in vitro endothelial linings grown within microfluidic channels. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2965-2971 (2011).
- Brinkley, B. R., et al. Variations in cell form and cytoskeleton in human breast carcinoma cells in vitro. Cancer Research. 40 (9), 3118-3129 (1980).
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 33 (2013).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 16 (2013).
- Dello Russo, C., et al. The human microglial HMC3 cell line: where do we stand? A systematic literature review. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 259 (2018).
- Dun, M. D., et al. Proteotranscriptomic Profiling of 231-BR Breast Cancer Cells: Identification of Potential Biomarkers and Therapeutic Targets for Brain Metastasis. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2316-2330 (2015).
- Xing, F., et al. Reactive astrocytes promote the metastatic growth of breast cancer stem-like cells by activating Notch signalling in brain. EMBO Molecular Medicine. 5 (3), 384-396 (2013).
- Zhang, B., Radisic, M. Organ-on-a-chip devices advance to market. Lab on a Chip. 17 (14), 2395-2420 (2017).
