Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para preparar e esculpir uma barreira cerebral sanguínea microambienta tumoral metastático e, em seguida, quantificar seu estado usando imagens confocal e inteligência artificial (machine learning).
Abstract
Metástases cerebrais são as lesões de câncer mais letais; 10-30% de todos os cânceres metástases no cérebro, com uma sobrevida mediana de apenas ~5-20 meses, dependendo do tipo de câncer. Para reduzir a carga do tumor metastático cerebral, as lacunas no conhecimento básico e translacional precisam ser abordadas. Os principais desafios incluem a escassez de modelos pré-clínicos reprodutíveis e ferramentas associadas. Modelos tridimensionais de metástase cerebral podem produzir os dados moleculares e fenotípicos relevantes usados para atender a essas necessidades quando combinados com ferramentas de análise dedicadas. Além disso, em comparação com os modelos de murina, modelos de células tumorais de pacientes que atravessam a barreira cerebral do sangue no microambiente cerebral geram resultados rapidamente e são mais interpretáveis com métodos quantitativos, assim, favoráveis a testes de alto rendimento. Aqui descrevemos e demonstramos o uso de uma nova plataforma de nicho cerebral microfluido 3D (μmBBN), onde múltiplos elementos do nicho podem ser cultivados por um longo período (vários dias), fluorescentemente imagens por microscopia confocal, e as imagens reconstruídas usando uma técnica inovadora de tomografia confocal; todos visavam compreender o desenvolvimento da micro metástase e mudanças no microambiente tumoral (TME) de forma repetível e quantitativa. Demonstramos como fabricar, sementes, imagem e analisar as células cancerígenas e componentes celulares e humorais TME, utilizando essa plataforma. Além disso, mostramos como a inteligência artificial (IA) é usada para identificar as diferenças fenotípicas intrínsecas das células cancerosas que são capazes de transitar através de um modelo μmBBN e atribuir-lhes um índice objetivo de potencial metastático cerebral. Os conjuntos de dados gerados por esse método podem ser utilizados para responder a questões básicas e translacionais sobre metástase, a eficácia das estratégias terapêuticas e o papel do TME em ambos.
Introduction
Metástases cerebrais são as lesões de câncer mais letais; 10-30% de todos os cânceres metástases no cérebro, com uma sobrevida mediana de apenas ~5-20 meses, dependendo do câncer tipo1,2. Uma questão principal que surge ao estudar a metástase do câncer é como sub clones migram do ambiente humorístico da corrente sanguínea para um órgão como o cérebro3,,4. Esta questão levou a muitas variações de ensaios migratórios, de invasão e extravasação. Todos esses métodos compartilham o passo crítico de contagem ou medição de propriedades de células que se movem de um local para outro em resposta a um estímulo. A maioria dos ensaios migratórios prontamente disponíveis são usados para estudar a migração bidimensional (2D) de células cancerígenas. Estes elucidaram uma riqueza de conhecimento; no entanto, eles não recapitulam a natureza tridimensional do sistema in vivo que outros métodos podem fornecer5. Portanto, é necessário estudar o microambiente tumoral (TME) em sistemas tridimensionais (3D), mas as abordagens de análise disponíveis para estruturas 3D são limitadas e muitas vezes inconsistentes.
Uma das ferramentas 3D mais populares é uma câmara de Boyden que consiste em uma membrana suspensa no fundo de um poço, separando duas regiões distintas. Boyden introduziu o ensaio para estudar leucócito chemotaxis4. As regiões inferiores podem ser variadas por química ou outras médias6,7 para induzir células na região superior a migrar para a região inferior. A abordagem mais comum para quantificar o número de células que migraram é liberar as células da parte inferior da membrana usando uma solução tampão, lise-las e, em seguida, contá-las com base na quantidade de conteúdo de DNA na solução7. Essa abordagem indireta é propensa a erros do operador devido à variabilidade técnica e o procedimento destrói informações sobre o fenótipo do câncer e o microambiental. As variações do ensaio da câmara de Boyden envolvem a fixação de células migratórias que permanecem na membrana, mas apenas fornece uma contagem de células que não são mais viáveis para o estudo continuado6,,8,9.
Devido às limitações da câmara de Boyden e ao crescimento das inovações na comunidade microfluidica, foram desenvolvidos chips de ensaio migratório que observam o movimento das células em resposta a um estímulo em uma direção em vez de três10,,11,12. Esses ensaios migratórios facilitam o controle sobre fatores como fluxo ou separação celular única13,14 que permitem melhor interpretação dos resultados; no entanto, seu formato 2D inevitavelmente perde algumas informações dinâmicas. Estudos recentes têm focado na extravasão (ou seja, o movimento das células de circulação para um tecido, como a barreira cerebral do sangue) em um ambiente 3D14,15. A distância de extravasação no tecido e no comportamento de sondagem que ocorre na barreira/membrana celular é mais refinada do que as medidas obtidas usando a câmara de Boyden ou um dispositivo de migração microfluida 2D16. Assim, dispositivos que permitem imagens adequadas e análise de extravasação 3D são fundamentais para capturar essas medidas sofisticadas, mas faltam na literatura.
Independente dos ensaios migratórios, técnicas robustas de imagem foram desenvolvidas para ressonância magnética (RM) e tomografia que são capazes de identificar e reconstruir com precisão tecido no espaço 3D17,18. Essas técnicas adquirem imagens em pilhas de z e segmentos da imagem com base nas propriedades do tecido e, em seguida, convertem as imagens segmentadas em malhas tridimensionais19,,20,,21. Isso permite que os médicos visualizem em órgãos, ossos e vasos individuais em 3D para auxiliar no planejamento cirúrgico ou auxiliar no diagnóstico de câncer ou doença cardíaca22,23. Aqui, mostraremos que essas abordagens podem ser adaptadas para uso em espécimes microscópicos e dispositivos de extravasação 3D.
Para isso, desenvolvemos a inovadora técnica de tomografia confocal, aqui apresentada, que proporciona flexibilidade para estudar a extravasão das células tumorais através de uma membrana, adaptando ferramentas de tomografia existentes. Essa abordagem permite o estudo de toda a gama de comportamentos de células cancerosas à medida que interagem com uma barreira celular, como uma camada celular endotelial. Células cancerígenas apresentam comportamentos de sondagem; alguns podem invadir, mas permanecem perto da membrana, enquanto outros atravessam a barreira prontamente. Esta técnica é capaz de produzir informações sobre o fenótipo da célula em todas as dimensões24. Usar essa abordagem para estudar o TME é relativamente barato, fácil de interpretar e reprodutível, quando comparado com modelos in vivo murine mais complexos. A metodologia apresentada deve fornecer uma base forte para o estudo de muitos tipos de tumores e microambi ambientes, adaptando a região estromal.
Descrevemos e demonstramos o uso de uma plataforma 3D microfluidicaFigure 1do cérebro do sangue (μmBBN) onde elementos críticos da barreira e do nicho (células endoteliais microvasculares cerebrais e astrócitos) podem ser cultivados por um período prolongado (aproximadamente até 9 dias), fluorescentemente imagens por microscopia confocal, e as imagens reconstruídas usando nossa técnica de tomografia confoccal (Figura 2); todos visavam compreender o desenvolvimento da micro metástase e mudanças no microambiente tumoral de forma repetível e quantitativa. A interface da barreira cerebral sanguínea com o nicho cerebral é composta de células endoteliais microvasculares cerebrais que são reforçadas por membrana do porão, pés de astrócito e pericitos25. Nós nos concentramos seletivamente nos componentes astrócitos e endoteliais dada a sua importância na formação e regulação da barreira cerebral do sangue. Demonstramos como fabricar, sementes, imagem e analisar as células cancerígenas e componentes celulares e humorísticos do tumor, utilizando essa plataforma. Finalmente, mostramos como o aprendizado de máquina pode ser usado para identificar as diferenças fenotípicas intrínsecas das células cancerosas capazes de transitar através de um modelo μmBBN e atribuir-lhes um índice objetivo de potencial metastático cerebral24. Os conjuntos de dados gerados por este método podem ser usados para responder perguntas básicas e translacionais sobre metástase, estratégias terapêuticas e o papel do TME em ambos.
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Protocol
1. Prepare o molde do nicho da barreira cerebral do sangue
NOTA: O dispositivo de cultivo usado nesta plataforma é um andaime baseado em PDMS que construímos um nicho de barreira cerebral de sangue celular. É feito de duas partes separadas por uma membrana porosa. Para preparar o nicho da barreira cerebral sanguínea são necessários dois moldes SU-8 feitos com fotolitografia26,27. O protocolo será descrito para o molde de 100 μm de espessura primeiro e, em seguida, as notas serão dadas para o molde de 200 μm de espessura.
- Para preparar o molde, limpe um wafer de silício de 4" usando acetona com uma garrafa de espremer e depois seque-o com uma arma de nitrogênio.
- Asse o wafer de silício em uma placa de aquecimento por 10 minutos a 200 °C para remover todo o solvente residual.
- Por sua vez, centrale o wafer de silício sobre o mandril de um reveste de giro e dispense 1 mL de SU8-2075 para o molde superior. Gire para 5 s a 500 rpm (aceleração 300 rpm/s) para dispersar o fotoresist e depois 30 s a 2200 rpm (aceleração 300 rpm/s) para obter um revestimento SU-8 de 100 μm de espessura. A otimização pode ser necessária para alcançar a espessura especificada.
- Leve a assada a bolacha em uma placa quente a 65 °C por 2 min e depois imediatamente a 98 °C por 20 min.
- Coloque o wafer em uma lâmpada fotolitografia e posicione a máscara centrada no wafer de acordo com os procedimentos padrão. Exponha os wafers revestidos SU-8 com um brilho de 230 mJ/cm2 de UVB (360 nm ± 10 nm). Um experimento de matriz de exposição pode ser realizado para determinar a dosagem ideal. Os desenhos da máscara estão disponíveis no Arquivo Suplementar 1.
- Realize um cozimento pós-exposição a 65 °C por 2 min e, em seguida, imediatamente a 98 °C por 10 min para melhorar a adesão. Esfrie o wafer a 50 °C.
- Remova a resistência não exposta usando o desenvolvedor de fotos SU-8. Enxágüe o wafer no desenvolvedor por 5 minutos em um banho e, em seguida, use uma garrafa de spray cheia com desenvolvedor SU-8 em um capô químico para agitar e remover SU-8 restante. Um microscópio 4x pode ser usado para observar se todo o SU-8 nãocurado foi removido. Uma linha branca nas bordas das características fotoresististas indica que o SU-8 não foi totalmente removido.
- Faça um último cozimento duro em um forno a 110 °C por 60 min.
- Siga o mesmo procedimento para o molde de 200 μm de espessura usando o SU-8 2075, mas ajuste o protocolo para o seguinte:
- Ajuste do revestimento girador: Gire por 5 s a 500 rpm (aceleração 300 rpm/s) para dispersar o fotoresist e depois 30 s a 1300 RPM (aceleração 300 rpm/s) para obter um revestimento de 200 μm de espessura.
- Leve ao forno a 65 °C por 2 min, depois a 98 °C por 40 min.
- Tempo de exposição de 340 mJ/cm2.
- Pós-exposição ao forno: 2 min a 65 °C e depois 98 °C por 15 min.
- Finalmente, silanize cada wafer colocando-os em uma câmara de vácuo dentro de um capô químico com um recipiente plástico no qual foram colocadas 3 gotas (~150 μL) de solução de silanização (Silane octill de trichloro perfluoro) foram colocadas. Puxe um vácuo e deixe durante a noite para permitir que o vapor cubra o wafer. Esta etapa reduz a adesão entre o SU-8 e o PDMS, aumentando a vida útil do molde.
ATENÇÃO: O silano de silano de tricloro perfluoroctyl deve ser sempre manuseado no capô da fumaça e mantido longe das fontes de água. - Coloque moldes individuais de wafer em placas de Petri de 150 mm usando duas tiras de fita dupla face. Certifique-se de que os wafers são planos. Uma alternativa é fabricar um molde de alumínio dentro do qual o wafer pode ser colocado. Como o molde de alumínio é fechado, ele produzirá moldes com uma espessura uniforme, enquanto o método da placa de Petri é sensível à inclinação da superfície é colocado. O achatamento melhorado dos moldes PDMS reduz o tempo de imagem confocal a jusante.
2. Forme e monte o dispositivo de barreira cerebral sanguínea PDMS (BBB)
- Misture 75 g de PDMS a uma proporção de 1:10 (Crosslinker:Base) em peso em um copo de plástico.
- Despeje o PDMS sobre os moldes (1 mm de espessura para o molde de 200 μm de espessura e 4 mm para o molde de 100 μm de espessura) e degas em um desiccador de vácuo por uma hora ou até que todas as bolhas tenham sido removidas. Coloque em forno de 65 °C durante a noite. A espessura de 1 mm pode ser ajustada com base na distância de trabalho do objetivo de 10x no microscópio confocal.
- Depois que o PDMS tiver curado use uma lâmina para cortar suavemente contra o wafer através do PDMS ao redor das bordas. Retire o PDMS e use uma lâmina para cortar ao longo das guias retangulares e um soco de biópsia de 1,5 mm para abrir as entradas e tomadas do dispositivo. Cubra as peças do dispositivo PDMS com fita adesiva de 48 mm de largura para mantê-la limpa de poeira e detritos.
- Em seguida, use uma tesoura de dissecção para cortar um retângulo de 5 mm x 50 mm de membrana de policarbonato com poros de 5 μm e armazená-lo dentro de uma placa de Petri para uso posterior.
- Junte o seguinte: 200 μL de ponta de pipeta, 2 mL de 1:10 PDMS misturado com tolueno em uma proporção de 2:3 em peso em um frasco de vidro, uma pipeta Pasteur com uma lâmpada de aperto, as partes superiores e inferiores PDMS preparadas, a membrana, três lâminas de vidro de 50 mm x 75 mm e transportar tudo para um revestimento de spiner. As seguintes etapas para montagem e semeadura celular do dispositivo são retratadas na Figura 1.
- Use a pipeta Pasteur para transferir 1 mL de solução de cola PDMS:toluene em uma lâmina de vidro de 50 mm x 75 mm no mandril do revestimento de giro. Gire por 5 segundos a 100 rpm (aceleração 300 rpm/s) e 30 segundos a 2000 rpm (aceleração de 300 rpm/s).
- Coloque o slide sobre uma mesa e cubra-o com uma câmara superior PDMS e uma câmara inferior para que o PDMS fique com características moldadas para entrar em contato com o slide e a cola seja transferida para a face PDMS, delineando o perímetro de todas as características.
- Vire a câmara superior do PDMS para outro slide com o revestimento de cola voltado para cima e coloque cuidadosamente a membrana através do dispositivo entre as entradas e as tomadas. Coloque a ponta de 200 μL na solução de cola PDMS:toluene até que tenha um pouco perverso na ponta. Toque na ponta entre cada entrada e saída para colocar uma pequena gota perto da borda da membrana onde entra em contato com o PDMS.
- Remova a outra metade do dispositivo e coloque-a com o revestimento da cola para baixo enquanto alinha as entradas e tomadas nas duas partes.
- Coloque o dispositivo montado em um forno a 37 °C durante a noite para curar a cola. Transfira para um pote de sino de vácuo com dessecante e deixe desidratar por dois dias. Este é um passo crucial para permitir que o Tolueno evapore e melhorar a consistência da semeadura do dispositivo regulando o vapor de água absorvido no ar de laboratório.
3. Semente o microambi ambiente cerebral no dispositivo
- Cultura celular e reagentes: Antes de iniciar este protocolo, obtenha os seguintes reagentes e células. Cultivar todas as linhas celulares em uma incubadora fixada a 37 °C em 5% de CO2.
- Manter as células de células de câncer de mama triplo-negativos humanos MDA-MB-231 (ATCC HTB-26) e MDA-MB-231-BR-GFP (obtidas de Patricia Steeg, PhD) em DMEM com 4,5 g/L de glicose, suplementada com 2 mM L-glutamina, 10% FBS e 1x antibiótico-antimycotic. Crie células fluorescentes MDA-MB-231-GFP transduzindo célulaS MDA-MB-231 com lentivírus pLL-EV-GFP vazio. Classifique a população transduzida de GFP+ usando a triagem celular ativada por fluorescência (FACS) antes da experimentação.
- Manter as células endoteliais microvasculares do cérebro humano hCMEC/D3 em meio EGM-2. Crie células fluorescentes hCMEC/D3-DsRed transduzindo hCMEC/D3 com lentivírus de vetor vazio pLL-3.7-dsRed. Remova todas as células não transduzidas e não fluorescentes da cultura usando FACS antes do uso experimental.
- Manter osstrócitos humanos normais (NHA) em DMEM suplementados com 4,5 g/L de glicose, 10% FBS, 2 mM Glutamax, 1 mM piruvato de sódio, 1x suplemento de crescimento N-2 e 1x antibiótico-antimíctico. Imortalize os astrócitos transdundo o vetor lentiviral pLOX-TERT-IResTK (Addgene 12245). Crie o vetor usando psPAX2 plasmídeo plasmídeo plasmídeo pMD2.G (Addgene 12260 e 12259).
- Remova um dispositivo μmBBN do desiccador de vácuo e coloque em uma superfície de metal ou papel (ou seja, fita) com as entradas viradas para baixo e coloque-o em uma câmara de plasma. Coloque também um deslizamento de vidro de 50 mm x 75 mm na câmara de plasma. Puxe um vácuo e depois trate com plasma a 80 W por 30 s.
- Remova rapidamente o slide de vidro e o dispositivo da câmara de plasma e coloque o dispositivo com as entradas voltadas para o escorregador de vidro alinhados usando um guia(Arquivo Suplementar 2). Isso criará um vínculo permanente entre o PDMS e o slide de vidro e não pode ser re-posicionado.
- Em seguida, corte as pontas de 16, 200 pontas de pipeta μL, 2 mm da ponta. Insira as pontas da pipeta em todas as entradas e tomadas. O dispositivo pode ser colocado de volta no desiccador de vácuo neste momento se não estiver pronto para semear as células.
- Coloque o dispositivo de volta na câmara de plasma e trate com plasma por 8 min a 200 W. Depois que o dispositivo tiver resfriado (5 minutos) do tratamento de plasma colocá-lo dentro de um recipiente secundário estéril, como uma caixa de ponta de pipeta transparente. Realize o próximo passo dentro de ~15 min ou a eficácia do tratamento plasmático pode ser reduzida levando ao entupimento.
- Vários dias antes da cultura de experimentos, placas de Petri de 1 x 106 células endoteliais (hCMEC/D3-DsRed) e 1 x 106 astrócitos (NHA). Enquanto o dispositivo está passando pelo tratamento de plasma de 8 min, prepare uma solução de colágeno composta por 0,5 mL de 3 mg/mL PureCol tipo I colágeno bovino com 64 μL de 0,8 M NaHCO3 e 20 μL de 10x de alta glicose (250 mM) MEM. Suspenda 5,0 x 105 células NHA na solução de colágeno. Mantenha a solução no gelo enquanto não estiver em uso.
- Transfira 120 μL da solução de colágeno/astrócito/microglia para o dispositivo através da ponta da pipeta para a câmara inferior(Figura 1 Setas vermelhas). Deixe a solução atravessar a câmara na ponta oposta da pipeta. Depois de todos os quatro canais do dispositivo terem sido preenchidos coloque o chip na incubadora de CO2 a 37 °C e 5% de CO2 por 1h ou até que o colágeno esteja definido.
- Após os conjuntos de colágeno, encha todas as pontas de pipeta alimentando a câmara inferior com uma mistura de mídia completa. Para chips contendo células endoteliais e astrócitos, é utilizada uma mistura de mídia endotelial:astrócito.
- Cubra a câmara superior com 2% de fator de crescimento reduzido Matrigel em mídia endotelial completa usando a ponta de pipeta de câmara superior(Figura 1 Setas azuis) e coloque na incubadora por 1 hora.
- Enxágüe a câmara superior com a mistura de mídia indicada e alternou qual dica é semeada com células endoteliais(Figura 1 Flechas Verdes). Suspenda 1 x 106 células endoteliais em 1 mL de mídia endotelial e sementes 30 μL a cada 15 minutos em pontas alternadas de câmara superior para cobertura uniforme. Células endoteliais de sementes em cada ponta de câmara superior duas vezes, para um total de 4 vezes por câmara.
- Após a semeadura final das células endoteliais, preencha todas as dicas com a mistura de mídia e coloque o dispositivo na incubadora a 37 °C e 5% de CO2,trocando de mídia em ambas as câmaras a cada 12 h.
4. Monitore a progressão da formação da camada endotelial
- A cobertura completa do canal pela camada endotelial é observada após 3 dias. Use um dos dois métodos para monitorar a cobertura da barreira endotelial: Fluorescência ou TEER. a fluorescência hCMEC/D3-DsRed e de acordo com % de cobertura em toda a área do canal podem ser quantificadas usando ImageJ.
- Abra o arquivo TIFF no representante ImageJ da barreira hCMEC/D3-DsRed. No software ImageJ, clique em Arquivo > Abra para selecionar o arquivo.
- Mescle todas as camadas Z da imagem usando a intensidade máxima seguindo esses comandos e opções principais: Imagem > Stacks > Z project > Todas as fatias Z, intensidade máxima.
- Realize um limiar de cor que seja o mesmo em todos os chips microfluidos avaliados usando este método. Para o estudo apresentado, empregamos um limite de 450. Use o menu limiar no ImageJ em: Imagem > Ajuste > Limiar.
- Definir as medições a serem registradas usando os seguintes comandos e opções: Analisar > Definir Medidas > Limite ao limiar, Fração de Área.
- Selecione uma região representativa do canal microfluido para medir desenhando uma caixa. A ferramenta caixa está localizada no menu principal do ImageJ. Medir 3 réplicas técnicas posicionadas no início, meio e extremidade de cada canal microfluido usando o mesmo tamanho da caixa.
- Analise cada canal e regise a fração da área, representando a % cobertura endotelial. Exporte essas medidas como arquivos de planilha para traçar e visualizar os dados usando os seguintes comandos: Analisar > Medir.
- Como alternativa, use o TEER baseado em espectroscopia impedance para medir junções apertadas endoteliais por área. A quantificação da barreira endotelial usando TEER é um proxy para a integridade da camada endotelial como uma barreira.
- Posicione dois eletrodos na entrada e saída das câmaras superior e inferior.
- Quantifique a impedância da monocamada endotelial como uma combinação das resistências, induções e capacitâncias no chip de acordo com um modelo proposto por Srinivasan et al.28,29.
5. Células cancerígenas de sementes no dispositivo
- Depois que a camada endotelial amadureceu, células cancerígenas de sementes entram no dispositivo. Prepare uma solução de 1 mL de 1 x 106 células cancerígenas em mídia celular totalmente cancerosa.
- Troque a mídia no chip para repor nutrientes da cultura celular.
- Semente cada canal de câmara superior com 30 μL de células cancerosas em suspensão e, em seguida, coloque o dispositivo de volta na incubadora por um 15 min. Sempre semeou as células cancerígenas do mesmo lado de todos os quatro canais de câmara superior dentro de um único dispositivo.
- Troque o dispositivo com novas mídias e o refil as pontas a cada 12 horas até que o dispositivo seja imageado por comportamento metastático.
6. Imagem do microambi ambiente tumoral por imagem confocal
- No ponto de tempo experimental desejado (1, 2 ou 9 dias), use imagens confocal para capturar uma imagem 3D do canal. Nós executamos esta etapa em um Nikon A1 usando as configurações descritas aqui. Esta etapa é automatizada, e cada canal requer 20-40 minutos para imagem, dependendo de quantos canais fluorescentes estão incluídos e da profundidade Z necessária para cobrir as posições de todas as células.
- Ligue o microscópio, abra o software e coloque a tampa da incubadora no microscópio.
- Coloque o aquecedor do estágio do microscópio em 37 °C e COde 2 a 5% se disponível.
- Depois que a incubadora do microscópio se estabilizar, coloque o dispositivo no estágio do microscópio usando a montagem de 50 mm x 75 mm.
- Concentre-se em um lado do dispositivo (à esquerda se for usado com o software de análise fornecido) com um objetivo de 10x e definir a altura Z como zero. Em configurações de pilha z, inclua uma faixa de 100 μm acima e 200 μm abaixo do plano de foco. Em seguida, use a configuração de costura para definir o número de campos X e Y para 1 e 9, respectivamente, com 15% de sobreposição. Coloque o orifício ao mínimo recomendado e a altura da camada z a 9 μm. Ajuste a exposição do campo brilhante para que a membrana porosa seja visível. Ligue os lasers de excitação para os canais dsRed (561 nm) e GFP (488 nm) e ajuste os poderes e cortes do laser fluorescente para que cada canal seja visível sem expor excessivamente os pixels.
- Verifique se todos os campos estão em foco quando forem ultrapassados. Se assim for, digite um nome de arquivo de saída (001.nd2) para a imagem e inicie o experimento para capturar automaticamente a imagem confocal 3D.
7. Meça o microambi ambiente tumoral através da tomografia confocal
- Use a tomografia confocal uma abordagem para estimar um conjunto de métricas e medidas que descrevem as células individuais e o microambiental tumoral dentro do dispositivo. A análise tomográfica confocal (Figura 2) converte uma pilha z confocal em uma representação tridimensional das células. Usando um script python personalizado dentro do ambiente de laboratório/caderno Jupyter, um plano é então compatível com a camada de células que formam a barreira cerebral sanguínea como a membrana30. Por fim, faça medições fenotípicas das populações de células cancerosas(Tabela 1).
- Realize esta análise no final de um experimento ou ao longo de um curso de tempo. Instale python e as bibliotecas apropriadas de acordo com o guia de software referenciado e abra o software do Windows Command Prompt executando o comando "conda activate", seguido de "jupyter lab". O ambiente Jupyter será carregado dentro do navegador padrão.
- Do explorador de arquivos Jupyter clique duas vezes no notebook Jupyter "contom.ipynb" para abri-lo. Execute o celular abaixo do título Importe bibliotecas, classes/funções personalizadas e configure o notebook clicando no celular do notebook e, em seguida, clicando no botão de reprodução. Todas as células do notebook abaixo são executadas usando a mesma abordagem. Note que aqui o notebook "cell" refere-se a um bloco de código python dentro do notebook Jupyter.
- Prepare os dados. Este algoritmo usa o kit de ferramentas de visualização (VTK) para manipular e exibir a pilha z e dados tridimensionais17.
- Coloque o fornecido. Arquivo XLSX ("Experiment Tracker.xlsx") na mesma pasta do windows do notebook Jupyter. O arquivo rastreia experimentos e interfaces com o notebook Jupyter. Coloque o arquivo ND2 da seção 6 em uma subpasta chamada "\Experiment_XXX\Confocal\" abaixo do local do notebook Jupyter. Pastas de experimento adicionais podem ser adicionadas dentro ajustando o "XXX" ao ID numérico atribuído a novas pastas.
- Rotule a primeira pasta de experimento "Experiment_001" e o arquivo ND2 "001.nd2". Primeiro, converta o arquivo de imagem ND2 em um arquivo TIFF de várias imagens costurado separado por canal de cores. Faça isso executando a célula do caderno abaixo do título "Leia a pilha z confocal na memória" com a função Save_tiff_from_ND2 () semcomentários 30. O arquivo ND2 é um formato de imagem proprietário da Nikon, portanto é necessário convertê-lo para um formato com o que o software de código aberto é compatível.
NOTA: O TIFF (Tag Image File Format) é usado porque é onipresente, compatível com 16 bits, facilmente importado em VTK, e várias imagens podem ser armazenadas em um único arquivo, o que é apropriado para imagens de pilha de z. A execução da célula do notebook lerá em uma imagem do arquivo ND2, extrairá informações da cor e das posições XYZ e armazenará essa imagem em uma matriz numpy de acordo com uma estrutura pré-determinada. Em seguida, salvará a matriz como um arquivo TIFF usando o arquivo da biblioteca python.
- Converter dados de imagem em modelo 3D
- Importe o arquivo TIFF em VTK (vtkTIFFReader) usando uma renderização 3D para visualizar as células(Figura 2). Selecione um limiar com base na cor das células na imagem. Para esclarecer, o objeto VTK representa um bloco de pixels (X, Y, Z) no espaço (volume), mas apenas certos pixels (verde ou vermelho) representam células, o resto são de fundo ou ruído (preto).
- Portanto, defina um filtro de opacidade no volume que remove o fundo confirmar que o que permanece fluorescência são apenas as células. Faça isso usando a célula do notebook Jupyter intitulada, Altere os valores de opacidade para cada canal de microscópio ajustando as variáveis de valor Channel_alpha (ou seja, GFP_alpha). Visualize o efeito usando a célula do notebook intitulada Exibir uma renderização 3D para verificar se o limiar está definido corretamente.
- Salve os valores de opacidade na planilha para usar na próxima etapa. Converta os dados de volume em objetos 3D individuais, cada um representando uma célula na imagem usando uma técnica chamada cubos de marcha31. Este algoritmo extrai uma malha poligonal de uma isosuperfície de campos escalares tridimensionais discretos de voxels.
- Use o valor da opacidade no algoritmo de cubos marchando para separar cada célula do fundo. Complete esta etapa para todas as células fluorescentes identificadas em cada canal de microscópio executando Converter imagem voxel em uma malha triangular e salvar como um arquivo VTK no notebook.
- Encaixar um plano na membrana
- Encaixe um plano na barreira endotelial localizando primeiro os centroides celulares (célula de caderno: Analise o canal RFP (barreira endotelial).). Iterar através da lista de malhas no volume e extrair as regiões que não estão conectadas usando um PolyDataConnectivityFilter de VTK. Calcule o centroid de cada malha e adicione a medição a uma lista de centrosids filtrando para malhas muito grandes ou muito pequenas (<50, >1000000 voxels).
- Coloque um plano na lista de centroides para as células endoteliais usando um método de minimização de erro (célula de caderno: Coloque um plano nos centrosids RFP (barreira endotelial)( Figura2, Figura 3)32. Inspecione o ajuste do avião plotando o plano e os centrosids e ajuste manualmente se necessário (usando, beta e z) executando a célula do notebook intitulada Visualize RFP centroids e plane fit.
- Depois que o avião estiver devidamente instalado, salve o normal do avião para o Arquivo rastreador de experimentos . Arquivo XLSX para uso futuro.
- Analisar as características descritivas das células cancerígenas individuais para os seguintes descritores(Tabela 1).
NOTA: Se o computador que realiza a análise estiver atrasado, a análise de alto rendimento através da computação de alto desempenho é uma opção. Este algoritmo é útil em laptops padrão para a análise de um pequeno número de células, no entanto, o VTK não é adequado para um grande número de objetos individuais (>1000). Portanto, é opcional usar o algoritmo adaptado para funcionar em um cluster de computação de alto desempenho. Isso permite a análise rápida de experimentos com muitas células(Figura 2). Todos os 7.5 são realizados executando as células do notebook intituladas Analisar os canais de microscópio restantes para descritores fenotípicos e Ler no Experiment_tracker informações e analisar os canais existentes.- Medir a extravasão das células cancerosas: Depois de caracterizar a camada endotelial com um plano, meça o volume de cada célula cancerígena que migrou através da membrana. Corte cada célula (Boolean) para que a malha abaixo da membrana seja mantida e a porção acima da membrana seja removida33. Em seguida, feche a malha aberta (vtkFillHoles).
- Recalcular o normal e o novo centroid da malha cortada. Meça o volume e a posição de cada célula cancerígena cortada para análise. O volume equivale ao número de voxels que a malha preenche de cada célula. Calcule a distância entre o plano endotelial e a posição de cada célula cancerosa.
- Meça o fenótipo celular: Calcule a morfologia de cada célula cancerosa fatorando sua forma, volume e posição.
- Medir a extravasão das células cancerosas: Depois de caracterizar a camada endotelial com um plano, meça o volume de cada célula cancerígena que migrou através da membrana. Corte cada célula (Boolean) para que a malha abaixo da membrana seja mantida e a porção acima da membrana seja removida33. Em seguida, feche a malha aberta (vtkFillHoles).
- Valide as medidas e economize em uma planilha ou parcela. Execute a célula do notebook intitulada Verificar se os centroides foram medidos com precisão e uma renderização aparecerá mostrando os centroides identificados em cima do volume de imagem por tipo de célula. Depois de todos os experimentos serem feitos exportar o conjunto completo de dados como um único arquivo de planilha digitando os experimentos a serem incluídos pelo ID na célula de notebook intitulada Export the data como um único Data.XLSX arquivo para os experimentos variáveis substituindo os IDs de experimentos determinados. Se verificar o conjunto de dados concluído, plote-o usando o celular de notebook intitulado Distância extravasada plot de tira. O enredo aparecerá no ambiente do notebook e salvará para arquivar.
8. Analisar as características relacionadas utilizando Inteligência Artificial
NOTA: Identifique recursos fenotípicos metastáticos usando algoritmos de inteligência artificial.
- Realize a classificação binária usando laranja de acordo com o esquema mostrado na Figura 5 e Arquivo Suplementar 3. Inicie o Orange a partir de um segundo Prompt de comando do Windows digitando "conda activate" seguido de "python -m Orange.canvas" e clique em Novo a partir do prompt. Orange é um software baseado em arrastar e soltar, então organize as funções arrastando cada item do menu esquerdo para a tela para combinar arquivo suplementar 3. Depois disso, clique duas vezes no ícone Arquivo e selecione o arquivo Data.XLSX.
- Filtre os dados para remover medições ruins, definidas como aquelas que falharam em uma operação booleana ou dando valores variáveis paramétricas fora dos limites conhecidos usando o ícone "Selecionar linhas". Clique duas vezes no ícone e defina condições que correspondem ao filtro, como "A esferofilidade está entre 0 e 1". Crie condições para 8.2.1, 8.2.2 e 8.2.3.
- As medidas extravasadas de distância do filtro variam de -100-200 μm.
- Filtrar as medidas de esférico da forma celular para variar de 0-1.
- Filtrar as medidas de volume de células cancerígenas para variar de 0-2000 voxels.
- Use todas as variáveis paramétricas (Tabela 1) para classificar o cérebro-metastático MDA-MB-231-BR-GFP e mda-mb-mb-231-GFP não-cerebral. Clique duas vezes em Selecionar colunas da tela. Usando o botão > para mover variáveis disponíveis em recursos, variáveis de destinoou atributos meta. A única variável que deve ser uma Variável Alvo é um rótulo metastático que define se as células do conjunto de dados são consideradas metastáticas (1) ou não (0). As variáveis de experimento podem ser colocadas na seção Meta Atributos.
- Prove os dados em um treinamento (80%) e conjunto de testes (20%). Clique duas vezes no ícone data sampler e selecione um tipo de amostragem de proporção fixa de dados: defina para 80% e selecione caixas de seleção replicáveis e estratificam. Estratifique e valide o conjunto de treinamento usando 10 dobras contra cada modelo/classificador. Clique duas vezes em Teste e Pontuação e selecione Validação cruzada com número de dobras: definido para 10 e Estratificado verificado. Definir a classe alvo para 1.
- Neste método, use redes neurais e algoritmos de aprendizagem da Floresta Aleatória, pois eles são robustos aos dados. Dentro do ícone Floresta Aleatória, escolha o número de árvores para ter 50 anos e não selecione outras opções. Dentro do ícone da Rede Neural escolha Neurônios por leito ocultor: 100, Ativação: ReLu, Solver: Adam, Alfa: 0,0001e Iterações Máximas: 200. No entanto, essas configurações variam significativamente de acordo com o estudo e devem ser bem compreendidas antes da aplicação.
- Depois de configurar a tela, clique duas vezes em cada ícone de Arquivo para Dados de Amostra e clique em Aplicar ou Enviar Dados. Clique duas vezes em Teste e Pontuação e os dados de treinamento começarão a ser usados para desenvolver um modelo usando os algoritmos. Depois de treinar o modelo de aprendizado de máquina, reassine teste e pontuação e selecione Teste em Dados de Teste e feche a janela pop-up para marcar o desempenho do modelo classificando as células no chip de acordo com a probabilidade de serem metastáticas cerebrais de 0 a 1.
- Salve o desempenho do modelo de aprendizado de máquina em um arquivo(Tabela 2). Inclua a área sob a curva (AUC) do ROC, a precisão e a pontuação da F1. Salve um segundo arquivo que contenha os índices metastáticos individuais e as probabilidades de classificação. Clique duas vezes no ícone Salvar e clique em Salvar Como escrever para registrar as probabilidades de classificação. Da mesma forma, a curva ROC pode ser visualizada clicando duas vezes no ícone ROC Analysis e o desempenho do modelo pode ser calculado clicando duas vezes no ícone Confusion Matrix.
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Representative Results
Utilizando essa técnica, analisamos tipos de células rotuladas com diferentes proteínas fluorescentes ou corantes. Demonstramos o uso desta abordagem com um chip μmBBN formulado com astrócitos hCMEC/D3-DsRed e não fluorescentes. As células endoteliais microvasculares cerebrais foram semeadas em uma membrana porosa (poros gravados por 5 μm de pista) e colocadas em uma incubadora34 a 37 °C sob 5% de CO2. Após três dias, a confluência da camada endotelial foi confirmada via microscopia e, em seguida, células cancerígenas foram colocadas em cima da camada endotelial. Duas linhas de células cancerígenas de mama, um clone de busca cerebral chamado MDA-MB-231-BR-GFP, e células parentais MDA-MB-231-GFP foram entradas no chip μmBBN contendo um nicho cerebral astrócito35,,36,,37,,38,,39,,40,,41. Os chips μmBBN foram imagedos em 1, 2 e 9 dias usando um microscópio confocal com 3 canais (dsRed, GFP e Brightfield) usando um objetivo de 10x, com fatias Z a cada 9 μm e 1x9 XY para cobrir toda a área da membrana. Este microscópio manteve uma temperatura de 37 °C durante o processo de imagem para minimizar o estresse nas células.
Uma imagem representativa de um chip μmBBN completo (Figura 3A) e cobertura endotelial(Figura 3B-D) é mostrada. Barreiras endoteliais com alta e baixa cobertura são quantificadas para verificar se os chips μmBBN são adequados para a adição de células cancerígenas(Figura 3B). Imagens representativas de um chip μmBBN com uma barreira endotelial confluente aceitável para experimentação (Figura 3C) e um chip μmBBN com cobertura endotelial especialmente ruim que não é adequada para a adição de células cancerosas são fornecidas(Figura 3D). A cultura de longo prazo das células endoteliais pode resultar em uma cobertura que se estende além da membrana que separa as câmaras de chip μmBBN superior e inferior. As células endoteliais geralmente crescem tanto em cima quanto diretamente sob a membrana, o que não afeta o movimento das células cancerígenas no espaço do nicho cerebral, mas pode dificultar a adaptação do plano. Devido à variabilidade da fabricação do chip μmBBN e à cobertura endotelial da membrana, os planos representativos se encaixam em uma barreira endotelial plana normal(Figura 3E),e uma membrana curva atípica é exibida para referência(Figura 3F). Secar o dispositivo em um forno a uma temperatura acima de 40 °C pode causar uma membrana curva, como mostrado.
Observamos diferenças fenotípicas da linha celular MDA-MB-231-BR-GFP e parental MDA-MB-231-GFP ao encontrar μmBBN astrócito que foram quantificadas utilizando a análise tomográfica confocal desenvolvida. Os 4 descritores fenotípicos usados para entrada no algoritmo de aprendizagem de máquina(Tabela 1) são exibidos na Figura 4.
A distância extravasada representa a distância em μm entre a barreira endotelial e cada posição celular cancerígena no chip μmBBN(Figura 4A). A barreira endotelial está localizada a 0 μm. As distâncias <0 μm representam células cancerígenas que permaneceram na câmara de fluxo. Distâncias >0 μm indicam células cancerígenas que extravasaram através da barreira endotelial e entraram no espaço do nicho cerebral. Após 1 dia de exposição ao μmBBN, ambos MDA-MB-231-BR-GFP e MDA-MB-231-GFP foram posicionados dentro da barreira endotelial. No entanto, após 2 e 9 dias de interação, um subconjunto das células MDA-MB-231-BR-GFP migraram >100 μm para o nicho cerebral astrócito, enquanto as células MDA-MB-231-GFP parentais permaneceram próximas à barreira endotelial. Resolvemos as posições das células cancerígenas na interface de nicho endotelial/nicho cerebral calculando o volume de cada célula cancerígena que passou pela barreira endotelial. A porcentagem resultante representa células cancerígenas extravasadas em volume(Figura 4B). Um volume de 0% extravasado por células indica células cancerígenas que permanecem no topo da barreira endotelial, variando a 100% quando uma célula cancerígena tem completamente extravasado através da barreira endotelial e reside no espaço do nicho cerebral. As células MDA-MB-231-GFP dos pais interagem inicialmente com a barreira endotelial após 1 dia de exposição ao chip μmBBN que foram <50% extravasados em volume. Aos 2, e 9 dias, as células MDA-MB-231-GFP mantêm uma proporção substancial de células que permaneceram no topo da barreira longe do espaço do nicho cerebral. As células MDA-MB-231-BR-GFP mantiveram uma proporção de células que foram >100% extravasadas, especialmente no ponto de tempo de 2 dias.
A forma das células cancerígenas mudou drasticamente durante a duração da exposição ao μmBBN. Imagens representativas das células cancerígenas em cada ponto de tempo são retratadas na Figura 4C. A quantificação morfológica da forma celular cancerígena foi calculada utilizando-se a esficidade, que explica o volume celular e a área da superfície(Figura 4D). A métrica de esférica varia de 0-1, com 1 representando uma esfera perfeita. Ambas as células MDA-MB-231-BR-GFP e MDA-MB-231-GFP foram altamente esféricas após um dia de semeadura no chip μmBBN. Após 2 e 9 dias de interação no chip μmBBN, ambas as linhas de células cancerígenas tendem a diminuir sua forma esférica, embora em taxas diferentes. Além da forma celular cancerígena, o volume em voxels de cada célula cancerosa também é quantificado usando a análise tomográfica confocal. Cada linha de células cancerígenas foi estratificada em dois grupos na Figura 4E-F: "out", representando as células cancerígenas que transitaram pela barreira endotelial (>90% extravasada através da barreira) e "in", a população de células que interagem com a barreira endotelial, mas não extravasam (<90% extravasadas). As subpopulações de células cancerígenas que extravasam no nicho astrócito eram menores em tamanho em comparação com as células cancerígenas que permaneceram em interação com a barreira endotelial, mas não extravasam totalmente através do cérebro.
O MDA-MB-231-BR-GFP revelou um padrão fenotípico nos chips μmBBN distintos dos MDA-MB-231-GFP parentais que podem ser explorados para diferenciar entre células cancerígenas metastáticas cerebrais e não-cerebrais usando aprendizado de máquina. Os dados foram divididos aleatoriamente em conjuntos de dados de treinamento e validação para treinar o modelo e realizar testes de validação. Para treinar o modelo, foram utilizadas 38.859 células após a filtragem dos dados e o modelo foi testado contra 9.714 células individuais. O modelo treinado foi aplicado às linhas de células cancerígenas e células cancerígenas geradas pelo PDX que foram analisadas em chips astróciticos μmBBN (4 isolados de metástases cerebrais de pacientes de uma variedade de tipos de tumores primários, e 1 tumor primário de câncer de mama) para gerar um índice de probabilidade metastática cerebral(Figura 5). Oito métodos diferentes de classificação de aprendizagem de máquina foram testados: baías ingênuas, floresta aleatória, árvore de decisão, k-vizinho mais próximo(kNN), descida de gradiente estocástico, rede neural e Adaboost. O resultado de cada método é mostrado na Tabela 2. A rede neural e a Adaboost foram os 2 métodos de classificação de melhor desempenho que são recomendados para uso com dados gerados utilizando a plataforma μmBBN com um AUC de 0,920 e 0,928, respectivamente. Além disso, apresentaram uma precisão de 0,833 e 0,853. A média de precisão e recall (F1) para a rede Neural e os métodos Adaboost foram de 0,847 e 0,860. A partir de trabalhos anteriores, onde aplicamos essa abordagem a amostras de PDX de tumor de mama não metastático e amostras metastáticas conhecidas (mama, pulmão, ovário, língua) descobrimos que a mesma abordagem aplicada às amostras de PDX permitiu a identificação precisa das células metastáticas das não metastáticas. A Tabela 2 mostra os resultados de cada algoritmo de aprendizagem de máquina aplicado aos dados PDX em que os mesmos métodos se mostraram os mais robustos (rede neural e Adaboost (Random Forest). Das 143 células utilizadas no conjunto de testes para as amostras de PDX, 71 eram não metastáticas, 46 eram de mama metastática, 11 eram de língua metastática, 13 tinham pulmão metastático e 2 tinham ovário metastático. Cada tipo de célula produziu uma precisão geral de 0,88, mas o indivíduo tinha as seguintes precisãos aproximadas: mama não metastática: 0,96, mama metastática: 0,80, língua metastática: 0,80, pulmão metastático: 0,92, ovário metastático: 1,0
Figura 1: Fluxo de trabalho experimental. (A) Representação esquemática do processo de montagem do dispositivo microfluido. Um spinner é usado para depositar uma fina película de PDMS:cola de tolueno em um slide de vidro de 50 mm x 75 mm. Cada metade do dispositivo μmBBN é carimbado lado do canal voltado para a cola e, em seguida, montado com uma membrana de policarbonato (poros de 5 μm) entre as partes do dispositivo μmBBN. Os dispositivos μmBBN são colocados em um forno de 37 °C por 24 h para curar a cola. Os dispositivos são então secos em um desiccator a vácuo por pelo menos 48 h antes do uso experimental. Um dispositivo μmBBN e uma lâmina de vidro de 50 mm x 75 mm são ativados com um tratamento de plasma e unidos. As pipetas P200 padrão cortadas nas pontas são inseridas em todas as entradas e tomadas do dispositivo μmBBN. O dispositivo μmBBN concluído é então esterilizado por um tratamento de plasma de 8 min (200 W) e depois transferido para um recipiente secundário estéril. (B) Visão geral esquemática da utilização do andaime do dispositivo microfluido para criar uma barreira cerebral de sangue celular e microambientre de nicho cerebral. Dentro de um armário de biossegurança, uma mistura de astrócitos em colágeno são semeados na câmara inferior do dispositivo μmBBN e permitidos solidificar por 1 h a 37 °C. Matrigel é usado para revestir a membrana através da câmara de fluxo superior por 1 h a 37 °C. Em seguida, as células endoteliais são semeadas em uma ponta da câmara superior e permitidas a fluir e se contentar com 15 min. Esta semeadura é repetida x4, alternando lados da câmara de fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visão geral da análise tomográfica confocal. O software começa convertendo uma imagem microscópica de pilha Z-stack confocal em um modelo 3D das células usando segmentação e malhas 3D. O programa então calcula a posição central de cada célula (centroide) e se encaixa em um plano à barreira endotelial. As medidas fenotípicas de cada célula são então tabuladas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Cobertura da barreira endotelial e encaixe do avião. (A) Esquema representativo e imagem de um dispositivo μmBBN. A linha branca tracejada dentro do esquema de visão superior indica a área do dispositivo representada na visão transversal. (B) Comparação da alta e baixa cobertura endotelial de dispositivos μmBBN antes da aplicação de células cancerosas. Welch duas amostras t-test, *** p < 0.1* 10-4. (C) Imagem representativa da alta cobertura endotelial. A caixa branca tracejada dentro do esquema de entrada de um dispositivo μmBBN indica a localização das células endoteliais dentro do dispositivo. Barras de escala de imagens de visão geral e de início = 200 μm. (D) Imagem representativa de baixa cobertura endotelial. Barras de escala de imagens de visão geral e de entrada = 200 μm. (E) Exemplo de ajuste de plano de uma barreira endotelial plana. O retângulo verde representa a posição do plano endotelial. Os pontos representam células endoteliais únicas que compõem a barreira. Pontos amarelos são células endoteliais acima do plano, e pontos roxos são células que caem abaixo do plano. Células endoteliais acima do plano (pontos amarelos) apresentam uma tendência a crescer as paredes laterais e a parte superior do dispositivo para formar um tubo. (F) Exemplo de ajuste de plano de um dispositivo μmBBN com um plano curvo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Quantificação de fenótipos celulares de fenótipos cerebrais-metastáticos e células parentais em chips microfluídicos de nicho cerebral astrócito. (A) Descasque de distância em μm de células cancerígenas da barreira endotelial em 1, 2 e 9 dias. A linha preta tracejada a 0 μm representa a barreira endotelial. As caixas vermelhas indicam um subconjunto de células MDA-MB-231-BR-GFP que migraram para longe para o nicho cerebral. (B) Lote de violino do volume total de células cancerígenas extravasadas através da barreira endotelial em 1, 2 e 9 dias. Linhas tracejadas representam quartis, linha mais longa e tracejada representa a média. (C) Imagens representativas da morfologia das células cancerosas no dispositivo μmBBN. Barra de escala = 25 μm. (D) Gráfico de violino da esficidade das células cancerosas no dispositivo μmBBN em 1, 2 e 9 dias. A esférica varia de 1: esférica a 0: não esférica. (E) Gráfico de caixa de volume de células MDA-MB-231-GFP no dispositivo μmBBN em voxels para células que descansam fora da barreira endotelial (fora) e células que extravasaram através da barreira (in). (F) Gráfico de caixa de volume de células MDA-MB-231-BR-GFP no dispositivo μmBBN em voxels para células que descansam fora da barreira endotelial (fora) e células que extravasaram através da barreira (in). A caixa exibe os quartis e bigodes estendidos para mostrar a proporção da faixa interquartil além dos quartis baixos e altos. Pairwise Wilcoxon Rank Sum e Kruskal-Wallis com as múltiplas comparações de Dunn, *** p < 0.1*10-4. Reproduzido a partir da referência24 com permissão da Sociedade Real de Química. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Resultados representativos da classificação de aprendizagem de máquina das células cancerosas. (A) Visão geral do aprendizado de máquina. Demonstra processo de divisão de dados coletados da tomografia confocal, filtrando os dados, treinando o algoritmo de aprendizagem de máquina usando validação 10 vezes e, em seguida, testando o modelo contra uma amostra aleatória de 20% dos dados que foram reservados. O modelo selecionado pode então ser aplicado em novos dados para coletar o índice metastático de células individuais. (B) Curvas ROC mostrando o desempenho de 8 algoritmos de aprendizagem de máquina diferentes para a cultura de células MDA-231-BR-GFP e MDA-231-GFP por 1, 2 e 9 dias antes da imagem. Este é o representante do tipo de curva a ser analisada para entender o desempenho do modelo treinado. (C) Curvas ROC para 8 diferentes algoritmos de aprendizagem de máquina aplicadas às células dissociadas do xenerto derivado do paciente (PDX) cultivadas por 2 dias. Este é o representante do tipo de curva a ser analisada para entender o desempenho do modelo treinado. Reproduzido a partir da referência24 com permissão da Sociedade Real de Química. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Recurso | Descritor |
| Célula tumoral | % extravasado no nicho |
| Célula tumoral | Volume |
| Célula tumoral | Esfericidade |
| Célula tumoral | Distância extravasada |
| Célula tumoral | Migração 2D de células vivas |
| Micro-metástase | Porosidade |
| Micro-metástase | Interação estrobomal |
| Micro-metástase | Idade |
| Micro-metástase | Taxa de crescimento |
| Célula estromal | Volume |
| Célula estromal | Distância das células cancerígenas próximas |
| Célula estromal | Distância da barreira endotelial |
| Célula estromal | Forma |
Tabela 1: Lista de descritores por tipo de recurso. A caracterização fenotípica das células tumorais é representada usando um painel de descritores. A caixa vermelha indica os descritores que foram usados para prever a probabilidade metastática cerebral através do aprendizado de máquina.
| Células cancerígenas | |||
| Método | Auc | Precisão | F1 |
| Rede Neural | 0.925 | 0.84 | 0.847 |
| AdaBoost | 0.928 | 0.853 | 0.86 |
| Floresta Aleatória | 0.925 | 0.849 | 0.855 |
| Árvore de Decisão | 0.898 | 0.817 | 0.827 |
| kNN | 0.775 | 0.702 | 0.718 |
| Regressão Logística | 0.769 | 0.735 | 0.751 |
| Baias ingênuas | 0.745 | 0.715 | 0.73 |
| Sgd | 0.73 | 0.73 | 0.737 |
| Células cancerígenas PDX | |||
| Método | Auc | Ca | F1 |
| Rede Neural | 0.972 | 0.881 | 0.878 |
| Floresta Aleatória | 0.964 | 0.888 | 0.887 |
| AdaBoost | 0.957 | 0.881 | 0.879 |
| Árvore | 0.954 | 0.867 | 0.865 |
| Regressão Logística | 0.897 | 0.832 | 0.831 |
| Baias ingênuas | 0.896 | 0.846 | 0.849 |
| kNN | 0.882 | 0.818 | 0.814 |
| Sgd | 0.861 | 0.86 | 0.853 |
Tabela 2: Comparação de métodos de aprendizagem de máquina para classificar células cancerígenas e células cancerígenas PDX por potencial metastático cerebral.
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Discussion
Desenvolvemos e apresentamos um novo método que adapta ferramentas frequentemente utilizadas em análises de imagem clínica para medição de extravasação e migração de células cancerígenas através de uma barreira endotelial no tecido cerebral. Nós colocamos essa abordagem pode ser útil tanto para medições in vivo quanto in vitro; demonstramos seu uso em um sistema microfluido 3D recapitulando vasculatura cerebral. As medidas de células cancerígenas, incluindo distância extravasada, percentual extravasado por volume, esfericidade e volume são quantificadas usando essa técnica. A distância extravasada e por cento extravasada por volume permitem ao usuário reconstruir a posição das células cancerígenas dentro do chip para avaliar a extravasão através da barreira e migração dentro do tecido. Medidas de forma celular, como esficidade e volume, estão relacionadas aos movimentos dinâmicos ou função da célula em cada ponto de tempo. As células MDA-MB-231-BR-GFP migratórias apresentam um alto nível de esficidade quando inicialmente introduzidas no dispositivo μmBBN e se tornam menos esféricas em forma à medida que diminuem seu movimento e começam a colonizar o nicho. O volume total de células do MDA-MB-231-GFP e MDA-MB-231-BR-GFP difere devido à diferença de forma das linhas celulares. As células cancerígenas que cruzam a barreira endotelial são mais arredondadas do que as células que não atravessam a barreira, assim, células redondas menores podem ser capazes de extravasar através da camada endotelial de forma mais eficiente.
Existem dois passos críticos dentro do protocolo que facilitam o sucesso. O primeiro ocorre durante a montagem das partes superior e inferior do dispositivo μmBBN que são separadas pela membrana porosa. As partes superior e inferior do dispositivo devem ser acasaladas para que as entradas e saídas se sobreponham, mas não sejam ocluídas pela membrana entre elas para promover o fluxo adequado. Todos os dispositivos μmBBN com acasalamento ruim das partes superior e inferior do dispositivo ou alinhamento da membrana são descartados para minimizar flutuações de qualidade. Posterior cozimento para curar o PDMS:cola de tolueno para montar o dispositivo é fundamental para realizar a 37 °C para produzir dispositivos μmBBN com membranas planas. Temperaturas de cozimento que excedem 37 °C tendem a produzir dispositivos com uma membrana curva que dificulta a análise da imagem, especialmente quando se encaixa um plano na barreira endotelial. O segundo passo crítico acontece durante a semeadura da barreira endotelial. As sementes devem ocorrer em intervalos mínimos de quinze minutos entre as duas entradas que alimentam a parte superior do dispositivo para garantir a distribuição aleatória das células endoteliais na membrana do dispositivo. A semeadura da mistura de colágeno contendo astrócitos no chip pode exigir solução de problemas e modificação do protocolo específico do laboratório. Se a superfície da membrana do dispositivo não for hidrofóbica, o colágeno encherá tanto as partes inferiores quanto superiores do dispositivo e definirá para que ele obstrua todo o fluxo através da parte superior do dispositivo. O objetivo do tratamento final do gás plasmológico é tornar a superfície do dispositivo hidrofóbica. Neste caso, recomendamos o ajuste do tratamento do gás plasmásico do dispositivo para aumentar a hidroofobidade.
Observamos algumas limitações com essa abordagem. Por exemplo, a abordagem usada para induzir fluorescência celular pode impactar a qualidade da imagem. Ao usar corantes de rastreamento de células vivas, o padrão fluorescente é feito de pequenas manchas, enquanto a expressão transfecida ou transduzida de fluoroforos produz um padrão uniforme. O padrão irregular requer agrupamento adicional e, às vezes, propenso a erros de pixels. Além disso, a sensibilidade da medida depende do cuidado tomado durante a imagem. Imagens de maior resolução e mais fatias z melhora a resolução, mas também leva mais tempo para imagem e análise. Células que estão tocando também podem ser analisadas incorretamente como uma grande célula única. Este é um problema para muitos sistemas automatizados de imagem, mas pode ser resolvido de duas maneiras. A primeira é que a camada endotelial tem muitas células tocando, mas sua combinação tem impacto insignificante na localização final do plano de corte. A segunda é que o número de células cancerígenas é baixo o suficiente para que seja raro que elas estejam tocando. Erros introduzidos ao encaixar o avião podem ocorrer por várias razões. A primeira é que algumas células endoteliais podem ter migrado para longe da membrana central durante a cultura celular. Isso pode resultar em células endoteliais cobrindo todo o canal ou invadindo o espaço cheio de colágeno, distorcendo assim a medição. Outra fonte de erro é, paradoxalmente, o ajuste manual do plano para corrigir o erro anterior. No entanto, estudos de repetibilidade e reprodutibilidade descobriram que isso tem impacto mínimo. Finalmente, observamos que sob certas circunstâncias o corte booleano da malha celular pode falhar ou o algoritmo para fechar a malha de corte também pode falhar. As técnicas utilizadas aqui são o atual "estado da arte", e esses problemas estão sendo abordados por cientistas algorítmicos.
Os resultados do treinamento dos algoritmos de aprendizagem de máquina (IA) contra dados coletados pela tomografia confocal da μmBBN demonstram que o número considerável de células individuais analisadas por essa abordagem pode ajudar a resolver questões de captura de heterogeneidade encontradas em células cancerosas. Um AUC maior que 0,9 é considerado um classificador de alto desempenho. Aqui demonstramos um AUC de 0,928. Esperamos que, à medida que o método seja melhorado, o desempenho continuará a aumentar. Como em todos os métodos de IA, deve-se tomar cuidado para selecionar cuidadosamente o conjunto de dados de treinamento para que ele represente amplamente o tipo de dados esperados a serem testados. Por essa razão, podemos esperar que o desempenho se degrade, se o modelo fosse aplicado diretamente às amostras dos pacientes, por exemplo, sem antes expor o modelo a uma robusta coleta de amostras de pacientes. Demonstramos isso aqui, em certa medida, incluindo medições de 1 dia, 2 dias e 9 dias para as células cancerígenas no modelo em comparação com o dia de 2 dias utilizado para o trabalho anterior. Observa-se que a amostragem ampla reduz ligeiramente o desempenho do modelo e mostra o quão sensíveis alguns dos métodos de pior desempenho podem ser, sugerindo assim que os usuários podem querer testar vários modelos em seus dados. Tabela 2 descrevendo os resultados do PDX mostra um bom desempenho geral. No entanto, os tipos individuais de PDX demonstram que a proporção de células medidas de cada amostra difere e pode influenciar o desempenho de cada local de origem. Por exemplo, a amostra ovariana produziu apenas duas células para o conjunto de testes. Em contraste, o câncer de mama metastático que tinha uma população maior. Esse conjunto de dados tinha como objetivo demonstrar que as células sobrevivem no nicho e podem ser analisadas, mas também destaca que é necessário cuidado interpretativo. Alterações na variável alvo também podem orientar os pesquisadores na identificação de sub clones com outros traços, como interações com células estrômicas ou comportamento quiescente.
Essa abordagem é importante à medida que mais laboratórios adotam sistemas de membrana on-a-chip, como barreira cerebral sanguínea em um chip, pulmão em um chip e intestino em um chip11,42. A maioria desses chips são montados de modo que a membrana esteja paralela ao sistema de imagem, o que até agora significa que seria difícil medir quando e quantas células se deslocaram de um lado da membrana para o outro15,28. Além disso, quando comparados com chips horizontalmente orientados, os chips verticalmente orientados fornecem uma área de membrana muito maior aumentando o alcance dinâmico do experimento. Além disso, como a orientação da membrana não é fundamental para essa técnica de análise, a tomografia confocal poderia potencialmente permitir novos experimentos in vitro. Por exemplo, a imagem da extravasação das células cancerígenas de mama da almofada de gordura murina para a corrente sanguínea seria acessível por esses métodos. Isso poderia ajudar os pesquisadores a identificar como as células cancerígenas sondam a interface entre o ECM de mama e o vaso.
Em conclusão, apresentamos uma metodologia para construir um dispositivo microfluido 3D que recapitula o nicho cerebral do sangue e demonstrar como usar tomografia confocal e aprendizado de máquina para análise. Usando esta plataforma, identificamos características de células cancerígenas cérebro-metastáticas que diferenciam entre células cancerígenas de PDX metastáticas cerebrais e não metastáticas com base em seu comportamento dentro do dispositivo μmBBN. O trabalho futuro melhorará a aplicabilidade clínica desta plataforma como um diagnóstico para prever metástases cerebrais. Acreditamos que ter apresentado esta plataforma será útil e interessante para laboratórios que precisam medir células de qualquer tipo migrando ou extravasando através de uma membrana. Isso é importante à medida que os modelos pré-clínicos do microambiental tumoral se tornam cada vez mais sofisticados, por isso deve a engenharia dos modelos e software de suporte. Para auxiliar na análise robusta dos dados, embalamos esta ferramenta como um simples de usar, o notebook python compartilhado com instruções de instalação30.
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Disclosures
Não há revelações para declarar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Laboratório Steeg, do Instituto Nacional de Câncer, pela generosa doação de células MDA-MB-231-BR-GFP. A microscopia confocal foi realizada no Instituto de Biointerfaces da Universidade de Michigan (BI). A citometria de fluxo foi realizada no Núcleo de Citometria de Fluxo da Universidade de Michigan. Vetores virais foram criados pelo Núcleo vetorial da Universidade de Michigan. Agradecemos também a Kelley Kidwell pela orientação na análise estatística desses dados.
Financiamento:
A C.R.O. foi parcialmente apoiada por uma Bolsa de Treinamento NIH T-32 (T32CA009676) e 1R21CA245597-01. T.M.W. foi parcialmente apoiado pelo 1R21CA245597-01 e pelo Centro Nacional de Promoção de Ciências Translacionais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Prêmio Número UL1TR002240. O financiamento para materiais e caracterização foi fornecido pelo Instituto Nacional de Câncer dos Institutos Nacionais de Saúde sob o prêmio nº 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, Fundação METAvivor e Fundação de Pesquisa do Câncer de Mama. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 1.5 mm biopsy punch with plunger | Integra LifeSciences Corporation | 33-31A-P/25 | |
| 10x MEM | Thermo Fisher Scientific | 11430030 | |
| 150 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 1x DPBS, without Ca and Mg | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| 200uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| 4 inch silicon wafer | University Wafer | 452 | |
| 48 mm wide packing tape | Fisher Scientific | 19-072-097 | |
| 50 x 75 mm glass slide | Fisher Scientific | 12-550C | |
| A1 confocal microscope | Nikon | ||
| acetone | Fisher Scientific | A9-20 | |
| antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin) | Gibco | 15240062 | |
| box cutter blade | Fisher Scientific | NC1721575 | |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| DMEM with 4.5 g/L glucose | Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| double sided tape | Fisher Scientific | NC0879005 | |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat inactivated | Corning | MT35011CV | |
| Fiji software | ImageJ | ||
| glass vial | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| hCMEC/D3 | EMD Millipore | SCC066 | |
| Jupyter notebook | Anaconda | ||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Matrigel - growth factor reduced with phenol red | Corning | CB-40230A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MDA-MB-231-BR-GFP | Dr. Patricia Steeg, NIH | ||
| N-2 growth supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| normal human astrocytes (NHA) | Lonza | CC-2565 | |
| Orange software | University of Ljubljana | ||
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Photolithography masks | Photosciences Incorporated | ||
| pLL3.7-dsRed | University of Michigan Vector Core | ||
| pLL-EV-GFP | University of Michigan Vector Core | ||
| pLOX-TERT-iresTK | Addgene | 12245 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polycarbonate membrane, 5um pore size | Millipore | TMTP04700 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| PureCol, 3 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5005 | Type I bovine collagen |
| sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | 25080094 | |
| sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Solo cup | Fisher Scientific | NC1416545 | |
| SU-8 2075 | MicroChem Corporation | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 developer | MicroChem Corporation | Y020100 4000L1PE | |
| Sylgard 184 | Ellsworth Adhesive Company | NC0162601 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 179965-1L | |
| Tricholoro perfluoro octyl silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G |
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