Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att förbereda och culturing en blod hjärnbarriären ögonbevarande tumör mikro-miljö och sedan kvantifiera sitt tillstånd med hjälp av konfokal avbildning och artificiell intelligens (maskininlärning).
Abstract
Hjärnmetastaser är de mest dödliga cancerlesionerna; 10-30% av alla cancerformer metastasera till hjärnan, med en median överlevnad på endast ~ 5-20 månader, beroende på cancer typ. För att minska hjärnan metastaserande tumör börda, luckor i grundläggande och translationella kunskaper måste åtgärdas. Stora utmaningar är bland annat en brist på reproducerbara prekliniska modeller och tillhörande verktyg. Tredimensionella modeller av hjärnmetastas kan ge de relevanta molekylära och fenotypiska data som används för att hantera dessa behov när de kombineras med dedikerade analysverktyg. Dessutom, jämfört med murine modeller, organ-on-a-chip modeller av patientens tumörceller korsar blod-hjärnbarriären i hjärnan mikromiljö generera resultat snabbt och är mer tolkningsbara med kvantitativa metoder, alltså mottagliga för hög genomströmning testning. Här beskriver vi och demonstrerar användningen av en ny 3D mikrofluidic blod hjärnan nisch (μmBBN) plattform där flera delar av nischen kan odlas under en längre period (flera dagar), fluorescerande avbildas av confocal mikroskopi, och bilderna rekonstrueras med hjälp av en innovativ konfokal tomografi teknik; alla syftar till att förstå utvecklingen av mikro-metastasering och förändringar av tumören mikro-miljö (TME) i en repeterbar och kvantitativt sätt. Vi visar hur man fabricerar, frö, bild, och analysera cancerceller och TME cellulära och humorala komponenter, med hjälp av denna plattform. Dessutom visar vi hur artificiell intelligens (AI) används för att identifiera de inneboende fenotypiska skillnader cancerceller som kan passera genom en modell μmBBN och att tilldela dem ett objektivt index för hjärnans metastaserande potential. De datamängder som genereras av denna metod kan användas för att svara på grundläggande och translationella frågor om metastasering, effekten av terapeutiska strategier, och den roll som TME i båda.
Introduction
Hjärnmetastaser är de mest dödliga cancerlesionerna; 10-30% av alla cancerformer metastasera till hjärnan, med en median överlevnad på endast ~ 5-20 månader, beroende på cancer typ1,2. En huvudfråga som uppstår vid studier av cancermetastas är hur subkloner migrerar från blodomloppets humorala miljö till ett organ som hjärnan3,4. Denna fråga har lett till många varianter av migration, invasion, och extravasation assays. Alla dessa metoder delar det kritiska steget att räkna eller mäta egenskaper hos celler som rör sig från en plats till en annan som svar på en stimulans. De flesta migrationsanalyser lätt tillgängliga används för att studera tvådimensionell (2D) migration av cancerceller. Dessa har klarlagt en rikedom av kunskap; de rekapitulerar dock inte den tredimensionella karaktär av in vivo-systemet som andra metoder kan ge5. Därför är det nödvändigt att studera tumör mikro-miljö (TME) i tredimensionella (3D) system, men analysen metoder som finns för 3D-strukturer är begränsade och ofta inkonsekvent.
En av de mest populära 3D-verktyg är en Boyden kammare som består av ett membran upphängd längst ner i en brunn, som skiljer två olika regioner. Boyden introducerade analysen för att studera leukocyte chemotaxis4. De nedre regionerna kan varieras med hjälp av kemieller andra medel 6,7 för att förmå celler i den övre regionen att migrera till den nedre regionen. Den vanligaste metoden för att kvantifiera antalet celler som har migrerat är att frigöra cellerna från botten av membranet med hjälp av en buffertlösning, lysa dem, och sedan räkna dem baserat på mängden DNA-innehåll i lösningen7. Denna indirekta metod är benägen att operatör fel på grund av tekniken variabilitet och förfarandet förstör information om cancer fenotyp och mikro-miljö. Variationer av Boyden kammaren assay innebära fixering av flyttande celler som finns kvar på membranet, men bara ger en räkning av celler som inte längre är livskraftiga för fortsatt studie6,8,9.
På grund av begränsningar i Boyden kammaren och tillväxten av innovationer i mikrofluidic gemenskapen, migration assay chips har utvecklats som observerar rörelse av celler som svar på en stimulans i en riktning snarare äntre 10,11,12. Dessa migreringsanalyser underlättar kontroll över faktorer som flöde eller encellsseparering13,14 som möjliggör bättre tolkning av resultaten; dock förlorar deras 2D-format oundvikligen en del dynamisk information. Nyligen genomförda studier har fokuserat på extravasation (dvs. förflyttning av celler från cirkulationen till en vävnad, såsom blod-hjärnbarriären) i en 3D-miljö14,15. Den extravasering avstånd till vävnad och sondering beteende som uppstår vid cellulära barriär / membran är mer raffinerad än mätningar som samlats in med antingen Boyden kammaren eller en 2D mikrofluidic migrationenhet 16. Enheter som möjliggör lämplig bildbehandling och analys av 3D-extravasering är således avgörande för att fånga dessa sofistikerade mätningar men saknas i litteraturen.
Oberoende av migreringsanalyser har robusta avbildningstekniker utvecklats för magnetresonanstomografi (MRT) och tomografi som kan identifiera och exakt rekonstruera vävnad i 3D-rymden17,18. Dessa tekniker förvärva bilder i z-stackar och segment delar av bilden baserat på egenskaperna hos vävnaden och sedan omvandla de segmenterade bilderna i tredimensionella maskor19,20,21. Detta gör det möjligt för läkare att visualisera i 3D enskilda organ, ben, och fartyg till stöd i kirurgisk planering eller stöd vid diagnos av cancer eller hjärtsjukdom22,23. Här kommer vi att visa att dessa tillvägagångssätt kan anpassas för användning på mikroskopiska exemplar och 3D extravasering enheter.
För detta ändamål utvecklade vi den innovativa confocal tomografi teknik, som presenteras häri, som ger flexibilitet att studera extravasation av tumörceller över ett membran genom att anpassa befintliga tomografi verktyg. Detta tillvägagångssätt möjliggör studier av hela spektrat av cancercell beteenden som de interagerar med en cellulär barriär, såsom en endotel cellskikt. Cancerceller uppvisar sonderingsbeteenden; vissa kan invadera men förblir nära membranet, medan andra korsar barriären lätt. Denna teknik är kapabel att ge information om fenotyp av cellen i alla dimensioner24. Att använda detta tillvägagångssätt för att studera TME är både relativt billigt, lättolkande och reproducerbart, jämfört med mer komplexa in vivo murine-modeller. Den presenterade metodiken bör ge en stark grund för studier av många typer av tumörer och mikromiljöer genom att anpassa regionen stromal.
Vi beskriver och demonstrerar användningen av en 3D-mikrofluidisk blodhjärnenisch (μmBBN) plattform (Figur 1) där kritiska element i barriären och nischen (hjärnans mikrovaskulära endotelceller och astrocyter) kan odlas under en längre period (ungefär upp till 9 dagar), fluorescerande avbildad av konfokalmikroskopi, och bilderna rekonstruerade med hjälp av vår confo tomografiteknik (Figur 2); alla syftar till att förstå utvecklingen av mikro-metastasering och förändringar i tumören mikro-miljö i en upprepningsbar och kvantitativt sätt. Blod-hjärnbarriären gränssnitt med hjärnan nisch är sammansatt av hjärnans mikrovaskulära endotelceller som stärks av källaren membran, astrocyte fot, och pericyter25. Vi fokuserade selektivt på astrocyten och endotelkomponenterna med tanke på deras betydelse i bildandet och regleringen av blod-hjärnbarriären. Vi visar hur man fabricerar, frö, bild, och analysera cancerceller och tumör mikro-miljö cellulära och humorala komponenter, med hjälp av denna plattform. Slutligen visar vi hur maskininlärning kan användas för att identifiera de inneboende fenotypiska skillnader av cancerceller som är kapabla att transitera genom en modell μmBBN och att tilldela dem ett objektivt index för hjärnans metastaserande potential24. De datamängder som genereras av denna metod kan användas för att svara på grundläggande och translationella frågor om metastasering, terapeutiska strategier och TME:s roll i båda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered blod-hjärnbarriären nisch mögel
OBS: Den odlingsanordning som används i denna plattform är en PDMS baserad byggnadsställning som vi bygger en cellulär blod-hjärnbarriären nisch på. Den är tillverkad av två delar åtskilda av ett poröst membran. För att förbereda blod-hjärnbarriären nisch två SU-8 formar gjorda med hjälp av fotolitografi ärnödvändiga 26,27. Protokollet kommer att beskrivas för den 100 μm tjocka formen först och sedan kommer noter att ges för den 200 μm tjocka formen.
- För att förbereda formen, rengör en 4 "kisel wafer med aceton med en squeeze flaska och sedan torka den med en kvävepistol.
- Grädda kiselrån på en värmeplatta i 10 min vid 200 °C för att avlägsna allt restlösningsmedel.
- I sin tur centrum kisel wafer på chucken av en spin coater och dispensera 1 mL av SU8-2075 för toppen mögel. Snurra för 5 s vid 500 varv/min (acceleration 300 rpm/s) för att skingra fotoresisten och sedan 30 s vid 2200 varv/min (acceleration 300 rpm/s) för att få en 100 μm tjock SU-8 beläggning. Optimering kan vara nödvändigt för att uppnå den angivna tjockleken.
- Mjuka grädda wafer på en kokplatta vid 65 °C i 2 min och sedan omedelbart vid 98 °C i 20 min.
- Placera wafer i en fotolitografi lampa och placera masken centrerad på rån enligt standardförfaranden. Exponera de SU-8 belagda rånarna med en utstrålning på 230 mJ/cm2 av UVB (360 nm ± 10 nm). Ett försök med exponeringsmatris kan utföras för att fastställa den optimala doseringen. Maskutföranden finns i Supplemental File 1.
- Utför en efterexponeringsbaka vid 65 °C i 2 min och sedan omedelbart vid 98 °C i 10 min för att förbättra vidhäftningen. Kyl wafer till 50 °C.
- Ta bort den oexponerade motstå med hjälp av SU-8 foto-utvecklare. Skölj wafer i utvecklare i 5 min i ett bad och sedan använda en sprayflaska fylld med SU-8 utvecklare i en kemisk huva att agitera och ta bort återstående ocured SU-8. Ett 4x mikroskop kan användas för att observera om alla odrade SU-8 har tagits bort. En vit linje på fotoresistfunktionernas kanter indikerar att SU-8 inte har tagits bort helt.
- Utför en sista hård bake i en ugn vid 110 °C i 60 min.
- Följ samma procedur för den 200 μm tjocka formen med hjälp av SU-8 2075 men justera protokollet till följande:
- Spin coater-inställningar: Snurra för 5 s vid 500 rpm (acceleration 300 rpm/s) för att skingra fotoresisten och sedan 30 s vid 1300 RPM (acceleration 300 rpm/s) för att få en 200 μm tjock beläggning.
- Mjuk grädda vid 65 °C i 2 min sedan vid 98 °C i 40 min.
- Exponeringstid på 340 mJ/cm2.
- Post exponering baka: 2 min vid 65 °C , och sedan 98 ° C i 15 min.
- Slutligen silanize varje wafer genom att placera dem i en vakuumkammare inuti en kemisk huva med en plastbehållare där 3 droppar (~150 μL) av silaniserande lösning (Trichloro perfluoro octyl silan) har placerats. Dra ett vakuum och lämna över natten så att ångan att belägga rån. Detta steg minskar vidhäftningen mellan SU-8 och PDMS, vilket ökar livslängden på formen.
FÖRSIKTIGHET: Trikloreperfluoroctyl silan ska alltid hanteras i draghuven och hållas borta från vattenkällor. - Placera enskilda rånformar i 150 mm Petriskålar med hjälp av två remsor av dubbelsidig tejp. Se till att plattorna är platta. Ett alternativ är att fabricera en aluminiumform inom vilken rånen kan placeras. Eftersom aluminium mögel är inneslutna det kommer att producera gjuter med en enhetlig tjocklek, medan Petri skålen metoden är känslig för lutningen av ytan är den placeras på. Den förbättrade planheten i PDMS-rösterna minskar nedströms confocal bildtagningstid.
2. Forma och montera PDMS-enheten för blodhjärnbarriär (BBB)
- Blanda 75 g PDMS vid förhållandet 1:10 (Crosslinker:Base) efter vikt i en plastkopp.
- Häll PDMS över formar (1 mm tjock för 200 μm tjock mögel och 4 mm för 100 μm tjock mögel) och avgaser i en vakuum desiccator i en timme eller tills alla bubblor har tagits bort. Placera i en 65 °C-ugn över natten. Tjockleken på 1 mm får justeras utifrån arbetsavståndet för 10x-målsättningen i konfokalmikroskopet.
- Efter att PDMS har härdat använda ett blad för att försiktigt skära mot wafer genom PDMS runt kanterna. Skala av PDMS:en och använd ett blad för att skära längs de rektangulära gejderna och en biopsistans på 1,5 mm för att öppna inloppen och utloppen på enheten. Täck PDMS-enhetens delar med 48 mm bred förpackningstejp för att hålla den ren från damm och skräp.
- Nästa användning dissekering sax för att skära en 5 mm x 50 mm rektangel av polykarbonat membran med 5 μm porer och lagra den insidan av en Petri skålen för senare användning.
- Samla följande: 200 μL pipettspets, 2 mL 1:10 PDMS blandat med toluen vid ett förhållande av 2:3 viktprocent i en glasflaska, en Pasteurpipett med en squeeze bulb, den förberedda PDMS övre och nedre delen, membranet, tre 50 mm x 75 mm glasglas och transportera allt till en spinnrockare. Följande steg för montering och cellsådd av enheten avbildas i figur 1.
- Använd Pasteur-pipetten för att överföra 1 mL PDMS:toluenlimslösning till en 50 mm x 75 mm glasrutschbana på spinnrockens chuck. Snurra i 5 sekunder vid 100 varv/min (acceleration 300 rpm/s) och 30 sekunder vid 2000 varv/min (acceleration 300 rpm/s).
- Placera bilden på ett bord och täck den med en PDMS övre kammare och en lägre kammare så att PDMS ansikten med funktioner gjutna i den kontakta bilden och limmet överförs till PDMS ansikte, beskriver omkretsen av alla funktioner.
- Vänd PDMS övre kammare på en annan bild med limbeläggningen uppåt och placera försiktigt membranet tvärs över enheten mellan inlopp och utlopp. Placera 200 μL-spetsen i PDMS:toluenlimlösningen tills den har elakt några i spetsen. Rör vid spetsen mellan varje in- och utlopp för att placera en liten droppe nära kanten av membranet där den kontaktar PDMS.
- Ta bort den andra halvan av enheten och placera den på med limbeläggningen nedåt samtidigt som du riktar inlopp och utlopp på de två delarna.
- Placera den monterade enheten i en ugn vid 37 °C över natten för att bota limmet. Överför till en vakuumklocka burk med torkmedel och låt torka i två dagar. Detta är ett avgörande steg för att toluenen ska kunna avdunsta och för att förbättra överensstämmelsen för sådd anordningen genom att reglera den absorberade vattenångan i laboratorieluften.
3. Sådde hjärnan mikro-miljö i enheten
- Cellodling och reagenser: Innan du påbörjar detta protokoll, erhåll följande reagenser och celler. Odla alla cellinjer i en inkubator som är satt till 37 °C i 5 % CO2.
- Upprätthålla mänskliga trippel-negativa bröstcancer cellinje MDA-MB-231 (ATCC HTB-26) och MDA-MB-231-BR-GFP celler (erhålls från Patricia Steeg, PhD) i DMEM med 4,5 g/L glukos, kompletteras med 2 mM L-glutamin, 10% FBS och 1x antibiotika-antimykotiska. Skapa MDA-MB-231-GFP fluorescerande celler genom att omvandla MDA-MB-231 cell med tomma vektor pLL-EV-GFP lentivirus. Sortera den transduced GFP+ befolkningen med hjälp av fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS) före experiment.
- Upprätthålla mänskliga hjärnan mikrovaskulära endotelceller hCMEC/D3 i EGM-2 medium. Skapa hCMEC/D3-DsRed fluorescerande celler genom att omvandla hCMEC/D3 med tom vektor pLL-3,7-dsRed lentivirus. Avlägsna alla icke-transduced, icke-fluorescerande celler från odlingen med FACS före experimentell användning.
- Upprätthålla normala humana astrocyter (NHA) i DMEM kompletteras med 4,5 g/L glukos, 10% FBS, 2 mM Glutamax, 1 mM natriumpynat, 1x N-2 tillväxt tillägg, och 1x antibiotika-antimykotiska. Föreviga astrocyterna genom att omvandla pLOX-TERT-iresTK lentiviral vektor (Addgene 12245). Skapa vektorn med hjälp av plasmid psPAX2 och kuvert plasmid pMD2.G (Addgene 12260 och 12259).
- Ta bort en μmBBN-anordning från vakuumdesiccatorn och placera på en metall- eller pappers-yta (dvs. tejp) med inloppen nedåt och lägg den i en plasmakammare. Placera även en 50 mm x 75 mm glas glida in i plasmakammaren. Dra ett vakuum och behandla sedan med plasma vid 80 W i 30 s.
- Ta snabbt bort glasglaset och enheten från plasmakammaren och placera enheten med inloppen uppåt på glasglaset som riktas med hjälp av en guide (Supplemental File 2). Detta kommer att skapa en permanent bindning mellan PDMS och glas slide och kan inte åter placeras.
- Därefter klippa tipsen av 16, 200 μL pipettspetsar, 2 mm från spetsen. Sätt i pipettspetsarna i alla inlopp och utlopp. Enheten kan placeras tillbaka i vakuum desiccator på denna punkt om inte redo att så cellerna.
- Placera tillbaka enheten i plasmakammaren och behandla med plasma i 8 min vid 200 W. Efter att enheten har svalnat (5 min) från plasmabehandlingen placera den inuti en steril sekundär behållare, som en genomskinlig pipett spets låda. Utför nästa steg inom ~15 min eller effektiviteten av plasmabehandlingen kan minskas vilket leder till igensättning.
- Flera dagar före experimentkulturen Petrisdiskar på 1 x 106 endotelceller (hCMEC/D3-DsRed) och 1 x 106 astrocyter (NHA). Medan enheten genomgår 8 min plasmabehandling, förbereda en kollagenlösning bestående av 0,5 mL av 3 mg/mL PureCol typ I bovint kollagen med 64 μL av 0,8 M NaHCO3 och 20 μL av 10x högglukos (250 mM) MEM. Häng in 5,0 x 105 NHA-celler i kollagenlösningen. Underhåll lösningen på is medan den inte används.
- Överför 120 μL av kollagen/astrocyte/mikroglialösningen till enheten genompipettspetsenför bottenkammaren ( Bild 1 Röda pilar ). Låt lösningen veke över kammaren i motsatt pipett spets. Efter att alla fyra kanalerna i enheten har fyllts placera chipet i CO2 inkubatorn vid 37 °C och 5% CO2 för 1 h eller tills kollagenet har ställt in.
- Efter kollagenuppsättningarna fyller du alla pipettspetsar som matar bottenkammaren med en blandning av kompletta medier. För chips som innehåller endotelceller och astrocyter används en 50:50-blandning av endotel:astrocyte media.
- Coat den övre kammaren med 2% tillväxt-faktor minskat Matrigel i komplett endotel media med hjälp av övre kammarpipett spets (Figur 1 Blå pilar) och placera i inkubatorn för 1 hr.
- Skölj den övre kammaren med den indikerade mediablandningen och alternerande vilken spets som är sådd med endotelceller (Figur 1 Gröna pilar). Häng 1 x 106 endotelceller i 1 mL endotelmedia och frö 30 μL var 15:e minut till växlande övre kammarspetsar för jämn täckning. Frö endothelial celler i varje övre kammare spets två gånger, för totalt 4 gånger per kammare.
- Efter slutsekudde av endotelceller, fyll alla tips med mediablandningen och placera enheten i inkubatorn vid 37 °C och 5% CO2, byta media i båda kamrarna var 12 h.
4. Övervaka progression av endotelskiktsbildningen
- Fullständig täckning av kanalen genom det endotelskikt observeras efter 3 dagar. Använd en av två metoder för att övervaka endotelbarriärens täckning: Fluorescens eller TEER. den hCMEC/D3-DsRed fluorescensen och enligt % täckning över kanalområdet kan kvantifieras med hjälp av ImageJ.
- Öppna TIFF-filen i ImageJ representant för hCMEC/D3-DsRed barriär. I ImageJ-programvaran klickar du på Arkiv > Öppna för att markera filen.
- Sammanfoga alla bildens Z-lager med hjälp av den maximala intensiteten efter dessa tangentkommandon och alternativ: Bild > Stackar > Z-projekt > Alla Z-segment, Maximal intensitet.
- Utför en färgtröskel som är densamma över alla mikrofluidiska chips som bedöms med den här metoden. För den presenterade studien vi anställde en tröskel på 450. Använd tröskelmenyn i ImageJ vid: Bild > Justera > Tröskelvärde.
- Ange att måtten ska registreras med hjälp av följande kommandon och alternativ: Analysera > Ange mått > Gräns till tröskelvärde, Områdesfraktion.
- Välj en representativ region för den mikrofluidiska kanalen som ska mätas genom att rita en ruta. Rutan verktyget finns på huvudmenyn i ImageJ. Mått 3 tekniska replikat placerade i början, mitten och slutet av varje mikrofluidisk kanal med samma ruta storlek.
- Analysera varje kanal och registrera områdesfraktionen, som representerar den % endoteltäckning. Exportera dessa mätningar som kalkylbladsfiler för att plotta och visualisera data med hjälp av följande kommandon: Analysera > Mät.
- Som ett alternativ, använd Impedansspektroskopibaserad TEER för att mäta endotelstäta knutningar per område. Kvantifiering av endoteliala barriären med hjälp av TEER är en proxy för integriteten hos endotelskiktet som en barriär.
- Placera två elektroder i in- och utlopp av de övre och nedre kamrarna.
- Kvantifiera impedansen av endotelmonolager som en kombination av motstånden, induktanserna, och kapacitanserna i chipet enligt en modell som föreslagits av Srinivasan et al.28,29.
5. Utsäde cancerceller i enheten
- Efter det endotelskikt har mognat, frö cancerceller i enheten. Bered en 1 mL-lösning på 1 x 106 cancerceller i kompletta cancercellsmedier.
- Byt media i chipet för att fylla på cellodling näringsämnen.
- Kärna ur varje övre kammarkanal med 30 μL cancerceller i suspension och placera sedan tillbaka anordningen i inkubatorn under en 15 min. Utsäde alltid cancercellerna på samma sida av alla fyra översta kammaren kanaler inom en enda enhet.
- Byt enheten med nya medier och påfyllnadstipsen var 12:e timme tills enheten avbildas för metastaserande beteende.
6. Bild tumören mikro-miljö genom confocal imaging
- Vid önskad experimentell tidspunkt (1, 2 eller 9-dagar) använder du konfokal avbildning för att fånga en 3D-bild av kanalen. Vi utför detta steg på en Nikon A1 med hjälp av de inställningar som beskrivs här. Det här steget är automatiserat, och varje kanal kräver 20-40 min till bild beroende på hur många fluorescerande kanaler som ingår och det Z-djup som behövs för att täcka alla cellernas positioner.
- Sätt på mikroskopet, öppna programvaran och placera inkubatorlocket på mikroskopet.
- Ställ in mikroskopet steg värmaren till 37 °C och CO2 till 5% om det finns.
- När mikroskopinkubatorn har stabiliserats placerar du enheten i mikroskopstadiet med hjälp av 50 mm x 75 mm-fästet.
- Fokusera på ena sidan av enheten (vänster om att användas med den medföljande analysprogramvara) med en 10x mål och ange Z-höjd som noll. Under Z-Stack-inställningar, inkludera ett intervall på 100 μm ovan och 200 μm under fokusplanet. Använd sedan stygninställningen för att ställa in antalet X- och Y-fält till 1 respektive 9 med 15 % överlappning. Ställ in tapphålet till dess rekommenderade minimum och z-skikthöjden till 9 μm. Justera den ljusa fältexponeringen så att det porösa membranet syns. Slå på excitationslasrarna för kanalerna dsRed (561 nm) och GFP (488 nm) och justera de fluorescerande laserkrafterna och cutoffs så att varje kanal syns utan att pixlarna överexponerade.
- Verifiera alla fält är i fokus när de blir överstiga. Om så är så, ange ett utdatafilnamn (001.nd2) för bilden och starta experimentet för att automatiskt fånga 3D-konfokalbilden.
7. Mät tumören mikro-miljö via confocal tomografi
- Använd confocal tomography ett tillvägagångssätt för att uppskatta en uppsättning av mått och mätningar som beskriver de enskilda cellerna och tumören mikro-miljö inom enheten. Konfokal tomografisk analys (Figur 2) omvandlar en konfokal z-stack till en tredimensionell representation av cellerna. Med hjälp av en anpassad python skript inom Jupyter notebook / lab miljö, ett plan matchas sedan till lagret av celler som bildar blod-hjärnbarriären sommembran 30. Slutligen, gör fenotypiska mätningar av cancercellpopulationerna (Tabell 1).
- Utför den här analysen i slutet av ett experiment eller över en tidskurs. Installera python och lämpliga bibliotek enligt den refererade programguiden, öppna sedan programvaran från Windows Command Prompt genom att köra kommandot "conda activate", följt av "jupyter lab". Den Jupyter miljön kommer att ladda inom standardwebbläsare.
- Från Jupyter filutforskaren dubbelklicka på Jupyter anteckningsboken "contom.ipynb" för att öppna den. Kör cellen nedanför rubriken Importera bibliotek, anpassade klasser/funktioner och konfigurera anteckningsboken genom att klicka på anteckningsbokscellen och sedan klicka på uppspelningsknappen. Alla anteckningsboksceller nedan exekveras med samma tillvägagångssätt. Observera att här anteckningsbok "cell" avser ett block av python kod inom Jupyter anteckningsboken.
- Förbered data. Den här algoritmen använder visualiseringsverktygslådan (VTK) för att manipulera och visa z-stacken och tredimensionella data17.
- Placera den medföljande . XLSX-fil ("Experiment Tracker.xlsx") i samma windows-mapp som jupyter-anteckningsboken. Filen spårar experiment och gränssnitt med Jupyter-anteckningsboken. Placera ND2-filen från avsnitt 6 till en undermapp som heter "\Experiment_XXX\Confocal\" under platsen för Jupyter-anteckningsboken. Ytterligare experimentmappar kan läggas till inom genom att justera "XXX" till det numeriska ID som tilldelats nya mappar.
- Märka den första experimentmappen "Experiment_001" och ND2-filen "001.nd2". Först konverterar ND2 bildfilen till en sydd flerbilds-TIFF-fil separerad med färgkanal. Gör detta genom att exekvera anteckningsbokscellen nedanför rubriken "Läs den konfokala z-stacken i minnet" med funktionen Save_tiff_from_ND2 () okommenterad30. Den ND2 filen är en egenutvecklad bildframställning format från Nikon, alltså är det nödvändigt att konvertera den till ett format som öppen källkod är kompatibel med.
OBS: TIFF (Tag Image File Format) används eftersom det är allmänt förekommande, 16 bitars kompatibel, enkelt importeras till VTK, och flera bilder kan lagras i en enda fil, vilket är lämpligt för z-stack bilder. Exekvering av anteckningsboken cellen kommer att läsa i en bild från ND2 filen, extrahera information om färgen och XYZ positioner sedan lagra den bilden i en numpy array enligt en förutbestämd struktur. Det kommer sedan att spara arrayen som en TIFF-fil med hjälp av python-biblioteket tifffile.
- Konvertera bilddata till 3D-modell
- Importera TIFF-filen till VTK (vtkTIFFReader) med hjälp av en 3D-rendering för att visualisera cellerna (Bild 2). Välj ett tröskelvärde baserat på färgen på cellerna i bilden. För att förtydliga representerar VTK-objektet ett block med pixlar (X, Y, Z) i rymden (volym) men endast vissa pixlar (grön eller röd) representerar celler, resten är bakgrund eller brus (svart).
- Därför ställer in ett opacitetsfilter på volymen som tar bort bakgrunden bekräfta att det fluorescens kvar är bara cellerna. Gör detta med hjälp av jupyter anteckningsbok cellen med titeln, Ändra opacitetsvärden för varje mikroskop kanal genom att justera Channel_alpha värde variabler (dvs. GFP_alpha). Visualisera effekten med anteckningsbokscellen med rubriken Visa en 3D-rendering för att verifiera tröskelvärdet är korrekt inställda.
- Spara opacitetsvärdena i kalkylbladet som ska användas i nästa steg. Omvandla volymdata till enskilda 3D-objekt, var och en representerar en cell i bilden med hjälp av en teknik som kallas marschkuber31. Denna algoritm extraherar ett polygonalt nät av en isosuran från tredimensionella diskreta skalärfält av voxels.
- Använd opacitetsvärdet i algoritmen marschkuber för att separera varje cell från bakgrunden. Slutför det här steget för alla fluorescerande celler som identifieras i varje mikroskopkanal genom att köra Konvertera voxel-bild till ett triangulärt nät och spara som en VTK-fil i anteckningsboken.
- Montering av ett plan på membranet
- Montera ett plan till endotelbarriären genom att först lokalisera cellcentrojerna (anteckningsbokscell: Analysera RFP-kanalen (endotelbarriären)). Iterera genom listan maskor i volymen och extrahera de regioner som inte är anslutna med hjälp av en PolyDataConnectivityFilter från VTK. Beräkna centroiden för varje nät och lägg till mätningen i en lista över centroider som filtrerar efter maskor som är för stora eller för små (<50, >1000000 voxels).
- Montera ett plan till listan över centroider för endotelcellerna med hjälp av en minimering av felmetod (anteckningsbokscell: Passa ett plan till RFP-centrojderna (endotelbarriär)) (Bild 2, figur 3)32. Inspektera passformen av planet genom att rita planet och centrojder och justera manuellt om det behövs (med hjälp av theta, beta och z) genom att köra anteckningsboken cell med titeln Visualize RFP centroids och plan fit.
- När planet är rätt monterat sparar du det normala för planet till Experiment Tracker File . XLSX-fil för framtida bruk.
- Analysera de beskrivande dragen i enskilda cancerceller för följande deskriptorer (Tabell 1).
OBS: Om datorn som utför analysen släpar efter är hög genomströmningsanalys via högpresterande datoranvändning ett alternativ. Denna algoritm är användbar på standard bärbara datorer för analys av små antal celler, men VTK är inte väl lämpad för ett stort antal enskilda objekt (>1000). Därför är det valfritt att använda den anpassade algoritmen för att fungera på ett högpresterande datorkluster. Detta möjliggör snabb analys av experiment med många celler (Figur 2). Alla 7,5 åstadkoms genom att köra anteckningsboken celler med titeln Analysera de återstående mikroskop kanaler för fenotypiska deskriptorer och Läs i Experiment_tracker information och analysera de kanaler som finns.- Mät extravasation av cancercellerna: Efter att ha karakteriserat det endotelskikt med ett plan, mät volymen av varje cancercell som har migrerat genom membranet. Klipp varje cell (Boolean) så att nätet under membranet hålls och portionen ovanför membranet tas bort33. Stäng sedan det öppna nätet (vtkFillHoles).
- Räkna om det normala och det klippta nätets nya centroid. Mät volym och position för varje klippt cancercell för analys. Volym motsvarar antalet voxels nätfyllnaderna för varje enskild cell. Beräkna avståndet mellan endotelplanet och positionen för varje cancercell.
- Mät cellulär fenotyp: Beräkna morfologin för varje cancercell genom att factoring dess form, volym och position.
- Mät extravasation av cancercellerna: Efter att ha karakteriserat det endotelskikt med ett plan, mät volymen av varje cancercell som har migrerat genom membranet. Klipp varje cell (Boolean) så att nätet under membranet hålls och portionen ovanför membranet tas bort33. Stäng sedan det öppna nätet (vtkFillHoles).
- Validera mätningarna och spara till ett kalkylblad eller en tomt. Kör anteckningsboken cellen med titeln Kontrollera att centroider mättes exakt och en rendering kommer att dyka upp som visar centrojder identifieras ovanpå den avbildade volymen efter celltyp. Efter alla experiment är gjort exportera den kompletta datauppsättningen som en enda kalkylbladsfil genom att skriva de experiment som ska ingå av ID i anteckningsboken cellen med titeln Exportera data som en enda Data.XLSX fil för variablerna experiment ersätter de givna experiment-ID: erna. Om verifiera den färdiga datauppsättningen ritar du in den med anteckningsbokscellen med titeln Distance extravasated strip plot. Handlingen kommer att visas i anteckningsbokens miljö och spara till fil.
8. Analysera de relaterade egenskaperna med hjälp av Artificiell Intelligens
OBS: Identifiera metastaserande fenotypiska funktioner med hjälp av algoritmer för artificiell intelligens.
- Utför binär klassificering med hjälp av Orange enligt det schema som visas i figur 5 och Tilläggsfil 3. Starta Orange från en andra Windows Command Prompt genom att skriva "conda aktivera" följt av "python -m Orange.canvas" och klicka på Nytt från prompten. Orange är en dra och släppa baserad programvara, så ordna funktionerna genom att dra varje objekt från vänster menyn till duken för att matcha Supplemental File 3. Efter det är klar dubbelklicka på Arkiv-ikonen och välj .XLSX filen.
- Filtrera data för att ta bort dåliga mätningar, definierade som de som misslyckades med en boolesk operation eller ger parametriska variabelvärden utanför kända gränser med hjälp av ikonen "Välj rader". Dubbelklicka på ikonen och ange villkor som motsvarar filtret som "Sphericity är mellan 0 och 1". Skapa förutsättningar för 8.2.1, 8.2.2 och 8.2.3.
- Filtrera extravaserade mätningar av avstånd till räckvidd från -100-200 μm.
- Filtrera sfäriska mätningar av cellformen till att vara från 0-1.
- Filtrera cancer cellvolym mätningar till allt från 0-2000 voxels.
- Använd alla parametriska variabler (tabell 1) för att klassificera hjärnan-metastaserande MDA-MB-231-BR-GFP och icke-hjärnans metastaserande MDA-MB-231-GFP. Dubbelklicka på Ikonen Välj kolumner på arbetsytan. Använda > knappen för att flytta Tillgängliga variabler till antingen Funktioner, Målvariablereller Meta attribut. Den enda variabel som ska vara en Målvariabel är en Metastatisk etikett som definierar om celler i datamängden betraktas som metastaserande (1) eller inte (0). Experimentvariabler kan placeras i avsnittet Meta attribut.
- Exempel på data i en utbildning (80%) och testuppsättning (20 %). Dubbelklicka på ikonen Data sampler och välj en Sampling typ av Fast andel av data: ange till 80% och välj replikerbara och stratifiera kryssrutor. Stratifiera och korsvalificera träningsset med hjälp av 10 veck mot varje modell/klassificerare. Dubbelklicka På Testa & Betyg och välj Kryssvalidering med Antal veck: satt till 10 och Stratifierad kontrolleras. Ställ in målklassen på 1.
- I denna metod, använd Neural Networks och Random Forest inlärningsalgoritmer som de är robusta för data. Inom ikonen Slumpskog väljer du antalet träd som ska vara 50 och välj inga andra alternativ. Inom neurala nätverk ikonen välja Nervceller per dolda layer: 100, Aktivering: ReLu, Problemlösaren: Adam, Alpha: 0,0001, och Max Iterationer: 200. Dessa inställningar kommer dock att variera avsevärt genom studier och bör vara väl förstådda före applicering.
- När du har konfigurerat arbetsytan dubbelklicka på varje ikon från Fil till Exempeldata och antingen slå Apply eller Skicka data. Dubbelklicka På Testa & Poäng och träningsdatan börjar användas för att utveckla en modell med hjälp av algoritmerna. Efter utbildning av maskininlärningsmodellen, åter öppna Test & Score och välj Test på testdata och stäng popup-fönstret för att poängföra modellens prestanda genom att klassificera cellerna i chipet enligt sannolikheten att de är hjärnmetastats från 0 till 1.
- Spara maskininlärningsmodellens prestanda i en fil (Tabell 2). Inkludera området under kurva (AUC) för ROC, noggrannheten och F1-poängen. Spara en andra fil som innehåller de enskilda metastaserande indexen och sannolikheterna för klassificering. Dubbelklicka på spara-ikonen och klicka på Spara som för att skriva till filen klassificeringssannolikheterna. På samma sätt kan ROC-kurvan visas genom att dubbelklicka på ROC Analysis-ikonen och modellprestandan kan beräknas genom att dubbelklicka på ikonen Confusion Matrix.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av denna teknik analyserade vi celltyper märkta med olika fluorescerande proteiner eller färgämnen. Vi visar användningen av detta tillvägagångssätt med en μmBBN chip formulerade med hCMEC/D3-DsRed och icke-fluorescerande astrocyterna. Hjärnans mikrovaskulära endotelceller sådes på ett poröst membran (5 μm spår etsade porer) och placerades i en inkubator34 vid 37 °C under 5% CO2. Efter tre dagar konfluency av endotelskiktet bekräftades via mikroskopi och sedan cancerceller placerades ovanpå endotel lagret. Två bröstcancer cellinjer, en hjärna-söker klon kallas MDA-MB-231-BR-GFP, och föräldrarnas MDA-MB-231-GFP celler var in i μmBBN chip som innehåller en astrocytic hjärnan nisch35,36,37,38,39,40,41. μmBBN-chipsen avbildades vid 1, 2 och 9-dagar med hjälp av ett konfokalt mikroskop med 3 kanaler (dsRed, GFP och Brightfield) med hjälp av ett 10x-mål, med Z-skivor varje 9 μm och 1x9 XY-sömmar för att täcka hela membranområdet. Detta mikroskop höll en temperatur på 37 °C under bildtagningsprocessen för att minimera stress på cellerna.
En representativ bild av ett komplett μmBBN-chip (Bild 3A) och endoteltäckning (Bild 3B-D) visas. Endotheliala barriärer med hög och låg täckning kvantifieras för att utröna μmBBN-chips är lämpliga för tillsats av cancerceller (Figur 3B). Representativa bilder av ett μmBBN-chip med en konfluent endotelbarriär som är acceptabel för experimentation (Figur 3C) och ett μmBBN-chip med särskilt dålig endoteltäckning som inte är lämplig för tillsats av cancerceller tillhandahålls (Figur 3D). Långvarig odling av endotelceller kan resultera i täckning som sträcker sig bortom membranet som skiljer topp- och botten μmBBN-spånutren. Endotelceller växer ofta både ovanpå och direkt under membranet, vilket inte påverkar cancercellens rörelse in i hjärnans nischutrymme men kan göra att planet passar in svårt. På grund av variabiliteten hos μmBBN-spåntillverkan och endoteltäckningen hos membranet visas representativa plan som passar till en normal platt endotelbarriär (Figur 3E), och ett atypiskt krökt membran som referens (Figur 3F). Att torka enheten i en ugn vid en temperatur över 40 °C kan orsaka ett böjt membran enligt bilden.
Vi observerade fenotypiska skillnader av MDA-MB-231-BR-GFP och föräldrarnas MDA-MB-231-GFP cellinje när man stöter astrocytic μmBBN som kvantifierades med hjälp av den utvecklade confocal tomographic analys. De 4 fenotypiska deskriptorerna som används för indata i maskininlärningsalgoritmen (Tabell 1) visas i figur 4.
Avstånd extravaserad representerar avståndet i μm mellan endotelbarriären och varje cancercellsposition i μmBBN-chippet (Figur 4A). Endotelbarriären ligger på 0 μm. Avstånd <0 μm representerar cancerceller som blev kvar i flödeskammaren. Avstånd >0 μm indikerar cancerceller som har extravaserat genom endotelbarriären och kommit in i hjärnans nischutrymme. Efter 1-dagars exponering för μmBBN både MDA-MB-231-BR-GFP och MDA-MB-231-GFP var placerade inom endotelbarriären. Men efter 2 och 9-Days av interaktion en delmängd av MDA-MB-231-BR-GFP migrerade > 100 μm i den astrocytic hjärnan nisch, medan föräldrarnas MDA-MB-231-GFP celler kvar i närheten till endotelbarriären. Vi löste cancercellpositionerna vid endotelbarriären/hjärnans nischgränssnitt genom att beräkna volymen av varje cancercell som har passerat genom endotelbarriären. Den resulterande procentsatsen representerar cancercell extravaserad i volym (Figur 4B). En 0% extravasated av cellvolym indikerar cancerceller som finns kvar på toppen av endotelbarriären, sträcker sig till 100% när en cancercell har helt extravasated genom endotelbarriären och bor i hjärnan nisch utrymme. Föräldrarnas MDA-MB-231-GFP-celler interagerar inledningsvis med endotelbarriären efter 1-Day av exponering för μmBBN chip som var <50% extravasated av volym. Vid 2, och 9-dagar MDA-MB-231-GFP celler upprätthålla en betydande andel av celler som förblev på toppen av barriären bort från hjärnan nisch utrymme. MDA-MB-231-BR-GFP-cellerna upprätthöll en andel celler som var >100% extravaserade, särskilt vid 2-Day-tidspunkten.
Cancercellformen förändrades dramatiskt under exponeringstiden för μmBBN. Representativa bilder av cancercellerna vid varje tidspunkt avbildas i figur 4C. Morfologisk kvantifiering av cancercellformen beräknades med hjälp av sfäricitet, som står för cellvolym och yta (Figur 4D). Sphericity-måttet sträcker sig från 0-1, med 1 som representerar en perfekt sfär. Både MDA-MB-231-BR-GFP och MDA-MB-231-GFP celler var mycket sfäriska 1-dag post seeding i μmBBN chip. Efter 2- och 9-dagars interaktion i μmBBN-chipet trendade båda cancercelllinjerna att minska sin sfäriska form, om än i olika takt. Förutom cancer cell form, volymen i voxels av varje cancercell är också kvantifieras med hjälp av confocal tomographic analys. Varje cancer cellinje var stratifierad i två grupper i figur 4E-F: "ut", som representerar de cancerceller som transiterade genom endotelbarriären (>90% extravasated genom barriären) och "in", befolkningen av celler som interagerar med den endothelial barriären men inte extravasate genom (lt90% extravasated). De cancercellsunderpopulationer som extravaserade in i den astrocytiska nischen var mindre i storlek jämfört med de cancerceller som förblev i samspel med endotelbarriären men inte helt extravaserade fram till hjärnan.
Hjärnan-söker MDA-MB-231-BR-GFP visade en fenotypisk mönster i μmBBN chips skiljer sig från föräldrarnas MDA-MB-231-GFP som kan utnyttjas för att skilja mellan hjärnan-metastaserande och icke-hjärnan metastaserande cancerceller med hjälp av maskininlärning. Datan var slumpmässigt separerat in i utbildning och giltighet dataset till tåg modellen och utföra verifieringstester. För att träna modellen användes totalt 38 859 celler efter filtrering av data och modellen testades mot 9 714 enskilda celler. Den tränade modellen tillämpades på cancer cellinjer och PDX-genererade cancerceller som analyserades i astrocytic μmBBN chips (4 isolerade från patientens hjärnmetastaser av en mängd olika primära tumörtyper, och 1 primär bröstcancer tumör) för att generera ett index för hjärnan metastaserande sannolikhet (Figur 5). Åtta olika maskininlärningsklassificeringsmetoder testades: Naiva bukter, slumpmässig skog, beslutsträd, k-närmaste-granne (kNN), stokastisk gradient nedstigning, neurala nätverk och Adaboost. Resultatet av varje metod visas i tabell 2. Neurala nätverk och Adaboost var de 2 bäst presterande klassificeringsmetoderna som rekommenderas för användning med data som genereras med hjälp av μmBBN-plattformen med en AUC på 0,920 respektive 0,928. Dessutom visade de en noggrannhet på 0,833 och 0,853. Genomsnittet av precision och återkallande (F1) för neurala nätverk och Adaboost metoder var 0,847 och 0,860. Från tidigare arbete där vi tillämpat detta tillvägagångssätt för PDX prover av icke-ögonbevarande bröst tumör och kända ögonbevarande prover (bröst, lunga, äggstockscancer, tunga) fann vi att samma tillvägagångssätt tillämpas på PDX prover aktiverat korrekt identifiering av de metastaserande celler från de icke-metastaserande sådana. Tabell 2 visar resultaten för varje maskininlärningsalgoritm som tillämpas på PDX-data vari samma metoder visade sig vara de mest robusta (Neurala nätverk och Adaboost (Random Forest). Av de 143 celler som används i testuppsättningen för PDX-proverna var 71 icke-metastaserande, 46 var ögonbevarande bröst, 11 var ögonbevarande tunga, 13 var ögonbevarande lunga och 2 var ögonbevarande äggstockscancer. Varje celltyp producerade en total noggrannhet på 0,88 men enskilda hade följande ungefärliga noggrannheter: icke-metastaserande bröst: 0,96, ögonbevarande bröst: 0,80, ögonbevarande tungan: 0,80, ögonbevarande lunga: 0,92, ögonbevarande äggstockscancer: 1,0
Bild 1: Experimentellt arbetsflöde. (A) Schematisk representation av den mikrofluidiska enhetsmonteringsprocessen. En spinnare används för att deponera en tunn film av PDMS:toluenlim på en 50 mm x 75 mm glasrutschbana. Varje halva av μmBBN-anordningen stämplas kanalsidan vänd mot limmet och monteras sedan ihop med ett polykarbonatmembran (5 μm porer) mellan μmBBN-apparatdelarna. μmBBN-apparaterna placeras i en 37 °C-ugn i 24 h för att bota limmet. Anordningar torkas sedan i en vakuumutsetorn i minst 48 h före experimentell användning. En μmBBN-apparat och 50 mm x 75 mm glasrutschbana aktiveras med en plasmabehandling och binds ihop. Standard P200-pipetter som kapas vid spetsarna sätts in i alla μmBBN-apparatinlopp och uttag. Den färdiga μmBBN-enheten steriliseras sedan av en 8 min (200 W) plasmabehandling som sedan överförs till en steril sekundär behållare. (B) Schematisk översikt av att utnyttja den mikrofluidiska enheten byggnadsställningar för att skapa en cellulär blod-hjärnbarriären och hjärnan nisch mikro-miljö. Inuti ett biosäkerhetsskåp sås en blandning av astrocyter i kollagen in i den nedersta μmBBN-apparatkammaren och tillåts stelna i 1 h vid 37 °C. Matrigel används för att belägga membranet genom den övre flödeskammaren i 1 h vid 37 °C. Då endotelceller sås i en spets av den övre kammaren och får flöda och nöja sig med 15 min. Denna sådd upprepas x4, alternerande sidor av flödeskammaren. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Konfokal tomografisk analysöversikt. Programvaran börjar med att omvandla en mikroskopisk konfokal Z-stack bild till en 3D-modell av cellerna med hjälp av segmentering och 3D-maskor. Programmet beräknar sedan mittpositionen för varje cell (centroid) och passar ett plan till endotelbarriären. Fenotypiska mätningar av varje enskild cell är sedan tabulated. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Endothelial barriärtäckning och planinpassning. (A) Representativt schematiskt och bild av en μmBBN-enhet. Den streckade vita linjen inom den schematiska toppvyn anger området för enheten som representeras i tvärsnittsvyn. (B) Jämförelse av hög och låg endoteltäckning av μmBBN-apparater före applicering av cancerceller. Welch två-prov t-test, *** p < 0,1 * 10-4. (C) Representativ bild av hög endothelial täckning. Den streckade vita rutan inom inset schemat för en μmBBN-enhet indikerar placeringen av endotelcellerna inom enheten. Skala staplar av översikt och inset bilder = 200 μm. (D) Representativ bild av låg endotel täckning. Skala staplar av översikt och inset bilder = 200 μm. (E) Exempel planpassning av en platt endotelbarriär. Den gröna rektangeln representerar endotelplanets position. Punkter representerar enstaka endotelceller som omfattar barriären. Gula prickar är endotelceller ovanför planet, och lila prickar är celler som faller under planet. Endotelceller ovanför planet (gula prickar) uppvisar en tendens att växa upp sidoväggarna och toppen av enheten för att bilda ett rör. (F) Exempelplanspassning av en μmBBN-anordning med ett krökt plan. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Kvantifiering av cellulära fenotyper av hjärnan-metastaserande och föräldracells fenotyper i astrocytiska blodhjärnan nisch mikrofluidiska chips. (A) Remsa av avstånd i μm av cancerceller från endotelbarriären vid 1, 2, och 9-Dagar. Den streckade svarta linjen vid 0 μm representerar endotelbarriären. Röda lådor indikerar en delmängd av MDA-MB-231-BR-GFP-celler som migrerat långt in i hjärnan nisch. (B) Violin tomt av den procent totala volymen av cancerceller extravaseras genom endotelbarriären vid 1, 2, och 9-Dagar. Korta streckade linjer representerar kvartilar, längre streckad linje representerar medelvärdet. (C) Representativa bilder av morfologin av cancerceller i μmBBN enhet. Skala bar = 25 μm. (D) Violin tomt av sphericity av cancerceller i μmBBN enhet vid 1, 2, och 9-Dagar. Sfärikalitet varierar från 1: sfärisk till 0: inte sfärisk. (E) Lådyta av MDA-MB-231-GFP-cellvolym i μmBBN-enheten i voxels för celler som vilar utanför endotelbarriären (ut) och celler som extravaserade genom barriären (in). (F) Lådtomt av MDA-MB-231-BR-GFP-cellvolym i μmBBN-enheten i voxels för celler som vilar utanför endotelbarriären (ut) och celler som extravaserade genom barriären (in). Rutan visar kvartilen och morrhår sträcker sig för att visa andelen av det interquartila intervallet förbi låg- och högkvartilen. Pairwise Wilcoxon Rank Sum och Kruskal-Wallis med Dunns flera jämförelser, *** p < 0,1 * 10-4. Återges från referens24 med tillstånd från Royal Society of Chemistry. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Representativa resultat av maskininlärningsklassificering av cancerceller. (A) Översikt över maskininlärning. Demonstrerar process för att dela upp data som samlats in från konfokal tomografi, filtrera data, träna maskininlärningsalgoritmen med 10-faldig validering och sedan testa modellen mot ett slumpmässigt urval av 20% av data som data reserverades. Den valda modellen kan sedan tillämpas på nya data för att samla in det metastaserande indexet för enskilda celler. (B) ROC kurvor som visar prestanda för 8 olika maskininlärningsalgoritmer för MDA-231-BR-GFP och MDA-231-GFP celler kultur för 1, 2 och 9-Dagar före bildbehandling. Detta är representativt för den typ av kurva som ska analyseras för att förstå prestanda för den tränade modellen. (C) ROC kurvor för 8 olika maskininlärningsalgoritmer tillämpas på patienten härledda xenograft (PDX) dissociated celler odlade för 2-Dagar. Detta är representativt för den typ av kurva som ska analyseras för att förstå prestanda för den tränade modellen. Återges från referens24 med tillstånd från Royal Society of Chemistry. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| Funktionen | Deskriptor |
| Tumör cell | % extravaseras in i nischen |
| Tumör cell | Volym |
| Tumör cell | Sfärikitet |
| Tumör cell | Avstånd extravaserad |
| Tumör cell | Live cell 2D-migrering |
| Mikro-metastasering | Porositet |
| Mikro-metastasering | Stromal interaktion |
| Mikro-metastasering | Ålder |
| Mikro-metastasering | Tillväxttakt |
| Stromal cell | Volym |
| Stromal cell | Avstånd från närliggande cancerceller |
| Stromal cell | Avstånd från endotelbarriär |
| Stromal cell | Form |
Tabell 1: Lista över deskriptorer efter funktionstyp. Den fenotypiska karakterisering av tumörceller representeras med hjälp av en panel av deskriptorer. Den röda rutan anger de deskriptorer som har använts för att förutsäga hjärnans metastaserande sannolikhet via maskininlärning.
| Cancerceller | |||
| Metod | Auc | Noggrannhet | F1 |
| Neurala nätverk | 0.925 | 0.84 | 0.847 |
| AdaBoost | 0.928 | 0.853 | 0.86 |
| Slumpmässiga Forest | 0.925 | 0.849 | 0.855 |
| Beslut Tree | 0.898 | 0.817 | 0.827 |
| Knn | 0.775 | 0.702 | 0.718 |
| Logistisk regression | 0.769 | 0.735 | 0.751 |
| Naiva Bayes | 0.745 | 0.715 | 0.73 |
| Sgd | 0.73 | 0.73 | 0.737 |
| PDX Cancerceller | |||
| Metod | Auc | Certifikatutfärdare | F1 |
| Neurala nätverk | 0.972 | 0.881 | 0.878 |
| Slumpmässiga Forest | 0.964 | 0.888 | 0.887 |
| AdaBoost | 0.957 | 0.881 | 0.879 |
| Träd | 0.954 | 0.867 | 0.865 |
| Logistisk regression | 0.897 | 0.832 | 0.831 |
| Naiva Bayes | 0.896 | 0.846 | 0.849 |
| Knn | 0.882 | 0.818 | 0.814 |
| Sgd | 0.861 | 0.86 | 0.853 |
Tabell 2: Jämförelse av maskininlärningsmetoder för att klassificera cancerceller och PDX-cancerceller efter hjärnmetasbestotisk potential.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har utvecklat och presenterat en ny metod som anpassar verktyg som ofta utnyttjas i kliniska bildframställningsanalyser för mätning av extravasation och migration av cancerceller genom en endotelbarriär till hjärnvävnad. Vi utgör detta tillvägagångssätt kan vara användbart för både in vivo och in vitro-mätningar; vi har visat dess användning på en 3D microfluidic system recapitulating hjärnan vasculature. Cancer cell mätningar inklusive avstånd extravasated, procent extravasated by volym, sfäricitet, och volym kvantifieras med hjälp av denna teknik. Avstånd extravaserat och procent extravaserat volymser tillåter användaren att rekonstruera cancercellernas position i chipet för att bedöma extravasation över barriären och migrationen i vävnaden. Cellformsmätningar som sfärikitet och volym är relaterade till cellens dynamiska rörelser eller funktion vid varje tidspunkt. Flyttande MDA-MB-231-BR-GFP celler uppvisar en hög nivå av sfärikitet när de ursprungligen införs i μmBBN enheten och blir mindre sfäriska i form när de minskar sin rörelse och börjar kolonisera nischen. Den totala cellvolymen för MDA-MB-231-GFP och MDA-MB-231-BR-GFP skilde sig på grund av celllinjernas formskillnad. Cancerceller som korsar endotelbarriären är mer rundade än de celler som inte går genom barriären, vilket innebär att mindre runda celler kan extravasera över endotelskiktet mer effektivt.
Två kritiska steg finns inom protokollet som underlättar framgång. Den första inträffar under monteringen av μmBBN enheten övre och nedre delar som är åtskilda av det porösa membranet. Övre och nedre apparatdelar måste paras så att inlopp och utlopp överlappar varandra men inte ockluderas av membranet däremellan för att främja korrekt flöde. Alla μmBBN-apparater med dålig parning av de övre och nedre apparatdelarna eller membraninriktningen kasseras för att minimera variationer i kvalitet. Efterföljande bakning för att bota PDMS:toluenlim för att montera enheten är avgörande för att utföra vid 37 °C för att producera μmBBN-enheter med membran som är platta. Bakning temperaturer som överstiger 37 °C tenderar att producera enheter med en böjd membran som gör bildanalys svårt, särskilt när du monterar ett plan till endotelbarriären. Det andra kritiska steget händer under sådd av endotelbarriären. Sådd bör ske med minst femton minuters mellanrum mellan de två inloppen som matar den översta delen av enheten för att säkerställa slumpmässig fördelning av endotelcellerna på anordningens membran. Sådd av kollagenblandningen som innehåller astrocyter i chipet kan kräva felsökning och modifiering av det labspecifika protokollet. Om membranytan på enheten inte är hydrofoba, kommer kollagen fylla både botten och övre delarna av enheten och ställa in så att den täpper till alla flöde genom den övre delen av enheten. Syftet med den slutliga plasmagasbehandlingen är att göra enheten yta hydrofoba. I detta fall rekommenderar vi justering av plasma gas behandling av enheten för att öka hydrofobicity.
Vi har observerat vissa begränsningar med detta tillvägagångssätt. Till exempel kan det tillvägagångssätt som används för att inducera cellfluorescens påverka bildkvaliteten. Vid användning av levande cellspårningsfärgämnen är fluorescerande mönstret gjort av små fläckar, medan transfekterat eller transduced uttryck av fluoroforer ger ett enhetligt mönster. Det fläckiga mönstret kräver ytterligare och ibland felbenägna klustring av pixlar. Dessutom är mätningens känslighet beroende av den omsorg som görs under bildtagningen. Bilder med högre upplösning och fler z-skivor förbättrar upplösningen, men tar också mer tid att avbilda och analysera. Celler som är vidröra kan också felaktigt analyseras som en stor enda cell. Detta är ett problem för många automatiserade bildsystem men kan åtgärdas på två sätt. Den första är att det endotelskikt har många celler vidrör, men deras kombination har försumbar inverkan på den slutliga platsen för skärplanet. Den andra är antalet cancerceller är tillräckligt låg för att det är sällsynt att de är rörande. Fel som införs vid montering av planet kan uppstå av flera skäl. Den första är att vissa endotelceller kan ha migrerat bort från det centrala membranet under cellodling. Detta kan resultera i endotelceller beläggning hela kanalen eller invaderar kollagen fyllt utrymme, därigenom skeva mätningen. En annan felkälla är, paradoxalt nog, den manuella justeringen av planet för att åtgärda det tidigare felet. Emellertid, repeterbarhet och reproducerbarhet studier har funnit detta ha minimal inverkan. Slutligen observerade vi att under vissa omständigheter kan den booleska skärningen av cellnätet misslyckas eller algoritmen för att stänga det skurna nätet också kan misslyckas. De tekniker som används här är den nuvarande "state of the art", och dessa problem behandlas för närvarande av algoritmiska forskare.
Resultaten från utbildning av maskininlärningsalgoritmer (AI) mot data som samlats in av confocal tomografi av μmBBN visar att det stora antalet enskilda celler som analyseras av detta tillvägagångssätt kan bidra till att lösa frågor om att fånga heterogenitet som finns i cancerceller. En AUC större än 0,9 anses vara en högpresterande klassificerare. Här visade vi en AUC på 0,928. Vi förväntar oss att eftersom metoden förbättras vid prestanda kommer att fortsätta att öka. Som med alla AI-metoder måste man vara noga med att välja träningsdatamängden noggrant så att den i stort sett representerar den typ av data som förväntas testas mot. Av denna anledning kan vi förvänta oss att prestanda skulle försämras, om modellen tillämpades direkt på patientprover till exempel utan att först utsätta modellen för en robust samling patientprover. Vi visar detta här i viss mån genom att inkludera 1-Day, 2-Day, och 9-Day mätningar för cancercellerna i modellen jämfört med 2-dagars dag som används för det tidigare arbetet. Vi observerar att den breda samplingen minskar modellens prestanda något och visar hur känsliga några av de sämre utför metoder kan vara, vilket tyder på att användarna kanske vill testa flera modeller på sina data. Tabell 2 som beskriver PDX-resultat visar en övergripande god prestanda. Enskilda PDX-typer visar dock att andelen celler som mäts från varje prov skiljer sig åt och kan påverka prestandan för varje ursprungsplats. Till exempel producerade äggstocksprovet bara två celler för testuppsättningen. Däremot metastaserande bröstcancer som hade en större befolkning. Denna datamängd var avsedd att visa att cellerna överlever i nischen och kan analyseras, men också belyser tolkningsvård behövs. Ändringar av målvariabeln kan också vägleda forskare att identifiera sub-kloner med andra egenskaper såsom interaktioner med stromaceller eller quiescent beteende.
Detta tillvägagångssätt är viktigt eftersom fler laboratorier anta membran på-ett-chip system såsom blod-hjärnbarriären på ett chip, lunga på ett chip och tarm på ett chip11,42. Majoriteten av dessa spånor är hopmonterade så att membranet är parallellt med bildhanteringssystemet, vilket hittills har inneburit att det skulle vara svårt att mäta när och hur många celler som har flyttats från ena sidan av membranet tillden andra 15,28. Dessutom, jämfört med horisontellt orienterade chips, vertikalt orienterade chips ger en mycket större membran område ökar det dynamiska omfånget av experimentet. Eftersom orientering av membranet inte är avgörande för denna analysteknik, kan konfokal tomografi dessutom potentiellt möjliggöra nya in vitro-experiment. Till exempel, imaging extravasation av bröstcancerceller från murine fett pad i blodet skulle vara tillgänglig genom dessa metoder. Detta kan hjälpa forskare att identifiera hur cancercellerna sond gränssnittet mellan bröstet ECM och fartyg.
Sammanfattningsvis presenterade vi en metodik för att konstruera en 3D mikrofluidic enhet som rekapitulerar blod hjärnan nisch och visa hur man använder konfokal tomografi och maskininlärning för analys. Med hjälp av denna plattform identifierade vi hjärn-metastaserande cancercell egenskaper som skiljer mellan hjärnan metastaserande och icke-metastaserande PDX cancerceller baserat på deras beteende inom μmBBN enheten. Framtida arbete kommer att förbättra den kliniska tillämpligheten av denna plattform som en diagnostisk mot förutsäga hjärnan metastaser. Vi tror att ha lagt fram denna plattform kommer att vara användbar och intressant för laboratorier som behöver mäta celler av någon typ migrera eller extravasating över ett membran. Detta är av betydelse, som pre-clinical modellerar av tumormikro-miljön blir mer och mer sofistikerad så till must som, av modellerar och understödja programvara. Till stöd i robust analys av de uppgifter vi har paketerat detta verktyg som en enkel att använda, delade python anteckningsbok med installationsanvisningar30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det finns inga upplysningar att deklarera.
Acknowledgments
Vi tackar Steeg Lab, vid National Cancer Institute för generös donation av MDA-MB-231-BR-GFP celler. Confocal mikroskopi utfördes vid University of Michigan Biointerfaces Institute (BI). Flödescytometri utfördes vid University of Michigan Flow Cytometry Core. Viral vektorer skapades av University of Michigan Vector Core. Vi tackar också Kelley Kidwell för vägledning i statistisk analys av dessa data.
Finansiering:
C.R.O. stöddes delvis av ett NIH T-32 Training Fellowship (T32CA009676) och 1R21CA245597-01. T.M.W. stöddes delvis av 1R21CA245597-01 och National Center for Advancing Translational Sciences of the National Institutes of Health under Award Number UL1TR002240. Finansiering för material och karakterisering tillhandahölls av National Cancer Institute of the National Institutes of Health under tilldelning nummer 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, METAvivor Foundation och Breast Cancer Research Foundation. Innehållet är ensamt författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 1.5 mm biopsy punch with plunger | Integra LifeSciences Corporation | 33-31A-P/25 | |
| 10x MEM | Thermo Fisher Scientific | 11430030 | |
| 150 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 1x DPBS, without Ca and Mg | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| 200uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| 4 inch silicon wafer | University Wafer | 452 | |
| 48 mm wide packing tape | Fisher Scientific | 19-072-097 | |
| 50 x 75 mm glass slide | Fisher Scientific | 12-550C | |
| A1 confocal microscope | Nikon | ||
| acetone | Fisher Scientific | A9-20 | |
| antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin) | Gibco | 15240062 | |
| box cutter blade | Fisher Scientific | NC1721575 | |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| DMEM with 4.5 g/L glucose | Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| double sided tape | Fisher Scientific | NC0879005 | |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat inactivated | Corning | MT35011CV | |
| Fiji software | ImageJ | ||
| glass vial | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| hCMEC/D3 | EMD Millipore | SCC066 | |
| Jupyter notebook | Anaconda | ||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Matrigel - growth factor reduced with phenol red | Corning | CB-40230A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MDA-MB-231-BR-GFP | Dr. Patricia Steeg, NIH | ||
| N-2 growth supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| normal human astrocytes (NHA) | Lonza | CC-2565 | |
| Orange software | University of Ljubljana | ||
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Photolithography masks | Photosciences Incorporated | ||
| pLL3.7-dsRed | University of Michigan Vector Core | ||
| pLL-EV-GFP | University of Michigan Vector Core | ||
| pLOX-TERT-iresTK | Addgene | 12245 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polycarbonate membrane, 5um pore size | Millipore | TMTP04700 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| PureCol, 3 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5005 | Type I bovine collagen |
| sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | 25080094 | |
| sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Solo cup | Fisher Scientific | NC1416545 | |
| SU-8 2075 | MicroChem Corporation | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 developer | MicroChem Corporation | Y020100 4000L1PE | |
| Sylgard 184 | Ellsworth Adhesive Company | NC0162601 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 179965-1L | |
| Tricholoro perfluoro octyl silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G |
References
- Rastogi, K., et al. Palliation of Brain Metastases: Analysis of Prognostic Factors Affecting Overall Survival. Indian Journal of Palliative Care. 24 (3), 308-312 (2018).
- Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
- Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
- Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. 294, 15-22 (2005).
- Poissonnier, A., Legembre, P. Boyden Chamber Assay to Study of Cell Migration Induced by Metalloprotease Cleaved-CD95L. Methods in Molecular Biology. 1557, 117-123 (2017).
- Li, X., Yang, H., Huang, H., Zhu, T. CELLCOUNTER: novel open-source software for counting cell migration and invasion in vitro. BioMed Research International. 2014, 863564 (2014).
- Little, A. C., et al. IL-4/IL-13 Stimulated Macrophages Enhance Breast Cancer Invasion Via Rho-GTPase Regulation of Synergistic VEGF/CCL-18 Signaling. Frontiers in Oncology. 9, 456 (2019).
- Allen, S. G., et al. Macrophages Enhance Migration in Inflammatory Breast Cancer Cells via RhoC GTPase Signaling. Scientific Reports. 6, 39190 (2016).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
- Choi, Y. P., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
- Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. Journal of Neuroscience Methods. 232, 165-172 (2014).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
- Schroeder, W., Martin, K., Lorenson, B. The Visualization Toolkit. 4th edn. , Kitware. (2006).
- Wells, W. M., Grimson, W. L., Kikinis, R., Jolesz, F. A. Adaptive segmentation of MRI data. IEEE Transactions on Medical Imaging. 15 (4), 429-442 (1996).
- Agarwal, S. K., Singh, S., Ghuman, S. S., Sharma, S., Lahiri, A. K. Radiological assessment of the Indian children with congenital sensorineural hearing loss. International Journal of Otolaryngology. 2014, 808759 (2014).
- Mansfield, P., Maudsley, A. A. Medical imaging by NMR. The British Journal of Radiology. 50 (591), 188-194 (1977).
- Plewes, D. B., Kucharczyk, W. Physics of MRI: a primer. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 35 (5), 1038-1054 (2012).
- Batteux, C., Haidar, M. A., Bonnet, D. 3D-Printed Models for Surgical Planning in Complex Congenital Heart Diseases: A Systematic Review. Frontiers in Pediatrics. 7, 23 (2019).
- Thibault, F., et al. MRI for surgical planning in patients with breast cancer who undergo preoperative chemotherapy. American Journal of Roentgenology. 183 (4), 1159-1168 (2004).
- Oliver, C. R., et al. A platform for artificial intelligence based identification of the extravasation potential of cancer cells into the brain metastatic niche. Lab on a Chip. 19 (7), 1162-1173 (2019).
- Gril, B., et al. Reactive astrocytic S1P3 signaling modulates the blood-tumor barrier in brain metastases. Nature Communications. 9 (1), 2705 (2018).
- Badilescu, S., Packirisamy, M. BioMEMS: Science And Engineering Perspectives. , Taylor & Francis/CRC Press. (2011).
- Liu, C. Foundations of MEMS. 2nd edn. , Prentice Hall. (2012).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab on a Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
- Lockman, P. R., et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (23), 5664-5678 (2010).
- Ryan Oliver, C., W, T. M. Con-tom: A Jupyter Notebook for Analyzing the tumor micro-environment in confocal images. Zenodo. , Version 0.8, 3825719 (2020).
- Lorensen, W. E., Johnson, C., Kasik, D., Whitton, M. C. History of the Marching Cubes Algorithm. IEEE Computer Graphics and Applications. 40 (2), 8-15 (2020).
- Kleinbaum, D. G., Kupper, L. L. Applied regression analysis and other multivariable methods. , Duxbury Press. (1978).
- Berg, M. d Computational geometry : algorithms and applications, 2nd rev. edn. , Springer. (2000).
- Esch, M. B., Post, D. J., Shuler, M. L., Stokol, T. Characterization of in vitro endothelial linings grown within microfluidic channels. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2965-2971 (2011).
- Brinkley, B. R., et al. Variations in cell form and cytoskeleton in human breast carcinoma cells in vitro. Cancer Research. 40 (9), 3118-3129 (1980).
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 33 (2013).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 16 (2013).
- Dello Russo, C., et al. The human microglial HMC3 cell line: where do we stand? A systematic literature review. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 259 (2018).
- Dun, M. D., et al. Proteotranscriptomic Profiling of 231-BR Breast Cancer Cells: Identification of Potential Biomarkers and Therapeutic Targets for Brain Metastasis. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2316-2330 (2015).
- Xing, F., et al. Reactive astrocytes promote the metastatic growth of breast cancer stem-like cells by activating Notch signalling in brain. EMBO Molecular Medicine. 5 (3), 384-396 (2013).
- Zhang, B., Radisic, M. Organ-on-a-chip devices advance to market. Lab on a Chip. 17 (14), 2395-2420 (2017).
