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Cancer Research

एक अंग पर एक चिप 3 डी मॉडल, मशीन लर्निंग, और Confocal टोमोग्राफी का उपयोग कर मस्तिष्क मेटास्टेटिक ट्यूमर माइक्रो पर्यावरण की मात्रा

Published: August 16, 2020 doi: 10.3791/61654
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 2,3,4, 1,2
1Department of Internal Medicine, University of Michigan Ann Arbor, 2Rogel Cancer Center, University of Michigan Ann Arbor, 3Department of Neurosurgery, University of Michigan Ann Arbor, 4Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan Ann Arbor
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एक रक्त मस्तिष्क बाधा मेटास्टेटिक ट्यूमर सूक्ष्म पर्यावरण को तैयार करने और उसे बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और फिर कॉन्फोकल इमेजिंग और आर्टिफिशियल इंटेलिजेंस (मशीन लर्निंग) का उपयोग करके अपने राज्य की मात्रा निर्धारित करते हैं।

Abstract

मस्तिष्क मेटास्टेस सबसे घातक कैंसर घाव हैं; कैंसर के प्रकार के आधार पर, केवल ~ 5-20 महीनों के औसत अस्तित्व के साथ, सभी कैंसर का 10-30% मस्तिष्क में मेटास्टेसाइज करता है। मस्तिष्क मेटास्टैटिक ट्यूमर बोझ को कम करने के लिए, बुनियादी और अनुवाद ज्ञान में अंतराल को दूर करने की जरूरत है । प्रमुख चुनौतियों में प्रजनन योग्य प्रीक्लीनिकल मॉडल और संबद्ध उपकरणों की कमी शामिल है। मस्तिष्क मेटास्टेसिस के त्रि-आयामी मॉडल समर्पित विश्लेषण उपकरणों के साथ संयुक्त होने पर इन आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रासंगिक आणविक और फेनोटाइपिक डेटा प्राप्त कर सकते हैं। इसके अलावा, मुरीन मॉडल की तुलना में, रोगी ट्यूमर कोशिकाओं के अंग-ऑन-ए-चिप मॉडल मस्तिष्क माइक्रोएनवायरमेंट में रक्त मस्तिष्क बाधा को पार करते हैं, तेजी से परिणाम उत्पन्न करते हैं और मात्रात्मक तरीकों के साथ अधिक व्याख्या योग्य होते हैं, इस प्रकार उच्च थ्रूपुट परीक्षण के लिए उत्तरदायी होते हैं। यहां हम एक उपन्यास 3 डी माइक्रोफ्लुइडिक रक्त मस्तिष्क आला (μmBBN) मंच के उपयोग का वर्णन और प्रदर्शन करते हैं जहां आला के कई तत्वों को एक विस्तारित अवधि (कई दिनों) के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा फ्लोरोसेंट रूप से इमेज्ड, और एक अभिनव कॉन्फोकल टोमोग्राफी तकनीक का उपयोग करके पुनर्निर्मित छवियों; सभी का उद्देश्य माइक्रो-मेटास्टेसिस के विकास और ट्यूमर माइक्रो-पर्यावरण (टीएमई) में एक दोहराने योग्य और मात्रात्मक तरीके से परिवर्तन को समझना है। हम इस मंच का उपयोग करके कैंसर कोशिकाओं और टीएमई सेलुलर और ह्यूमरल घटकों का निर्माण, बीज, छवि और विश्लेषण कैसे करते हैं, इसका प्रदर्शन करते हैं। इसके अलावा, हम दिखाते हैं कि कैसे आर्टिफिशियल इंटेलिजेंस (एआई) का उपयोग कैंसर कोशिकाओं के आंतरिक फेनोटाइपिक मतभेदों की पहचान करने के लिए किया जाता है जो एक मॉडल μmBBN के माध्यम से पारगमन करने में सक्षम हैं और उन्हें मस्तिष्क मेटास्टैटिक क्षमता का एक उद्देश्य सूचकांक प्रदान करते हैं। इस विधि द्वारा उत्पन्न डेटा सेट का उपयोग मेटास्टेसिस के बारे में बुनियादी और अनुवादात्मक प्रश्नों, चिकित्सीय रणनीतियों की प्रभावकारिता और दोनों में टीएमई की भूमिका के जवाब देने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

मस्तिष्क मेटास्टेस सबसे घातक कैंसर घाव हैं; सभी कैंसर का 10-30% मस्तिष्क के लिए मेटास्टेसाइज, केवल ~ 5-20 महीने के औसत अस्तित्व के साथ, कैंसर प्रकार1,,2पर निर्भर करता है । कैंसर मेटास्टेसिस का अध्ययन करते समय एक प्रमुख प्रश्न यह उठता है कि उप क्लोन रक्तधारा के विनोदी वातावरण से मस्तिष्क3,4जैसे अंग में कैसे प्रवास करते हैं । इस सवाल के कारण पलायन, आक्रमण और अपर्णा में कई भिन्नताएं हैं। ये सभी विधियां कोशिकाओं के गुणों को गिनने या मापने के महत्वपूर्ण कदम को साझा करती हैं जो उत्तेजना के जवाब में एक स्थान से दूसरे स्थान पर जाती हैं। अधिकांश माइग्रेशन परख आसानी से उपलब्ध है कैंसर कोशिकाओं के दो आयामी (2 डी) प्रवास का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है। इनसे ज्ञान का खजाना स्पष्ट हो गया है; हालांकि, वे वीवो सिस्टम में तीन आयामी प्रकृति का पुनर्पूंजीकरण नहीं करते हैं कि अन्य तरीके5प्रदान कर सकते हैं । इसलिए, त्रि-आयामी (3 डी) प्रणालियों में ट्यूमर माइक्रो-पर्यावरण (टीएमई) का अध्ययन करना आवश्यक है, लेकिन 3 डी संरचनाओं के लिए उपलब्ध विश्लेषण दृष्टिकोण सीमित हैं और अक्सर असंगत होते हैं।

सबसे लोकप्रिय 3 डी उपकरणों में से एक बॉयडन चैंबर है जिसमें एक कुएं के तल पर निलंबित झिल्ली होती है, जो दो अलग-अलग क्षेत्रों को अलग करती है। बॉयडन ने ल्यूकोसाइट केमोटैक्सिस4का अध्ययन करने के लिए परख की शुरुआत की । निचले क्षेत्रों को निचले क्षेत्र में स्थानांतरित करने के लिए ऊपरी क्षेत्र में कोशिकाओं को प्रेरित करने के लिए रसायन विज्ञान या अन्य साधनों6,,7 द्वारा भिन्न किया जा सकता है। माइग्रेट की गई कोशिकाओं की संख्या को निर्धारित करने के लिए सबसे आम दृष्टिकोण यह है कि एक बफर समाधान का उपयोग करके झिल्ली के नीचे से कोशिकाओं को जारी किया जाए, उन्हें lyse किया जाए, और फिर समाधान7में डीएनए सामग्री की मात्रा के आधार पर उन्हें गिनें। यह अप्रत्यक्ष दृष्टिकोण तकनीक परिवर्तनशीलता के कारण ऑपरेटर त्रुटि से ग्रस्त है और प्रक्रिया कैंसर फेनोटाइप और सूक्ष्म पर्यावरण के बारे में जानकारी को नष्ट कर देती है। बॉयडन चैम्बर परख की विविधताओं में झिल्ली पर रहने वाली प्रवासी कोशिकाओं का निर्धारण शामिल है, लेकिन केवल उन कोशिकाओं की गिनती प्रदान करता है जो,अब निरंतर अध्ययन6,,8,9के लिए व्यवहार्य नहीं हैं।

बॉयडन चैंबर की सीमाओं और माइक्रोफ्लुइडिक समुदाय में नवाचारों के विकास के कारण, माइग्रेशन परख चिप्स विकसित किए गए हैं जो तीन 10 ,11, 12,11,12के बजाय एक दिशा में उत्तेजना के जवाब में कोशिकाओं की गति का पालन करते हैं। ये माइग्रेशन परख प्रवाह या एकल कोशिका पृथक्करण13, 14,14 जैसे कारकों पर नियंत्रण की सुविधा प्रदान करते हैं जो परिणामों की बेहतर व्याख्या को सक्षम करते हैं; हालांकि, उनका 2D प्रारूप अनिवार्य रूप से कुछ गतिशील जानकारी खो देता है। हाल के अध्ययनों में 3 डी वातावरण14, 15,15में एक ऊतक में परिसंचरण से कोशिकाओं की आवाजाही (यानी, रक्त मस्तिष्क बाधा) पर ध्यान केंद्रित किया है। सेलुलर बैरियर/झिल्ली पर होने वाले ऊतक और जांच व्यवहार में अपूथ दूरी बॉयडन चैंबर या 2डी माइक्रोफ्लुइडिक माइग्रेशन डिवाइस16का उपयोग करके प्राप्त मापों की तुलना में अधिक परिष्कृत होती है । इस प्रकार, उपकरणों है कि उचित इमेजिंग और 3 डी एक्स्ट्राावेशन के विश्लेषण सक्षम इन परिष्कृत माप पर कब्जा करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, लेकिन साहित्य में कमी कर रहे हैं ।

माइग्रेशन परख से स्वतंत्र, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) और टोमोग्राफी के लिए मजबूत इमेजिंग तकनीक विकसित की गई है जो 3 डी स्पेस17,,18में ऊतकों की पहचान और सटीक पुनर्निर्माण करने में सक्षम हैं। ये तकनीकें ऊतक के गुणों के आधार पर जेड-स्टैक और छवि के खंड भागों में छवियां प्राप्त करती हैं और फिर खंडित छवियों को त्रि-आयामी meshes19,20,,21में परिवर्तित करती हैं।, यह चिकित्सकों को 3 डी व्यक्तिगत अंगों, हड्डियों और जहाजों में कल्पना करने की अनुमति देता है ताकि कैंसर या हृदय रोगके,निदान में शल्य चिकित्सा योजना या सहायता में सहायता की जासके। यहां, हम बताएंगे कि इन दृष्टिकोणों को सूक्ष्म नमूनों और 3 डी अपूश उपकरणों पर उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

इस उद्देश्य के लिए, हमने अभिनव कॉन्फोकल टोमोग्राफी तकनीक विकसित की, जो यहां प्रस्तुत की गई है, जो मौजूदा टोमोग्राफी उपकरणों को अनुकूलित करके एक झिल्ली में ट्यूमर कोशिकाओं के अपव्यय का अध्ययन करने के लिए लचीलापन प्रदान करती है। यह दृष्टिकोण कैंसर सेल व्यवहार के पूर्ण सरगम के अध्ययन को सक्षम बनाता है क्योंकि वे एक सेलुलर बाधा के साथ बातचीत करते हैं, जैसे कि एंडोथेलियल सेल परत। कैंसर कोशिकाओं के व्यवहार की जांच प्रदर्शन; कुछ आक्रमण कर सकते हैं, लेकिन झिल्ली के करीब रहते हैं, जबकि अन्य बाधा को आसानी से पार करते हैं। यह तकनीक सभी आयामों24में कोशिका के फेनोटाइप के बारे में जानकारी देने में सक्षम है । टीएमई का अध्ययन करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करना अपेक्षाकृत सस्ती, व्याख्या करने में आसान और प्रजनन योग्य दोनों है, जब वीवो मुरीन मॉडल में अधिक जटिल की तुलना में। प्रस्तुत पद्धति स्ट्रोमल क्षेत्र को अनुकूल बनाकर कई प्रकार के ट्यूमर और सूक्ष्म वातावरण के अध्ययन के लिए एक मजबूत आधार प्रदान करना चाहिए।

हम 3 डी माइक्रोफ्लुइडिक रक्त मस्तिष्क आला (μmBBN) मंच(चित्रा 1)के उपयोग का वर्णन और प्रदर्शन करते हैं जहां बाधा और आला (मस्तिष्क सूक्ष्मकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं और एस्ट्रोसाइट्स) के महत्वपूर्ण तत्वों को एक विस्तारित अवधि (लगभग 9 दिनों तक) के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है, फ्लोरोसेंटली रूप से कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेज डे, और हमारे कॉन्फोसल टॉमोग्राफी का उपयोग करके पुनर्निर्माण की गई छवियां(चित्रा 2) सभी के उद्देश्य से माइक्रो मेटास्टेसिस के विकास को समझने और ट्यूमर सूक्ष्म पर्यावरण में परिवर्तन एक दोहराने योग्य और मात्रात्मक तरीके से । मस्तिष्क आला के साथ रक्त मस्तिष्क बाधा इंटरफेस मस्तिष्क माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं से बना है जो बेसमेंट झिल्ली, एस्ट्रोसाइट पैर, और पेरिसाइट्स25द्वारा मजबूत होते हैं। हमने रक्त मस्तिष्क बाधा के गठन और विनियमन में उनके महत्व को देखते हुए एस्ट्रोसाइट और एंडोथेलियल घटकों पर चुनिंदा रूप से ध्यान केंद्रित किया। हम इस मंच का उपयोग करके कैंसर कोशिकाओं और ट्यूमर सूक्ष्म पर्यावरण सेलुलर और विनोदी घटकों का निर्माण, बीज, छवि और विश्लेषण कैसे करते हैं, इसका प्रदर्शन करते हैं। अंत में, हम दिखाते हैं कि कैसे मशीन लर्निंग का उपयोग कैंसर कोशिकाओं के आंतरिक फेनोटाइपिक मतभेदों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो एक मॉडल μmBBN के माध्यम से पारगमन करने में सक्षम हैं और उन्हें मस्तिष्क मेटास्टेटिक क्षमता24का एक उद्देश्य सूचकांक प्रदान करने के लिए। इस विधि द्वारा उत्पन्न डेटा सेट का उपयोग मेटास्टेसिस, चिकित्सीय रणनीतियों और दोनों में टीएमई की भूमिका के बारे में बुनियादी और अनुवादात्मक सवालों के जवाब देने के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

1. रक्त मस्तिष्क बाधा आला मोल्ड तैयार

नोट: इस मंच में उपयोग किया जाने वाला खेती उपकरण एक पीडीएमएस आधारित पाड़ है जिस पर हम एक सेलुलर रक्त मस्तिष्क बाधा का निर्माण करते हैं। यह एक छिद्रपूर्ण झिल्ली से अलग दो भागों से बना है। रक्त मस्तिष्क बाधा आला तैयार करने के लिए फोटोलिथोग्राफी का उपयोग करके बनाए गए दो एसयू-8 मोल्ड26,,27आवश्यक हैं। प्रोटोकॉल पहले 100 माइक्रोन मोटी मोल्ड के लिए वर्णित किया जाएगा और फिर 200 माइक्रोन मोटी मोल्ड के लिए नोट दिए जाएंगे।

  1. मोल्ड तैयार करने के लिए, एक निचोड़ बोतल के साथ एसीटोन का उपयोग करके 4 "सिलिकॉन वेफर को साफ करें और फिर इसे नाइट्रोजन बंदूक से सुखाएं।
    1. सभी अवशिष्ट सॉल्वेंट को हटाने के लिए 200 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एक हॉटप्लेट पर सिलिकॉन वेफर बेक करें।
    2. बदले में एक स्पिन कोटर के चक पर सिलिकॉन वेफर केंद्र और शीर्ष मोल्ड के लिए SU8-2075 के 1 एमएल बांटना । फोटोरेसिस्ट को तितर-बितर करने के लिए 500 आरपीएम (त्वरण 300 आरपीएम/एस) पर 5 एस के लिए स्पिन करें और फिर 100 माइक्रोन मोटी एसयू-8 कोटिंग प्राप्त करने के लिए 2200 आरपीएम (त्वरण 300 आरपीएम/एस) पर 30 एस। निर्दिष्ट मोटाई प्राप्त करने के लिए अनुकूलन आवश्यक हो सकता है।
  2. सॉफ्ट बेक एक हॉटप्लेट पर 2 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर और फिर तुरंत 20 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर।
  3. वेफर को फोटोलिथोग्राफी लैंप में रखें और मानक प्रक्रियाओं के अनुसार वेफर पर केंद्रित मास्क की स्थिति रखें। यूवीबी (360 एनएम ± 10 एनएम) के230 एमजे/सेमी 2 की चमक के साथ एसयू-8 लेपित वेफर्स का पर्दाफाश करें। इष्टतम खुराक निर्धारित करने के लिए एक एक्सपोजर मैट्रिक्स प्रयोग किया जा सकता है। मास्क डिजाइन पूरक फ़ाइल 1में उपलब्ध हैं।
  4. 2 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर पोस्ट-एक्सपोजर बेक करें और फिर आसंजन में सुधार करने के लिए 10 मिनट के लिए तुरंत 98 डिग्री सेल्सियस पर। वेफर को 50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
  5. एसयू-8 फोटो-डेवलपर का उपयोग करके संयुक्त राष्ट्र के उजागर विरोध को हटा दें। एक स्नान में 5 मिनट के लिए डेवलपर में वेफर कुल्ला और फिर एक रासायनिक हुड में एसयू-8 डेवलपर से भरा स्प्रे बोतल का उपयोग करने के लिए आंदोलन और शेष असुरक्षित एसयू-8 को दूर । यदि सभी असित एसयू-8 को हटा दिया गया है तो निरीक्षण करने के लिए 4x माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जा सकता है। फोटोरेसिस्ट सुविधाओं के किनारों पर एक सफेद रेखा इंगित करती है कि एसयू-8 को पूरी तरह से हटाया नहीं गया है।
  6. 60 मिनट के लिए 110 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में एक अंतिम हार्ड बेक प्रदर्शन करते हैं।
  7. एसयू-8 2075 का उपयोग करके 200 माइक्रोन मोटी मोल्ड के लिए एक ही प्रक्रिया का पालन करें, लेकिन प्रोटोकॉल को निम्नलिखित में समायोजित करें:
    1. स्पिन कोटर सेटिंग्स: फोटोरेसिस्ट को तितर-बितर करने के लिए 500 आरपीएम (त्वरण 300 आरपीएम/एस) पर 5 एस के लिए स्पिन करें और फिर 200 माइक्रोन मोटी कोटिंग प्राप्त करने के लिए 1300 आरपीएम (त्वरण 300 आरपीएम/एस) पर 30 एस।
    2. 2 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर नरम सेंकना तो 40 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर।
    3. ३४० mJ/सेमी2का एक्सपोजर समय ।
    4. पोस्ट एक्सपोजर बेक: 65 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट, और फिर 15 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस।
  8. अंत में, एक प्लास्टिक कंटेनर के साथ रासायनिक हुड के अंदर एक वैक्यूम कक्ष में रखकर प्रत्येक वेफर को सीलनाइज करें जिसमें सीलनिंग समाधान (ट्राइक्लोरो परफ्लो ऑक्टिल सिलेन) की 3 बूंदें (~ 150 माइक्रोन) रखी गई हैं। एक वैक्यूम खींचो और वाष्प को वेफर कोट करने की अनुमति देने के लिए रात भर छोड़ दें। यह कदम एसयू-8 और पीडीएमएस के बीच आसंजन को कम करता है, जिससे मोल्ड की जिंदगी बढ़ती है।
    सावधानी: ट्राइक्लोरो परफ्लोरोक्टाइल सिलेन को हमेशा धुएं के हुड में संभाला जाना चाहिए और जल स्रोतों से दूर रखा जाना चाहिए।
  9. डबल-तरफा टेप की दो स्ट्रिप्स का उपयोग करके व्यक्तिगत वेफर मोल्ड्स को 150 मिमी पेट्री व्यंजनों में रखें। सुनिश्चित करें कि वेफर्स फ्लैट हैं। एक विकल्प के लिए एक एल्यूमीनियम मोल्ड जिसके भीतर वेफर रखा जा सकता है बनाना है । क्योंकि एल्यूमीनियम मोल्ड संलग्न है यह एक समान मोटाई के साथ डाले का उत्पादन होगा, जबकि पेट्री पकवान विधि सतह के झुकाव के प्रति संवेदनशील है यह पर रखा है । पीडीएमएस के बेहतर फ्लैटनेस डाउनस्ट्रीम कॉन्फोकल इमेजिंग समय को कम कर देता है।

2. फार्म और PDMS रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) डिवाइस को इकट्ठा

  1. एक प्लास्टिक कप में वजन से 1:10 (क्रॉसलिंकर: बेस) के अनुपात में पीडीएमएस के 75 ग्राम मिलाएं।
  2. मोल्डों पर पीडीएमएस डालें (200 माइक्रोन मोटी मोल्ड के लिए 1 मिमी मोटी और 100 माइक्रोन मोटी मोल्ड के लिए 4 मिमी) और एक घंटे के लिए वैक्यूम डेसिकेटर में डेगास या जब तक सभी बुलबुले हटा दिए गए हैं। रात भर 65 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें। 1 मिमी मोटाई को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में 10x उद्देश्य की कार्य दूरी के आधार पर समायोजित किया जा सकता है।
  3. पीडीएमएस ठीक होने के बाद किनारों के आसपास पीडीएमएस के माध्यम से वेफर के खिलाफ धीरे से कटौती करने के लिए एक ब्लेड का उपयोग करें। पीडीएमएस को छील दें और आयताकार गाइड और डिवाइस पर इनलेट्स और आउटलेट खोलने के लिए 1.5 मिमी बायोप्सी पंच के साथ काटने के लिए एक ब्लेड का उपयोग करें। पीडीएमएस डिवाइस के हिस्सों को धूल और मलबे से साफ रखने के लिए 48 मिमी चौड़े पैकिंग टेप के साथ कवर करें।
  4. अगला उपयोग विच्छेदन कैंची 5 मिमी x 50 मिमी आयत पॉलीकार्बोनेट झिल्ली को 5 माइक्रोन मीटर छिद्रों के साथ काटने के लिए और बाद में उपयोग के लिए पेट्री डिश के अंदर स्टोर करें।
  5. निम्नलिखित इकट्ठा करें: 200 माइक्रोल पिपेट टिप, 1:10 पीडीएमएस के 2 एमएल को एक ग्लास शीशी में वजन से 2:3 के अनुपात में टॉल्यून के साथ मिश्रित, एक निचोड़ बल्ब के साथ एक पाश्चुर पिपेट, तैयार पीडीएमएस ऊपरी और निचले हिस्सों, झिल्ली, तीन 50 मिमी x 75 मिमी ग्लास स्लाइड और यह सब एक स्पिन कोटर के लिए परिवहन। डिवाइस की असेंबली और सेल सीडिंग के लिए निम्नलिखित चरणों को चित्र 1में दर्शाया गया है ।
  6. पीडीएमएस के 1 एमएल को स्थानांतरित करने के लिए पाश्चर पिपेट का उपयोग करें: स्पिन कोटर के चक पर 50 मिमी x 75 मिमी ग्लास स्लाइड में टोल्यून गोंद समाधान। 100 आरपीएम (त्वरण 300 आरपीएम/एस) पर 5 सेकंड के लिए स्पिन और 2000 आरपीएम (त्वरण 300 आरपीएम/एस) पर 30 सेकंड।
  7. स्लाइड को एक टेबल पर रखें और इसे एक पीडीएमएस अपर चैंबर और एक निचले चैंबर के साथ कवर करें ताकि पीडीएमएस इसमें ढाला गया सुविधाओं के साथ सामना करे स्लाइड से संपर्क करें और गोंद को पीडीएमएस चेहरे पर स्थानांतरित कर दिया जाए, सभी सुविधाओं की परिधि को रेखांकित करें।
  8. पीडीएमएस ऊपरी कक्ष को गोंद कोटिंग के साथ एक और स्लाइड पर फ्लिप करें और ध्यान से इनलेट्स और आउटलेट के बीच डिवाइस में झिल्ली रखें। पीडीएमएस में 200 μL टिप रखें: टोल्यूईन गोंद समाधान जब तक कि यह टिप में कुछ दुष्ट न हो जाए। झिल्ली के किनारे के पास एक छोटी सी बूंद रखने के लिए प्रत्येक इनलेट और आउटलेट के बीच टिप को स्पर्श करें जहां यह पीडीएमएस से संपर्क करता है।
  9. डिवाइस के अन्य आधे हिस्से को निकालें और दो भागों पर इनलेट्स और आउटलेट को संरेखित करते हुए गोंद कोटिंग के साथ इसे रखें।
  10. गोंद का इलाज करने के लिए रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इकट्ठे डिवाइस को ओवन में रखें। एक वैक्यूम बेल जार में डिशरेंट के साथ स्थानांतरित करें और दो दिनों के लिए निर्जलीकरण करें। यह टोल्यून को वाष्पित होने की अनुमति देने और प्रयोगशाला हवा में अवशोषित जल वाष्प को विनियमित करके डिवाइस को बोने की निरंतरता में सुधार करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है ।

3. डिवाइस में मस्तिष्क सूक्ष्म पर्यावरण बीज

  1. सेल कल्चर और रिएजेंट्स: इस प्रोटोकॉल को शुरू करने से पहले, निम्नलिखित रिएजेंट्स और सेल्स प्राप्त करें। 5% सीओ2में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट इनक्यूबेटर में सभी सेल लाइनों की खेती करें।
    1. डीएमईएम में 4.5 ग्राम/एल ग्लूकोज के साथ 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 10% एफबीएस और 1x एंटीबायोटिक-एंटीमीको के साथ पूरक मानव ट्रिपल-निगेटिव ब्रेस्ट कैंसर सेल लाइन एमडीए-एमबी-231 (एटीसीसी एचटीबी-26) और एमडीए-एमबी-231-बीआर-जीएफपी कोशिकाओं (पेट्रीसिया स्टीग, पीएचडी से प्राप्त) बनाए रखें । खाली वेक्टर पीएलएल-ईवी-जीएफपी लेंटीवायरस के साथ एमडीए-एमबी-231 सेल को ट्रांसड्यूस करके एमडीए-एमबी-231-जीएफपी फ्लोरोसेंट सेल बनाएं। प्रयोग से पहले फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (FACS) का उपयोग करके ट्रांसड्यूडेड जीएफपी+ आबादी को सॉर्ट करें।
    2. ईजीएम-2 माध्यम में मानव मस्तिष्क माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं एचसीएमईसी/डी3 को बनाए रखें। खाली वेक्टर पीएलएल-3.7-डीएसरेड लेंटीवायरस के साथ hCMEC/DsRed फ्लोरोसेंट कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करके बनाएं । प्रायोगिक उपयोग से पहले एफएसीएस का उपयोग करके संस्कृति से सभी गैर-ट्रांसड्यूड, गैर-फ्लोरोसेंट कोशिकाओं को हटा दें।
    3. डीएमईएम में सामान्य मानव एस्ट्रोसाइट्स (एनएचए) को बनाए रखें 4.5 ग्राम/एल ग्लूकोज, 10% एफबीएस, 2 एमएम ग्लूटामैक्स, 1 एमएम सोडियम पाइरुवेट, 1x एन-2 ग्रोथ सप्लीमेंट और 1x एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक के साथ पूरक। पीएलओएक्स-टीईआरटी-आईरेसटिक लेंटीवायरल वेक्टर (ऐडजीन 12245) को ट्रांसड्यूस करके एस्ट्रोसाइट्स को अमर करें। प्लाज्मिड पीएसपीएएक्स2 और लिफाफा प्लाज्मिड mMD2.G (Addgene 12260 और 12259) का उपयोग करके वेक्टर बनाएं।
  2. वैक्यूम डेसिकेटर से एक μmBBN डिवाइस निकालें और नीचे का सामना करना पड़ inlets के साथ एक धातु या कागज (यानी, टेप) सतह पर जगह है और यह एक प्लाज्मा कक्ष में डाल दिया । इसके अलावा प्लाज्मा चैंबर में 50 एमएम x 75 एमएम ग्लास स्लाइड रखें। एक वैक्यूम खींचो और फिर 30 एस के लिए 80 डब्ल्यू पर प्लाज्मा के साथ इलाज करें।
  3. प्लाज्मा कक्ष से ग्लास स्लाइड और डिवाइस को जल्दी से हटा दें और डिवाइस को एक गाइड(पूरक फ़ाइल 2)का उपयोग करके गठबंधन ग्लास स्लाइड पर सामना करने वाले इनलेट्स के साथ रखें। इससे पीडीएमएस और ग्लास स्लाइड के बीच परमानेंट बॉन्ड तैयार होगा और इसे दोबारा पोजिशन नहीं किया जा सकता।
  4. इसके बाद टिप से 16, 200 माइक्रोल पिपेट टिप्स, 2 मिमी से टिप्स काट लें। सभी इनलेट्स और आउटलेट्स में पिपेट टिप्स डालें। डिवाइस को इस बिंदु पर वैक्यूम डेसीकेटर में वापस रखा जा सकता है यदि कोशिकाओं को बीज देने के लिए तैयार नहीं है।
  5. डिवाइस को प्लाज्मा कक्ष में वापस रखें और 200 डब्ल्यू में 8 मिनट के लिए प्लाज्मा के साथ इलाज करें। प्लाज्मा उपचार से डिवाइस ठंडा (5 मिनट) के बाद यह एक बाँझ माध्यमिक कंटेनर के अंदर जगह है, एक पारदर्शी पिपेट टिप बॉक्स की तरह । ~ 15 मिनट के भीतर अगले कदम प्रदर्शन या प्लाज्मा उपचार की प्रभावशीलता को कम किया जा सकता है जिससे क्लोजिंग हो सकती है।
  6. प्रयोग संस्कृति पेट्री व्यंजन 1 x 106 एंडोथेलियल कोशिकाओं (hCMEC/D3-DsRed) और 1 x 106 एस्ट्रोसाइट्स (एनएचए) के व्यंजन से कई दिन पहले । जबकि डिवाइस 8 मिनट प्लाज्मा उपचार के दौर से गुजर रहा है, एक कोलेजन समाधान तैयार जिसमें 0.5 मिलीग्राम/एमएल प्यूरीकोल प्रकार के 0.5 एमएल से मिलकर मैं गोजातीय कोलेजन 0.8 एम नाएचसीओ3 और 10x उच्च ग्लूकोज (250 मीटर) एमईएम के 20 माइक्रोन के साथ 64 माइक्रोन के साथ तैयार करें। कोलेजन समाधान में 5.0 x10 5 एनएचए कोशिकाओं को निलंबित करें। उपयोग में नहीं रहते हुए बर्फ पर समाधान बनाए रखें।
  7. कोलेजन/एस्ट्रोसाइट/माइक्रोग्लिया समाधान के १२० μL को नीचे कक्ष(चित्रा 1 लाल तीर)के लिए पिपेट टिप के माध्यम से डिवाइस में स्थानांतरित करें । विपरीत पिपेट टिप में कक्ष भर में बाती करने के लिए समाधान की अनुमति दें। डिवाइस के सभी चार चैनलों के बाद सीओ2 इनक्यूबेटर में चिप को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में1 घंटे के लिए या कोलेजन सेट होने तक रखें।
  8. कोलेजन सेट के बाद, सभी पिपेट टिप्स को पूर्ण मीडिया के मिश्रण के साथ नीचे के कक्ष को खिलाते हुए भरें। एंडोथेलियल कोशिकाओं और एस्ट्रोसाइट्स युक्त चिप्स के लिए, एंडोथेलियल का 50:50 मिश्रण: एस्ट्रोसाइट मीडिया का उपयोग किया जाता है।
  9. कोट 2% विकास के साथ ऊपरी कक्ष-कारक ने ऊपरी कक्ष पिपेट टिप(चित्रा 1 नीले तीर)का उपयोग करके पूर्ण एंडोथेलियल मीडिया में मैट्रिगेल को कम किया और 1 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में रखें।
  10. संकेतित मीडिया मिश्रण और वैकल्पिक जो टिप एंडोथेलियल कोशिकाओं(चित्रा 1 हरे तीर)के साथ वरीयता प्राप्त है के साथ ऊपरी कक्ष कुल्ला । एंडोथेलियल मीडिया के 1 एमएल में 1 x10 6 एंडोथेलियल कोशिकाओं को निलंबित करें और यहां तक कि कवरेज के लिए ऊपरी कक्ष सुझावों को बारी-बारी से हर 15 मिनट में बीज 30 माइक्रोन करें। बीज एंडोथेलियल कोशिकाओं को प्रत्येक ऊपरी कक्ष टिप में दो बार, प्रति कक्ष कुल 4 बार के लिए।
  11. एंडोथेलियल कोशिकाओं की अंतिम सीडिंग के बाद, सभी युक्तियों को मीडिया मिश्रण के साथ भरें और डिवाइस को इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर रखें, दोनों कक्षों में मीडिया को हर 12 घंटे में बदलते हैं।

4. एंडोथेलियल लेयर गठन की प्रगति की निगरानी करें

  1. एंडोथेलियल लेयर द्वारा चैनल का पूरा कवरेज 3 दिनों के बाद मनाया जाता है। एंडोथेलियल बैरियर के कवरेज की निगरानी के लिए दो तरीकों में से एक का उपयोग करें: फ्लोरेसेंस या टीयर। HCMEC/D3-DsRed फ्लोरेसेंस और चैनल क्षेत्र में % कवरेज के अनुसार ImageJ का उपयोग कर मात्रा निर्धारित किया जा सकता है ।
    1. HCMEC/D3-DsRed बाधा के ImageJ प्रतिनिधि में झगड़ा फ़ाइल खोलें । इमेजजे सॉफ्टवेयर में फाइल का चयन करने के लिए फाइल एंड जीटी; ओपन पर क्लिक करें।
    2. इन प्रमुख आदेशों और विकल्पों का उपयोग करके अधिकतम तीव्रता का उपयोग करके छवि की सभी जेड-परतों को मर्ज करें: छवि और जीटी; स्टैक और जीटी; जेड परियोजना और सभी जेड स्लाइस, अधिकतम तीव्रता।
    3. एक रंग सीमा का प्रदर्शन करें जो इस विधि का उपयोग करके मूल्यांकन किए गए सभी माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स में समान है। अध्ययन प्रस्तुत करने के लिए हम ४५० की एक दहलीज कार्यरत हैं । इमेजजे में थ्रेसहोल्ड मेन्यू का इस्तेमाल करें: इमेज एंड जीटी; एडजस्ट करें और थ्रेसहोल्ड।
    4. निम्नलिखित आदेशों और विकल्पों का उपयोग करके रिकॉर्ड किए जाने वाले मापों को निर्धारित करें: विश्लेषण करें और माप निर्धारित करें और सीमा सीमा, क्षेत्र अंश तक सीमित करें।
    5. बॉक्स खींचकर मापने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के प्रतिनिधि क्षेत्र का चयन करें। बॉक्स टूल इमेजजे के मुख्य मेनू पर स्थित है। उपाय 3 तकनीकी एक ही बॉक्स आकार का उपयोग कर प्रत्येक microfluidic चैनल के शुरुआत, मध्य और अंत में तैनात प्रतिकृति।
    6. प्रत्येक चैनल का विश्लेषण करें और% एंडोथेलियल कवरेज का प्रतिनिधित्व करते हुए क्षेत्र अंश रिकॉर्ड करें। इन मापों को स्प्रेडशीट फाइलों के रूप में निर्यात करें ताकि निम्नलिखित आदेशों का उपयोग करके डेटा को प्लॉट और कल्पना की जा सके: विश्लेषण और उपायकरें।
  2. एक विकल्प के रूप में, प्रति क्षेत्र एंडोथेलियल टाइट जंक्शनों को मापने के लिए बाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी-आधारित टीईईआर का उपयोग करें। टीईईआर का उपयोग करके एंडोथेलियल बैरियर का मात्राकरण एक बाधा के रूप में एंडोथेलियल परत की अखंडता के लिए एक प्रॉक्सी है।
    1. ऊपरी और निचले कक्षों के इनलेट और आउटलेट में दो इलेक्ट्रोड रखें।
    2. श्रीनिवासन एट अल द्वारा प्रस्तावित एक मॉडल के अनुसार चिप में प्रतिरोध, प्रेरक और क्षमताओं के संयोजन के रूप में एंडोथेलियल मोनोलेयर की बाधा की मात्रा28,,29।

5. डिवाइस में बीज कैंसर कोशिकाओं

  1. एंडोथेलियल परत परिपक्व होने के बाद, डिवाइस में बीज कैंसर कोशिकाओं। पूर्ण कैंसर सेल मीडिया में 1 x 10 6 कैंसर कोशिकाओं का1 एमएल समाधान तैयार करें।
  2. सेल संस्कृति पोषक तत्वों की भरपाई के लिए चिप में मीडिया का आदान-प्रदान करें।
  3. प्रत्येक शीर्ष कक्ष चैनल को निलंबन में कैंसर कोशिकाओं के 30 माइक्रोन के साथ बीज करें और फिर डिवाइस को 15 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में वापस रखें। हमेशा एक ही डिवाइस के भीतर सभी चार शीर्ष कक्ष चैनलों के एक ही पक्ष पर कैंसर कोशिकाओं बीज ।
  4. डिवाइस को नए मीडिया के साथ एक्सचेंज करें और हर 12 घंटे में सुझावों को फिर से भरें जब तक कि डिवाइस मेटास्टैटिक व्यवहार के लिए चित्रित न हो जाए।

6. कॉन्फोकल इमेजिंग द्वारा ट्यूमर माइक्रो-पर्यावरण की छवि

  1. वांछित प्रायोगिक समय बिंदु (1, 2, या 9-दिन) पर, चैनल की 3डी छवि को कैप्चर करने के लिए कॉन्फोकल इमेजिंग का उपयोग करें। हम यहां वर्णित सेटिंग्स का उपयोग करके निकॉन A1 पर यह कदम उठाते हैं। यह चरण स्वचालित है, और प्रत्येक चैनल को 20-40 मिनट की आवश्यकता होती है, जो इस बात पर निर्भर करता है कि कितने फ्लोरोसेंट चैनल शामिल हैं और सभी कोशिकाओं की स्थितियों को कवर करने के लिए जेड-गहराई की आवश्यकता है।
  2. माइक्रोस्कोप को चालू करें, सॉफ्टवेयर खोलें और इनक्यूबेटर कवर को माइक्रोस्कोप पर रखें।
  3. माइक्रोस्कोप स्टेज हीटर को 37 डिग्री सेल्सियस और सीओ को 2 से5 फीसदी तक यदि उपलब्ध हो तो सेट करें।
  4. माइक्रोस्कोप इनक्यूबेटर स्थिर होने के बाद, डिवाइस को 50 मिमी x 75 मिमी माउंट का उपयोग करके माइक्रोस्कोप चरण में रखें।
  5. डिवाइस के एक तरफ ध्यान केंद्रित करें (बाएं यदि प्रदान किए गए विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ उपयोग किया जाना है) 10x उद्देश्य के साथ और जेड ऊंचाई को शून्य के रूप में सेट करें। जेड-स्टैक सेटिंग्स के तहत, फोकस प्लेन के नीचे 100 माइक्रोन और 200 माइक्रोन की रेंज शामिल करें। फिर 15% ओवरलैप के साथ क्रमशः एक्स और वाई फील्ड्स की संख्या 1 और 9 तक सेट करने के लिए सिलाई सेटिंग का उपयोग करें। पिनहोल को उसकी अनुशंसित न्यूनतम और जेड-लेयर ऊंचाई को 9 माइक्रोन में सेट करें। उज्ज्वल क्षेत्र जोखिम को समायोजित करें ताकि छिद्रपूर्ण झिल्ली दिखाई दे। डीएसरेड (561 एनएम) और जीएफपी (488 एनएम) चैनलों के लिए उत्तेजन लेजर चालू करें और फ्लोरोसेंट लेजर शक्तियों और कटऑफ को समायोजित करें ताकि प्रत्येक चैनल पिक्सल को ओवरएक्सपोज़ किए बिना दिखाई दे।
  6. सत्यापित करें कि जब सभी फ़ील्ड पर कदम रखते हैं तो सभी फ़ील्ड फोकस में होते हैं। यदि हां, तो छवि के लिए आउटपुट फ़ाइल नाम (001.nd2) दर्ज करें और 3डी कॉन्फोकल इमेज को स्वचालित रूप से कैप्चर करने के लिए प्रयोग शुरू करें।

7. कॉन्फोकल टोमोग्राफी के माध्यम से ट्यूमर माइक्रो-पर्यावरण को मापें

  1. डिवाइस के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं और ट्यूमर सूक्ष्म वातावरण का वर्णन करने वाले मैट्रिक्स और मापों के एक सेट का अनुमान लगाने के लिए कॉन्फोकल टोमोग्राफी का उपयोग करें। कॉन्फोकल टोमोग्राफिक विश्लेषण(चित्रा 2)एक कॉन्फोकल जेड-स्टैक को कोशिकाओं के त्रि-आयामी प्रतिनिधित्व में परिवर्तित करता है। Jupyter नोटबुक/प्रयोगशाला पर्यावरण के भीतर एक कस्टम अजगर स्क्रिप्ट का उपयोग करना, एक विमान तो कोशिकाओं की परत है जो झिल्ली30की तरह रक्त मस्तिष्क बाधा फार्म से मिलान किया जाता है । अंत में, कैंसर सेल आबादी(तालिका 1)के फेनोटाइपिक माप बनाएं।
    1. किसी प्रयोग के अंत में या एक समय के दौरान इस विश्लेषण को करें। संदर्भित सॉफ्टवेयर गाइड के अनुसार अजगर और उपयुक्त पुस्तकालयों को स्थापित करें, फिर "कोंडा एक्टिवेट" कमांड चलाकर विंडोज कमांड प्रॉम्प्ट से सॉफ्टवेयर खोलें, इसके बाद "ज्यूडिटर लैब"। जुपिटर वातावरण डिफ़ॉल्ट ब्राउज़र के भीतर लोड होगा।
    2. जूपिटर फ़ाइल एक्सप्लोरर से डबल क्लिक करें Jupyter नोटबुक "contom.ipynb" इसे खोलने के लिए । शीर्षक आयात पुस्तकालयों, कस्टम कक्षाएं/कार्यों के नीचे सेल चलाएं और नोटबुक सेल पर क्लिक करके नोटबुक सेटअप करें और फिर प्ले बटन पर क्लिक करें । नीचे दी गई सभी नोटबुक कोशिकाओं को एक ही दृष्टिकोण का उपयोग करके निष्पादित किया जाता है। ध्यान दें कि यहां नोटबुक "सेल" जुपिटर नोटबुक के भीतर अजगर कोड के ब्लॉक को संदर्भित करता है।
  2. डाटा तैयार करें। यह एल्गोरिदम जेड-स्टैक और त्रि-आयामी डेटा17में हेरफेर और प्रदर्शित करने के लिए विज़ुअलाइज़ेशन टूलकिट (वीटीके) का उपयोग करता है।
    1. प्रदान की गई जगह । XLSX फ़ाइल ("प्रयोग ट्रैकर.xlsx") Jupyter नोटबुक के रूप में एक ही खिड़कियों फ़ोल्डर में । फ़ाइल जुपिटर नोटबुक के साथ प्रयोगों और इंटरफेस को ट्रैक करती है। धारा 6 से ND2 फ़ाइल को जुपिटर नोटबुक स्थान के नीचे "\ Experiment_XXX \ Confocal\" नामक एक सबफोल्डर में रखें। नए फ़ोल्डर को सौंपे गए संख्यात्मक आईडी में "XXX" को समायोजित करके अतिरिक्त प्रयोग फ़ोल्डर जोड़े जा सकते हैं।
    2. पहले प्रयोग फ़ोल्डर "Experiment_001" और ND2 फ़ाइल "001.nd2" लेबल। सबसे पहले, ND2 इमेजिंग फ़ाइल को रंग चैनल द्वारा अलग की गई एक सिले हुए बहु-छवि झगड़ा फ़ाइल में परिवर्तित करें। Save_tiff_from_ND2 () कार्य अकंपमेंटेड30के साथ "स्मृति में कॉन्फोकल जेड स्टैक पढ़ें" शीर्षक के नीचे नोटबुक सेल को निष्पादित करके ऐसा करें। ND2 फ़ाइल निकॉन से एक मालिकाना इमेजिंग प्रारूप है, इस प्रकार इसे एक प्रारूप में परिवर्तित करना आवश्यक है जो ओपन सोर्स सॉफ्टवेयर के साथ संगत है।
      नोट: झगड़ा (टैग इमेज फाइल फॉर्मेट) का उपयोग इसलिए किया जाता है क्योंकि यह सर्वव्यापी है, 16 बिट संगत है, आसानी से वीटीके में आयात किया जाता है, और कई छवियों को एक ही फ़ाइल में संग्रहीत किया जा सकता है, जो जेड-स्टैक छवियों के लिए उपयुक्त है। नोटबुक सेल को निष्पादित करना ND2 फ़ाइल से एक छवि में पढ़ा जाएगा, रंग और XYZ पदों की जानकारी निकालने तो एक पूर्व निर्धारित संरचना के अनुसार एक numpy सरणी में है कि छवि स्टोर । इसके बाद यह अजगर लाइब्रेरी टिफफाइल का उपयोग करके एक झगड़ा फ़ाइल के रूप में सरणी को बचाएगा।
  3. इमेजिंग डेटा को 3D मॉडल में परिवर्तित करें
    1. कोशिकाओं(चित्रा 2)की कल्पना करने के लिए 3डी रेंडरिंग का उपयोग करके TIFF फ़ाइल को वीटीके (vtkTIFFReader) में आयात करें। छवि में कोशिकाओं के रंग के आधार पर एक सीमा का चयन करें। स्पष्ट करने के लिए, वीटीके ऑब्जेक्ट अंतरिक्ष (मात्रा) में पिक्सल (एक्स, वाई, जेड) के एक ब्लॉक का प्रतिनिधित्व करता है लेकिन केवल कुछ पिक्सेल (हरा या लाल) कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है, बाकी पृष्ठभूमि या शोर (काला) हैं।
    2. इसलिए, पृष्ठभूमि को हटाने वाली मात्रा पर एक अस्पष्टता फ़िल्टर सेट करें जो इस बात की पुष्टि करता है कि फ्लोरेसेंस केवल कोशिकाओं को ही रहता है। Channel_alpha वैल्यू वेरिएबल्स (यानी GFP_alpha) को एडजस्ट करके प्रत्येक माइक्रोस्कोप चैनल के लिए अस्पष्टता मूल्यों को बदलें, शीर्षक से जुपिटर नोटबुक सेल का उपयोग करके ऐसा करें। देखें एक 3D प्रतिपादन शीर्षक नोटबुक सेल का उपयोग कर प्रभाव की कल्पना करने के लिए सीमा को सत्यापित करने के लिए सही ढंग से सेट कर रहे हैं।
    3. अगले चरण में उपयोग करने के लिए स्प्रेडशीट में अस्पष्टता मूल्यों को सहेजें। वॉल्यूम डेटा को अलग-अलग 3D ऑब्जेक्ट्स में परिवर्तित करें, प्रत्येक छवि में एक कोशिका का प्रतिनिधित्व करते हुए एक तकनीक का उपयोग करके31मार्चिंग क्यूब्स कहा जाता है। यह एल्गोरिदम स्वरों के त्रि-आयामी असतत स्केलर क्षेत्रों से आइसोसुरफेस का एक बहुभुज जाल निकालता है।
    4. पृष्ठभूमि से प्रत्येक सेल को अलग करने के लिए मार्चिंग क्यूब्स एल्गोरिदम में अस्पष्टता मूल्य का उपयोग करें। एक त्रिकोणीय जाल में परिवर्तित स्वर छवि चलाकर प्रत्येक माइक्रोस्कोप चैनल में पहचाने गए सभी फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के लिए इस चरण को पूरा करें और नोटबुक में वीटीके फ़ाइल के रूप में सहेजें।
  4. झिल्ली के लिए एक विमान फिटिंग
    1. पहले सेल सेंट्रोइड्स (नोटबुक सेल: आरएफपी चैनल (एंडोथेलियलबैरियर) का विश्लेषण करके एंडोथेलियल बैरियर के लिए एक विमान फिट करें। सूची के माध्यम से मात्रा में मेष और वीटीके से पॉलीडेटाकनेक्टिविटीफिल्टर का उपयोग करके जुड़े नहीं क्षेत्रों को निकालने के लिए। प्रत्येक जाल के केंद्र की गणना करें और माप को उन मेश के लिए फ़िल्टर करने वाले सेंट्रोइड की सूची में जोड़ें जो बहुत बड़े या बहुत छोटे हैं (<50, >1000000 voxels)।
    2. त्रुटि विधि (नोटबुक सेल: आरएफपी सेंट्रोइड्स (एंडोथेलियल बैरियर)के लिए एक विमान फिट(चित्रा 2, चित्रा 3)32का उपयोग करके एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए सेंट्रोइड की सूची में एक विमान फिट करें। विमान और सेंट्रोइड की साजिश रचकर विमान के फिट का निरीक्षण करें और यदि आवश्यक हो तो मैन्युअल रूप से समायोजित करें (थेटा, बीटा और जेड का उपयोग करके) नोटबुक सेल चलाकर, जिसका शीर्षक था विजुअलाइज आरएफपी सेंट्रोइड और प्लेन फिट।
    3. विमान ठीक से फिट होने के बाद, प्रयोग ट्रैकर फ़ाइल को विमान के सामान्य को बचाएं। भविष्य के उपयोग के लिए XLSX फ़ाइल।
  5. निम्नलिखित वर्णनकर्ताओं(तालिका 1)के लिए व्यक्तिगत कैंसर कोशिकाओं की वर्णनात्मक विशेषताओं का विश्लेषण करें।
    नोट: यदि विश्लेषण करने वाला कंप्यूटर पिछड़ रहा है, तो उच्च प्रदर्शन कंप्यूटिंग के माध्यम से उच्च थ्रूपुट विश्लेषण एक विकल्प है। यह एल्गोरिदम कोशिकाओं की छोटी संख्या के विश्लेषण के लिए मानक लैपटॉप पर उपयोगी है, हालांकि वीटीके बड़ी संख्या में व्यक्तिगत वस्तुओं (>1000) के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं है। इसलिए, उच्च प्रदर्शन वाले कंप्यूटिंग क्लस्टर पर कार्य करने के लिए अनुकूलित एल्गोरिदम का उपयोग करना वैकल्पिक है। यह कई कोशिकाओं(चित्रा 2)के साथ प्रयोगों का तेजी से विश्लेषण करने में सक्षम बनाता है। 7.5 के सभी नोटबुक कोशिकाओं को चलाकर पूरा किया जाता है जिसका शीर्षक है कि फेनोटाइपिक वर्णनकर्ताओं के लिए शेष माइक्रोस्कोप चैनलों का विश्लेषण करें और Experiment_tracker जानकारी में पढ़ें और मौजूद चैनलों का विश्लेषण करें।
    1. कैंसर कोशिकाओं के अपव्यय को मापें: एक विमान के साथ एंडोथेलियल परत की विशेषता के बाद, झिल्ली के माध्यम से माइग्रेट किए गए प्रत्येक कैंसर कोशिका की मात्रा को मापें। प्रत्येक कोशिका (बूलियन) को क्लिप करें ताकि झिल्ली के नीचे का जाल रखा जाए और झिल्ली के ऊपर के हिस्से को33हटा दिया जाए। फिर खुली जाल (vtkFillHoles) बंद करें।
      1. काटा जाल के सामान्य और नए केंद्र की गणना करें। विश्लेषण के लिए प्रत्येक काटा कैंसर सेल की मात्रा और स्थिति को मापने। वॉल्यूम प्रत्येक एकल सेल के जाल भरने वाले स्वरों की संख्या के बराबर है। एंडोथेलियल प्लेन और प्रत्येक कैंसर सेल की स्थिति के बीच की दूरी की गणना करें।
    2. सेलुलर फेनोटाइप को मापें: प्रत्येक कैंसर कोशिका के आकार, मात्रा और स्थिति को फैक्टर करके आकृति विज्ञान की गणना करें।
  6. माप को मान्य करें और स्प्रेडशीट या साजिश में सहेजें। चेक शीर्षक से नोटबुक सेल चलाएं कि सेंट्रोइड्स को सही मापा गया था और एक रेंडर सेल प्रकार द्वारा इमेज्ड वॉल्यूम के शीर्ष पर पहचाने गए सेंट्रोइड को दिखाता है। सभी प्रयोगों के बाद एक एकल स्प्रेडशीट फ़ाइल के रूप में पूरा डेटा सेट निर्यात कर रहे है नोटबुक सेल में आईडी द्वारा शामिल किया जा करने के लिए एक एकल डेटा के रूप में डेटा निर्यात शीर्षक से एक ही डेटा.XLSX दिया प्रयोग आईडी की जगह चर प्रयोगों के लिए फ़ाइल । यदि पूरा डेटा सेट सत्यापित करें, तो इसे दूरी एक्स्ट्राास्रेटेड स्ट्रिप प्लॉटशीर्षक से नोटबुक सेल का उपयोग करके प्लॉट करें। प्लॉट नोटबुक पर्यावरण में दिखाई देगा और फाइल करने के लिए बचत करेगा।

8. आर्टिफिशियल इंटेलिजेंस का उपयोग कर संबंधित विशेषताओं का विश्लेषण

नोट: आर्टिफिशियल इंटेलिजेंस एल्गोरिदम का उपयोग करके मेटास्टैटिक फेनोटाइपिक सुविधाओं की पहचान करें।

  1. चित्रा 5 और पूरक फ़ाइल 3में दर्शाई गई योजना के अनुसार ऑरेंज का उपयोग करके बाइनरी वर्गीकरण करें। "कोंडा एक्टिवेट" टाइप करके ऑरेंज को दूसरे विंडोज कमांड प्रॉम्प्ट से शुरू करें और इसके बाद "पायथन-एम ऑरेंज.कैनवास" और प्रॉम्प्ट से नए पर क्लिक करें। ऑरेंज एक ड्रैग एंड ड्रॉप आधारित सॉफ्टवेयर है, इसलिए पूरक फ़ाइल 3से मेल खाने के लिए बाएं मेनू से प्रत्येक आइटम को कैनवास पर खींचकर कार्यों की व्यवस्था करें। उसके बाद पूरा डबल फाइल आइकन पर क्लिक करें और डेटा.XLSX फ़ाइल का चयन करें।
  2. खराब मापों को हटाने के लिए डेटा को फ़िल्टर करें, जिन्हें उन लोगों के रूप में परिभाषित किया गया है जो बूलियन ऑपरेशन में विफल रहे हैं या "चुनिंदा पंक्तियों" आइकन का उपयोग करके ज्ञात सीमाओं के बाहर पैरामेट्रिक चर मूल्य दे रहे हैं। "स्पिरसिटी 0 और 1 के बीच है" जैसे फ़िल्टर के अनुरूप आइकन और सेट शर्तों पर डबल क्लिक करें। 8.2.1, 8.2.2 और 8.2.3 के लिए स्थितियां बनाएं।
    1. -100-200 माइक्रोन से लेकर दूरी अपव्यवसुप्त माप को फ़िल्टर करें।
    2. सेल आकार के फिल्टर स्पेरीसिटी माप 0-1 से लेकर।
    3. 0-2000 स्वरों से लेकर फिल्टर कैंसर सेल वॉल्यूम माप।
    4. ब्रेन-मेटास्टैटिक एमडीए-एमबी-231-बीआर-जीएफपी और नॉन-ब्रेन मेटास्टैटिक एमडीए-एमबी-231-जीएफपी को वर्गीकृत करने के लिए सभी पैरामेट्रिक वेरिएबल्स(टेबल1) का इस्तेमाल करें। कैनवास से कॉलम आइकन चुनें डबल क्लिक करें। उपलब्ध चरों को या तो सुविधाओं,लक्ष्य चर या मेटा विशेषताओंमें स्थानांतरित करने केलिए और अधिक बटन का उपयोग करना । एकमात्र चर जो लक्ष्य चर होना चाहिए वह मेटास्टैटिक लेबल है जो यह परिभाषित करता है कि डेटा सेट में कोशिकाओं को मेटास्टैटिक (1) माना जाता है या नहीं (0)। प्रयोग चर मेटा गुण अनुभाग में रखा जा सकता है।
  3. एक प्रशिक्षण में डेटा का नमूना (80%) और टेस्ट सेट (20%)। डेटा पारखी आइकन पर डबल क्लिक करें और डेटा के निश्चित अनुपात के एक नमूना प्रकार का चयन करें: ८०% के लिए सेट और प्रतिकृति और स्तरीकरण चेक बक्से का चयन करें । प्रत्येक मॉडल/क्लासिफायर के मुकाबले 10 गुना का उपयोग करके प्रशिक्षण सेट को स्तरिफाई और क्रॉस-मान्य करें । डबल क्लिक टेस्ट और स्कोर और सिलवटों की संख्या के साथ क्रॉस सत्यापन का चयन करें: 10 और स्तरीकृत जांच के लिए सेट करें। लक्ष्य वर्ग को 1सेट करें ।
  4. इस विधि में, तंत्रिका नेटवर्क और रैंडम वन लर्निंग एल्गोरिदम का उपयोग करें क्योंकि वे डेटा के लिए मजबूत हैं। रैंडम वन आइकन के भीतर, पेड़ों की संख्या 50 होने का चयन करें और किसी भी अन्य विकल्प का चयन न करें। तंत्रिका नेटवर्क आइकन के भीतर न्यूरॉन्स प्रति छिपे हुए लेटआर चुनें: 100, एक्टिवेशन: आरू, सॉल्वर: एडम, अल्फा: 0.0001,और मैक्स पुनरावृत्ति: 200। हालांकि, इन सेटिंग्स अध्ययन से काफी भिन्न होंगे और आवेदन से पहले अच्छी तरह से समझा जाना चाहिए।
  5. कैनवास को डबल सेट करने के बाद फाइल से लेकर सैंपल डेटा तक प्रत्येक आइकन पर क्लिक करें और या तो हिट अप्लाई करें या डेटा भेजें। डबल क्लिक टेस्ट और स्कोर और प्रशिक्षण डेटा एल्गोरिदम का उपयोग करके एक मॉडल विकसित करने के लिए उपयोग किया जाना शुरू हो जाएगा। मशीन लर्निंग मॉडल को प्रशिक्षित करने के बाद, टेस्ट और स्कोर को फिर से खोलें और टेस्ट डेटा पर टेस्ट का चयन करें और चिप में कोशिकाओं को वर्गीकृत करके मॉडल के प्रदर्शन को स्कोर करने के लिए पॉपअप विंडो को बंद करें, संभावना के अनुसार वे 0 से 1 तक मस्तिष्क मेटास्टेटिक हैं।
  6. एक फ़ाइल(तालिका 2)के लिए मशीन लर्निंग मॉडल प्रदर्शन को सहेजें। आरओसी के वक्र (एयूसी) के तहत क्षेत्र, सटीकता और F1 स्कोर शामिल करें। एक दूसरी फ़ाइल को सहेजें जिसमें व्यक्तिगत मेटास्टैटिक सूचकांक और वर्गीकरण संभावनाएं शामिल हैं। सेव Save आइकन पर डबल क्लिक करें और वर्गीकरण संभावनाओं को फाइल करने के लिए लिखने के लिए सेव एएस पर क्लिक करें। इसी तरह आरओसी कर्व को डबल क्लिक करके आरओसी एनालिसिस आइकन को देखा जा सकता है और मॉडल परफॉर्मेंस की गणना भ्रम मैट्रिक्स आइकन को डबल क्लिक करके की जा सकती है ।

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Representative Results

इस तकनीक का उपयोग करके, हमने विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन या रंगों के साथ लेबल किए गए सेल प्रकारों का विश्लेषण किया। हम hCMEC/D3-DsRed और गैर फ्लोरोसेंट एस्ट्रोसाइट्स के साथ तैयार एक μmBBN चिप के साथ इस दृष्टिकोण के उपयोग का प्रदर्शन । मस्तिष्क माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को एक छिद्रपूर्ण झिल्ली (5 माइक्रोन ट्रैक नक़्क़ाशीदार छिद्रों) पर वरीयता दी गई थी और 5% सीओ2के तहत37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर 34 में रखा गया था। तीन दिनों के बाद एंडोथेलियल परत की आंतरसंस् ष्ठनी माइक्रोस्कोपी के माध्यम से पुष्टि की गई और फिर कैंसर कोशिकाओं को एंडोथेलियल परत के शीर्ष पर रखा गया। दो स्तन कैंसर सेल लाइनें, एक मस्तिष्क की मांग क्लोन एमडीए-एमबी-231-बीआर-जीएफपी, और माता पिता एमडीए-एमबी-231-GFP कोशिकाओं,को एक एस्ट्रोसाइटिक मस्तिष्क आला३५, ३६, ३७,,३८, ३८,,36३८, ३८,37४०, ४१,41युक्त μmBBN चिप में इनपुट थे ।,, μmBBN चिप्स 1, 2 पर छवि रहे थे, और 9 दिन 3 चैनलों (dsRed, GFP और ब्राइटफील्ड) के साथ एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एक 10x उद्देश्य का उपयोग कर, जेड स्लाइस के साथ हर 9 μm और 1x9 XY सिलाई के लिए पूरे झिल्ली क्षेत्र को कवर । इस माइक्रोस्कोप ने कोशिकाओं पर तनाव को कम करने के लिए इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस का तापमान बनाए रखा।

एक पूर्ण μmBBN चिप(चित्रा 3A)और एंडोथेलियल कवरेज(चित्रा 3बी-डी)की एक प्रतिनिधि छवि दिखाई गई है। उच्च और निम्न कवरेज वाले एंडोथेलियल बाधाओं को कैंसर कोशिकाओं(चित्रा 3B)के अलावा पता लगाने के लिए मात्रा निर्धारित की जाती है। एक μmBBN चिप की प्रतिनिधि छवियां एक कॉन्फ्लोटेड एंडोथेलियल बैरियर के साथ जो प्रयोग(चित्रा 3सी)के लिए स्वीकार्य है और विशेष रूप से खराब एंडोथेलियल कवरेज के साथ एक माइक्रोम्ब्बन चिप प्रदान की जाती है जो कैंसर कोशिकाओं के अलावा के लिए उपयुक्त नहीं है(चित्रा 3 डी)। एंडोथेलियल कोशिकाओं की दीर्घकालिक खेती के परिणामस्वरूप कवरेज हो सकता है जो ऊपर और नीचे μmBBN चिप कक्षों को अलग करने वाली झिल्ली से परे फैला है। एंडोथेलियल कोशिकाएं अक्सर झिल्ली के शीर्ष पर और सीधे दोनों पर बढ़ती हैं, जो मस्तिष्क आला अंतरिक्ष में कैंसर सेल आंदोलन को प्रभावित नहीं करती हैं लेकिन विमान को मुश्किल फिट कर सकती हैं। झिल्ली के μmBBN चिप निर्माण और एंडोथेलियल कवरेज की परिवर्तनशीलता के कारण, प्रतिनिधि विमान एक सामान्य फ्लैट एंडोथेलियल बैरियर(चित्रा 3E)में फिट होते हैं, और एक असामान्य घुमावदार झिल्ली संदर्भ(चित्रा 3F)के लिए प्रदर्शित की जाती है। 40 डिग्री सेल्सियस से ऊपर के तापमान पर ओवन में डिवाइस को सुखाने से एक घुमावदार झिल्ली हो सकती है जैसा कि दिखाया गया है।

हमने विकसित कॉन्फोकल टोमोग्राफिक विश्लेषण का उपयोग करके मात्राकृत एस्ट्रोसाइटिक माइक्रोम्बएन का सामना करते समय एमडीए-एमबी-231-बीआर-जीएफपी और माता-पिता एमडीए-एमबी-231-जीएफपी सेल लाइन के फेनोटाइपिक मतभेदों को देखा। मशीन लर्निंग एल्गोरिदम(टेबल 1)में इनपुट के लिए उपयोग किए जाने वाले 4 फेनोटाइपिक वर्णनकर्ता चित्र 4में प्रदर्शित होते हैं।

दूरी एक्स्ट्राावर एंडोथेलियल बैरियर और μmBBN चिप(चित्रा 4A)में प्रत्येक कैंसर सेल की स्थिति के बीच μm में दूरी का प्रतिनिधित्व करता है । एंडोथेलियल बैरियर 0 माइक्रोन पर स्थित है। दूरी और लेफ्टिनेंट;0 माइक्रोन कैंसर कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं जो प्रवाह कक्ष में बने रहे। दूरी और gt;0 माइक्रोन कैंसर कोशिकाओं है कि एंडोथेलियल बाधा के माध्यम से अतिरिक्त है और मस्तिष्क आला अंतरिक्ष में प्रवेश किया है संकेत मिलता है । μmBBN के संपर्क में 1 दिन के बाद दोनों एमडीए-एमबी-231-बीआर-जीएफपी और एमडीए-एमबी-231-जीएफपी एंडोथेलियल बैरियर के भीतर तैनात थे । हालांकि, 2 और 9 दिनों की बातचीत के बाद एमडीए-एमबी-231-बीआर-जीएफपी का एक सबसेट एस्ट्रोसाइटिक मस्तिष्क आला में चला गया और जीटी;100 माइक्रोन, जबकि माता-पिता एमडीए-एमबी-231-जीएफपी कोशिकाएं एंडोथेलियल बैरियर के निकट रहीं। हमने एंडोथेलियल बैरियर/ब्रेन आला इंटरफेस पर कैंसर सेल की स्थिति को एंडोथेलियल बैरियर से गुजरने वाले प्रत्येक कैंसर सेल की मात्रा की गणना करके हल किया । परिणामस्वरूप प्रतिशत मात्रा(चित्रा 4B)द्वारा अतिरिक्त कैंसर सेल का प्रतिनिधित्व करता है । कोशिका की मात्रा से 0% अपूत कैंसर कोशिकाओं को इंगित करता है जो एंडोथेलियल बैरियर के शीर्ष पर रहते हैं, 100% तक जब कैंसर सेल एंडोथेलियल बैरियर के माध्यम से पूरी तरह से अपूस् ट्रक होता है और मस्तिष्क आला अंतरिक्ष में रहता है। माता-पिता एमडीए-एमबी-231-जीएफपी कोशिकाएं शुरू में μmBBN चिप के संपर्क में आने के 1-दिन के बाद एंडोथेलियल बैरियर के साथ बातचीत करती हैं जो मात्रा द्वारा अतिरिक्त & 50% थीं। 2 में, और 9 दिन एमडीए-एमबी-231-GFP कोशिकाओं कोशिकाओं का एक बड़ा हिस्सा है कि मस्तिष्क आला अंतरिक्ष से दूर बाधा के शीर्ष पर बने रहते हैं बनाए रखने के लिए । एमडीए-एमबी-231-बीआर-जीएफपी कोशिकाओं ने उन कोशिकाओं का अनुपात बनाए रखा जो विशेष रूप से 2-दिन के समय पर और अधिक खर्च किए गए थे।

कैंसर सेल आकार μmBBN के संपर्क की अवधि में नाटकीय रूप से बदल गया । प्रत्येक समय बिंदु पर कैंसर कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियों को चित्र 4सीमें चित्रित किया गया है। कैंसर सेल आकार के रूपात्मक मात्रा की गणना स्पाइरेसिटी का उपयोग करके की गई थी, जो सेल वॉल्यूम और सरफेस एरिया(चित्रा 4D)के लिए खाते हैं। स्पेरीसिटी मीट्रिक 0-1 से होती है, जिसमें 1 एक आदर्श क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। एमडीए-एमबी-231-बीआर-जीएफपी और एमडीए-एमबी-231-जीएफपी कोशिकाएं दोनों ही माइक्रोम्बीएन चिप में अत्यधिक गोलाकार 1-दिन की पोस्ट सीडिंग थीं । μmBBN चिप में बातचीत के 2 और 9 दिनों के बाद, दोनों कैंसर सेल लाइनों के आकार में अपने गोलाकार कम करने के लिए ट्रेंड, हालांकि अलग दरों पर । कैंसर सेल आकार के अलावा, प्रत्येक कैंसर सेल के स्वरों में मात्रा भी कॉन्फोकल टोमोग्राफिक विश्लेषण का उपयोग करके मात्रा निर्धारित की जाती है। प्रत्येक कैंसर सेल लाइन को चित्रा 4ई-एफमें दो समूहों में स्तरीकृत किया गया था: "बाहर", कैंसर कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है जो एंडोथेलियल बैरियर (>90% बाधा के माध्यम से बहिष्कृत) और "में", कोशिकाओं की आबादी जो एंडोथेलियल बैरियर के साथ बातचीत करती है लेकिन (<90% एक्स्ट्राअटाइल्ड) के माध्यम से एक्स्ट्राअवसरेट नहीं करती है। कैंसर सेल उपजनसंख्या है कि एस्ट्रोसाइटिक आला में एक्स्ट्राावेशन कैंसर की कोशिकाओं है कि एंडोथेलियल बाधा के साथ बातचीत में बने रहे, लेकिन पूरी तरह से मस्तिष्क के माध्यम से अतिरिक्त नहीं किया की तुलना में आकार में छोटे थे ।

ब्रेन की मांग करने वाले एमडीए-एमबी-231- बीआर-जीएफपी ने पैरेंटल एमडीए-एमबी-231-जीएफपी से अलग μmBBN चिप्स में एक फेनोटाइपिक पैटर्न का खुलासा किया जिसका फायदा मशीन लर्निंग का इस्तेमाल कर ब्रेन-मेटास्टैटिक और नॉन ब्रेन मेटास्टैटिक कैंसर सेल्स के बीच अंतर करने के लिए किया जा सकता है । डेटा को मॉडल को प्रशिक्षित करने और सत्यापन परीक्षण करने के लिए बेतरतीब ढंग से प्रशिक्षण और सत्यापन डेटासेट में अलग किया गया था। मॉडल को प्रशिक्षित करने के लिए, डेटा को फ़िल्टर करने के बाद कुल 38,859 कोशिकाओं का उपयोग किया गया था और मॉडल का परीक्षण 9,714 व्यक्तिगत कोशिकाओं के खिलाफ किया गया था। प्रशिक्षित मॉडल कैंसर सेल लाइनों और पीडीएक्स-जनित कैंसर कोशिकाओं पर लागू किया गया था जिनका विश्लेषण एस्ट्रोसाइटिक माइक्रोम्ब्बन चिप्स (विभिन्न प्रकार के रोगी मस्तिष्क मेटास्टेस से अलग 4, और 1 प्राथमिक स्तन कैंसर ट्यूमर) मस्तिष्क मेटास्टैटिक संभावना(चित्रा 5)का सूचकांक उत्पन्न करने के लिए किया गया था। आठ अलग-अलग मशीन लर्निंग वर्गीकरण विधियों का परीक्षण किया गया: भोले बेज़, यादृच्छिक वन, निर्णय पेड़, कश्मीर-निकटतम-पड़ोसी(केएनएन), स्टोचस्टिक ग्रेडिएंट वंश, तंत्रिका नेटवर्क और एडाबूस्ट। प्रत्येक विधि का परिणाम तालिका 2में दिखाया गया है। तंत्रिका नेटवर्क और एडाबूस्ट 2 सर्वश्रेष्ठ प्रदर्शन वर्गीकरण विधियां थीं जिन्हें क्रमशः 0.920 और 0.928 के AUC के साथ μmBBN प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके उत्पन्न डेटा के साथ उपयोग के लिए अनुशंसित किया जाता है। इसके अलावा, उन्होंने 0.833 और 0.853 की सटीकता दिखाई। तंत्रिका नेटवर्क और एडाबूस्ट विधियों के लिए सटीक और याद (F1) का औसत 0.847 और 0.860 था। पिछले काम से जहां हमने गैर-मेटास्टैटिक स्तन ट्यूमर और ज्ञात मेटास्टैटिक नमूनों (स्तन, फेफड़े, अंडाशय, जीभ) के पीडीएक्स नमूनों के लिए इस दृष्टिकोण को लागू किया, हमने पाया कि पीडीएक्स नमूनों पर लागू एक ही दृष्टिकोण गैर-मेटास्टैटिक लोगों से मेटास्टैटिक कोशिकाओं की सटीक पहचान सक्षम करता है। तालिका 2 पीडीएक्स डेटा पर लागू प्रत्येक मशीन लर्निंग एल्गोरिदम के परिणामों को दर्शाता है जिसमें एक ही तरीके सबसे मजबूत साबित हुए (तंत्रिका नेटवर्क और एडाबूस्ट (रैंडम वन)। पीडीएक्स नमूनों के लिए निर्धारित परीक्षण में इस्तेमाल की जाने वाली १४३ कोशिकाओं में से ७१ गैर-मेटास्टैटिक थे, ४६ मेटास्टैटिक स्तन थे, 11 मेटास्टैटिक जीभ थे, 13 मेटास्टैटिक फेफड़े थे और 2 मेटास्टैटिक अंडाशय थे । प्रत्येक कोशिका प्रकार ने 0.88 की समग्र सटीकता का उत्पादन किया लेकिन व्यक्ति के पास निम्नलिखित अनुमानित सटीकता थी: गैर-मेटास्टैटिक स्तन: 0.96, मेटास्टैटिक स्तन: 0.80, मेटास्टैटिक जीभ: 0.80, मेटास्टैटिक फेफड़े: 0.92, मेटास्टैटिक ओवेरियन: 1.0

Figure 1
चित्रा 1: प्रायोगिक कार्यप्रवाह। (A)माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस असेंबली प्रक्रिया का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। एक स्पिनर का उपयोग पीडीएमएस की पतली फिल्म जमा करने के लिए किया जाता है: 50 मिमी x 75 मिमी ग्लास स्लाइड पर टोल्यून गोंद। μmBBN डिवाइस के प्रत्येक आधे पर मुहर लगी है चैनल की ओर गोंद का सामना करना पड़ रहा है और फिर μmBBN डिवाइस भागों के बीच एक पॉलीकार्बोनेट झिल्ली (5 μm छिद्रों) के साथ इकट्ठे हुए । गोंद को ठीक करने के लिए μmBBN उपकरणों को 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखा जाता है। उपकरणों तो प्रयोगात्मक उपयोग से पहले कम से ४८ घंटे के लिए एक वैक्यूम desiccator में सूख रहे हैं । एक μmBBN डिवाइस और 50 मिमी x 75 मिमी ग्लास स्लाइड प्लाज्मा उपचार के साथ सक्रिय होते हैं और एक साथ बंधुआ होते हैं। सुझावों पर कटौती मानक P200 पिपेट सभी μmBBN डिवाइस इनलेट्स और आउटलेट में डाला जाता है । पूरा μmBBN डिवाइस तो एक 8 मिनट (२०० डब्ल्यू) प्लाज्मा उपचार तो एक बाँझ माध्यमिक कंटेनर में स्थानांतरित द्वारा निष्फल है । (ख)एक सेलुलर रक्त मस्तिष्क बाधा और मस्तिष्क आला माइक्रो पर्यावरण बनाने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस मचान का उपयोग करने का योजनाबद्ध सिंहावलोकन । एक जैवसेफ्टी कैबिनेट के अंदर, कोलेजन में एस्ट्रोसाइट्स के मिश्रण को नीचे μmBBN डिवाइस कक्ष में वरीयता दी जाती है और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए जमना करने की अनुमति दी जाती है। मैट्रिक्स का उपयोग 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए शीर्ष प्रवाह कक्ष के माध्यम से झिल्ली को कोट करने के लिए किया जाता है। फिर एंडोथेलियल कोशिकाओं को शीर्ष कक्ष के एक सिरे में वरीयता दी जाती है और 15 मिनट के लिए प्रवाह और व्यवस्थित करने की अनुमति दी जाती है। इस सीडिंग को प्रवाह कक्ष के बारी-बारी से x4, बारी-बारी से दोहराया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: कॉन्फोकल टोमोग्राफिक विश्लेषण अवलोकन। सॉफ्टवेयर विभाजन और 3 डी meshes का उपयोग कर कोशिकाओं के एक 3-डी मॉडल में एक सूक्ष्म confocal जेड-स्टैक छवि परिवर्तित करके शुरू होता है । कार्यक्रम तो प्रत्येक सेल (सेंट्रोइड) की केंद्र स्थिति की गणना करता है और एंडोथेलियल बाधा के लिए एक विमान फिट बैठता है । प्रत्येक एक कोशिका के फेनोटाइपिक माप फिर सारणीबद्ध किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एंडोथेलियल बैरियर कवरेज और विमान फिटिंग। (एक)प्रतिनिधि योजनाबद्ध और एक μmBBN डिवाइस की छवि । शीर्ष दृश्य योजनाबद्ध के भीतर धराशायी सफेद रेखा क्रॉस-सेक्शनल व्यू में प्रतिनिधित्व करने वाले डिवाइस के क्षेत्र को इंगित करती है। (ख)कैंसर कोशिकाओं के आवेदन से पहले μmbbn उपकरणों के उच्च और निम्न एंडोथेलियल कवरेज की तुलना । वेल्च दो नमूना टी परीक्षण, *** पी < 0.1 *10-4। (ग)उच्च एंडोथेलियल कवरेज की प्रतिनिधि छवि। एक μmBBN डिवाइस के इनसेट योजनाबद्ध के भीतर धराशायी सफेद बॉक्स डिवाइस के भीतर एंडोथेलियल कोशिकाओं के स्थान को इंगित करता है । अवलोकन और इनसेट छवियों के पैमाने सलाखों = 200 μm. (D)कम एंडोथेलियल कवरेज के प्रतिनिधि छवि। अवलोकन और इनसेट छवियों के पैमाने सलाखों = 200 μm.(ई)उदाहरण विमान एक फ्लैट एंडोथेलियल बाधा के फिट। हरे आयत एंडोथेलियल विमान की स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है। डॉट्स एकल एंडोथेलियल कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं जिनमें बाधा शामिल है। पीले डॉट्स विमान के ऊपर एंडोथेलियल कोशिकाएं हैं, और बैंगनी डॉट्स कोशिकाएं हैं जो विमान के नीचे गिरती हैं। विमान (पीले डॉट्स) के ऊपर एंडोथेलियल कोशिकाएं ट्यूब बनाने के लिए साइडवॉल और डिवाइस के शीर्ष को विकसित करने की प्रवृत्ति प्रदर्शित करती हैं। (F)उदाहरण विमान एक घुमावदार विमान के साथ एक μmBBN डिवाइस के फिट । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: एस्ट्रोसाइटिक रक्त मस्तिष्क आला माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स में मस्तिष्क-मेटास्टैटिक और माता-पिता की कोशिका फेनोटाइप के सेलुलर फेनोटाइप का मात्राकरण। (A)एंडोथेलियल बैरियर से 1, 2 और 9 दिन में कैंसर कोशिकाओं के माइक्रोन में दूरी की पट्टी साजिश । 0 माइक्रोन पर धराशायी काली रेखा एंडोथेलियल बैरियर का प्रतिनिधित्व करता है। लाल बक्से एमडीए-एमबी-231-बीआर-जीएफपी कोशिकाओं के सबसेट का संकेत देते हैं जो मस्तिष्क के आला में दूर चले गए। (ख)कैंसर कोशिकाओं की प्रतिशत कुल मात्रा का वायलिन प्लॉट 1, 2 और 9-दिन में एंडोथेलियल बैरियर के माध्यम से अतिरिक्त है । छोटी धराशायी रेखाएं क्वार्टाइल्स का प्रतिनिधित्व करती हैं, लंबी धराशायी रेखा मतलब का प्रतिनिधित्व करती है। (ग)μmBBN डिवाइस में कैंसर कोशिकाओं की आकृति विज्ञान के प्रतिनिधि छवियां । स्केल बार = 25 माइक्रोन (D)1, 2, और 9-दिन में μmBBN डिवाइस में कैंसर कोशिकाओं की sphericity के वायलिन साजिश । स्पिरसिटी 1 से होती है: गोलाकार से 0: गोलाकार नहीं। (ई)एमडीए के बॉक्स प्लॉट-एमबी-231-जीएफपी सेल वॉल्यूम में μmBBN डिवाइस में एंडोथेलियल बैरियर (आउट) और कोशिकाओं के बाहर आराम करने वाली कोशिकाओं के लिए जो बैरियर (इन) के माध्यम से अपूस्करित होते हैं । (F)एमडीए का बॉक्स प्लॉट-एमबी-231-बीआर-जीएफपी सेल वॉल्यूम μmBBN डिवाइस में एंडोथेलियल बैरियर (आउट) के बाहर आराम करने वाली कोशिकाओं और बैरियर (इन) के माध्यम से अपस्र्वल करने वाली कोशिकाओं के लिए । बॉक्स क्वार्टाइल्स और मूंछ को प्रदर्शित करता है जो कम और उच्च क्वार्टाइल्स के पिछले इंटरक्वार्टाइल रेंज के अनुपात को दिखाने के लिए विस्तारित होता है। जोड़ीवाइज विलकॉक्सन रैंक सम और क्रुस्कल-वालिस डन की कई तुलनाओं के साथ, *** पी & 0.1 * 10-4। रॉयल सोसायटी ऑफ केमिस्ट्री से अनुमति के साथ संदर्भ24 से पुन: पेश किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: कैंसर कोशिकाओं के मशीन लर्निंग वर्गीकरण के प्रतिनिधि परिणाम। (A)मशीन लर्निंग ओवरव्यू । कॉन्फोकल टोमोग्राफी से एकत्र किए गए डेटा को विभाजित करने, डेटा को फ़िल्टर करने, मशीन लर्निंग एल्गोरिदम को 10 गुना सत्यापन का उपयोग करके प्रशिक्षित करने और फिर आरक्षित डेटा के 20% के यादृच्छिक नमूने के खिलाफ मॉडल का परीक्षण करने की प्रक्रिया को दर्शाता है। चयनित मॉडल तो नए डेटा पर लागू किया जा सकता है व्यक्तिगत कोशिकाओं के मेटास्टेटिक सूचकांक इकट्ठा करने के लिए । (ख)आरओसी घटता है जो इमेजिंग से पहले 1, 2 और 9-दिन के लिए एमडीए-231-बीआर-जीएफपी और एमडीए-231-जीएफपी कोशिका संस्कृति के लिए 8 विभिन्न मशीन लर्निंग एल्गोरिदम के प्रदर्शन को दिखाता है । यह प्रशिक्षित मॉडल के प्रदर्शन को समझने के लिए विश्लेषण किए जाने वाले वक्र के प्रकार का प्रतिनिधि है। (ग)रोगी व्युत्पन्न xenograft (PDX) अलग कोशिकाओं के लिए लागू 8 अलग मशीन लर्निंग एल्गोरिदम के लिए ROC घटता 2 दिनों के लिए सुसंस्कृत कोशिकाओं । यह प्रशिक्षित मॉडल के प्रदर्शन को समझने के लिए विश्लेषण किए जाने वाले वक्र के प्रकार का प्रतिनिधि है। रॉयल सोसायटी ऑफ केमिस्ट्री से अनुमति के साथ संदर्भ24 से पुन: पेश किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

सुविधा डिस्क्रिप्टर
ट्यूमर सेल % आला में अतिरिक्त
ट्यूमर सेल आयतन
ट्यूमर सेल स्पिरसिटी
ट्यूमर सेल दूरी अपव्यवसुया
ट्यूमर सेल लाइव सेल 2D माइग्रेशन
माइक्रो मेटास्टेसिस पॉरोसिटी
माइक्रो मेटास्टेसिस स्ट्रोमल इंटरैक्शन
माइक्रो मेटास्टेसिस उम्र
माइक्रो मेटास्टेसिस विकास दर
स्ट्रोमल सेल आयतन
स्ट्रोमल सेल आसपास के कैंसर कोशिकाओं से दूरी
स्ट्रोमल सेल एंडोथेलियल बैरियर से दूरी
स्ट्रोमल सेल आकार

तालिका 1: फीचर प्रकार द्वारा वर्णनकर्ताओं की सूची। ट्यूमर कोशिकाओं के फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन वर्णनकर्ताओं के एक पैनल का उपयोग करके प्रतिनिधित्व किया जाता है। लाल बॉक्स मशीन लर्निंग के माध्यम से मस्तिष्क मेटास्टैटिक संभावना की भविष्यवाणी करने के लिए उपयोग किए गए वर्णनकर्ताओं को इंगित करता है।

कैंसर कोशिकाएं
विधि एयूसी सटीकता F1
तंत्रिका नेटवर्क 0.925 0.84 0.847
एडीएबूस्ट 0.928 0.853 0.86
रैंडम वन 0.925 0.849 0.855
निर्णय ट्री 0.898 0.817 0.827
केएनएन 0.775 0.702 0.718
लॉजिस्टिक प्रतिगमन 0.769 0.735 0.751
भोले बायस 0.745 0.715 0.73
एसजीडी 0.73 0.73 0.737
पीडीएक्स कैंसर कोशिकाएं
विधि एयूसी सीए F1
तंत्रिका नेटवर्क 0.972 0.881 0.878
रैंडम वन 0.964 0.888 0.887
एडीएबूस्ट 0.957 0.881 0.879
दरख्‍़त 0.954 0.867 0.865
लॉजिस्टिक प्रतिगमन 0.897 0.832 0.831
भोले बायस 0.896 0.846 0.849
केएनएन 0.882 0.818 0.814
एसजीडी 0.861 0.86 0.853

तालिका 2: मस्तिष्क मेटास्टेटिक क्षमता द्वारा कैंसर कोशिकाओं और पीडीएक्स कैंसर कोशिकाओं को वर्गीकृत करने के लिए मशीन लर्निंग विधियों की तुलना।

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Discussion

हमने एक नई विधि विकसित की है और प्रस्तुत की है जो मस्तिष्क के ऊतकों में एंडोथेलियल बैरियर के माध्यम से कैंसर कोशिकाओं के अपव्यय और प्रवास के मापन के लिए अक्सर नैदानिक इमेजिंग विश्लेषणों में उपयोग किए जाने वाले उपकरणों को अनुकूलित करती है। हम इस दृष्टिकोण को वीवो और इन विट्रो माप दोनों के लिए उपयोगी हो सकते हैं; हमने मस्तिष्क वास्कुलेचर को फिर से 3 डी माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम पर इसके उपयोग का प्रदर्शन किया है। इस तकनीक का उपयोग करके दूरी अतिरिक्त, मात्रा, स्पाइरिसिटी और वॉल्यूम द्वारा अतिरिक्त प्रतिशत सहित कैंसर सेल मापों की मात्रा निर्धारित की जाती है। दूरी अपव्ययोजित और मात्रा द्वारा अतिरिक्त प्रतिशत उपयोगकर्ता को चिप के भीतर कैंसर कोशिकाओं की स्थिति का पुनर्निर्माण करने के लिए बाधा और ऊतक के भीतर प्रवास भर में अतिरिक्तण का आकलन करने की अनुमति देता है । सेल आकार माप जैसे कि स्पिरेसिटी और वॉल्यूम प्रत्येक समय बिंदु पर कोशिका के गतिशील आंदोलनों या कार्य से संबंधित हैं। प्रवासी एमडीए-एमबी-231-बीआर-जीएफपी कोशिकाएं उच्च स्तर की स्पिरसिटी प्रदर्शित करती हैं जब शुरू में μmBBN डिवाइस में पेश किया जाता है और आकार में कम गोलाकार हो जाते हैं क्योंकि वे अपने आंदोलन को कम करते हैं और आला उपनिवेश करना शुरू करते हैं। एमडीए-एमबी-231-जीएफपी और एमडीए-एमबी-231-बीआर-जीएफपी की कुल सेल मात्रा सेल लाइनों के आकार में अंतर के कारण भिन्न थी। एंडोथेलियल बैरियर को पार करने वाली कैंसर कोशिकाएं उन कोशिकाओं की तुलना में अधिक गोल होती हैं जो बाधा के माध्यम से पार नहीं होती हैं, इस प्रकार छोटी गोल कोशिकाएं एंडोथेलियल परत में अधिक कुशलता से अपूस्वल करने में सक्षम हो सकती हैं।

दो महत्वपूर्ण कदम प्रोटोकॉल है कि सफलता की सुविधा के भीतर मौजूद हैं । पहला μmBBN डिवाइस के ऊपरी और निचले हिस्सों की असेंबली के दौरान होता है जो असुरक्षित झिल्ली से अलग होते हैं। ऊपरी और निचले डिवाइस भागों को संभोग किया जाना चाहिए ताकि इनलेट्स और आउटलेट ओवरलैप हों लेकिन उचित प्रवाह को बढ़ावा देने के लिए बीच में झिल्ली से ओक्लेड नहीं होते हैं। गुणवत्ता में उतार-चढ़ाव को कम करने के लिए ऊपरी और निचले डिवाइस भागों या झिल्ली संरेखण के खराब संभोग वाले सभी μmBBN उपकरणों को छोड़ दिया जाता है। पीडीएमएस का इलाज करने के लिए बाद में बेकिंग: डिवाइस को इकट्ठा करने के लिए टोल्यून गोंद 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है ताकि झिल्ली के साथ μmBBN उपकरणों का उत्पादन किया जा सके। बेकिंग तापमान जो 37 डिग्री सेल्सियस से अधिक है, एक घुमावदार झिल्ली के साथ उपकरणों का उत्पादन करता है जो छवि विश्लेषण को मुश्किल बनाता है, खासकर जब एंडोथेलियल बैरियर के लिए एक विमान फिटिंग। दूसरा महत्वपूर्ण कदम एंडोथेलियल बैरियर के सीडिंग के दौरान होता है । डिवाइस की झिल्ली पर एंडोथेलियल कोशिकाओं का यादृच्छिक वितरण सुनिश्चित करने के लिए डिवाइस के शीर्ष भाग को खिलाने वाले दो इनलेट्स के बीच कम से कम पंद्रह मिनट के अंतराल पर सीडिंग होनी चाहिए। चिप में एस्ट्रोसाइट्स युक्त कोलेजन मिश्रण के सीडिंग के लिए प्रयोगशाला-विशिष्ट प्रोटोकॉल में समस्या निवारण और संशोधन की आवश्यकता हो सकती है। यदि डिवाइस की झिल्ली सतह हाइड्रोफोबिक नहीं है, तो कोलेजन डिवाइस के नीचे और शीर्ष दोनों हिस्सों को भर देगा और सेट करेगा ताकि यह डिवाइस के शीर्ष भाग के माध्यम से सभी प्रवाह को रोक सके। अंतिम प्लाज्मा गैस उपचार का उद्देश्य डिवाइस सतह हाइड्रोफोबिक बनाने के लिए है। इस मामले में, हम हाइड्रोफोबिकिटी बढ़ाने के लिए डिवाइस के प्लाज्मा गैस उपचार के समायोजन की सलाह देते हैं।

हमने इस दृष्टिकोण के साथ कुछ सीमाएं देखी हैं । उदाहरण के लिए, सेल फ्लोरेसेंस को प्रेरित करने के लिए उपयोग किया जाने वाला दृष्टिकोण इमेजिंग गुणवत्ता को प्रभावित कर सकता है। लाइव सेल ट्रैकिंग रंगों का उपयोग करते समय, फ्लोरोसेंट पैटर्न छोटे धब्बों से बना होता है, जबकि फ्लोरोफोरस की संक्रमित या ट्रांसड्यूड एक्सप्रेशन एक समान पैटर्न पैदा करता है। धब्बेदार पैटर्न के लिए पिक्सल के अतिरिक्त और कभी-कभी त्रुटि प्रवण क्लस्टरिंग की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, माप की संवेदनशीलता इमेजिंग के दौरान ली गई देखभाल पर निर्भर है। उच्च रिज़ॉल्यूशन छवियां और अधिक जेड स्लाइस रिज़ॉल्यूशन में सुधार करते हैं, लेकिन छवि और विश्लेषण करने में भी अधिक समय लगता है। कोशिकाओं है कि छू रहे है भी गलत तरीके से एक बड़े एकल कोशिका के रूप में विश्लेषण किया जा सकता है । यह कई स्वचालित इमेजिंग सिस्टम के लिए एक समस्या है, लेकिन दो तरीकों से संबोधित किया जा सकता है। पहला यह है कि एंडोथेलियल लेयर में कई कोशिकाएं छूती हैं, लेकिन उनके संयोजन का काटने वाले विमान के अंतिम स्थान पर नगण्य प्रभाव पड़ता है। दूसरा कैंसर कोशिकाओं की संख्या काफी कम है कि यह दुर्लभ है कि वे छू रहे हैं । विमान फिटिंग जब शुरू की त्रुटियों कई कारणों के लिए हो सकता है । पहला यह है कि कुछ एंडोथेलियल कोशिकाएं कोशिका संस्कृति के दौरान केंद्रीय झिल्ली से दूर चली गई हो सकती हैं। इसके परिणामस्वरूप एंडोथेलियल कोशिकाएं पूरे चैनल को कोटिंग कर सकती हैं या कोलेजन से भरे स्थान पर हमला कर सकती हैं, जिससे माप को तिरछा किया जा सकता है। त्रुटि का एक और स्रोत है, विडंबना यह है कि पिछले त्रुटि को ठीक करने के लिए विमान का मैनुअल समायोजन । हालांकि, पुनरावृत्ति और प्रजनन अध्ययनों ने इसे न्यूनतम प्रभाव पाया है। अंत में, हमने देखा कि कुछ परिस्थितियों में सेल जाल का बूलियन कटिंग विफल हो सकता है या कट जाल को बंद करने के लिए एल्गोरिदम भी विफल हो सकता है। यहां उपयोग की जाने वाली तकनीकें वर्तमान "कला की स्थिति" हैं, और इन समस्याओं को वर्तमान में एल्गोरिथम वैज्ञानिकों द्वारा संबोधित किया जा रहा है।

μmBBN के कॉन्फोकल टोमोग्राफी द्वारा एकत्र किए गए डेटा के खिलाफ मशीन लर्निंग एल्गोरिदम (एआई) के प्रशिक्षण से परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि इस दृष्टिकोण द्वारा विश्लेषण की गई व्यक्तिगत कोशिकाओं की काफी संख्या कैंसर कोशिकाओं में पाई जाने वाली विषमता को कैप्चर करने के मुद्दों को संबोधित करने में मदद कर सकती है। 0.9 से अधिक एयूसी को उच्च प्रदर्शन करने वाला क्लासिफायर माना जाता है। यहां हमने 0.928 के एयूसी का प्रदर्शन किया। हम उम्मीद करते हैं कि जैसे-जैसे प्रदर्शन पर विधि में सुधार होता है, वह बढ़ता रहेगा। सभी एआई विधियों के साथ, प्रशिक्षण डेटा सेट को सावधानीपूर्वक चुनने के लिए देखभाल की जानी चाहिए ताकि यह मोटे तौर पर डेटा के प्रकार का प्रतिनिधित्व करता है जिसके खिलाफ परीक्षण किए जाने की उम्मीद है। इस कारण से, हम उम्मीद कर सकते हैं कि प्रदर्शन नीचा होगा, यदि मॉडल को सीधे रोगी नमूनों पर लागू किया गया था, उदाहरण के लिए मॉडल को पहले रोगी नमूनों के मजबूत संग्रह में उजागर किए बिना। हम पिछले काम के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले 2-दिवस की तुलना में मॉडल में कैंसर कोशिकाओं के लिए 1-डे, 2-डे और 9-डे मापों को शामिल करके कुछ हद तक यहां प्रदर्शित करते हैं। हम देखते हैं कि व्यापक नमूना मॉडल के प्रदर्शन को थोड़ा कम कर देता है और दिखाता है कि कुछ गरीब प्रदर्शन करने वाले तरीके कितने संवेदनशील हो सकते हैं, इस प्रकार यह सुझाव देते हैं कि उपयोगकर्ता अपने डेटा पर कई मॉडलों का परीक्षण करना चाहते हैं। पीडीएक्स परिणामों का वर्णन करने वाली तालिका 2 समग्र रूप से अच्छा प्रदर्शन दिखाती है। हालांकि, व्यक्तिगत पीडीएक्स प्रकार प्रदर्शित करते हैं कि प्रत्येक नमूने से मापी गई कोशिकाओं का अनुपात अलग होता है और मूल की प्रत्येक साइट के लिए प्रदर्शन को प्रभावित कर सकता है। उदाहरण के लिए, अंडाशय के नमूने ने परीक्षण सेट के लिए केवल दो कोशिकाओं का उत्पादन किया। इसके विपरीत, मेटास्टैटिक स्तन कैंसर जिसमें एक बड़ी आबादी थी। इस डेटा सेट का उद्देश्य यह प्रदर्शित करना था कि कोशिकाएं आला में जीवित रहती हैं और उनका विश्लेषण किया जा सकता है, लेकिन व्याख्यात्मक देखभाल पर भी प्रकाश डाला गया है। लक्ष्य चर में परिवर्तन भी इस तरह के स्ट्रोमल कोशिकाओं या शांत व्यवहार के साथ बातचीत के रूप में अंय लक्षण के साथ उप क्लोन की पहचान करने में शोधकर्ताओं का मार्गदर्शन कर सकते हैं ।

यह दृष्टिकोण महत्वपूर्ण है क्योंकि अधिक प्रयोगशालाएं एक चिप पर रक्त मस्तिष्क बाधा, चिप पर फेफड़े और चिप11,,42पर आंत जैसे झिल्ली को अपनाती हैं। इनमें से अधिकांश चिप्स इकट्ठे किए जाते हैं ताकि झिल्ली इमेजिंग सिस्टम के समानांतर हो, जिसका अर्थ है कि अब तक यह मापना मुश्किल होगा कि झिल्ली के एक तरफ से दूसरे15,,28में कब और कितनी कोशिकाएं चली गई हैं। इसके अलावा, क्षैतिज उन्मुख चिप्स की तुलना में, खड़ी उन्मुख चिप्स प्रयोग की गतिशील रेंज को बढ़ाने के लिए एक बहुत बड़ा झिल्ली क्षेत्र प्रदान करते हैं। इसके अलावा, क्योंकि झिल्ली का अभिविन्यास इस विश्लेषण तकनीक के लिए महत्वपूर्ण नहीं है, कॉन्फोकल टोमोग्राफी संभावित रूप से नए इन विट्रो प्रयोगों को सक्षम कर सकती है। उदाहरण के लिए, मूर्तिन वसा पैड से रक्त प्रवाह में स्तन कैंसर की कोशिकाओं के अतिवरण इमेजिंग इन तरीकों से सुलभ होगा । इससे शोधकर्ताओं को यह पहचानने में मदद मिल सकती है कि कैंसर की कोशिकाएं स्तन ईसीएम और पोत के बीच इंटरफेस की जांच कैसे करती हैं ।

अंत में, हमने एक 3डी माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का निर्माण करने के लिए एक पद्धति प्रस्तुत की जो रक्त मस्तिष्क आला को पुनः प्राप्त करती है और विश्लेषण के लिए कॉन्फोकल टोमोग्राफी और मशीन लर्निंग का उपयोग कैसे करती है। इस मंच का उपयोग करके, हमने मस्तिष्क-मेटास्टैटिक कैंसर कोशिका विशेषताओं की पहचान की जो मस्तिष्क मेटास्टैटिक और गैर-मेटास्टैटिक पीडीएक्स कैंसर कोशिकाओं के बीच अंतर करते हैं जो μmBBN डिवाइस के भीतर उनके व्यवहार के आधार पर। भविष्य के काम मस्तिष्क मेटास्टेस की भविष्यवाणी की दिशा में एक नैदानिक के रूप में इस मंच के नैदानिक प्रयोज्यता में सुधार होगा । हमारा मानना है कि इस मंच को प्रस्तुत करने के बाद प्रयोगशालाओं के लिए उपयोगी और दिलचस्प होगा जिन्हें किसी भी प्रकार की माइग्रेटिंग या झिल्ली में बाहर करने की कोशिकाओं को मापने की आवश्यकता होती है। यह ट्यूमर सूक्ष्म पर्यावरण के पूर्व नैदानिक मॉडल के रूप में महत्व का है तेजी से परिष्कृत हो तो मॉडल और सहायक सॉफ्टवेयर की इंजीनियरिंग चाहिए । डेटा के मजबूत विश्लेषण में सहायता करने के लिए हमने इस उपकरण को उपयोग करने के लिए एक सरल के रूप में पैक किया है, स्थापना निर्देश30के साथ साझा अजगर नोटबुक।

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Disclosures

घोषणा करने के लिए कोई खुलासे नहीं हैं ।

Acknowledgments

हम नेशनल कैंसर इंस्टीट्यूट में एमडीए-एमबी-231-बीआर-जीएफपी कोशिकाओं के उदार दान के लिए स्टीग लैब को धन्यवाद देते हैं । यूनिवर्सिटी ऑफ मिशिगन बायोइंटरफेस इंस्टीट्यूट (बीआई) में कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का प्रदर्शन किया गया । फ्लो साइटोमेट्री यूनिवर्सिटी ऑफ मिशिगन फ्लो साइटोमेट्री कोर में किया गया था। वायरल वैक्टर मिशिगन विश्वविद्यालय वेक्टर कोर द्वारा बनाए गए थे । हम इन आंकड़ों के सांख्यिकीय विश्लेषण में मार्गदर्शन के लिए केले किडवेल को भी धन्यवाद देते हैं।

धन:

C.R.O. आंशिक रूप से एक NIH टी-३२ प्रशिक्षण फैलोशिप (T32CA009676) और 1R21CA245597-01 द्वारा समर्थित किया गया था । टी.M डब्ल्यू आंशिक रूप से 1R21CA245597-01 और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के अनुवाद विज्ञान को आगे बढ़ाने के लिए केंद्र द्वारा पुरस्कार संख्या UL1TR0022240 द्वारा समर्थित किया गया था । पुरस्कार संख्या 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, METAvivor फाउंडेशन, और स्तन कैंसर अनुसंधान फाउंडेशन के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा सामग्री और लक्षण वर्णन के लिए धन प्रदान किया गया था । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करता है

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA with phenol red Thermo Fisher Scientific 25200056
1.5 mm biopsy punch with plunger Integra LifeSciences Corporation 33-31A-P/25
10x MEM Thermo Fisher Scientific 11430030
150 mm petri dishes Fisher Scientific FB0875714
1x DPBS, without Ca and Mg Thermo Fisher Scientific 14190144
200uL pipette tip Fisher Scientific 02-707-411
4 inch silicon wafer University Wafer 452
48 mm wide packing tape Fisher Scientific 19-072-097
50 x 75 mm glass slide Fisher Scientific 12-550C
A1 confocal microscope Nikon
acetone Fisher Scientific A9-20
antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin) Gibco 15240062
box cutter blade Fisher Scientific NC1721575
dissection scissors Fisher Scientific 08-951-5
DMEM with 4.5 g/L glucose Thermo Fisher Scientific 11960-044
double sided tape Fisher Scientific NC0879005
EGM-2 Lonza CC-3162
Fetal Bovine Serum, Heat inactivated Corning MT35011CV
Fiji software ImageJ
glass vial Fisher Scientific 03-341-25D
glutamax Thermo Fisher Scientific 35050061
hCMEC/D3 EMD Millipore SCC066
Jupyter notebook Anaconda
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081
Matrigel - growth factor reduced with phenol red Corning CB-40230A
MDA-MB-231 ATCC HTB-26
MDA-MB-231-BR-GFP Dr. Patricia Steeg, NIH
N-2 growth supplement Thermo Fisher Scientific 17502048
normal human astrocytes (NHA) Lonza CC-2565
Orange software University of Ljubljana
Pasteur pipette Fisher Scientific 13-711-9AM
Photolithography masks Photosciences Incorporated
pLL3.7-dsRed University of Michigan Vector Core
pLL-EV-GFP University of Michigan Vector Core
pLOX-TERT-iresTK Addgene 12245
pMD2.G Addgene 12259
polycarbonate membrane, 5um pore size Millipore TMTP04700
psPAX2 Addgene 12260
PureCol, 3 mg/mL Advanced Biomatrix 5005 Type I bovine collagen
sodium bicarbonate Thermo Fisher Scientific 25080094
sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360070
Solo cup Fisher Scientific NC1416545
SU-8 2075 MicroChem Corporation Y111074 0500L1GL
SU8 developer MicroChem Corporation Y020100 4000L1PE
Sylgard 184 Ellsworth Adhesive Company NC0162601
Toluene Sigma-Aldrich 179965-1L
Tricholoro perfluoro octyl silane Sigma-Aldrich 448931-10G

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