Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Kvantifisere hjernen metastatisk tumor mikro-miljø ved hjelp av en organ-on-a chip 3D modell, maskinlæring, og konfokal tomografi

Published: August 16, 2020 doi: 10.3791/61654
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 2,3,4, 1,2
1Department of Internal Medicine, University of Michigan Ann Arbor, 2Rogel Cancer Center, University of Michigan Ann Arbor, 3Department of Neurosurgery, University of Michigan Ann Arbor, 4Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan Ann Arbor
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å forberede og kultivere en blod hjernebarriere metastatisk tumor mikro-miljø og deretter kvantifisere sin tilstand ved hjelp av konfokal avbildning og kunstig intelligens (maskinlæring).

Abstract

Hjernemetastaser er de mest dødelige kreftlesjonene; 10-30% av alle kreftformer metastaserer til hjernen, med en median overlevelse på bare ~ 5-20 måneder, avhengig av krefttypen. For å redusere hjernens metastatiske tumorbyrde må hull i grunnleggende og translasjonell kunnskap tas opp. Store utfordringer inkluderer en mangel på reproduserbare prekliniske modeller og tilhørende verktøy. Tredimensjonale modeller av hjernemetastase kan gi de relevante molekylære og fenotypiske dataene som brukes til å møte disse behovene når de kombineres med dedikerte analyseverktøy. Videre, sammenlignet med murine modeller, organ-on-a-chip modeller av pasient tumorceller traversering blod hjernebarrieren inn i hjernen mikromiljø generere resultater raskt og er mer tolkes med kvantitative metoder, og dermed mottagelig for høy gjennomstrømning testing. Her beskriver og demonstrerer vi bruken av en ny 3D mikrofluidisk blod hjerne nisje (μmBBN) plattform hvor flere elementer av nisje kan dyrkes i en lengre periode (flere dager), fluorescerende avbildet av konfokal mikroskopi, og bildene rekonstruert ved hjelp av en innovativ konfokaltomografi teknikk; alle hadde som mål å forstå utviklingen av mikrometastase og endringer i tumormikromiljøet (TME) på en repeterbar og kvantitativ måte. Vi demonstrerer hvordan vi kan dikte, frø, bilde og analysere kreftcellene og TME cellulære og humorale komponenter, ved hjelp av denne plattformen. Videre viser vi hvordan kunstig intelligens (AI) brukes til å identifisere de iboende fenotypiske forskjellene i kreftceller som er i stand til transitt gjennom en modell μmBBN og for å tildele dem en objektiv indeks av hjernenmetastatisk potensial. Datasettene som genereres av denne metoden, kan brukes til å svare på grunnleggende og translasjonelle spørsmål om metastase, effekten av terapeutiske strategier og TME-ens rolle i begge.

Introduction

Hjernemetastaser er de mest dødelige kreftlesjonene; 10-30% av alle kreftformer metastaserer til hjernen, med en median overlevelse på bare ~ 5-20 måneder, avhengig av kreft type1,2. Et hovedspørsmål som oppstår når man studerer kreftmetastase er hvordan subkloner migrerer fra blodets humorale miljø til et organ som hjernen3,4. Dette spørsmålet har ført til mange variasjoner av migrasjon, invasjon og ekstravasasjonsanalyser. Alle disse metodene deler det kritiske trinnet for å telle eller måle egenskaper for celler som beveger seg fra ett sted til et annet som svar på en stimulans. De fleste migrasjonsanalyser som er lett tilgjengelige, brukes til å studere todimensjonal (2D) migrering av kreftceller. Disse har belyst et vell av kunnskap; Imidlertid rekafulerer de ikke den tredimensjonale naturen til in vivo-systemet som andre metoder kan gi5. Derfor er det nødvendig å studere tumormikromiljøet (TME) i tredimensjonale (3D) systemer, men analysetilnærmingene som er tilgjengelige for 3D-strukturer er begrensede og ofte inkonsekvente.

Et av de mest populære 3D-verktøyene er et Boyden-kammer som består av en membran suspendert på bunnen av en brønn, som skiller to forskjellige regioner. Boyden introduserte analysen for å studere leukocytt chemotaxis4. De nederste områdene kan varieres av kjemi eller andremidler 6,7 for å indusere celler i det øvre området for å migrere til det nedre området. Den vanligste tilnærmingen til å kvantifisere antall celler som har migrert er å frigjøre cellene fra bunnen av membranen ved hjelp av en bufferløsning, lyse dem, og deretter telle dem basert på mengden DNA-innhold i løsningen7. Denne indirekte tilnærmingen er utsatt for operatørfeil på grunn av teknikkvariabilitet, og prosedyren ødelegger informasjon om kreftfenotypen og mikromiljøet. Variasjoner av Boyden kammeranalyse innebærer fiksering av trekkceller som forblir på membranen, men gir bare et antall celler som ikke lenger er levedyktige for fortsatt studie6,8,9.

På grunn av begrensninger av Boyden kammeret og veksten av innovasjoner i mikrofluidisk samfunnet, migrasjon analyse chips har blitt utviklet som observerer bevegelsen av celler som svar på en stimulans i en retning i stedet fortre 10,11,12. Disse overføringsanalysene legger til rette for kontroll over faktorer som flyt eller enkeltcelleseparasjon13,14 som muliggjør bedre tolkning av resultatene; Imidlertid mister deres 2D-format uunngåelig noe dynamisk informasjon. Nyere studier har fokusert på ekstravasasjon (det vil vil vil at bevegelsen av celler fra sirkulasjon til et vev, for eksempel blodhjernebarrieren) i et 3D-miljø14,15. Den ekstravasasjonsavstanden i vev og sonderingsatferd som oppstår ved cellulær barriere/membran er mer raffinert enn målinger som er hentet ved hjelp av enten Boyden-kammeret eller en 2D mikrofluidisk migrasjonsenhet16. Dermed er enheter som muliggjør passende bildebehandling og analyse av 3D-ekstravasasjon avgjørende for å fange opp disse sofistikerte målingene, men mangler i litteraturen.

Uavhengig av migrasjonsanalyser er robuste bildeteknikker utviklet for magnetisk resonansavbildning (MR) og tomografi som er i stand til å identifisere og nøyaktig rekonstruere vev i 3D-rom17,,18. Disse teknikkene skaffe bilder i z-stabler og segment deler av bildet basert på egenskapene til vevet og deretter konvertere segmenterte bilder til tredimensjonale masker19,,20,,21. Dette gjør det mulig for leger å visualisere i 3D individuelle organer, bein og fartøy for å hjelpe til med kirurgisk planlegging eller hjelp til diagnostisering av kreft eller hjertesykdom22,23. Her vil vi vise at disse tilnærmingene kan tilpasses for bruk på mikroskopiske prøver og 3D-ekstravasasjonsenheter.

For dette formål utviklet vi den innovative confocal tomografiteknikken, presentert her, som gir fleksibilitet til å studere ekstravasasjon av tumorceller over en membran ved å tilpasse eksisterende tomografiverktøy. Denne tilnærmingen gjør det mulig å studere hele spekteret av kreftcelleatferd når de samhandler med en cellulær barriere, for eksempel et endotelcellelag. Kreftceller viser sondering atferd; noen kan invadere, men forbli nær membranen, mens andre krysser barrieren lett. Denne teknikken er i stand til å gi informasjon om fenotypen av cellen i alle dimensjoner24. Ved hjelp av denne tilnærmingen til å studere TME er både relativt billig, lett å tolke og reproduserbar, sammenlignet med mer komplekse in vivo murine modeller. Den presenterte metodikken bør gi et sterkt grunnlag for studiet av mange typer svulster og mikromiljøer ved å tilpasse stromalregionen.

Vi beskriver og demonstrerer bruken av en 3D mikrofluidisk blod hjerne nisje (μmBBN) plattform (Figur 1) hvor kritiske elementer av barrieren og nisje (hjernen mikrovaskulære endotelceller og astrocytter) kan dyrkes i en lengre periode (ca. 9 dager), fluorescerende avbildet av konfokal mikroskopi, og bildene rekonstruert ved hjelp av vår confocal tomografi teknikk (Figur 2); alle hadde som mål å forstå utviklingen av mikrometastase og endringer i tumormikromiljøet på en repeterbar og kvantitativ måte. Blod hjernebarrieren grensesnitt med hjernen nisje består av hjernen mikrovaskulære endotelceller som er styrket av kjellermembran, astrocytt føtter, og pericytes25. Vi fokuserte selektivt på astrocytten og endotelkomponentene gitt deres betydning i dannelsen og reguleringen av blodhjernebarrieren. Vi demonstrerer hvordan vi kan fremstille, frø, bilde og analysere kreftceller og tumor mikro-miljø cellulære og humorale komponenter, ved hjelp av denne plattformen. Til slutt viser vi hvordan maskinlæring kan brukes til å identifisere de iboende fenotypiske forskjellene i kreftceller som er i stand til transitt gjennom en modell μmBBN og å tildele dem en objektiv indeks av hjernens metastatiskepotensial 24. Datasettene som genereres av denne metoden, kan brukes til å svare på grunnleggende og translasjonelle spørsmål om metastase, terapeutiske strategier og TME-rollen i begge.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forbered blod hjernebarrieren nisje mold

MERK: Den kulterende enheten som brukes i denne plattformen er et PDMS-basert stillas som vi bygger en cellulær blodhjernebarriere nisje på. Den er laget av to deler adskilt av en porøs membran. For å forberede blod hjernebarrieren nisje to SU-8 former laget ved hjelp av fotolitografi er nødvendig26,27. Protokollen vil bli beskrevet for 100 μm tykk form først og deretter notater vil bli gitt for 200 μm tykk mugg.

  1. For å forberede formen, rengjør en 4 "silisiumwafer ved hjelp av aceton med en klemmeflaske og tørk den deretter med en nitrogenpistol.
    1. Stek silisiumwaferen på en kokeplate i 10 min ved 200 °C for å fjerne alt gjenværende oppløsningsvæske.
    2. I sin tur midt i silisiumwaferen på chucken på en spin coater og dispensere 1 ml SU8-2075 for toppformen. Spinn for 5 s ved 500 o/min (akselerasjon 300 o/min/s) for å spre fotoresisten og deretter 30 s ved 2200 o/min (akselerasjon 300 o/min/s) for å få et 100 μm tykt SU-8-belegg. Optimalisering kan være nødvendig for å oppnå den angitte tykkelsen.
  2. Myk bake wafer på en kokeplate ved 65 °C i 2 min og deretter umiddelbart ved 98 °C i 20 min.
  3. Plasser wafer i en fotolitografilampe og plasser masken sentrert på wafer i henhold til standardprosedyrer. Utsett SU-8-belagte wafers med en utstråling på 230 mJ/cm2 UVB (360 nm ± 10 nm). Et eksponeringsmatriseeksperiment kan utføres for å bestemme den optimale dosen. Maskedesign er tilgjengelige i tilleggsfil 1.
  4. Utfør en bake etter eksponering ved 65 °C i 2 min og deretter umiddelbart ved 98 °C i 10 min for å forbedre vedheftet. Avkjøl waferen til 50 °C.
  5. Fjern den uutsatte motstanden ved hjelp av SU-8 fotoutvikler. Skyll wafer i utvikleren i 5 min i et bad og bruk deretter en sprayflaske fylt med SU-8-utvikler i en kjemisk hette for å røre og fjerne gjenværende usikrede SU-8. Et 4x mikroskop kan brukes til å observere hvis alle usikrede SU-8 er fjernet. En hvit linje på kantene av fotoresistfunksjonene indikerer at SU-8 ikke er fjernet helt.
  6. Utfør en siste hard bake i en ovn ved 110 °C i 60 min.
  7. Følg samme fremgangsmåte for den tykke formen på 200 μm ved hjelp av SU-8 2075, men juster protokollen til følgende:
    1. Spin coater innstillinger: Spinn for 5 s ved 500 rpm (akselerasjon 300 rpm / s) for å spre fotoresisten og deretter 30 s ved 1300 RPM (akselerasjon 300 rpm / s) for å få en 200 μm tykk belegg.
    2. Myk bake ved 65 °C i 2 min deretter ved 98 °C i 40 min.
    3. Eksponeringstid på 340 mJ/cm2.
    4. Etter eksponering bake: 2 min ved 65 °C, og deretter 98 °C i 15 min.
  8. Til slutt, silanize hver wafer ved å plassere dem i et vakuumkammer inne i en kjemisk hette med en plastbeholder der 3 dråper (~ 150 μL) av silanizing løsning (Trichloro perfluoro octyl silane) er plassert. Trekk et vakuum og la over natten for å la dampen belegge wafer. Dette trinnet reduserer vedheft mellom SU-8 og PDMS, noe som øker formens levetid.
    FORSIKTIG: Triklor perfluoroktylsilon bør alltid håndteres i røykhetten og holdes borte fra vannkilder.
  9. Legg individuelle wafer former i 150 mm Petri retter ved hjelp av to strimler av dobbeltsidig tape. Sørg for at wafers er flat. Et alternativ er å fremstille en aluminiumsform der wafer kan plasseres. Fordi aluminiumsformen er vedlagt, vil den produsere kaster med en jevn tykkelse, mens Petri-parabolmetoden er følsom for tilt av overflaten er den plassert på. Den forbedrede flatheten til PDMS-kastene reduserer nedstrøms konfokal bildetid.

2. Form og monter PDMS blodhjernebarrieren (BBB)

  1. Bland 75 g PDMS i forholdet 1:10 (Crosslinker:Base) etter vekt i en plastkopp.
  2. Hell PDMS over formene (1 mm tykk for 200 μm tykk mugg og 4 mm for 100 μm tykk form) og degas i en vakuum desiccator i en time eller til alle boblene er fjernet. Plasser i en 65 °C ovn over natten. Tykkelsen på 1 mm kan justeres basert på arbeidsavstanden til 10x-målet i det konokale mikroskopet.
  3. Etter at PDMS har herdet, bruk et blad til å forsiktig skjære mot wafer gjennom PDMS rundt kantene. Fjern PDMS av og bruk et blad til å skjære langs de rektangulære føringene og en 1,5 mm biopsipunch for å åpne viker og uttak på enheten. Dekk PDMS-enhetsdelene med 48 mm bred pakketape for å holde den ren mot støv og rusk.
  4. Deretter bruker disseksjon saks for å kutte en 5 mm x 50 mm rektangel av polykarbonat membran med 5 μm porer og lagre den inne i en petriskål for senere bruk.
  5. Samle følgende: 200 μL pipettespiss, 2 ml 1:10 PDMS blandet med toluen i forholdet 2:3 etter vekt i et hetteglass med glass, en Pasteurpipette med klemmepære, de tilberedte PDMS øvre og nedre delene, membranen, tre 50 mm x 75 mm glasssklier og transportere alt til et spin-coater. Følgende trinn for montering og cellesåing av enheten er avbildet i figur 1.
  6. Bruk Pasteurpipetten til å overføre 1 ml PDMS:toluenlimoppløsning til et 50 mm x 75 mm glasssklie på chucken på spin-coateren. Spinn i 5 sekunder ved 100 o/min (akselerasjon 300 o/min/s) og 30 sekunder ved 2000 o/min (akselerasjon 300 o/min/s).
  7. Plasser lysbildet på et bord og dekk det med ett PDMS øvre kammer og ett lavere kammer slik at PDMS-ansiktene med funksjoner støpt inn i det, kontakter lysbildet og limet overføres til PDMS-ansiktet, som beskriver omkretsen av alle funksjoner.
  8. Vend PDMS øvre kammer på et annet lysbilde med limbelegget vendt opp og plasser forsiktig membranen over enheten mellom viker og uttak. Plasser 200 μL-spissen i PDMS:toluenlimoppløsningen til den har flettet noen inn i spissen. Berør spissen mellom hvert innløp og uttak for å plassere en liten dråpe nær kanten av membranen der den kommer i kontakt med PDMS.
  9. Fjern den andre halvdelen av enheten og plasser den på med limbelegget ned mens du justerer innløpene og uttakene på de to delene.
  10. Plasser den monterte enheten i en ovn ved 37 °C over natten for å kurere limet. Overfør til en vakuumklokkekrukke med tørkemiddel og la dehydrere i to dager. Dette er et avgjørende skritt for å tillate Toluene å fordampe og forbedre konsistensen av såing enheten ved å regulere absorbert vanndamp i laboratorieluften.

3. Seed hjernen mikro-miljø inn i enheten

  1. Cellekultur og reagenser: Før du begynner denne protokollen, må du få følgende reagenser og celler. Dyrk alle cellelinjer i en inkubator satt til 37 °C i 5% CO2.
    1. Opprettholde human trippel-negativ brystkreft celle linje MDA-MB-231 (ATCC HTB-26) og MDA-MB-231-BR-GFP celler (hentet fra Patricia Steeg, PhD) i DMEM med 4,5 g / L glukose, supplert med 2 mM L-glutamin, 10% FBS og 1x antibiotika-antimykotisk. Lag MDA-MB-231-GFP fluorescerende celler ved å transdusere MDA-MB-231 celle med tom vektor pLL-EV-GFP lentivirus. Sorter den transduserte GFP+ populasjonen ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS) før eksperimentering.
    2. Opprettholde humane hjerne mikrovaskulære endotelceller hCMEC/D3 i EGM-2 medium. Lag hCMEC/D3-DsRed fluorescerende celler ved å transdusere hCMEC/D3 med tom vektor pLL-3.7-dsRed lentivirus. Fjern alle ikke-transduserte, ikke-fluorescerende celler fra kulturen ved hjelp av FACS før eksperimentell bruk.
    3. Opprettholde normale menneskelige astrocytter (NHA) i DMEM supplert med 4,5 g / L glukose, 10% FBS, 2 mM Glutamax, 1 mM natrium pyruvat, 1x N-2 vekst supplement, og 1x antibiotika-antimykotisk. Udødeliggjør astrocytter ved å transdusere pLOX-TERT-iresTK lentiviral vektor (Addgene 12245). Lag vektoren ved hjelp av plasmid psPAX2 og konvolutt plasmid pMD2.G (Addgene 12260 og 12259).
  2. Fjern en μmBBN-enhet fra vakuumdesiccatoren og plasser den på en metall- eller papiroverflate (f.eks. tape) med innløpene vendt ned og sett den inn i et plasmakammer. Plasser også et 50 mm x 75 mm glasssklie inn i plasmakammeret. Trekk et vakuum og deretter behandle med plasma ved 80 W i 30 s.
  3. Fjern glasssklie og enheten raskt fra plasmakammeret og plasser enheten med vidlene vendt opp på glasslysbildet justert ved hjelp av en hjelpelinje (Tilleggsfil 2). Dette vil skape en permanent binding mellom PDMS og glass lysbildet og kan ikke re-posisjoneres.
  4. Klipp deretter avsnuppene 16, 200 μL pipettespisser, 2 mm fra spissen. Sett pipettespissene inn i alle viker og uttak. Enheten kan plasseres tilbake i vakuumdesiccatoren på dette punktet hvis den ikke er klar til å så cellene.
  5. Plasser apparatet tilbake i plasmakammeret og behandle med plasma i 8 min ved 200 W. Etter at enheten er avkjølt (5 min) fra plasmabehandlingen, plasser den inne i en steril sekundær beholder, som en gjennomsiktig pipettespissboks. Utfør neste trinn innen ~15 min eller effektiviteten av plasmabehandlingen kan reduseres fører til tilstopping.
  6. Flere dager før eksperimentkulturen Petri retter av 1 x 106 endotelceller (hCMEC/ D3-DsRed) og 1 x 106 astrocytter (NHA). Mens enheten gjennomgår 8 min plasmabehandling, forberede en kollagen løsning bestående av 0,5 ml av 3 mg / ml PureCol type I storfe kollagen med 64 μL på 0,8 M NaHCO3 og 20 μL av 10x høy glukose (250 mM) MEM. Suspender 5,0 x 105 NHA-celler i kollagenoppløsningen. Vedlikehold løsningen på isen mens den ikke er i bruk.
  7. Overfør 120 μL av kollagen/astrocytten/mikrogliaoppløsningen til enheten gjennom pipettespissen for bunnkammeret (figur 1 Røde piler). La oppløsningen vike over kammeret inn i den motsatte pipettespissen. Etter at alle de fire kanalene på enheten er fylt, plasser brikken i CO 2-inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2 i 1 time eller til kollagen er satt.2
  8. Etter kollagen sett, fyll alle pipette tips fôring bunnkammeret med en blanding av komplette medier. For sjetonger som inneholder endotelceller og astrocytter, brukes en 50:50-blanding av endotel:astrocyttmedier.
  9. Coat det øvre kammeret med 2% vekstfaktor redusert Matrigel i komplett endotelmedier ved hjelp av den øvre kammerpipette spissen (Figur 1 Blå piler) og plasser i inkubatoren i 1 time.
  10. Skyll det øvre kammeret med den angitte medieblandingen og veksler mellom hvilke spisser som er seeded med endotelceller (Figur 1 Grønne piler). Suspender 1 x 106 endotelceller i 1 ml endotelmedier og frø 30 μL hver 15. Seed endotelceller i hver øvre kammerspiss to ganger, totalt 4 ganger per kammer.
  11. Etter den endelige seeding av endotelceller, fyll alle tipsene med medieblandingen og plasser enheten i inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2, endre medier i begge kamrene hver 12.

4. Overvåk progresjonen av endotellagdannelsen

  1. Fullstendig dekning av kanalen ved endotellaget observeres etter 3 dager. Bruk én av to metoder til å overvåke dekningen av endeohelbarrieren: Fluorescens eller TEER. hCMEC/D3-DsRed fluorescens og i henhold til % dekning over kanalområdet kan kvantifiseres ved hjelp av ImageJ.
    1. Åpne TIFF-filen i ImageJ-representanten for hCMEC/D3-DsRed-barrieren. Klikk Fil > Åpne i ImageJ-programvaren for å velge filen.
    2. Slå sammen alle Z-lagene i bildet ved hjelp av maksimal intensitet ved å følge disse tastekommandoene og alternativene: Bilde > Stabler > Z-prosjekt > Alle Z-skiver, Maksimal intensitet.
    3. Utfør en fargeterskel som er den samme på tvers av alle mikrofluidiske chips vurdert ved hjelp av denne metoden. For studien som ble presentert, brukte vi en terskel på 450. Bruk terskelmenyen i ImageJ at: Bilde > Juster > Terskel.
    4. Angi målene som skal registreres ved hjelp av følgende kommandoer og alternativer: Analyser > Angi målinger > Begrens til terskel, Områdefraksjon.
    5. Velg et representativt område for mikrofluidisk kanal for å måle ved å tegne en boks. Boksverktøyet er plassert på hovedmenyen til ImageJ. Mål 3 tekniske replikeringer plassert i begynnelsen, midten og slutten av hver mikrofluidisk kanal ved hjelp av samme boksstørrelse.
    6. Analyser hver kanal og registrer områdefraksjonen, som representerer % endoteldekningen. Eksporter disse målene som regnearkfiler for å tegne inn og visualisere dataene ved hjelp av følgende kommandoer: Analyser > Mål.
  2. Som et alternativ kan du bruke Impedance-spektroskopibasert TEER til å måle endoteltette veikryss per område. Kvantifisering av endeotelbarrieren ved hjelp av TEER er en proxy for integriteten til endeotellaget som en barriere.
    1. Plasser to elektroder i innløpet og utløpet av de øvre og nedre kamrene.
    2. Kvantifisere impedansen av endotelmonolaget som en kombinasjon av motstand, induktorer og kapasitanser i brikken i henhold til en modell foreslått av Srinivasan et al.28,29.

5. Frø kreftceller inn i enheten

  1. Etter endotellaget har modnet, frø kreftceller inn i enheten. Forbered en 1 ml løsning av 1 x 106 kreftceller i komplette kreftcellemedier.
  2. Utveksle media i chip for å fylle celle kultur næringsstoffer.
  3. Seed hver toppkammerkanal med 30 μL av kreftceller i suspensjon og plasser deretter enheten tilbake i inkubatoren i en 15 min. Frø alltid kreftcellene på samme side av alle fire toppkammerkanaler i en enkelt enhet.
  4. Byr enheten med nye medier og fyll på tipsene hver 12.

6. Bilde svulsten mikro-miljø ved konfokal avbildning

  1. På ønsket eksperimentell tidspunkt (1, 2 eller 9 dager) bruker du konfokal bildebehandling til å ta et 3D-bilde av kanalen. Vi utfører dette trinnet på en Nikon A1 ved hjelp av innstillingene som er beskrevet her. Dette trinnet er automatisert, og hver kanal krever 20-40 min til bildet avhengig av hvor mange fluorescerende kanaler som er inkludert og Z-dybden som trengs for å dekke posisjonene til alle cellene.
  2. Slå på mikroskopet, åpne programvaren og plasser inkubatordekselet på mikroskopet.
  3. Sett mikroskopets varmeapparat til 37 °C og CO2 til 5 % hvis tilgjengelig.
  4. Etter at mikroskopinkubatoren har stabilisert seg, plasserer du enheten i mikroskopstadiet ved hjelp av 50 mm x 75 mm-braketten.
  5. Fokuser på den ene siden av enheten (venstre hvis den skal brukes med den medfølgende analyseprogramvaren) med et 10x mål og sett Z-høyden som null. Under z-stack-innstillinger inkluderer du et område på 100 μm over og 200 μm under fokusplanet. Bruk deretter søminnstillingen til å angi antall X- og Y-felt til henholdsvis 1 og 9 med 15 % overlapping. Sett pinhole til anbefalt minimum og z-laghøyden til 9 μm. Juster den lyse felteksponeringen slik at den porøse membranen er synlig. Slå på eksitasjonslasere for dsRed (561 nm) og GFP (488 nm) kanaler og justere fluorescerende laserkrefter og cutoffs slik at hver kanal er synlig uten å overeksponere piksler.
  6. Kontroller at alle feltene er i fokus når de tråkkes over. I så fall skriver du inn et utdatafilnavn (001.nd2) for bildet og starter eksperimentet for å automatisk ta opp 3D-konfokalbildet.

7. Mål tumormikromiljøet via konfokal tomografi

  1. Bruk konfokal tomografi en tilnærming til å estimere et sett med beregninger og målinger som beskriver de enkelte cellene og tumormikromiljøet i enheten. Konfokal tomografisk analyse (figur 2) konverterer en konfokal z-stabel til en tredimensjonal representasjon av cellene. Ved hjelp av et tilpasset python-skript i Jupyter notebook / lab-miljøet, blir et fly deretter matchet med laget av celler som danner blodhjernsbarrieren sommembran 30. Til slutt, gjør fenotypiske målinger av kreftcellepopulasjonene (tabell 1).
    1. Utfør denne analysen på slutten av et eksperiment eller over et tidskurs. Installer python og de riktige bibliotekene i henhold til den refererte programvareguiden, og åpne deretter programvaren fra Windows Command Prompt ved å kjøre kommandoen "conda activate", etterfulgt av "jupyter lab". Jupyter-miljøet lastes inn i standardnettleseren.
    2. Fra Jupyter filutforsker dobbeltklikker du på Jupyter notebook "contom.ipynb" for å åpne den. Kjør cellen under tittelen Importer biblioteker, egendefinerte klasser/funksjoner og konfigurer notatblokken ved å klikke notatblokkcellen og deretter klikke avspillingsknappen. Alle notatblokker nedenfor utføres ved hjelp av samme tilnærming. Legg merke til at her refererer notatboken "celle" til en blokk med python-kode i Jupyter-notatblokken.
  2. Klargjør dataene. Denne algoritmen bruker visualiseringsverktøysettet (VTK) til å manipulere og vise z-stakken og tredimensjonale data17.
    1. Plasser den medfølgende . XLSX fil ("Experiment Tracker.xlsx") i samme windows-mappe som Jupyter notatbok. Filen sporer eksperimenter og grensesnitt med Jupyter notatbok. Plasser ND2-filen fra del 6 i en undermappe kalt "\Experiment_XXX\Confocal\" under plasseringen av Jupyter-notatblokken. Flere eksperimentmapper kan legges til i ved å justere "XXX" til den numeriske ID-en som er tilordnet til nye mapper.
    2. Merk den første eksperimentmappen "Experiment_001" og ND2-filen "001.nd2". Først konverterer du ND2-bildefilen til en sydd TIFF-fil med flere bilder atskilt med fargekanal. Gjør dette ved å kjøre notatblokkcellen under tittelen "Les den confocal z-stakken i minnet" med Save_tiff_from_ND2 () -funksjonen ukomprimert30. Den ND2 fil er et proprietært bildebehandlingsformat fra Nikon, og dermed er det nødvendig å konvertere den til et format som åpen kildekode programvare er kompatibel med.
      MERK: TIFF (Tag Image File Format) brukes fordi den er allestedsnærværende, 16-biters kompatibel, enkelt importert til VTK, og flere bilder kan lagres i en enkelt fil, noe som passer for z-stack-bilder. Utføre notatblokkcellen vil lese i et bilde fra ND2-filen, trekke ut informasjon om farge- og XYZ-stillinger og deretter lagre dette bildet i en numpy matrise i henhold til en forhåndsbestemt struktur. Det vil da lagre matrisen som en TIFF-fil ved hjelp av python-biblioteket tifffile.
  3. Konvertere bildedata til 3D-modell
    1. Importer TIFF-filen til VTK (vtkTIFFReader) ved hjelp av en 3D-gjengivelse for å visualisere cellene (figur 2). Velg en terskel basert på fargen på cellene i bildet. For å klargjøre representerer VTK-objektet en blokk med piksler (X, Y, Z) i mellomrom (volum), men bare visse piksler (grønn eller rød) representerer celler, resten er bakgrunn eller støy (svart).
    2. Derfor angir du et tetthetsfilter på volumet som fjerner bakgrunnen, bekrefter at det som er fluorescens igjen, bare er cellene. Gjør dette ved hjelp av Jupyter notebook-cellen med tittelen Endre tetthetsverdier for hver mikroskopkanal ved å justere Channel_alpha-verdivariablene (det vil GFP_alpha). Visualiser effekten ved hjelp av notatblokkcellen med tittelen Vis en 3D-gjengivelse for å kontrollere at terskelen er riktig angitt.
    3. Lagre tetthetsverdiene i regnearket som skal brukes i neste trinn. Konverter volumdataene til individuelle 3D-objekter, som hver representerer en celle i bildet ved hjelp av en teknikk som kalles marsjerende kuber31. Denne algoritmen trekker ut et polygonalt nett av et isosurface fra tredimensjonale diskrete skalarfelt av voxels.
    4. Bruk tetthetsverdien i algoritmen for marsjerende kuber til å skille hver celle fra bakgrunnen. Fullfør dette trinnet for alle fluorescerende celler identifisert i hver mikroskopkanal ved å kjøre Konverter voxelbilde til et trekantet nett og lagre som en VTK-fil i notatblokken.
  4. Montere et fly til membranen
    1. Monter et fly til endepitelbarrieren ved først å finne celle centroids (notatbokcelle: Analyser RFP-kanalen (endotelbarrieren)). Iterer gjennom listemaskene i volumet og trekker ut områdene som ikke er koblet til ved hjelp av et PolyDataConnectivityFilter fra VTK. Beregn centroid for hvert nett, og legg til målingen i en liste over centroider som filtrerer etter nett som er for store eller for små (<50, >1000000 voxels).
    2. Sett et plan til listen over centroider for endotelcellene ved hjelp av en minimering av feilmetode (notatbokcelle: Monter et plan til RFP centroids (endotelbarrieren)) (figur 2, figur 3)32. Inspiser flyets passform ved å plotte flyet og centroids og juster manuelt om nødvendig (ved hjelp av theta, beta og z) ved å kjøre den bærbare cellen med tittelen Visualiser RFP centroider og planpassform.
    3. Når flyet er riktig montert, lagrer du normalen på flyet til Experiment Tracker File . XLSX-fil for fremtidig bruk.
  5. Analyser de beskrivende egenskapene til individuelle kreftceller for følgende beskrivelser (tabell 1).
    MERK: Hvis datamaskinen som utfører analysen henger, er høy gjennomstrømmingsanalyse via databehandling med høy ytelse et alternativ. Denne algoritmen er nyttig på standard bærbare datamaskiner for analyse av et lite antall celler, men VTK er ikke godt egnet til et stort antall individuelle objekter (> 1000). Det er derfor valgfritt å bruke den tilpassede algoritmen til å fungere på en databehandlingsklynge med høy ytelse. Dette muliggjør rask analyse av eksperimenter med mange celler (figur 2). Alle 7.5 oppnås ved å kjøre de bærbare cellene med tittelen Analyser de gjenværende mikroskopkanalene for fenotypisk beskrivelser og Les i Experiment_tracker-informasjonen og analyser kanalene som finnes.
    1. Mål ekstravasasjonen av kreftcellene: Etter å ha karakterisert endeotellaget med et plan, mål volumet av hver kreftcelle som har migrert gjennom membranen. Klipp hver celle (boolsk) slik at nettet under membranen holdes og delen over membranen fjernes33. Lukk deretter det åpne nettet (vtkFillHoles).
      1. Omberegn normalen og den nye centroid av klippet mesh. Mål volumet og posisjonen til hver klippet kreftcelle for analyse. Volumet tilsvarer antall voxels mesh fyller av hver enkelt celle. Beregn avstanden mellom endeotelplanet og posisjonen til hver kreftcelle.
    2. Mål cellulær fenotype: Beregn morfologien til hver kreftcelle ved å faktoriere formen, volumet og posisjonen.
  6. Valider målingene og lagre i et regneark eller plott. Kjør notatblokkcellen med tittelen Kontroller at centroider ble målt nøyaktig, og en gjengivelse vil dukke opp som viser centroids identifisert på toppen av det avbildede volumet etter celletype. Når alle eksperimentene er fullført, eksporterer du hele datasettet som en enkelt regnearkfil ved å skrive inn eksperimentene som skal inkluderes av ID-en i notatblokkcellen med tittelen Eksporter dataene som én enkelt Data.XLSX-fil for variablene eksperimenter som erstatter de angitte eksperiment-IDene. Hvis du kontrollerer det fullførte datasettet, plotter du det ved hjelp av notatblokkcellen Med tittelen Avstand ekstravasert stripeplott. Handlingen vises i notatblokkmiljøet og lagres i fil.

8. Analyser de relaterte egenskapene ved hjelp av kunstig intelligens

MERK: Identifiser metastatiske fenotypiske funksjoner ved hjelp av algoritmer for kunstig intelligens.

  1. Utfør binær klassifisering ved hjelp av Oransje i henhold til ordningen som vises i figur 5 og tilleggsfil 3. Start Orange fra en annen Windows Ledetekst ved å skrive "conda activate" etterfulgt av "python -m Orange.canvas" og klikk Ny fra ledeteksten. Orange er en dra og slipp basert programvare, så ordne funksjonene ved å dra hvert element fra venstre meny til lerretet for å matche supplerende fil 3. Når det er fullført, dobbeltklikker du filikonet og velger data.XLSX filen.
  2. Filtrer dataene for å fjerne dårlige målinger, definert som de som mislyktes i en boolsk operasjon eller gi parametriske variable verdier utenfor kjente grenser ved hjelp av ikonet "Velg rader". Dobbeltklikk på ikonet og angi betingelser som tilsvarer filteret, for eksempel "Sfærisitet er mellom 0 og 1". Opprett betingelser for 8.2.1, 8.2.2 og 8.2.3.
    1. Filteravstand ekstravaserte målinger til varierer fra -100-200 μm.
    2. Filter sfærisitetsmålinger av celleform til varierer fra 0-1.
    3. Filtrer målinger av kreftceller til å variere fra 0-2000 voxels.
    4. Bruk alle parametriske variabler (tabell 1) til å klassifisere hjernemetastatisk MDA-MB-231-BR-GFP og ikke-hjernemetastaserende MDA-MB-231-GFP. Dobbeltklikk Velg kolonner-ikonet fra lerretet. Bruk > -knappen til å flytte tilgjengelige variabler til enten Funksjoner, Målvariablereller Metaattributter. Den eneste variabelen som skal være en målvariabel er en metastatisk etikett som definerer om celler i datasettet anses som metastatiske (1) eller ikke (0). Eksperimentvariabler kan plasseres i Metaattributter-delen.
  3. Eksempel dataene på en opplæring (80 %) og testsett (20 %). Dobbeltklikk på Data sampler-ikonet, og velg en samplingstype for Fast dataandel: sett til 80 % og merk av for replikerbar og stratifiser. Stratifiser og kryssvalider treningssettet ved hjelp av 10 ganger mot hver modell/klassifikator. Dobbeltklikk Test og poengsum, og velg Kryssvalidering med Antall folder: sett til 10 og Stratified sjekket. Cross validation Sett målklassen til 1.
  4. I denne metoden bruker du Neural Networks og Random Forest-læringsalgoritmer som de er robuste for dataene. Velg Antall trær som skal være 50, i Tilfeldig skog-ikonet, og velg ikke andre alternativer. Number of Trees Innenfor Neural Network-ikonet velger du Nevroner per skjult layer: 100, Aktivering: ReLu, Problemløser: Adam, Alpha: 0,0001og Max Iterations: 200. Disse innstillingene vil imidlertid variere betydelig etter studier og bør forstås godt før bruk.
  5. Når du har konfigurert lerretet dobbeltklikker du hvert ikon fra Fil til eksempeldata og enten trykk Bruk eller Send data. Dobbeltklikk Test & Score og treningsdataene vil begynne å bli brukt til å utvikle en modell ved hjelp av algoritmene. Etter trening av maskinlæringsmodellen, åpner du Test & Score på nytt og velger Test på testdata og lukker popup-vinduet for å score ytelsen til modellen ved å klassifisere cellene i brikken i henhold til sannsynligheten for at de er hjernens metastatiske fra 0 til 1.
  6. Lagre ytelsen til maskinlæringsmodellen i en fil (tabell 2). Inkluder området under kurven (AUC) av ROC, nøyaktigheten og F1-poengsummen. Lagre en annen fil som inneholder de enkelte metastatiske indeksene og klassifiseringssypnegene. Dobbeltklikk på Lagre-ikonet, og klikk Lagre som for å skrive for å sende inn klassifiseringssypene. På samme måte kan ROC-kurven vises ved å dobbeltklikke på ROC Analysis-ikonet, og modellytelsen kan beregnes ved å dobbeltklikke på Confusion Matrix-ikonet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjelp av denne teknikken analyserte vi celletyper merket med forskjellige fluorescerende proteiner eller fargestoffer. Vi demonstrerer bruken av denne tilnærmingen med en μmBBN-chip formulert med hCMEC/D3-DsRed og ikke-fluorescerende astrocytter. Hjernen mikrovaskulære endotelceller ble seeded på en porøs membran (5 μm spor etset porer) og plassert i en inkubator34 ved 37 ° C under 5% CO2. Etter tre dager ble samløpet av endeotellaget bekreftet via mikroskopi, og deretter ble kreftceller plassert på toppen av endeotellaget. To brystkreftcellelinjer, en hjernesøkende klone kalt MDA-MB-231-BR-GFP, og foreldre MDA-MB-231-GFP-celler ble lagt inn i μmBBN-brikken som inneholder en astrocytisk hjernenisje35,,36,,37,,38,,39,,40,,41. μmBBN-brikkene ble avbildet på 1, 2 og 9 dager ved hjelp av et konfokalt mikroskop med 3 kanaler (dsRed, GFP og Brightfield) ved hjelp av et 10x mål, med Z-skiver hver 9 μm og 1x9 XY søm for å dekke hele membranområdet. Dette mikroskopet opprettholdt en temperatur på 37 °C under bildebehandlingsprosessen for å minimere stress på cellene.

Et representativt bilde av en komplett μmBBN-brikke (figur 3A) og endoteldekning (figur 3B-D) vises. Endotelbarrierer med høy og lav dekning kvantifiseres for å fastslå at μmBBN-spon er egnet for tilsetning av kreftceller (figur 3B). Representative bilder av en μmBBN-chip med en samtidig endotelbarriere som er akseptabel for eksperimentering (figur 3C) og en μmBBN-chip med spesielt dårlig endoteldekning som ikke er egnet for tilsetning av kreftceller er gitt (figur 3D). Langsiktig dyrking av endotelceller kan resultere i dekning som strekker seg utover membranen som skiller topp- og bunn μmBBN-chipkamrene. Endotelceller vokser ofte både oppå og rett under membranen, noe som ikke påvirker kreftcellebevegelse inn i hjernens nisjeplass, men kan gjøre flyet vanskelig. På grunn av variabiliteten til μmBBN-chipfabrikasjonen og endoteldekningen av membranen, passer representative fly til en normal flat endotelbarriere (figur 3E), og en atypisk buet membran vises for referanse (figur 3F). Tørking av apparatet i en ovn ved en temperatur over 40 °C kan forårsake en buet membran som vist.

Vi observerte fenotypiske forskjeller i MDA-MB-231-BR-GFP og foreldre MDA-MB-231-GFP cellelinje når man møter astrocytisk μmBBN som ble kvantifisert ved hjelp av den utviklede konfokale tomografiske analysen. De 4 fenotypiskbeskrivelsene som brukes til inndata i maskinlæringsalgoritmen (tabell 1) vises i figur 4.

Avstand ekstravasert representerer avstanden i μm mellom endotelbarrieren og hver kreftcelleposisjon i μmBBN-brikken (figur 4A). Endepitelbarrieren ligger på 0 μm. Avstander <0 μm representerer kreftceller som forble i strømningskammeret. Avstander > 0 μm indikerer kreftceller som har ekstravasert gjennom endotelbarrieren og kom inn i hjernens nisjeplass. Etter 1 dag med eksponering for μmBBN ble både MDA-MB-231-BR-GFP og MDA-MB-231-GFP plassert innenfor endeotelbarrieren. Men etter 2 og 9 dager med interaksjon migrerte en undergruppe av MDA-MB-231-BR-GFP > 100 μm inn i den astrocytiske hjernenisjen, mens foreldrene MDA-MB-231-GFP-cellene forble i nærheten av endotelbarrieren. Vi løste kreftcelleposisjonene ved endeotelbarrieren/ hjernenisjegrensesnittet ved å beregne volumet av hver kreftcelle som har gått gjennom endepitelbarrieren. Den resulterende prosentandelen representerer kreftcelle ekstravasert av volum (figur 4B). En 0% ekstravasert av cellevolum indikerer kreftceller som forblir på toppen av endotelbarrieren, alt til 100% når en kreftcelle har helt ekstravasert gjennom endotelbarrieren og ligger i hjernens nisjeplass. De foreldre MDA-MB-231-GFP-cellene samhandler først med endotelbarrieren etter 1 dag med eksponering for μmBBN-brikken som var <50 % ekstravasert av volum. Ved 2, og 9-Days MDA-MB-231-GFP celler opprettholde en betydelig andel av celler som forble på toppen av barrieren vekk fra hjernen nisje plass. MDA-MB-231-BR-GFP-cellene opprettholdt en andel celler som var > 100% ekstravasated, spesielt ved 2-dagers tidspunkt.

Kreftcelleformen endret seg dramatisk i løpet av eksponeringen for μmBBN. Representative bilder av kreftcellene på hvert tidspunkt er avbildet i figur 4C. Morfologisk kvantifisering av kreftcelleformen ble beregnet ved hjelp av sfærisitet, som står for cellevolum og overflateareal (figur 4D). Sfærisitetsberegningen varierer fra 0-1, med 1 som representerer en perfekt sfære. Både MDA-MB-231-BR-GFP og MDA-MB-231-GFP-cellene var svært sfæriske 1-dagers ettersåing i μmBBN-brikken. Etter 2- og 9-dagers interaksjon i μmBBN-brikken, trendet begge kreftcellelinjene for å redusere sfærisk form, om enn til forskjellige priser. I tillegg til kreftcelleform kvantifiseres også volumet i voxels av hver kreftcelle ved hjelp av den konfokale tomografiske analysen. Hver kreftcellelinje ble stratifisert i to grupper i figur 4E-F: "ut", som representerer kreftcellene som passerte gjennom endepitelbarrieren (> 90% ekstravasert gjennom barrieren) og "inn", populasjonen av celler som samhandler med endepitelbarrieren, men ikke ekstravasate gjennom (<90% ekstravasket). Kreftcelleunderpopulasjonene som ekstravaserte inn i den astrocytiske nisjen var mindre i størrelse sammenlignet med kreftcellene som forble i samspill med endotelbarrieren, men ikke helt ekstravasate gjennom til hjernen.

Den hjernesøkende MDA-MB-231-BR-GFP avslørte et fenotypisk mønster i μmBBN-brikkene som er forskjellig fra foreldrenes MDA-MB-231-GFP som kan utnyttes til å skille mellom hjernemetastatiske og ikke-hjernemetastatiske kreftceller ved hjelp av maskinlæring. Dataene ble tilfeldig delt inn i opplærings- og valideringsdatasett for å lære opp modellen og utføre valideringstester. For å trene modellen ble totalt 38 859 celler brukt etter filtrering av dataene, og modellen ble testet mot 9714 individuelle celler. Den trente modellen ble brukt på kreftcellelinjene og PDX-genererte kreftceller som ble analysert i astrocytiske μmBBN-chips (4 isolert fra pasientens hjernemetastaser av en rekke primære tumortyper, og 1 primær brystkreftsvulst) for å generere en indeks av hjernemetastaserende sannsynlighet (figur 5). Åtte forskjellige maskinlæringsklassifiseringsmetoder ble testet: Naive bukter, tilfeldig skog, beslutningstre, k-nærmeste nabo (kNN), stokastisk gradient nedstigning, nevrale nettverk og Adaboost. Resultatet av hver metode vises i tabell 2. Nevrale nettverk og Adaboost var de 2 beste klassifiseringsmetodene som anbefales for bruk med data generert ved hjelp av μmBBN-plattformen med en AUC på henholdsvis 0,920 og 0,928. Videre viste de en nøyaktighet på 0,833 og 0,853. Gjennomsnittet av presisjon og tilbakekalling (F1) for Neural nettverk og Adaboost metoder var 0,847 og 0,860. Fra tidligere arbeid hvor vi brukte denne tilnærmingen til PDX-prøver av ikke-metastatisk brystsvulst og kjente metastatiske prøver (bryst, lunge, ovarie, tunge) fant vi at den samme tilnærmingen som ble brukt på PDX-prøvene, gjorde det mulig å identifisere de metastatiske cellene nøyaktig identifisering av de metastatiske cellene fra de ikke-metastatiske. Tabell 2 viser resultatene for hver maskinlæringsalgoritme som brukes på PDX-dataene, hvor de samme metodene viste seg å være de mest robuste (Neural network og Adaboost (Random Forest). Av de 143 cellene som ble brukt i testsettet for PDX-prøvene, var 71 ikke-metastatiske, 46 var metastatisk bryst, 11 var metastatisk tunge, 13 var metastatisk lunge og 2 var metastatisk ovarie. Hver celletype produserte en total nøyaktighet på 0,88, men individet hadde følgende omtrentlige nøyaktigheter: ikke-metastatisk bryst: 0,96, metastatisk bryst: 0,80, metastatisk tunge: 0,80, metastatisk lunge: 0,92, metastatisk ovarial: 1,0

Figure 1
Figur 1: Eksperimentell arbeidsflyt. (A)Skjematisk representasjon av den mikrofluidiske enheten monteringsprosessen. En spinner brukes til å deponere en tynn film av PDMS: toluen lim på en 50 mm x 75 mm glasssklie. Hver halvdel av μmBBN-enheten er stemplet kanalsiden mot limet og deretter montert med en polykarbonatmembran (5 μm porer) mellom delene av μmBBN-enheten. ΜmBBN-enhetene er plassert i en 37 °C ovn i 24 timer for å kurere limet. Enheter tørkes deretter i en vakuumdesiccator i minst 48 timer før eksperimentell bruk. En μmBBN-enhet og 50 mm x 75 mm glasssklie aktiveres med plasmabehandling og bindes sammen. Standard P200 pipetter kuttet på tuppene settes inn i alle μmBBN-enhetsinntak og -uttak. Den ferdige μmBBN-enheten steriliseres deretter av en plasmabehandling på 8 min (200 W) og overføres deretter til en steril sekundær beholder. (B) Skjematisk oversikt over bruk av mikrofluidisk enhet stillas for å skape en cellulær blod hjernebarriere og hjernen nisje mikro-miljø. Inne i et biosikkerhetsskap seedes en blanding av astrocytter i kollagen inn i det nederste μmBBN-enhetskammeret og får størkning i 1 time ved 37 °C. Matrigel brukes til å belegge membranen gjennom det øverste strømningskammeret i 1 t ved 37 °C. Deretter blir endotelceller seeded inn i en spiss av toppkammeret og får lov til å flyte og bosette seg i 15 min. Denne såingen gjentas x4, vekslende sider av strømningskammeret. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Oversikt over konocal tomografisk analyse. Programvaren begynner med å konvertere et mikroskopisk konfokalt Z-stack-bilde til en 3D-modell av cellene ved hjelp av segmentering og 3D-masker. Programmet beregner deretter midtposisjonen til hver celle (centroid) og passer et plan til endepitelbarrieren. Fenotypiske målinger av hver enkelt celle blir deretter tabulert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Endotelbarrieredekning og planmontering. (A)Representativ skjematisk og bilde av en μmBBN-enhet. Den stiplede hvite linjen i toppvisningen skjematisk angir området på enheten som er representert i tverrsnittsvisningen. (B)Sammenligning av høy og lav endoteldekning av μmBBN-enheter før bruk av kreftceller. Welch to-prøve t-test, *** p < 0,1 * 10-4. (C) Representativt bilde av høy endoteldekning. Den stiplede hvite boksen i inndataskjemaet til en μmBBN-enhet angir plasseringen av endotelcellene i enheten. Skalerer linjer med oversikt og innfelte bilder = 200 μm. (D) Representativt bilde av lav endoteldekning. Skalerer linjer med oversikt og innfelte bilder = 200 μm. (E) Eksempel på at et flatt endeotelbarriere passer. Det grønne rektangelet representerer posisjonen til endeotelplanet. Prikker representerer enkelt endotelceller som består av barrieren. Gule prikker er endotelceller over flyet, og lilla prikker er celler som faller under flyet. Endotelceller over flyet (gule prikker) viser en tendens til å vokse opp sideveggene og toppen av enheten for å danne et rør. (F)Eksempel planpassass på en μmBBN-enhet med et buet plan. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Kvantifisering av cellulære fenotyper av hjernemetastatiske og foreldrecellefenotyper i astrocytiske blodhjernenisjemikrofluidiske chips. (A) Strip plot of distance i μm av kreftceller fra endotelbarrieren på 1, 2 og 9-Dager. Den stiplede svarte linjen ved 0 μm representerer endeotelbarrieren. Røde bokser indikerer et delsett av MDA-MB-231-BR-GFP-celler som migrerte langt inn i hjernens nisje. (B) Fiolin plott av prosent totale volumet av kreftceller ekstravasated gjennom endotelbarrieren på 1, 2, og 9-Dager. Korte stiplede linjer representerer kvartiler, lengre stiplet linje representerer gjennomsnittet. (C)Representative bilder av morfologien til kreftceller i μmBBN-enheten. Vektstangen = 25 μm. (D) Fiolinplott av sfærisiteten til kreftceller i μmBBN-enheten ved 1, 2 og 9 dager. Sfærisitet varierer fra 1: sfærisk til 0: ikke sfærisk. (E) Box plot av MDA-MB-231-GFP cellevolum i μmBBN enheten i voxels for celler som hviler utenfor endotelbarrieren (ut) og celler som ekstravaserte gjennom barrieren (i). (F) Box plot av MDA-MB-231-BR-GFP cellevolum i μmBBN enheten i voxels for celler som hviler utenfor endotelbarrieren (ut) og celler som ekstravasated gjennom barrieren (i). Boksen viser kvartiler og whiskers utvide for å vise andelen av interkvartil området forbi lav og høy kvartiler. Pairwise Wilcoxon Rank Sum og Kruskal-Wallis med Dunns flere sammenligninger, *** p < 0,1 * 10-4. Gjengitt fra referanse24 med tillatelse fra Royal Society of Chemistry. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Representative resultater av maskinlæringsklassifisering av kreftceller. (A) Oversikt over maskinlæring. Demonstrerer prosessen med å dele data samlet inn fra konfokal tomografi, filtrere dataene, trene maskinlæringsalgoritmen ved hjelp av 10-foldvalidering og deretter teste modellen mot et tilfeldig utvalg på 20% av dataene som ble reservert. Den valgte modellen kan deretter brukes på nye data for å samle inn den metastatiske indeksen for individuelle celler. (B) ROC kurver som viser ytelsen til 8 forskjellige maskinlæringsalgoritmer for MDA-231-BR-GFP og MDA-231-GFP celler kultur for 1, 2 og 9-dager før bildebehandling. Dette er representativt for hvilken type kurve som skal analyseres for å forstå ytelsen til den trente modellen. (C) ROC kurver for 8 forskjellige maskinlæringsalgoritmer brukt på pasienter avledet xenograft (PDX) dissosierte celler dyrket i 2 dager. Dette er representativt for hvilken type kurve som skal analyseres for å forstå ytelsen til den trente modellen. Gjengitt fra referanse24 med tillatelse fra Royal Society of Chemistry. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Funksjonen Beskrivelsen
Tumorcelle % ekstravasket inn i nisje
Tumorcelle Volum
Tumorcelle Sfære
Tumorcelle Avstand ekstravasert
Tumorcelle Live celle 2D-overføring
Mikrometastase Porøsitet
Mikrometastase Stromal interaksjon
Mikrometastase Alder
Mikrometastase Vekst
Stromal celle Volum
Stromal celle Avstand fra nærliggende kreftceller
Stromal celle Avstand fra endotelbarrieren
Stromal celle Figuren

Tabell 1: Liste over beskrivelser etter funksjonstype. Fenotypisk karakterisering av tumorceller er representert ved hjelp av et panel av beskrivelser. Den røde boksen indikerer beskrivelsene som har blitt brukt til å forutsi hjernens metastatiske sannsynlighet via maskinlæring.

Kreftceller
Metoden AUC Nøyaktighet F1 (andre personer)
Nevrale nettverk 0.925 0.84 0.847
AdaBoost 0.928 0.853 0.86
Tilfeldig skog 0.925 0.849 0.855
Beslutning Treet 0.898 0.817 0.827
KNN 0.775 0.702 0.718
Logistisk regresjon 0.769 0.735 0.751
Naive Bayes 0.745 0.715 0.73
Sgd 0.73 0.73 0.737
PDX Kreftceller
Metoden AUC Ca. F1 (andre personer)
Nevrale nettverk 0.972 0.881 0.878
Tilfeldig skog 0.964 0.888 0.887
AdaBoost 0.957 0.881 0.879
Treet 0.954 0.867 0.865
Logistisk regresjon 0.897 0.832 0.831
Naive Bayes 0.896 0.846 0.849
KNN 0.882 0.818 0.814
Sgd 0.861 0.86 0.853

Tabell 2: Sammenligning av maskinlæringsmetoder for å klassifisere kreftceller og PDX-kreftceller etter hjernemetastatisk potensial.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har utviklet og presentert en ny metode som tilpasser verktøy som ofte benyttes i kliniske bildeanalyser for måling av ekstravasasjon og migrering av kreftceller gjennom en endotelbarriere til hjernevev. Vi utgjør denne tilnærmingen kan være nyttig for både in vivo og in vitro målinger; vi har vist sin bruk på et 3D mikrofluidisk system rekafilaterende hjernevaskulatur. Kreftcellemålinger, inkludert avstandsavsatt, prosent ekstravasert av volum, sfærisitet og volum kvantifiseres ved hjelp av denne teknikken. Avstand ekstravasert og prosent ekstravasert av volum tillater brukeren å rekonstruere plasseringen av kreftcellene i brikken for å vurdere ekstravasasjon over barrieren og migrasjon i vevet. Celleformmålinger som sfærisitet og volum er relatert til cellens dynamiske bevegelser eller funksjon ved hvert gangpunkt. Migrerende MDA-MB-231-BR-GFP-celler viser et høyt nivå av sfærisitet når de først ble introdusert i μmBBN-enheten og blir mindre sfæriske i form når de reduserer bevegelsen og begynner å kolonisere nisjen. Samlet cellevolum for MDA-MB-231-GFP og MDA-MB-231-BR-GFP var forskjellig på grunn av forskjellen i form av cellelinjene. Kreftceller som krysser endotelbarrieren er mer avrundet enn cellene som ikke krysser gjennom barrieren, og dermed kan mindre runde celler kunne ekstravasere over endeotellaget mer effektivt.

Det finnes to kritiske trinn i protokollen som letter suksess. Den første oppstår under montering av μmBBN enheten øvre og nedre deler som er adskilt av den porøse membranen. Øvre og nedre enhetsdeler må pares slik at innløpene og uttakene overlapper hverandre, men ikke er okkludert av membranen i mellom for å fremme riktig strømning. Alle μmBBN-enheter med dårlig parring av de øvre og nedre enhetsdelene eller membranjusteringen kastes for å minimere svingninger i kvalitet. Etterfølgende baking for å kurere PDMS:toluenlim for å montere enheten er avgjørende for å utføre ved 37 °C for å produsere μmBBN-enheter med membraner som er flate. Baketemperaturer som overstiger 37 °C har en tendens til å produsere enheter med en buet membran som gjør bildeanalyse vanskelig, spesielt når du monterer et plan til endepitelbarrieren. Det andre kritiske trinnet skjer under såing av endotelbarrieren. Seedings bør forekomme med minst femten minutters intervaller mellom de to innløpene som fôrer den øverste delen av enheten for å sikre tilfeldig fordeling av endotelcellene på enhetens membran. Seeding av kollagenblandingen som inneholder astrocytter i brikken kan kreve feilsøking og endring av laboratoriespesifikke protokollen. Hvis membranoverflaten på enheten ikke er hydrofob, vil kollagen fylle både de nederste og øverste delene av enheten og stille inn slik at den tetter all strøm gjennom den øverste delen av enheten. Formålet med den endelige plasmagassbehandlingen er å gjøre enhetens overflate hydrofob. I dette tilfellet anbefaler vi justering av plasmagassbehandlingen av enheten for å øke hydrofobiiteten.

Vi har observert noen begrensninger med denne tilnærmingen. For eksempel kan tilnærmingen som brukes til å indusere cellefluorescens påvirke bildekvaliteten. Ved bruk av levende cellesporing fargestoffer, er fluorescerende mønster laget av små flekker, mens transfected eller transdusert uttrykk for fluoroforer produserer et jevnt mønster. Det spotty mønsteret krever ekstra og noen ganger feil utsatt klynger av piksler. I tillegg er målingens følsomhet avhengig av omsorgen som tas under bildebehandling. Bilder med høyere oppløsning og flere z-skiver forbedrer oppløsningen, men tar også mer tid å bilde og analysere. Celler som berører kan også analyseres feil som en stor enkeltcelle. Dette er et problem for mange automatiserte bildesystemer, men kan løses på to måter. Den første er at endeotellaget har mange celler som berører, men deres kombinasjon har ubetydelig innvirkning på den endelige plasseringen av skjæreplanet. Den andre er antall kreftceller er lav nok til at det er sjelden de berører. Feil som oppstår ved montering av flyet kan oppstå av flere grunner. Den første er at noen endotelceller kan ha migrert bort fra sentralmembranen under cellekulturen. Dette kan føre til endotelceller belegg hele kanalen eller invadere kollagen fylt plass, og dermed skjev målingen. En annen feilkilde er paradoksalt nok manuell justering av flyet for å fikse den forrige feilen. Repeterbarhets- og reproduserbarhetsstudier har imidlertid funnet at dette har minimal innvirkning. Til slutt observerte vi at under visse omstendigheter kan den boolske kuttingen av cellenettet mislykkes, eller algoritmen for å lukke kuttet mesh kan også mislykkes. Teknikkene som brukes her er dagens "state of the art", og disse problemene blir for tiden adressert av algoritmiske forskere.

Resultatene fra opplæring av maskinlæringsalgoritmene (AI) mot data samlet inn av konfokal tomografi av μmBBN viser at det betydelige antallet individuelle celler analysert av denne tilnærmingen kan bidra til å løse problemer med å fange heterogenitet som finnes i kreftceller. En AUC større enn 0,9 regnes som en høytytende klassifikator. Her demonstrerte vi en AUC på 0,928. Vi forventer at etter hvert som metoden forbedres på ytelsen vil fortsette å øke. Som med alle AI-metoder må det tas hensyn til å velge treningsdatasettet nøye, slik at det representerer den typen data som forventes å bli testet mot. Av denne grunn kan vi forvente at ytelsen vil forringes, hvis modellen ble brukt direkte på pasientprøver for eksempel uten først å utsette modellen for en robust samling av pasientprøver. Vi demonstrerer dette her til en viss grad ved å inkludere 1-dagers, 2-dagers og 9-dagers målinger for kreftcellene i modellen sammenlignet med 2-dagers dagen som ble brukt til det forrige arbeidet. Vi ser at det brede utvalget reduserer ytelsen til modellen litt og viser hvor følsomme noen av de dårligere ytelsesmetodene kan være, og dermed foreslå at brukerne kanskje vil teste flere modeller på dataene sine. Tabell 2 som beskriver PDX-resultater, viser en samlet god ytelse. Individuelle PDX-typer viser imidlertid at andelen celler målt fra hvert utvalg varierer og kan påvirke ytelsen for hvert opprinnelsessted. For eksempel produserte ovarieprøven bare to celler for testsettet. I motsetning, metastatisk brystkreft som hadde en større populasjon. Dette datasettet var ment å demonstrere at cellene overlever i nisjen og kan analyseres, men fremhever også tolkende omsorg er nødvendig. Endringer i målvariabelen kan også veilede forskere i å identifisere underkloner med andre egenskaper som interaksjoner med stromale celler eller quiescent atferd.

Denne tilnærmingen er viktig som flere laboratorier vedta membran on-a-chip systemer som blod hjernebarriere på en chip, lunge på en chip og gut på en chip11,42. De fleste av disse brikkene er montert slik at membranen er parallell med bildesystemet, noe som til nå har betydd at det ville være vanskelig å måle når og hvor mange celler som har flyttet fra den ene siden av membranen til denandre 15,28. Videre, sammenlignet med horisontalt orienterte chips, gir vertikalt orienterte chips et mye større membranområde som øker eksperimentets dynamiske rekkevidde. I tillegg, fordi orientering av membranen ikke er avgjørende for denne analyseteknikken, kan konfokal tomografi potensielt muliggjøre nye in vitro-eksperimenter. For eksempel, imaging ekstravasasjon av brystkreftceller fra murine fett pad inn i blodet ville være tilnærmet ved disse metodene. Dette kan hjelpe forskere med å identifisere hvordan kreftcellene sonderer grensesnittet mellom brystet ECM og fartøyet.

Til slutt presenterte vi en metodikk for å konstruere en 3D mikrofluidisk enhet som rekastaterer blodhjernnisjen og demonstrerer hvordan man bruker konfokal tomografi og maskinlæring for analyse. Ved hjelp av denne plattformen identifiserte vi hjernemetastatiske kreftcelleegenskaper som skiller mellom hjernens metastatiske og ikke-metastatiske PDX-kreftceller basert på deres oppførsel i μmBBN-enheten. Fremtidig arbeid vil forbedre den kliniske anvendeligheten til denne plattformen som en diagnostisk mot å forutsi hjernemetastaser. Vi tror at å ha presentert denne plattformen vil være nyttig og interessant for laboratorier som trenger å måle celler av enhver type migrering eller ekstravasating over en membran. Dette er av betydning som prekliniske modeller av svulsten mikro-miljø blir stadig mer sofistikert så å må engineering av modellene og støtte programvare. For å hjelpe til med robust analyse av dataene har vi pakket dette verktøyet som en enkel å bruke, delt python notatbok med installasjonsinstruksjoner30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Det er ingen avsløringer å erklære.

Acknowledgments

Vi takker Steeg Lab, ved National Cancer Institute for sjenerøs donasjon av MDA-MB-231-BR-GFP celler. Konfokal mikroskopi ble utført ved University of Michigan Biointerfaces Institute (BI). Flow cytometri ble utført ved University of Michigan Flow Cytometry Core. Virale vektorer ble opprettet av University of Michigan Vector Core. Vi takker også Kelley Kidwell for veiledning i statistisk analyse av disse dataene.

Finansiering:

C.R.O. ble delvis støttet av en NIH T-32 Training Fellowship (T32CA009676) og 1R21CA245597-01. T.M.W. ble delvis støttet av 1R21CA245597-01 og National Center for Advancing Translational Sciences of the National Institutes of Health under Award Number UL1TR002240. Støtte til materialer og karakterisering ble gitt av National Cancer Institute of the National Institutes of Health under prisnummer 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, METAvivor Foundation og Breast Cancer Research Foundation. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA with phenol red Thermo Fisher Scientific 25200056
1.5 mm biopsy punch with plunger Integra LifeSciences Corporation 33-31A-P/25
10x MEM Thermo Fisher Scientific 11430030
150 mm petri dishes Fisher Scientific FB0875714
1x DPBS, without Ca and Mg Thermo Fisher Scientific 14190144
200uL pipette tip Fisher Scientific 02-707-411
4 inch silicon wafer University Wafer 452
48 mm wide packing tape Fisher Scientific 19-072-097
50 x 75 mm glass slide Fisher Scientific 12-550C
A1 confocal microscope Nikon
acetone Fisher Scientific A9-20
antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin) Gibco 15240062
box cutter blade Fisher Scientific NC1721575
dissection scissors Fisher Scientific 08-951-5
DMEM with 4.5 g/L glucose Thermo Fisher Scientific 11960-044
double sided tape Fisher Scientific NC0879005
EGM-2 Lonza CC-3162
Fetal Bovine Serum, Heat inactivated Corning MT35011CV
Fiji software ImageJ
glass vial Fisher Scientific 03-341-25D
glutamax Thermo Fisher Scientific 35050061
hCMEC/D3 EMD Millipore SCC066
Jupyter notebook Anaconda
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081
Matrigel - growth factor reduced with phenol red Corning CB-40230A
MDA-MB-231 ATCC HTB-26
MDA-MB-231-BR-GFP Dr. Patricia Steeg, NIH
N-2 growth supplement Thermo Fisher Scientific 17502048
normal human astrocytes (NHA) Lonza CC-2565
Orange software University of Ljubljana
Pasteur pipette Fisher Scientific 13-711-9AM
Photolithography masks Photosciences Incorporated
pLL3.7-dsRed University of Michigan Vector Core
pLL-EV-GFP University of Michigan Vector Core
pLOX-TERT-iresTK Addgene 12245
pMD2.G Addgene 12259
polycarbonate membrane, 5um pore size Millipore TMTP04700
psPAX2 Addgene 12260
PureCol, 3 mg/mL Advanced Biomatrix 5005 Type I bovine collagen
sodium bicarbonate Thermo Fisher Scientific 25080094
sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360070
Solo cup Fisher Scientific NC1416545
SU-8 2075 MicroChem Corporation Y111074 0500L1GL
SU8 developer MicroChem Corporation Y020100 4000L1PE
Sylgard 184 Ellsworth Adhesive Company NC0162601
Toluene Sigma-Aldrich 179965-1L
Tricholoro perfluoro octyl silane Sigma-Aldrich 448931-10G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rastogi, K., et al. Palliation of Brain Metastases: Analysis of Prognostic Factors Affecting Overall Survival. Indian Journal of Palliative Care. 24 (3), 308-312 (2018).
  2. Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
  3. Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
  4. Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
  5. Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
  6. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. 294, 15-22 (2005).
  7. Poissonnier, A., Legembre, P. Boyden Chamber Assay to Study of Cell Migration Induced by Metalloprotease Cleaved-CD95L. Methods in Molecular Biology. 1557, 117-123 (2017).
  8. Li, X., Yang, H., Huang, H., Zhu, T. CELLCOUNTER: novel open-source software for counting cell migration and invasion in vitro. BioMed Research International. 2014, 863564 (2014).
  9. Little, A. C., et al. IL-4/IL-13 Stimulated Macrophages Enhance Breast Cancer Invasion Via Rho-GTPase Regulation of Synergistic VEGF/CCL-18 Signaling. Frontiers in Oncology. 9, 456 (2019).
  10. Allen, S. G., et al. Macrophages Enhance Migration in Inflammatory Breast Cancer Cells via RhoC GTPase Signaling. Scientific Reports. 6, 39190 (2016).
  11. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  12. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  13. Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
  14. Choi, Y. P., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
  15. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. Journal of Neuroscience Methods. 232, 165-172 (2014).
  16. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
  17. Schroeder, W., Martin, K., Lorenson, B. The Visualization Toolkit. 4th edn. , Kitware. (2006).
  18. Wells, W. M., Grimson, W. L., Kikinis, R., Jolesz, F. A. Adaptive segmentation of MRI data. IEEE Transactions on Medical Imaging. 15 (4), 429-442 (1996).
  19. Agarwal, S. K., Singh, S., Ghuman, S. S., Sharma, S., Lahiri, A. K. Radiological assessment of the Indian children with congenital sensorineural hearing loss. International Journal of Otolaryngology. 2014, 808759 (2014).
  20. Mansfield, P., Maudsley, A. A. Medical imaging by NMR. The British Journal of Radiology. 50 (591), 188-194 (1977).
  21. Plewes, D. B., Kucharczyk, W. Physics of MRI: a primer. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 35 (5), 1038-1054 (2012).
  22. Batteux, C., Haidar, M. A., Bonnet, D. 3D-Printed Models for Surgical Planning in Complex Congenital Heart Diseases: A Systematic Review. Frontiers in Pediatrics. 7, 23 (2019).
  23. Thibault, F., et al. MRI for surgical planning in patients with breast cancer who undergo preoperative chemotherapy. American Journal of Roentgenology. 183 (4), 1159-1168 (2004).
  24. Oliver, C. R., et al. A platform for artificial intelligence based identification of the extravasation potential of cancer cells into the brain metastatic niche. Lab on a Chip. 19 (7), 1162-1173 (2019).
  25. Gril, B., et al. Reactive astrocytic S1P3 signaling modulates the blood-tumor barrier in brain metastases. Nature Communications. 9 (1), 2705 (2018).
  26. Badilescu, S., Packirisamy, M. BioMEMS: Science And Engineering Perspectives. , Taylor & Francis/CRC Press. (2011).
  27. Liu, C. Foundations of MEMS. 2nd edn. , Prentice Hall. (2012).
  28. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab on a Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  29. Lockman, P. R., et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (23), 5664-5678 (2010).
  30. Ryan Oliver, C., W, T. M. Con-tom: A Jupyter Notebook for Analyzing the tumor micro-environment in confocal images. Zenodo. , Version 0.8, 3825719 (2020).
  31. Lorensen, W. E., Johnson, C., Kasik, D., Whitton, M. C. History of the Marching Cubes Algorithm. IEEE Computer Graphics and Applications. 40 (2), 8-15 (2020).
  32. Kleinbaum, D. G., Kupper, L. L. Applied regression analysis and other multivariable methods. , Duxbury Press. (1978).
  33. Berg, M. d Computational geometry : algorithms and applications, 2nd rev. edn. , Springer. (2000).
  34. Esch, M. B., Post, D. J., Shuler, M. L., Stokol, T. Characterization of in vitro endothelial linings grown within microfluidic channels. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2965-2971 (2011).
  35. Brinkley, B. R., et al. Variations in cell form and cytoskeleton in human breast carcinoma cells in vitro. Cancer Research. 40 (9), 3118-3129 (1980).
  36. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 33 (2013).
  37. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  38. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 16 (2013).
  39. Dello Russo, C., et al. The human microglial HMC3 cell line: where do we stand? A systematic literature review. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 259 (2018).
  40. Dun, M. D., et al. Proteotranscriptomic Profiling of 231-BR Breast Cancer Cells: Identification of Potential Biomarkers and Therapeutic Targets for Brain Metastasis. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2316-2330 (2015).
  41. Xing, F., et al. Reactive astrocytes promote the metastatic growth of breast cancer stem-like cells by activating Notch signalling in brain. EMBO Molecular Medicine. 5 (3), 384-396 (2013).
  42. Zhang, B., Radisic, M. Organ-on-a-chip devices advance to market. Lab on a Chip. 17 (14), 2395-2420 (2017).

Tags

Kreftforskning Utgave 162 Tumor mikromiljø kreft organ-on-a-chip maskinlæring kunstig intelligens konfokal mikroskopi langsiktig cellekultur
Kvantifisere hjernen metastatisk tumor mikro-miljø ved hjelp av en organ-on-a chip 3D modell, maskinlæring, og konfokal tomografi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oliver, C. R., Westerhof, T. M.,… More

Oliver, C. R., Westerhof, T. M., Castro, M. G., Merajver, S. D. Quantifying the Brain Metastatic Tumor Micro-Environment using an Organ-On-A Chip 3D Model, Machine Learning, and Confocal Tomography. J. Vis. Exp. (162), e61654, doi:10.3791/61654 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter