Summary
Burada, bir kan beyin bariyeri metastatik tümör mikro-ortamının hazırlanması ve kültürlenmesi ve konfokal görüntüleme ve yapay zeka (makine öğrenimi) kullanılarak durumunun ölçülmesi için bir protokol saklıyız.
Abstract
Beyin metastazları en ölümcül kanser lezyonlarıdır; Tüm kanserlerin% 10-30 beyne metastaz, sadece ~ 5-20 ay bir ortanca sağkalım ile, kanser türüne bağlı olarak. Beyin metastatik tümör yükünü azaltmak için, temel ve çevirisel bilgi boşlukları ele alınması gerekir. Başlıca zorluklar arasında tekrarlanabilir preklinik modellerin ve ilişkili araçların azlığı sayılabilir. Beyin metastazı üç boyutlu modelleri özel analiz araçları ile kombine edildiğinde bu ihtiyaçları karşılamak için kullanılan ilgili moleküler ve henotypic veri verim olabilir. Ayrıca, murine modelleri ile karşılaştırıldığında, beyin mikroortamına kan beyin bariyerini geçen hasta tümör hücrelerinin organ-on-a-chip modelleri hızla sonuç üretmek ve kantitatif yöntemlerle daha yorumlanabilir, böylece yüksek iş artışı testi için uygun. Burada, nişin birden fazla elementinin uzun bir süre (birkaç gün) kültürlenebileceği, konfokal mikroskopi ile floresan olarak görüntülenebileceği ve yenilikçi bir konfokal tomografi tekniği kullanılarak yeniden yapılandırılan görüntülerin bulunduğu yeni bir 3D mikroakışkan kan beyin niş (μmBBN) platformunun kullanımını tanımlıyor ve gösteriyoruz; mikro-metastaz ın gelişimini ve tümör mikro-ortamında (TME) tekrarlanan ve kantitatif bir şekilde değişimlerini anlamayı amaçlamıştır. Bu platformu kullanarak kanser hücrelerini ve TME hücresel ve mizahi bileşenlerini nasıl imal edebileceğimizi, tohumla, imaja nasıl üretebileceğimizi ve analiz edebileceğimizi gösteriyoruz. Ayrıca, yapay zekanın (AI) bir model μmBBN ile geçiş yeteneğine sahip kanser hücrelerinin içsel phenotipik farklılıklarını belirlemek ve onlara beyin metastatik potansiyelinin nesnel bir indeks atamak için nasıl kullanıldığını gösteriyoruz. Bu yöntemle oluşturulan veri kümeleri metastaz, terapötik stratejilerin etkinliği ve TME'nin her ikisinde de rolü hakkındaki temel ve çevirisel soruları yanıtlamak için kullanılabilir.
Introduction
Beyin metastazları en ölümcül kanser lezyonlarıdır; Tüm kanserlerin% 10-30 beyne metastaz, sadece ~ 5-20 ay bir ortanca sağkalım ile, kanser türüne bağlı olarak1,2. Kanser metastazı incelenirken ortaya çıkan bir temel soru nasıl alt klonlarbeyingibi bir organiçine kan dolaşımının mizah ortamından göç nasıl3 ,4. Bu soru göç, istila ve ekstravazasyon tahlilleri birçok varyasyonyol açmıştır. Tüm bu yöntemler, bir uyarıcıya yanıt olarak bir konumdan diğerine hareket eden hücrelerin özelliklerini sayma veya ölçme nin kritik adımını paylaşır. Çoğu göç tahlilleri kolayca kullanılabilir kanser hücrelerinin iki boyutlu (2D) göç çalışma için kullanılır. Bunlar bir bilgi zenginliğini aydınlatmıştır; ancak, diğeryöntemlerin 5sağlayabilir in vivo sisteminin üç boyutlu doğasını özetlemek yok. Bu nedenle, tümör mikro-çevre (TME) üç boyutlu (3D) sistemlerde incelenmesi gereklidir, ancak 3D yapılar için mevcut analiz yaklaşımları sınırlı ve genellikle tutarsız.
En popüler 3D araçlardan biri, iki farklı bölgeyi ayıran bir kuyunun dibinde asılı bir membrandan oluşan bir Boyden odasıdır. Boyden lökosit chemotaxis4çalışma için titret tanıttı. Alt bölgeler kimya veya diğer araçlarla farklı olabilir6,7 alt bölgeye göç etmek için üst bölgedeki hücreleri ikna etmek için. Göç eden hücre sayısını ölçmek için en yaygın yaklaşım, hücreleri bir tampon çözeltisi kullanarak membranın alt kısmından serbest bırakmak, onları lyse ve daha sonra çözeltideki DNA içeriği miktarına göre saymaktır7. Bu dolaylı yaklaşım teknik değişkenliği nedeniyle operatör hatasına yatkındır ve prosedür kanser fenotip ve mikro-çevre hakkında bilgi yok eder. Boyden odası tsay varyasyonları membran üzerinde kalan göçmen hücrelerinin fiksasyonu içerir, ama sadece artık devam çalışmaiçinuygun olan hücrelerin sayısını sağlar 6,8,9.
Boyden odası sınırlamaları ve mikroakışkan toplumda yeniliklerin büyüme nedeniyle, göç taşkınlık yongaları üç10yerine bir yönde bir uyarıcı yanıt olarak hücrelerin hareketini gözlemlemek geliştirilmiştir10 ,11,12. Bu geçiş tahlilleri, sonuçların daha iyi yorumlanmasını sağlayan akış veya tek hücre ayrımı13,14 gibi faktörler üzerinde kontrolü kolaylaştırır; ancak, onların 2D biçimi kaçınılmaz olarak bazı dinamik bilgi kaybeder. Son çalışmalar extravazasyon üzerinde duruldu (yani, bir doku içine dolaşımdan hücrelerin hareketi, kan beyin bariyeri gibi) bir 3D ortamda14,15. Doku içine ekstravazasyon mesafesi ve hücresel bariyer / membran oluşur probing davranışı boyden odası veya 2D mikroakışkan göç cihazı16kullanılarak toplanan ölçümler daha rafine. Bu nedenle, 3D ekstravazasyonun uygun görüntüleme ve analizini sağlayan cihazlar bu gelişmiş ölçümleri yakalamak için kritik öneme sahip olmakla birlikte literatürde eksiktir.
Göç tahlillerinden bağımsız olarak manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ve tomografi için 3Boyutlu alanda dokuyu tanımlayabilen ve doğru bir şekilde yeniden yapılandırabilen sağlam görüntüleme teknikleri geliştirilmiştir17,18. Bu teknikler doku özelliklerine göre görüntünün z-yığınları ve segment bölümlerinde görüntüleri elde ve daha sonra üç boyutlu meshes19,,20,21içine segmentli görüntüleri dönüştürmek . Bu hekimlerin 3D bireysel organlar, kemikler ve damarlar kanser veya kalp hastalığı tanısında cerrahi planlama veya yardım yardımcı görselleştirmek için izin verir22,23. Burada, bu yaklaşımların mikroskobik numuneler ve 3D ekstravazasyon cihazlarında kullanılmak üzere uyarlanabileceğini göstereceğiz.
Bu amaçla, mevcut tomografi araçlarını uyarlayarak tümör hücrelerinin bir membran üzerinde ekstravazasyonunu inceleme esnekliği sağlayan, burada sunulan yenilikçi konfokal tomografi tekniğini geliştirdik. Bu yaklaşım, bir endotel hücre tabakası gibi hücresel bir bariyer ile etkileşim gibi kanser hücresi davranışlarının tam gam çalışma sağlar. Kanser hücreleri sondalama davranışları sergilerler; bazıları istila edebilir ama zara yakın kalırken, diğerleri bariyeri kolayca geçer. Bu teknik tüm boyutlarda hücrenin fenotip hakkında bilgi verebilme yeteneğine sahiptir24. TME'yi incelemek için bu yaklaşımı kullanmak hem nispeten ucuz, yorumlanması kolay, hem de daha karmaşık in vivo murine modelleriile karşılaştırıldığında tekrarlanabilir. Sunulan metodoloji stromal bölgeyi uyarlayarak birçok tümör ve mikro ortam türünün incelenmesi için güçlü bir temel oluşturmalıdır.
Bariyer ve nişin (beyin mikrovasküler endotel hücreleri ve astrositler) kritik unsurlarının uzun bir süre (yaklaşık 9 güne kadar) kültürlenebileceği, konfokal mikroskopi tekniğiile floresan olarak görüntülenebileceği ve konfokal tomografi tekniği(Şekil 2)kullanılarak yeniden yapılandırılan görüntülerin 3Boyutlu mikroakışkan kan beyin nişi (Şekil1) (Şekil 1)kullanımını tanımlıyor ve gösteriyoruz . mikro-metastaz ın gelişimini ve tümör mikro-ortamındaki değişiklikleri tekrarlanabilir ve kantitatif bir şekilde anlamayı amaçlamıştır. Beyin niş ile kan beyin bariyer arayüzü bazal membran tarafından güçlendirilir beyin mikrovasküler endotel hücreleri oluşur, astrosit ayaklar, ve perisitler25. Biz seçici kan beyin bariyerinin oluşumu ve düzenlenmesinde önemi göz önüne alındığında astrosit ve endotel bileşenleri üzerinde duruldu. Bu platformu kullanarak kanser hücrelerini ve tümör mikro-çevre hücresel ve mizahi bileşenlerini nasıl imal edebileceğimizi, tohumla, imaja nasıl üretebileceğimizi ve analiz edebileceğimizi gösteriyoruz. Son olarak, makine öğreniminin, bir model μmBBN ile geçiş yeteneğine sahip kanser hücrelerinin içsel phenotipik farklılıklarını belirlemek ve onlara beyin metastatik potansiyelinin nesnel bir indeksini atamak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz24. Bu yöntemle oluşturulan veri kümeleri metastaz, tedavi stratejileri ve TME'nin her ikisinde de rolü hakkındaki temel ve çevirisel soruları yanıtlamak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kan beyin bariyeri niş kalıp hazırlayın
NOT: Bu platformda kullanılan kültür cihazı üzerine hücresel kan beyin bariyeri niş inşa pdms tabanlı iskele olduğunu. Gözenekli bir zarla ayrılmış iki bölümden oluşur. Kan beyin bariyeri niş hazırlamak için iki SU-8 kalıbı fotolitografi kullanılarak yapılan gerekli26,27. Protokol önce 100 μm kalınlığındaki kalıp için tanımlanacak, daha sonra 200 μm kalınlığındaki kalıp için notlar verilecektir.
- Kalıp hazırlamak için, bir sıkmak şişe ile aseton kullanarak 4 "silikon gofret temiz ve daha sonra bir azot tabancası ile kurulayın.
- Tüm artık çözücükaldırmak için 200 °C'de 10 dakika boyunca bir ocakta silikon gofret pişirin.
- Sırayla bir spin coater chuck üzerine silikon gofret merkezi ve üst kalıp için SU8-2075 1 mL dağıtmak. 5 000 rpm (ivme 300 rpm/s) ile fotodirenç dağıtmak için 5 s'ye (ivme 300 rpm/s) 2200 rpm'de (ivme 300 rpm/s) 100 μm kalınlığında SU-8 kaplama elde etmek için döndürün. Belirtilen kalınlığa ulaşmak için optimizasyon gerekebilir.
- 65 °C'de bir ocakta gofret üzerinde 2 dk, sonra hemen 98 °C'de 20 dk pişirin.
- Gofret bir fotolitografi lambası içine yerleştirin ve standart prosedürlere göre gofret üzerine merkezli maske konumlandırın. SU-8 kaplamalı gofretleri 230 mJ/cm2 UVB (360 nm ± 10 nm) parlaklığı ile ortaya çıkarın. Optimum dozu belirlemek için bir pozlama matrisdeneyi yapılabilir. Maske tasarımları Ek Dosya 1mevcuttur.
- Yapışmayı artırmak için 65 °C'de 2 dk ve hemen 98 °C'de 10 dk pişirin. Gofret 50 °C'ye kadar soğutun.
- SU-8 fotoğraf geliştiricisini kullanarak maruz kalan direnci kaldırın. Bir banyoda 5 dakika için geliştirici gofret durulayın ve sonra ajite ve kalan uncured SU-8 kaldırmak için kimyasal bir başlık SU-8 geliştirici ile dolu bir sprey şişesi kullanın. Tüm su-8'in çıkarılıp çıkarılmadığını gözlemlemek için 4x mikroskop kullanılabilir. Fotodirenç özelliklerinin kenarlarındaki beyaz çizgi, SU-8'in tam olarak kaldırılmadığını gösterir.
- 60 dk için 110 °C'de bir fırında son bir sert fırında gerçekleştirin.
- SU-8 2075 kullanarak 200 μm kalınlığında kalıp için aynı yordamı izleyin ama protokolü aşağıdakilere göre ayarlayın:
- Spin coater ayarları: Fotodirenç dağıtmak için 5 s 5 s (ivme 300 rpm/s) ve sonra 30 s 1300 RPM (ivme 300 rpm/ s) 200 μm kalınlığında kaplama elde etmek için dağıtmak için.
- 65 °C'de 2 dk, 98 °C'de 40 dk pişirilir.
- Pozlama süresi 340 mJ/cm2.
- Pozlama sonrası fırında: 65 °C'de 2 dk, 15 dk sonra 98 °C.
- Son olarak, 3 damla (~ 150 μL) silanizing çözeltisi (Trichloro perfluoro oktil silane) yerleştirilmiş olan plastik bir kap ile kimyasal bir başlık içinde bir vakum odasına yerleştirerek her gofret silanize. Bir vakum çekin ve buhar gofret kaplamak için izin vermek için bir gecede bırakın. Bu adım, SU-8 ve PDMS arasındaki yapışmayı azaltarak kalıbın ömrünü artırır.
DİkKAT: Trikloro perfluoroctyl silane her zaman duman kaputunda ele alınmalıdır ve su kaynaklarından uzak tutulmalıdır. - Çift taraflı bant iki şeritler kullanarak 150 mm Petri yemekleri içine ayrı gofret kalıpları yerleştirin. Gofretlerin düz olduğundan emin olun. Alternatif bir gofret yerleştirilebilir içine bir alüminyum kalıp imal etmektir. Alüminyum kalıp kapalı olduğu için tek tip kalınlıkta dökümler üretecek, petri çanak yöntemi ise yüzeyin eğimine duyarlı dır. PDMS dökümlerinin geliştirilmiş düzlüğü, aksodakgörüntüleme süresini azaltır.
2. PDMS kan beyin bariyeri (BBB) cihazını oluşturmak ve monte etmek
- Plastik bir bardakağırlığına göre 1:10 (Crosslinker:Base) oranında 75 g PDMS karıştırın.
- PDMS'yi kalıpların üzerine dökün (200 μm kalınlığında kalıp için 1 mm kalınlığında ve 100 μm kalınlığında kalıp için 4 mm) ve vakum desiccator'da bir saat veya tüm kabarcıklar çıkarılana kadar gaz degaz. Bir gecede 65 °C'lik bir fırına koyun. 1 mm kalınlık, konfokal mikroskoptaki 10x hedefinin çalışma mesafesine göre ayarlanabilir.
- PDMS iyileştikten sonra, kenarlarda ki PDMS'den gofretini hafifçe kesmek için bir bıçak kullanın. PDMS'yi soyun ve dikdörtgen kılavuzları kesmek için bir bıçak ve cihazdaki giriş ve çıkışları açmak için 1,5 mm biyopsi yumruğu kullanın. PDMS cihaz parçalarını toz ve enkazdan temiz tutmak için 48 mm genişliğinde paketleme bandı ile kapatın.
- Daha sonra 5 mm x 50 mm'lik polikarbonat membran dikdörtgenini 5 mm gözenekleri ile kesmek ve daha sonra kullanmak üzere petri kabının içinde saklamak için diseksiyon makası kullanın.
- Aşağıdakileri toplayın: 200 μL pipet ucu, 2 mL 1:10 PDMS toluen ile 2:3 oranında bir cam şişe ağırlık, bir sıkma ampul ile pastöre, hazırlanan PDMS üst ve alt parçalar, membran, üç 50 mm x 75 mm cam slaytlar ve bir spincoater hepsini taşıma. Cihazın montaj ve hücre tohumlama için aşağıdaki adımlar Şekil 1'degösterilmiştir.
- 1 mL PDMS:toluen tutkal çözeltisini spin coater'ın aynası üzerindeki 50 mm x 75 mm'lik cam kaydırağa aktarmak için Pasteur pipetini kullanın. 100 rpm (ivme 300 rpm/s) ve 2000 rpm 'de 30 saniye (hızlanma 300 rpm/s) ile 5 saniye boyunca döndürün.
- Slaytı bir masaya yerleştirin ve bir PDMS üst haznesi ve bir alt oda ile kaplayın, böylece PDMS'nin içine kalıplanmış özelliklere sahip yüzleri slayta başvurun ve yapıştırıcı tüm özelliklerin çevresini özetleyerek PDMS yüzüne aktarılır.
- PDMS üst hazodasını tutkal kaplaması yukarı bakacak şekilde başka bir slayta çevirin ve membranı cihaz boyunca giriş ler ve çıkışlar arasında dikkatlice yerleştirin. 200 μL'lik ucu PDMS:toluen tutkal çözeltisine, ucuna bir kısmını sığınana kadar yerleştirin. PDMS'ye temas ettiği membranın kenarına küçük bir damla yerleştirmek için her giriş ve priz arasındaki uca dokunun.
- Cihazın diğer yarısını çıkarın ve iki parça üzerindeki giriş ve çıkışları hizalarken tutkal kaplaması ile aşağı yerleştirin.
- Tutkal tedavi etmek için 37 ° C gecede bir fırıniçine monte cihaz yerleştirin. Kurutucu ile bir vakum çan kavanoza aktarın ve iki gün boyunca dehidrat sağlar. Bu, Toluen'in buharlaşmasına izin vermek ve laboratuvar havasında emilen su buharını düzenleyerek cihazın tohumlama tutarlılığını artırmak için çok önemli bir adımdır.
3. Beyin mikro ortamını cihaza tohumla
- Hücre kültürü ve reaktifler: Bu protokole başlamadan önce aşağıdaki reaktifleri ve hücreleri edinin. 37 °C'de %5 CO2'deayarlanmış bir kuluçka makinesinde tüm hücre hatlarını geliştirin.
- DMEM'de insan üçlü negatif meme kanseri hücre hattı MDA-MB-231 (ATCC HTB-26) ve MDA-MB-231-BR-GFP hücrelerini (Patricia Steeg, PhD'den elde edilen) 4,5 g/L glukozile, 2 mM L-glutamin, %10 FBS ve 1x antibiyotik-antimikotik ile koruyun. Boş vektör pLL-EV-GFP lentivirus ile MDA-MB-231 hücre transdükse ederek MDA-MB-231-GFP floresan hücreleri oluşturun. Transekse gfp+ popülasyonunu denemeden önce floresan etkinleştirilmiş hücre sıralamasını (FACS) kullanarak sıralayın.
- EGM-2 ortamda insan beyni mikrovasküler endotel hücrelerini hCMEC/D3 koruyun. HCMEC/D3-DsRed floresan hücreleri boş vektör pLL-3.7-dsRed lentivirus ile hCMEC/D3 transducing oluşturun. Deneysel kullanımdan önce FACS kullanarak transkunolmayan floresan olmayan hücreleri kültürden çıkarın.
- DMEM'de normal insan astrositlerini (NHA) 4.5 g/L glukoz, %10 FBS, 2 mM Glutamax, 1 mM sodyum pirüuvat, 1x N-2 büyüme takviyesi ve 1x antibiyotik-antimikotik ile desteklenir. PLOX-TERT-iresTK lentiviral vektörü (Addgene 12245) ile dönüştürerek astrositleri ölümsüzleştirin. Plazmid psPAX2 ve zarf plazmid pMD2.G (Addgene 12260 ve 12259) kullanarak vektör oluşturun.
- Bir μmBBN cihazını vakum kurutucudan çıkarın ve girişler aşağı bakacak şekilde metal veya kağıda (örn. bant) yerleştirin ve plazma odasına yerleştirin. Ayrıca plazma odasına 50 mm x 75 mm cam kaydırak yerleştirin. Bir vakum çekin ve sonra 30 s için 80 W plazma ile tedavi.
- Cam kaydırağı ve cihazı plazma haznesinden hızla çıkarın ve cihazı bir kılavuz kullanarak hizalanmış cam kaydırağa bakan girişlerle yerleştirin(Ek Dosya 2). Bu, PDMS ve cam slayt arasında kalıcı bir bağ oluşturur ve yeniden konumlandırılamaz.
- Daha sonra uçlardan 2 mm, 16, 200 μL pipet uçları kesin. Pipet uçlarını tüm giriş ve çıkışlara yerleştirin. Cihaz hücreleri tohum için hazır değilse bu noktada vakum desiccator geri yerleştirilebilir.
- Cihazı plazma odasına geri yerleştirin ve 200 W'da 8 dakika plazma ile tedavi edin. Cihaz plazma işlem yerinden soğuduktan sonra (5 dk) şeffaf bir pipet ucu kutusu gibi steril bir ikincil kabın içine yerleştirin. ~ 15 dk içinde bir sonraki adımı gerçekleştirmek veya plazma tedavisinin etkinliğini tıkanması yol azaltılabilir.
- Deney kültüründen birkaç gün önce Petri 1 x 106 endotel hücresi (hCMEC/D3-DsRed) ve 1 x 106 astrosit (NHA) yer almaktadır. Cihaz 8 dk plazma tedavisi görürken, 0,5 mL 3 mg/mL PureCol tip I sığır kollajeninden oluşan ve 0,8 M NaHCO3 ve 20 μL 10x yüksek glikoz (250 mM) MEM ile kollajen çözeltisi hazırlayın. Kollajen çözeltisindeki 5.0 x 105 NHA hücresini askıya alın. Kullanılmadığı süre boyunca çözeltiyi buz üzerinde saklayın.
- Kollajen/astrosit/mikroglia çözeltisinin 120 μL'sini alt odanın pipet ucu ile cihaza aktarın(Şekil 1 Kırmızı oklar). Çözeltinin odanın diğer tarafına, ters pipet ucuna doğru fitil lemesine izin verin. Cihazın dört kanalı da dolduruldıktan sonra çipi 37 °C'de CO2 kuluçka makinesine, %5 CO2'yi ise 1 saat veya kollajen ayarlanana kadar yerleştirin.
- Kollajen setleri sonra, tam bir ortam karışımı ile alt oda besleme tüm pipet ipuçları doldurun. Endotel hücreleri ve astrositiçeren yongalar için endotel:astrosit medianın 50:50 karışımı kullanılır.
- Üst hazneyi %2 büyüme faktörü ile kaplayın matrigel tam endotel media üst oda pipet ucu(Şekil 1 Mavi oklar)kullanarak azaltılmış ve 1 saat için kuvöz yerleştirin.
- Belirtilen ortam karışımı ile üst hazneyi durulayın ve alternatif hangi ucu endotel hücreleri ile tohumlanır (Şekil 1 Yeşil oklar). 1 mL endotel media'da 1 x 106 endotel hücresini askıya alın ve her 15 dakikada bir 30°L tohumu, eşit kapsama alanı için alternatif üst hazne uçlarına dönüştürün. Tohum endotel hücreleri her üst oda ucu içine iki kez, oda başına 4 kez toplam.
- Endotel hücrelerinin son tohumlama sonra, medya karışımı ile tüm ipuçlarını doldurun ve 37 °C ve% 5 CO2,her 12 saat her iki odada medya değişen kuvöz cihaz yerleştirin.
4. Endotel tabaka oluşumunun ilerlemesini izlemek
- Kanalın endotel tabakası ile tam kapsama alanı 3 gün sonra gözlenir. Endotel bariyerinin kapsamını izlemek için iki yöntemden birini kullanın: Floresan veya TEER. hCMEC/D3-DsRed floresan ve kanal alanı boyunca % kapsama imageJ kullanılarak ölçülebilir.
- TIFF dosyasını hCMEC/D3-DsRed bariyerinin ImageJ temsilcisinde açın. ImageJ yazılımında dosyayı seçmek için Dosya > Aç'ı tıklatın.
- Bu anahtar komutları ve seçenekleri izleyerek görüntünün tüm Z katmanlarını birleştirin: Resim > Yığınlar > Z projesi > Tüm Z dilimleri, Maksimum yoğunluk.
- Bu yöntemle değerlendirilen tüm mikroakışkan yongalar arasında aynı renk eşiği gerçekleştirin. Sunulan çalışma için 450 barajını aştık. ImageJ'deki eşik menüsünü şu anda kullanın: Resim > Ayarla > Eşik.
- Aşağıdaki komutları ve seçenekleri kullanarak kaydedilecek ölçümleri ayarlayın: Çözümle > Ölçümleri Ayarla > Eşiğe sınır, Alan Fraksiyonu.
- Bir kutu çizerek ölçmek için mikroakışkan kanalın temsili bir bölge seçin. Kutu aracı ImageJ ana menüsünde yer almaktadır. Ölçü 3 teknik aynı kutu boyutunu kullanarak her mikroakışkan kanalın başında, ortasında ve sonunda konumlandırılmış çoğaltır.
- Her kanalı analiz edin ve % endotel kapsamını temsil eden alan fraksiyonu kaydedin. Verileri aşağıdaki komutları kullanarak çizmek ve görselleştirmek için bu ölçümleri elektronik tablo dosyaları olarak dışa aktarma: Çözümle > Ölçü .
- Alternatif olarak, alan başına endotel sıkı kavşaklarını ölçmek için Empedans spektroskopisi tabanlı TEER'i kullanın. TEER kullanılarak endotel bariyerinin ölçülmesi, endotel tabakasının bir bariyer olarak bütünlüğü için bir vekildir.
- Üst ve alt odaların giriş ve çıkışına iki elektrot yerleştirin.
- Srinivasan ve ark. 28 tarafından önerilen bir modele göre dirençler, endüktanslar ve kapasitanslar bir arada olarak endotel monolayer empedans ölçmek ,,29.28
5. Tohum kanser hücreleri cihaza
- Endotel tabakası olgunlaştıktan sonra, tohum kanser hücreleri cihaza. Tam kanser hücresi ortamda 1 x 106 kanser hücresinin 1 mL çözeltisini hazırlayın.
- Hücre kültürü besin doldurmak için çip medya değişimi.
- 30 μL'lik kanser hücrelerinin süspansiyonuna sahip her üst oda kanalını tohumlayın ve cihazı 15 dakika boyunca kuvöze geri yerleştirin. Her zaman tek bir cihaz içinde dört üst oda kanallarının aynı tarafında kanser hücreleri tohum.
- Aygıtı metastatik davranış için görüntülene kadar her 12 saatte bir yeni ortamla değiştirin ve ipuçlarını yeniden doldurun.
6. Konfokal görüntüleme ile tümör mikro-çevre görüntü
- İstenilen deneysel zaman noktasında (1, 2 veya 9 gün), kanalın 3Boyutlu görüntüsünü yakalamak için konfokal görüntüleme kullanın. Bu adımı nikon A1'de burada açıklanan ayarları kullanarak gerçekleştiriyoruz. Bu adım otomatiktir ve her kanalın görüntüye kaç floresan kanalın dahil edildiğine ve tüm hücrelerin konumlarını kapsayacak şekilde Z derinliğine bağlı olarak görüntüye 20-40 dakika gerekir.
- Mikroskobu açın, yazılımı açın ve kuvöz kapağını mikroskoba yerleştirin.
- Mikroskop sahne ısıtıcısını 37 °C ve VARSA CO2 ila %5'e ayarlayın.
- Mikroskop inkübatör stabilize edildikten sonra, 50 mm x 75 mm'lik montaj ını kullanarak cihazı mikroskop aşamasına yerleştirin.
- 10x hedefiyle aygıtın bir tarafına (sağlanan analiz yazılımıyla birlikte kullanılacaksa sola) odaklanın ve Z yüksekliğini sıfır olarak ayarlayın. z-stack ayarları altında, odak düzleminin 100 μm üzerinde ve 200 μm altında bir dizi içerir. Daha sonra X ve Y alanlarının sayısını sırasıyla %15 çakışarak 1 ve 9 olarak ayarlamak için dikiş ayarını kullanın. İğne deliğini önerilen minimuma ve z-tabakası nın yüksekliğine 9 μm'ye ayarlayın. Gözenekli membranın görünür olması için parlak alan pozlamasını ayarlayın. DSRed (561 nm) ve GFP (488 nm) kanalları için uyarma lazerlerini açın ve floresan lazer güçlerini ve kesilmeleri, pikselleri aşırı açığa çıkarmadan her kanalın görülebilmesi için ayarlayın.
- Üzerine basıldığında tüm alanların odakta olduğunu doğrulayın. Bu nedenle, görüntü için bir çıktı dosya adı (001.nd2) girin ve 3B konfokal görüntüyü otomatik olarak yakalamak için denemeyi başlatın.
7. Konfokal tomografi ile tümör mikro çevresini ölçün
- Konfokal tomografiyi kullanarak cihazdaki hücreleri ve tümör mikro çevresini tanımlayan bir dizi metrik ve ölçümü tahmin edin. Konfokal tomografik analiz (Şekil 2) konfokal z-yığınını hücrelerin üç boyutlu bir temsiline dönüştürür. Jupyter dizüstü bilgisayar / laboratuvar ortamında özel bir python komut dosyası kullanarak, bir düzlem daha sonra membran gibi kan beyin bariyeri oluşturan hücrelerin tabakası eşleşir30. Son olarak, kanser hücresi popülasyonlarının henotibik ölçümleri yapmak(Tablo 1).
- Bu analizi bir denemenin sonunda veya bir zaman diliminde gerçekleştirin. Python'u ve uygun kitaplıkları başvurulan yazılım kılavuzuna göre yükleyin, ardından "conda activate" komutunu çalıştırarak Windows Komut İstemi'nden yazılımı açın ve ardından "jupyter lab"ı izleyin. Jupyter ortamı varsayılan tarayıcı içinde yüklenir.
- Jupyter dosya gezgini çift açmak için Jupyter dizüstü "contom.ipynb" tıklayın. İçe aktar kitaplıkları, özel sınıflar/işlevler başlığıaltındaki hücreyi çalıştırın ve not defteri hücresini tıklatıp sonra oynat düğmesini tıklatarak not defterini kurlayın. Aşağıdaki tüm not defteri hücreleri aynı yaklaşım kullanılarak yürütülür. Burada not defteri "hücre" Jupyter not defteri içinde python kodu bir blok anlamına gelir unutmayın.
- Verileri hazırlayın. Bu algoritma, z yığınını ve üç boyutlu verileri işlemek ve görüntülemek için görselleştirme araç kitini (VTK) kullanır17.
- Sağlanan yerleştirin. XlsX dosyası ("Deneme İzleyici.xlsx") Jupyter dizüstü bilgisayar ile aynı windows klasöründe. Dosya, Jupyter not defteriyle deneyleri ve arabirimleri izler. BÖLÜM 6'daki ND2 dosyasını Jupyter not defteri konumunun altına "\Experiment_XXX\Confocal\" adlı bir alt klasöre yerleştirin. "XXX" yeni klasörlere atanan sayısal kimlik için ayarlayarak ek deneme klasörleri eklenebilir.
- İlk deneme klasörünü "Experiment_001" ve ND2 dosyasını "001.nd2" olarak etiketleyin. İlk olarak, ND2 görüntüleme dosyasını renk kanalıyla ayrılmış dikişli çok görüntülü TIFF dosyasına dönüştürün. Bunu, "Confocal z yığınını belleğe oku" başlığının altındaki not defteri hücresini Save_tiff_from_ND2 () fonksiyonu yorumsuz30ile çalıştırarak yapın. ND2 dosyası Nikon özel bir görüntüleme biçimidir, bu nedenle açık kaynak yazılım ile uyumlu bir biçime dönüştürmek için gereklidir.
NOT: TIFF (Tag Image Dosya Biçimi) her yerde olduğu için kullanılır, 16 bit uyumlu, vtk'ye kolayca içe aktarılır ve birden çok görüntü z-stack görüntüleri için uygun olan tek bir dosyada depolanabilir. Not defteri hücresini yürütmend2 dosyasından bir görüntü de okunur, renk ve XYZ konumlarının bilgilerini ayıklamak ve daha önce belirlenmiş bir yapıya göre bir sayısal dizi bu görüntü depolar. Daha sonra python kitaplığı tifffile kullanarak bir TIFF dosyası olarak dizi kaydeder.
- Görüntüleme verilerini 3B modele dönüştürme
- HÜCRELERI görselleştirmek için 3D render kullanarak TIFF dosyasını VTK'ya (vtkTIFFReader) aktarın(Şekil 2). Görüntüdeki hücrelerin rengine göre bir eşik seçin. Açıklığa kavuşturmak için, VTK nesnesi boşlukta (hacim) bir piksel bloğunu (X, Y, Z) temsil eder, ancak yalnızca belirli pikseller (yeşil veya kırmızı) hücreleri temsil eder, geri kalanı arka plan veya gürültüdür (siyah).
- Bu nedenle, arka planı kaldıran birim üzerinde bir opaklık filtresi ayarlayın, floresan kalan şeyin yalnızca hücreler olduğunu onaylayın. Jupyter dizüstü bilgisayar hücre başlıklı kullanarak bunu yapın, Channel_alpha değer değişkenleri (yani, GFP_alpha) ayarlayarak her mikroskop kanalı için opaklık değerlerini değiştirin. Eşiğe doğru ayarlanan bir 3D render görüntülebaşlıklı not defteri hücresini kullanarak efekti görselleştirin.
- Bir sonraki adımda kullanmak üzere elektronik tablodaki opaklık değerlerini kaydedin. Birim verilerini, her biri görüntüdeki bir hücreyi temsil eden tek tek 3B nesnelere dönüştürün,31'lik yürüyen küpler adı verilen bir teknik kullanarak. Bu algoritma voxels üç boyutlu ayrık skaler alanlardan bir izosurface bir poligonal örgü ayıklar.
- Her hücreyi arka plandan ayırmak için yürüyen küpler algoritmasındaki opaklık değerini kullanın. Voxel görüntüsünü üçgen örgüye dönüştür'ü çalıştırarak her mikroskop kanalında tanımlanan tüm floresan hücreler için bu adımı tamamlayın ve not defterine VTK dosyası olarak kaydedin.
- Bir düzlemi membrana sığdırmak
- Hücre merkezlerini ilk bularak bir uçağı endotel bariyerine takın (notebook hücresi: RFP kanalını (endotel bariyerini analiz edin)..endothelial barrier Birimdeki liste meshes ile titreştirin ve VTK'dan bir PolyDataConnectivityFilter kullanarak bağlı olmayan bölgeleri ayıklayın. Her kafesin santrilojiyi hesaplayın ve ölçümü çok büyük veya çok küçük kafesler için filtreleme yapan centroidler listesine ekleyin (<50, >1000000 voxels).
- Hata yönteminin en aza indirgemesini kullanarak endotel hücreleri için bir uçağı merkez hücrelerinin listesine sığdırın (notebook hücresi: Uçağı RFP centroids'e (endotel bariyerine)sığdırın)(Şekil 2, Şekil 3)32. Düzlem ve santriomlar çizerek uçağın uygun olup olmadığını inceleyin ve gerekirse el ile ayarlayın (teta, beta ve z kullanarak) RFP santrikoiler ve düzlem uygun Visualizebaşlıklı dizüstü bilgisayar hücreçalıştırarak .
- Uçak düzgün takıldıktan sonra, düzlemin normalini Deney İzleyici Dosyasına kaydedin. Gelecekteki kullanım için XLSX dosyası.
- Aşağıdaki tanımlayıcılar için tek tek kanser hücrelerinin tanımlayıcı özelliklerini analiz edin(Tablo 1).
NOT: Analizi gerçekleştiren bilgisayar geri kalıyorsa, yüksek performanslı bilgi işlem yoluyla yüksek iş analizi bir seçenektir. Bu algoritma, az sayıda hücrenin analizi için standart dizüstü bilgisayarlarda kullanışlıdır, ancak VTK çok sayıda tek tek nesne (>1000) için uygun değildir. Bu nedenle, yüksek performanslı bir bilgi işlem kümesiüzerinde çalışmak için uyarlanmış algoritmayı kullanmak isteğe bağlıdır. Bu, birçok hücreyle yapılan deneylerin hızlı bir şekilde analiz edilmesini sağlar (Şekil 2). Tüm 7.5 not defteri hücreleri bilimden tanımlayıcılar için kalan mikroskop kanalları analiz ve Experiment_tracker bilgi okuyun ve var olan kanalları analizederek çalıştırarak gerçekleştirilir .- Kanser hücrelerinin ekstravazasyon ölçün: Bir düzlem ile endotel tabakası karakterize sonra, membran yoluyla göç eden her kanser hücresinin hacmini ölçmek. Her hücreyi (Boolean) kes, böylece membranın altındaki kafes tutulur ve membranın üzerindeki kısım çıkarılır33. Daha sonra açık kafesi (vtkFillHoles) kapatın.
- Kırpılan kafesin normal ve yeni merkezroidini yeniden hesaplayın. Analiz için kırpılatan her kanser hücresinin hacmini ve konumunu ölçün. Birim, her bir hücrenin kafes dolgularının voxel sayısına eşittir. Endotel düzlemi ve her kanser hücresinin konumu arasındaki mesafeyi hesaplayın.
- Hücresel fenotipölçün: Şekli, hacmi ve konumunu hesaba katarak her kanser hücresinin morfolojisini hesaplayın.
- Kanser hücrelerinin ekstravazasyon ölçün: Bir düzlem ile endotel tabakası karakterize sonra, membran yoluyla göç eden her kanser hücresinin hacmini ölçmek. Her hücreyi (Boolean) kes, böylece membranın altındaki kafes tutulur ve membranın üzerindeki kısım çıkarılır33. Daha sonra açık kafesi (vtkFillHoles) kapatın.
- Ölçümleri doğrulayın ve bir elektronik tabloya veya çizime kaydedin. Merkeztaşıların doğru ölçüldüklerini kontrol edin başlıklı dizüstü bilgisayar hücresini çalıştırın ve görüntülenmiş birimin üstünde hücre türüne göre tanımlanan santridoidleri gösteren bir işleme açılır. Tüm denemeler yapıldıktan sonra, kimlik tarafından eklenecek deneyleri not defteri hücresine yazarak tüm veri kümesini tek bir elektronik tablo dosyası olarak dışa aktarın: Verilen deneme kimliklerinin yerine geçen değişkenler için verileri tek bir Veri.XLSX dosyası olarak dışa aktarın. Tamamlanan veri kümesini doğrularsanız, uzaklık başlıklı not defteri hücresini kullanarak çizin. Çizim not defteri ortamında görünür ve dosyaya kaydedin.
8. Yapay Zeka ile ilgili özellikleri analiz edin
NOT: Yapay zeka algoritmaları kullanarak metastatik metotipik özellikleri tanımlayın.
- Şekil 5 ve Ek Dosya 3'tegösterilen şemaya göre Turuncu kullanarak ikili sınıflandırma yapın. "conda activate" ve ardından "python -m Orange.canvas" yazarak ikinci bir Windows Komut Komut Istemi'nden Orange'ı başlatın ve komut isteminden Yeni'yi tıklatın. Turuncu bir sürükle ve bırak tabanlı yazılımdır, bu nedenle tamamlayıcı Dosya 3maç için tuval üzerine sol menüden her öğesürükleyerek işlevleri düzenlemek . Bundan sonra dosya simgesine çift tıklayın ve Veri.XLSX dosyasını seçin.
- Boolean işleminde başarısız olan veya "Satırları Seç" simgesini kullanarak bilinen sınırların dışında parametrik değişken değerleri veren ler olarak tanımlanan kötü ölçümleri kaldırmak için verilere filtre uygulayın. "Sphericity 0 ile 1 arasındadır" gibi filtreye karşılık gelen simgeyi ve koşulları çift tıklatın. 8.2.1, 8.2.2 ve 8.2.3 için koşullar oluşturun.
- Filtre mesafesi ekstravaze ölçümleri -100-200 m arasında değişmektedir.
- Hücre şeklinin 0-1 aralığına kadar filtreleme.
- Filtre kanser hücresi hacmi ölçümleri 0-2000 voxels arasında değişmektedir.
- Beyin-metastatik MDA-MB-231-BR-GFP ve beyin dışı metastatik MDA-MB-231-GFP sınıflandırmak için tüm parametrik değişkenleri(Tablo 1)kullanın. Tuvalden Sütunları Seç simgesini çift tıklatın. Kullanılabilir Değişkenleri Özellikler, Hedef Değişkenlerveya Meta Özniteliklerinetaşımak için > düğmesini kullanma . Hedef Değişken olması gereken tek değişken, veri kümesindeki hücrelerin metastatik (1) veya değil (0) olarak kabul edilip edilmeyeceğini tanımlayan metastatik etikettir. Deney değişkenleri Meta Öznitelikleri bölümüne yerleştirilebilir.
- Verileri bir eğitime örnek let (%80) ve test seti (%20). Veri örnekleyici simgesine çift tıklayın ve sabit veri oranı örnekleme türünü seçin: %80'e ayarlayın ve çoğaltma ve katmanla titreme onay kutularını seçin. Her modele/sınıflandırıcıya karşı 10 kat kullanarak eğitim kümesini stratejilendirin ve çapraz doğrulayın. Test & Skor'u çift tıklatın ve kıvrım sayısıyla Çapraz doğrulamayı seçin: 10'a ayarlayın ve Katmanlı kontrol edildi. Hedef sınıfı 1olarak ayarlayın.
- Bu yöntemde, verilere dayanıklı oldukları için Sinir Ağları ve Rastgele Orman öğrenme algoritmalarını kullanın. Rastgele Orman simgesi içinde, 50 olacak Ağaç Sayısını seçin ve başka seçenekler seçmeyin. Nöral Ağ simgesi içinde gizli laye r başına Nöronlarseçin: 100, Aktivasyon: ReLu, Çözücü: Adam, Alfa: 0.0001, ve Max Yinelemeler: 200. Ancak, bu ayarlar çalışmaya göre önemli ölçüde değişir ve uygulamadan önce iyi anlaşılmalıdır.
- Tuvali ayarladıktan sonra Dosyadan Örnek Verilere her simgeyi çift tıklatın ve Veriyi Uygula veya Gönder'etıklayın. Çift tıklayın Test & Puan ve eğitim verileri algoritmaları kullanarak bir model geliştirmek için kullanılmaya başlanır. Makine öğrenme modelini eğittikten sonra Test & Skor'u yeniden açın ve Test Verileri Test'ini seçin ve çipteki hücreleri 0'dan 1'e kadar beyin metastatik olma olasılığına göre sınıflandırarak modelin performansını yükseltmek için pop-up penceresini kapatın.
- Makine öğrenme modeli performansını bir dosyaya kaydedin (Tablo 2). ROC eğrisi (AUC) altında alan, doğruluk ve F1 puanı ekleyin. Tek tek metastatik endeksleri ve sınıflandırma olasılıklarını içeren ikinci bir dosyayı kaydedin. Kaydet simgesini çift tıklatın ve sınıflandırma olasılıklarını dosyalamak için As'ı kaydet'i tıklatın. Benzer şekilde, ROC eğrisi ROC Analizi simgesine çift tıklayarak görüntülenebilir ve model performansı Karışıklık Matrisi simgesine çift tıklayarak hesaplanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu tekniği kullanarak, farklı floresan proteinler veya boyalar ile etiketlenmiş hücre tiplerini analiz ettik. Bu yaklaşımın hCMEC/D3-DsRed ve floresan olmayan astrositlerle formüle edilmiş bir μmBBN çipi ile kullanıldığını gösteriyoruz. Beyin mikrovasküler endotel hücreleri gözenekli bir membran üzerine tohumlanmış (5 μm parça kazınmış gözenekleri) ve bir kuluçka34 37 ° c altında% 5 CO2altında yerleştirilir . Üç gün sonra endotel tabakasının birleşimi mikroskopi ile doğrulandı ve daha sonra kanser hücreleri endotel tabakasının üstüne yerleştirildi. İki meme kanseri hücre hatları, bir beyin arayan klon MDA-MB-231-BR-GFP olarak adlandırılmış, ve ebeveyn MDA-MB-231-GFP hücreleri bir astrositik beyin niş içeren μmBBN çip içine girdi35,36,37,38,39,40,41. ΜmBBN yongaları 1, 2 ve 9-Days 3 kanallı (dsRed, GFP ve Brightfield) 10x nesnel bir konfokal mikroskop kullanılarak, her 9 μm ve 1x9 XY dikişli 10x'te görüntülendi. Bu mikroskop, hücreler üzerindeki stresi en aza indirmek için görüntüleme işlemi sırasında 37 °C sıcaklıkta muhafaza edilmiştir.
Tam bir μmBBN yongasının(Şekil 3A)ve endotel kapsamının(Şekil 3B-D)temsili bir görüntüsü gösterilmiştir. Yüksek ve düşük kapsama alanı olan endotel bariyerleri, μmBBN yongalarının kanser hücrelerinin eklenmesi için uygun olduğunu tespit etmek için ölçülür(Şekil 3B). Deney için kabul edilebilir bir konfluent endotel bariyeri olan bir μmBBN yongasının(Şekil 3C)ve kanser hücrelerinin eklenmesine uygun olmayan özellikle zayıf endotel kapsama alanına sahip bir μmBBN yongasının temsili görüntüleri sağlanır (Şekil 3D). Endotel hücrelerinin uzun süreli kültüre aldatan üst ve alt μmBBN talaş odalarını ayıran membranın ötesine yayılan kapsama neden olabilir. Endotel hücreleri genellikle beyin niş uzaya kanser hücresi hareketini etkilemez ama uçak zor uygun yapabilirsiniz hem üstünde ve doğrudan membran altında büyümek. ΜmBBN talaş imalatının değişkenliği ve membranın endotel kapsama alanı nedeniyle, temsili düzlemler normal düz endotel bariyerine(Şekil 3E)uygun ve atipik kavisli membran referans için görüntülenir (Şekil 3F). Cihazın 40 °C'nin üzerindeki bir sıcaklıkta fırında kurutularak kavisli bir membrana neden olabilir.
Geliştirilen konfokal tomografik analiz kullanılarak ölçülen astrositik μmBBN ile karşılaşıldığında MDA-MB-231-BR-GFP ve ebeveyn MDA-MB-231-GFP hücre hattının henotik farklılıkları gözlendi. Makine öğrenme algoritmasına(Tablo 1)giriş için kullanılan 4 adet henotibik tanımlayıcı Şekil 4'tegösterilmiştir.
Ekstravaze edilen uzaklık, endotel bariyeri ile μmBBN çipindeki her kanser hücresi pozisyonu arasındaki mesafeyi temsil eder(Şekil 4A). Endotel bariyeri 0 μm'de dir. Mesafeler <0 μm akış odasında kalan kanser hücrelerini temsil eder. Mesafeler >0 μm endotel bariyerinden geçen ve beyin niş alanına giren kanser hücrelerini gösterir. MDA-MB-231-BR-GFP ve MDA-MB-231-GFP'ye 1 günlük maruziyetten sonra endotel bariyeri içinde konumlandırıldı. Ancak, 2 ve 9-Gün etkileşimden sonra MDA-MB-231-BR-GFP'nin bir alt kümesi astrositik beyin nişine >100 μm göç etmiş, ebeveyn MDA-MB-231-GFP hücreleri ise endotel bariyerine yakın kalmıştır. Endotel bariyerinden geçen her kanser hücresinin hacmini hesaplayarak endotel bariyeri/beyin niş arayüzündeki kanser hücresi pozisyonlarını çözdük. Elde edilen yüzde hacimle ekstravazlanmış kanser hücresini temsil eder(Şekil 4B). Hücre hacmi ile ekstravaze% 0 endotel bariyerinin üstünde kalan kanser hücrelerini gösterir, bir kanser hücresi tamamen endotel bariyeri ile extravazated ve beyin niş uzayda bulunduğunda% 100 arasında değişen. Ebeveyn MDA-MB-231-GFP hücreleri başlangıçta hacim tarafından ekstravazlaştırılan μmBBN çipe maruz kaldıktan sonra 1 gün sonra endotel bariyeri ile etkileşime girilir. At 2, ve 9-Gün MDA-MB-231-GFP hücreleri uzak beyin niş uzaydan bariyerin üstünde kalan hücrelerin önemli bir kısmını korumak. MDA-MB-231-BR-GFP hücreleri özellikle 2 günlük zaman diliminde >%100 ekstravasated olan hücrelerin bir kısmını korudu.
Kanser hücresi şekli μmBBN maruz kalma süresi boyunca önemli ölçüde değişti. Her zaman noktasındakanser hücrelerinin temsili görüntüleri Şekil 4C'degösterilmiştir. Kanser hücresi şeklinin morfolojik niceliği, hücre hacmi ve yüzey alanı için hesap layan sphericity kullanılarak hesaplanmıştır (Şekil 4D). Herikilik metrik 0-1 arasında değişmektedir, 1 mükemmel bir küre temsil eder. Hem MDA-MB-231-BR-GFP hem de MDA-MB-231-GFP hücreleri μmBBN çipin içine 1 günlük küresel tohumlama yapıldı. ΜmBBN çipinde 2 ve 9 günlük etkileşimden sonra, her iki kanser hücresi hattı da farklı oranlarda da olsa küresel şekillerini azaltmaya eğilimlidir. Kanser hücresi şekline ek olarak, her kanser hücresinin voxels hacmi de konfokal tomografik analiz kullanılarak ölçülür. Her kanser hücresi hattı Şekil 4E-F'deiki gruba ayrılmıştır : "out", endotel bariyerinden geçen kanser hücrelerini temsil eden (>%90 bariyerden ekstravasated) ve "in", endotel bariyeriyle etkileşime giren ancak ekstravasat olmayan hücre popülasyonu (<90% ekstravasated). Astrositik niş içine extravazated kanser hücresi alt popülasyonları endotel bariyeri ile etkileşim içinde kaldı ama tam olarak beyne ekstravazat vermedi kanser hücrelerine göre boyutu daha küçüktü.
Beyin arayan MDA-MB-231-BR-GFP, makine öğrenimi kullanarak beyin-metastatik ve beyin dışı metastatik kanser hücrelerini ayırt etmek için yararlanılabilen ebeveyn MDA-MB-231-GFP'den farklı olarak μmBBN yongalarında bir henotypik desen saptandı. Veriler, modeli eğitmek ve doğrulama testleri gerçekleştirmek için rasgele eğitim ve doğrulama veri kümelerine ayrılmıştır. Modeli eğitmek için, veri filtreleme den sonra toplam 38.859 hücre kullanıldı ve model 9.714 tek tek hücrelere karşı test edildi. Eğitilen model, beyin metastatik olasılık indeksi oluşturmak için astrositik μmBBN yongalarında (4 adet primer tümör tipinin hasta beyin metastazlarından izole edilmiş ve 1 primer meme kanseri tümörü) analiz edilen kanser hücresi hatlarına ve PDX tarafından oluşturulan kanser hücrelerine uygulanmıştır(Şekil 5). Sekiz farklı makine öğrenme sınıflandırma yöntemi test edildi: Naif koylar, rastgele orman, karar ağacı, k-en yakın-komşu(kNN), stokastik gradyan iniş, nöral ağ ve Adaboost. Her yöntemin sonucu Tablo 2'degösterilmiştir. Nöral ağ ve Adaboost, sırasıyla 0,920 ve 0,928 AUC ile μmBBN platformu kullanılarak oluşturulan verilerle kullanılması önerilen en iyi performans gösteren 2 sınıflandırma yöntemiydi. Ayrıca, 0.833 ve 0.853 doğruluk gösterdi. Nöral ağ ve Adaboost yöntemleri için ortalama hassasiyet ve geri çağırma (F1) 0.847 ve 0.860 idi. Bu yaklaşımı metastatik olmayan meme tümörü pdx örneklerine ve bilinen metastatik örneklere (meme, akciğer, yumurtalık, dil) uyguladığımız önceki çalışmalardan, PDX örneklerine uygulanan aynı yaklaşımın metastatik olmayan hücrelerden metastatik hücrelerin doğru bir şekilde tanımlanmasını sağladığını gördük. Tablo 2, PDX verilerine uygulanan her makine öğrenimi algoritmasının sonuçlarını gösterirken, aynı yöntemlerin en sağlam (Nöral ağ ve Adaboost (Random Forest) olduğu kanıtlanmıştır. PDX örnekleri için yapılan testsetinde kullanılan 143 hücreden 71'i metastatik olmayan, 41'i metastatik meme, 11'i metastatik dil, 13'ü metastatik akciğer ve 2'si metastatik over idi. Her hücre tipi nin genel doğruluğu 0.88'dir ancak bireyin şu yaklaşık doğrulukları vardı: metastatik olmayan meme: 0.96, metastatik meme: 0.80, metastatik dil: 0.80, metastatik akciğer: 0.92, metastatik over: 1.0
Şekil 1: Deneysel iş akışı. (A) Mikroakışkan cihaz montaj sürecinin şematik gösterimi. Bir spinner 50 mm x 75 mm cam slayt üzerine PDMS:toluen tutkal ince bir film yatırmak için kullanılır. ΜmBBN cihazının her yarısı kanal tarafına tutkalla bakacak şekilde damgalanır ve daha sonra μmBBN cihaz parçaları arasında bir polikarbonat membran (5 m gözenekleri) ile monte edilir. ΜmBBN cihazları tutkal tedavi etmek için 24 saat için 37 °C fırında yerleştirilir. Cihazlar daha sonra deneysel kullanımdan önce en az 48 saat boyunca vakum lu kurutucuda kurutulur. Bir μmBBN cihazı ve 50 mm x 75 mm cam kaydırak plazma tedavisi ile aktive edilir ve birbirine bağlanır. Uçlarda kesilen standart P200 pipetleri tüm μmBBN cihaz giriş ve çıkışlarına yerleştirilir. Tamamlanan μmBBN cihazı 8 dk (200 W) plazma tedavisi ile sterilize edilir ve steril ikincil bir konteynere aktarılır. (B) Bir hücresel kan beyin bariyeri ve beyin niş mikro-çevre oluşturmak için mikroakışkan cihaz iskele kullanarak şematik genel bakış. Bir biyogüvenlik kabini içinde, kollajen astrositkarışımı alt μmBBN cihaz odasına tohumlu ve 37 °C'de 1 saat katılaşmak için izin verilir. Matrigel, membranı 37 °C'de 1 saat boyunca üst akış odasından kaplamak için kullanılır. Daha sonra endotel hücreleri üst odanın bir ucuna tohumlanır ve 15 dk.'ya akıp yerleşmelerine izin verilir. Bu tohumlama, akış odasının alternatif kenarları olan x4 tekrarlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Konfokal tomografik analize genel bakış. Yazılım segmentasyon ve 3D meshes kullanarak hücrelerin 3-D modeli içine mikroskobik konfokal Z-stack görüntü dönüştürerek başlar. Program daha sonra her hücrenin merkez konumunu hesaplar (centroid) ve endotel bariyerine bir düzlem uyuyor. Daha sonra her bir hücrenin henotypik ölçümleri tablolanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Endotel bariyer kapsama alanı ve uçak montajı. (A) Bir μmBBN cihazının temsilşetiği ve görüntüsü. Üst görünüm şemasıiçindeki kesik li beyaz çizgi, kesit görünümünde temsil edilen aygıtın alanını gösterir. (B) Kanser hücrelerinin uygulanmadan önce μmBBN cihazlarının yüksek ve düşük endotel kapsamının karşılaştırılması. Welch iki örnekli t-testi, *** p < 0.1*10-4. (C) Yüksek endotel kapsamının temsili görüntüsü. ΜmBBN cihazının inset şemasındaki kesik beyaz kutu, cihaz içindeki endotel hücrelerinin konumunu gösterir. Genel bakış ve inset görüntülerin ölçek çubukları = 200 μm. (D) Düşük endotel kapsamının temsili görüntüsü. Genel bakış ve inset görüntülerin ölçek çubukları = 200 μm. (E) Düz bir endotel bariyerinin örnek düzlem sığdır. Yeşil dikdörtgen endotel düzleminin konumunu temsil eder. Dots bariyer oluşan tek endotel hücreleri temsil eder. Sarı nokta, düzlemin üzerindeki endotel hücreleridir ve mor noktalar düzlemin altına düşen hücrelerdir. Düzlemin üzerindeki endotel hücreleri (sarı nokta) bir tüp oluşturmak için cihazın yanaklarında ve üst kısmında büyüme eğilimi sergiler. (F) Kavisli düzleme sahip bir μmBBN cihazının örnek düzlem uyumu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Astrositik kan beyin niş mikroakışkan yongaları beyin-metastatik ve ebeveyn hücre fenotiplerinin hücresel fenotilerinin nicelleştirilmesi. (A) 1, 2 ve 9-Gün endotel bariyerinden kanser hücrelerinin μm mesafe şerit arsa. 0 μm'deki kesikli siyah çizgi endotel bariyerini temsil eder. Kırmızı kutular, beyin nişine çok göç eden MDA-MB-231-BR-GFP hücrelerinin bir alt kümesini gösterir. (B) Kanser hücrelerinin yüzde toplam hacminin keman arsa 1, 2 ve 9-Days endotel bariyerinden ekstravaze. Kısa kesik çizgiler dörtteleri, daha uzun kesikli çizgi ortalamayı temsil eder. (C) ΜmBBN cihazındaki kanser hücrelerinin morfolojisinin temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu = 25 μm. (D) ΜmBBN cihazındaki kanser hücrelerinin 1, 2 ve 9-Gün'de genişliklerinin keman çizimi. Küresellik 1 arasında değişir: küresel 0: küresel değil. (E) Endotel bariyeri (dışarı) dışında dinlenen hücreler ve bariyer (in) ile ekstravaze hücreleri için voxels μmBBN cihazda MDA-MB-231-GFP hücre hacmi kutu arsa. (F) Endotel bariyeri (dışarı) dışında dinlenen hücreler ve bariyer (içinde) ile ekstravaze hücreleri için voxels μmBBN cihazda MDA-MB-231-BR-GFP hücre hacmi kutu arsa. Kutu, düşük ve yüksek dörtte leri geçen interquartile aralığının oranını göstermek için uzanan dörtte birlikve bıyıkları görüntüler. Dunn'ın çoklu karşılaştırmaları ile çift yönlü Wilcoxon Rank Sum ve Kruskal-Wallis, *** p < 0.1*10-4. Royal Society of Chemistry'nin izniylereferans 24'ten üretilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Kanser hücrelerinin makine öğrenimi sınıflandırmasının temsili sonuçları. (A) Makine öğrenimine genel bakış. Konfokal tomografiden toplanan verilerin bölünmesi, verilerin filtrelenmesi, makine öğrenimi algoritmasının 10 kat doğrulama kullanılarak eğitilmesi ve modelin rezerve edilen verilerin %20'sinin rastgele bir örneği yle test edilmesi sürecini gösterir. Seçili model daha sonra tek tek hücrelerin metastatik dizini toplamak için yeni verilere uygulanabilir. (B) Görüntülemeden önce MDA-231-BR-GFP ve MDA-231-GFP hücreleri için 8 farklı makine öğrenimi algoritmasının performansını gösteren ROC eğrileri. Bu, eğitilen modelin performansını anlamak için analiz edilecek eğri türünü temsil eder. (C) Roc eğrileri hastaya uygulanan 8 farklı makine öğrenme algoritması türetilmiş ksenogreft (PDX) ayrıştırılmış hücreler için 2-Gün kültürlü. Bu, eğitilen modelin performansını anlamak için analiz edilecek eğri türünü temsil eder. Royal Society of Chemistry'nin izniylereferans 24'ten üretilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Özelliği | Tanımlayıcısı |
| Tümör hücresi | % niş içine ekstravasated |
| Tümör hücresi | Birim |
| Tümör hücresi | Sphericity |
| Tümör hücresi | Ekstravasated mesafe |
| Tümör hücresi | Canlı hücre 2B geçişi |
| Mikro-metastaz | Gözeneklilik |
| Mikro-metastaz | Stromal etkileşim |
| Mikro-metastaz | Yaş |
| Mikro-metastaz | Büyüme hızı |
| Stromal hücre | Birim |
| Stromal hücre | Yakındaki kanser hücrelerinden uzaklık |
| Stromal hücre | Endotel bariyerinden uzaklık |
| Stromal hücre | Şekil |
Tablo 1: Özellik türüne göre tanımlayıcıların listesi. Tümör hücrelerinin henotipik karakterizasyonu tanımlayıcılardan oluşan bir panel kullanılarak temsil edilir. Kırmızı kutu, makine öğrenimi yoluyla beyin metastatik olasılığını tahmin etmek için kullanılan tanımlayıcıları gösterir.
| Kanser hücreleri | |||
| Yöntem | Auc | Doğru -luk | F1 |
| Sinir Ağı | 0.925 | 0.84 | 0.847 |
| AdaBoost | 0.928 | 0.853 | 0.86 |
| Rastgele Orman | 0.925 | 0.849 | 0.855 |
| Karar Ağacı | 0.898 | 0.817 | 0.827 |
| Knn | 0.775 | 0.702 | 0.718 |
| Lojistik Regresyon | 0.769 | 0.735 | 0.751 |
| Naif Bayes | 0.745 | 0.715 | 0.73 |
| Sgd | 0.73 | 0.73 | 0.737 |
| PDX Kanser hücreleri | |||
| Yöntem | Auc | Ca | F1 |
| Sinir Ağı | 0.972 | 0.881 | 0.878 |
| Rastgele Orman | 0.964 | 0.888 | 0.887 |
| AdaBoost | 0.957 | 0.881 | 0.879 |
| Ağaç | 0.954 | 0.867 | 0.865 |
| Lojistik Regresyon | 0.897 | 0.832 | 0.831 |
| Naif Bayes | 0.896 | 0.846 | 0.849 |
| Knn | 0.882 | 0.818 | 0.814 |
| Sgd | 0.861 | 0.86 | 0.853 |
Tablo 2: Kanser hücrelerini ve PDX kanser hücrelerini beyin metastatik potansiyeline göre sınıflandırmak için makine öğrenimi yöntemlerinin karşılaştırılması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kanser hücrelerinin beyin dokusuna endotel bariyerinden ekstravazasyon ve göçünün ölçümü için klinik görüntüleme analizlerinde sıklıkla kullanılan araçları uyarlayan yeni bir yöntem geliştirdik ve sunduk. Biz bu yaklaşımın hem in in in in in in in vitro ölçümler için yararlı olabilir poz; beyin vaskülatürünü özetlemek için 3 Boyutlu mikroakışkan bir sistem üzerinde kullanıldığını gösterdik. Ekstravasated mesafe, hacim, sphericity ve hacim tarafından ekstravazlanmış yüzde dahil kanser hücresi ölçümleri bu teknik kullanılarak ölçülür. Mesafe ekstravazve hacim tarafından ekstravazlanmış yüzde kullanıcı bariyer ve doku içinde göç genelinde ekstravazasyon ve göç değerlendirmek için çip içinde kanser hücrelerinin konumunu yeniden izin verir. Her zaman noktasında hücrenin dinamik hareketleri veya işlevi ile ilgili olan her zaman dilimi gibi hücre şekli ölçümleri. Göçmen MDA-MB-231-BR-GFP hücreleri, başlangıçta μmBBN cihazına sokulduğunda yüksek düzeyde küresellik sergilerler ve hareketlerini azalttıkça ve nişi kolonileştirmeye başladıkça daha az küresel bir şekil haline gelirler. MDA-MB-231-GFP ve MDA-MB-231-BR-GFP'nin toplam hücre hacmi, hücre hatlarının şekli ndeki farklılık nedeniyle farklılık göstermektedir. Endotel bariyerini geçen kanser hücreleri bariyerden geçmeyen hücrelerden daha yuvarlaktır, böylece daha küçük yuvarlak hücreler endotel tabakasında daha verimli bir şekilde ekstravazatyapabilir.
Başarıyı kolaylaştıran protokol içinde iki kritik adım vardır. İlki, gözenekli membran ile ayrılan μmBBN cihazının üst ve alt kısımlarının montajı sırasında gerçekleşir. Üst ve alt cihaz parçaları, giriş ve çıkışların çakışması için çiftleştirilmelidir, ancak doğru akışı teşvik etmek için aradaki zar tarafından tıkanmaz. Kalitedeki dalgalanmaları en aza indirmek için üst ve alt cihaz parçalarının veya membran hizalamalarının zayıf bir şekilde yerle bir edilmesine sahip tüm μmBBN aygıtları atılır. PdMS tedavi sonraki pişirme:toluen tutkal cihazı monte etmek için 37 °C'de düz membranlar ile μmBBN cihazlar üretmek için gerçekleştirmek için önemlidir. 37 °C'yi aşan pişirme sıcaklıkları, özellikle bir uçağı endotel bariyerine takarken görüntü analizini zorlaştıran kavisli membrana sahip cihazlar üretme eğilimindedir. İkinci kritik adım endotel bariyerinin tohumlanması sırasında gerçekleşir. Tohumlamalar, endotel hücrelerinin cihazın zarına rastgele dağıtılmasını sağlamak için cihazın üst kısmını besleyen iki giriş arasında en az on beş dakikalık aralıklarla gerçekleşmelidir. Çipe astrosit içeren kollajen karışımının tohumlanması, sorun giderme ve laboratuvara özgü protokolde değişiklik gerektirebilir. Cihazın membran yüzeyi hidrofobik değilse, kollajen cihazın hem alt hem de üst kısımlarını doldurur ve cihazın üst kısmından tüm akışı tıkayacak şekilde ayarlar. Son plazma gazı tedavisinin amacı cihazın hidrofobik yüzeyi yapmaktır. Bu durumda, hidrofobikliği artırmak için cihazın plazma gazı tedavisinin ayarını öneririz.
Bu yaklaşımla bazı sınırlamalar gözlemledik. Örneğin, hücre floresansını tetiklemek için kullanılan yaklaşım görüntüleme kalitesini etkileyebilir. Canlı hücre izleme boyaları kullanılırken, floresan desen küçük noktalardan oluşur, transfected veya floroforların transdüktör ifade tek düze bir desen üretir. Lekeli desen, piksellerin ek ve bazen hataya açık kümelemesi gerektirir. Ayrıca, ölçümün hassasiyeti görüntüleme sırasında alınan bakıma bağlıdır. Daha yüksek çözünürlüklü görüntüler ve daha fazla z dilimleri çözünürlüğü artırır, ancak görüntüve analiz etmek daha fazla zaman alır. Dokunan hücreler de yanlış büyük tek bir hücre olarak analiz edilebilir. Bu birçok otomatik görüntüleme sistemleri için bir sorundur, ancak iki şekilde ele alınabilir. Birincisi, endotel tabakasında dokunan birçok hücre vardır, ancak bunların kombinasyonu kesme düzleminin son konumu üzerinde ihmal edilebilir bir etkiye sahiptir. İkincisi kanser hücrelerinin sayısı yeterince düşük ki dokunmadan nadirdir. Düzlemi sığdırırken ortaya çıkan hatalar çeşitli nedenlerle oluşabilir. Birincisi, bazı endotel hücrelerinin hücre kültürü sırasında merkezi zardan uzaklaşmış olmasıdır. Bu endotel hücrelerinin tüm kanal kaplama veya kollajen dolu alan işgal neden olabilir, böylece ölçüm çarpık. Başka bir hata kaynağı, paradoksal olarak, önceki hatayı düzeltmek için düzlemin el ile ayarlanmasıdır. Ancak, tekrarlanabilirlik ve tekrarlanabilirlik çalışmaları bu en az etkiye sahip bulduk. Son olarak, belirli koşullar altında hücre örgü Boolean kesim başarısız olabilir veya kesme örgü kapatmak için algoritma da başarısız olabilir gözlendi. Burada kullanılan teknikler mevcut "sanat durumu"dur ve bu sorunlar şu anda algoritmik bilim adamları tarafından ele alınmaktadır.
ΜmBBN konfokal tomografisi ile toplanan verilere karşı makine öğrenme algoritmaları (AI) eğitim sonuçları, bu yaklaşım tarafından analiz bireysel hücrelerin önemli sayıda kanser hücrelerinde bulunan heterojenite yakalama sorunları ele yardımcı olabileceğini göstermektedir. 0,9'dan büyük bir AUC, yüksek performanslı bir sınıflandırıcı olarak kabul edilir. Burada 0.928 auc gösterdi. Biz yöntem geliştirildikçe performans artmaya devam edeceğini bekliyoruz. Tüm AI yöntemlerinde olduğu gibi, test edilmesi beklenen veri türünü geniş ölçüde temsil etmesi için eğitim veri kümesini dikkatle seçmek için dikkatli olunmalıdır. Bu nedenle, model, örneğin modeli sağlam bir hasta numune koleksiyonuna maruz bırakmadan doğrudan hasta örneklerine uygulansaydı, performansın düşmesini bekleyebiliriz. Biz modelde kanser hücreleri için 1-Gün, 2-Gün ve 9-Gün ölçümleri bir önceki çalışma için kullanılan 2-Gün ile karşılaştırıldığında ekleyerek bir ölçüde bu göstermek. Geniş örneklemenin modelin performansını biraz azalttığını ve bazı kötü performans yöntemlerinin ne kadar hassas olabileceğini gösterdiğini gözlemliyoruz, bu da kullanıcıların verilerinde birkaç modeli test etmek isteyebileceğini düşündürüyor. PDX sonuçlarını açıklayan Tablo 2 genel olarak iyi bir performans gösterir. Ancak, tek tek PDX türleri, her örnekten ölçülen hücrelerin oranının farklı olduğunu ve her bir kaynak alanının performansını etkileyebileceğini gösterir. Örneğin, yumurtalık örneği test kümesi için sadece iki hücre üretti. Buna karşılık, daha büyük bir nüfusa sahip metastatik meme kanseri. Bu veri seti, hücrelerin niş hayatta ve analiz edilebilir göstermek için tasarlanmıştır, ama aynı zamanda yorumlayıcı bakım gerekli vurgulamaktadır. Hedef değişkendeki değişiklikler, stromal hücrelerle etkileşimler veya cıszın davranışı gibi diğer özelliklerle alt klonları belirlemede araştırmacılara da yol gösterebilir.
Daha fazla laboratuvar bir çip üzerinde kan beyin bariyeri, bir çip üzerinde akciğer ve bir çip üzerinde bağırsak gibi membran-a-chip sistemleri benimsemek gibi bu yaklaşım önemlidir11,42. Bu yongaların çoğunluğu membran görüntüleme sistemi ile paralel olduğu şekilde monte edilir, şimdiye kadar bu zaman ve kaç hücre diğer15membranınbir tarafında taşındı ölçmek için zor olacağını anlamına gelir ,28. Ayrıca, yatay odaklı yongaları ile karşılaştırıldığında, dikey odaklı yongaları deneyin dinamik aralığını artırarak çok daha büyük bir membran alanı sağlar. Buna ek olarak, membranın yönelimi bu analiz tekniği için kritik olmadığından, konfokal tomografi potansiyel olarak yeni in vitro deneylere olanak sağlayabilir. Örneğin, meme kanseri hücrelerinin minvazi yağ yastığından kan dolaşımına ekstravazasyonunun görüntülenmesi bu yöntemlerle yaklaşılabilir. Bu araştırmacılar nasıl kanser hücrelerinin meme ECM ve damar arasındaki arayüzü araştırmak belirlemenize yardımcı olabilir.
Sonuç olarak, kan beyin niş özetleyen ve analiz için konfokal tomografi ve makine öğrenme nasıl kullanılacağını göstermek bir 3D mikroakışkan cihaz oluşturmak için bir metodoloji sundu. Bu platformu kullanarak, beyin metastatik ve metastatik olmayan PDX kanser hücrelerini μmBBN cihazındaki davranışlarına göre ayıran beyin-metastatik kanser hücre özelliklerini belirledik. Gelecekteki çalışmalar beyin metastazları tahmin doğru bir tanı olarak bu platformun klinik uygulanabilirliğini artıracaktır. Bu platformu sunmuş olmanın, bir zar ın üzerinde göç eden veya ekstravazlayan her türlü hücreyi ölçmesi gereken laboratuvarlar için yararlı ve ilginç olacağına inanıyoruz. Bu tümör mikro-çevre nin pre-klinik modelleri giderek daha sofistike böylece modellerin mühendislik ve destekleyici yazılım olması gerektiği gibi önemlidir. Verilerin sağlam analizine yardımcı olmak için bu aracı kullanımı basit olarak paketledik, yükleme yönergeleri ile paylaşılan python dizüstü30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Beyan etmek için hiçbir açıklama vardır.
Acknowledgments
Biz MDA-MB-231-BR-GFP hücrelerinin cömert bağış için Ulusal Kanser Enstitüsü'nde Steeg Lab teşekkür ederiz. Konfokal mikroskopi Michigan Üniversitesi Biyoarayüz enstitüsünde (BI) gerçekleştirildi. Akış sitometrimichigan Flow Sitometri Core Üniversitesi'nde yapıldı. Viral vektörler Michigan Vektör Çekirdeği Üniversitesi tarafından oluşturuldu. Ayrıca Kelley Kidwell'e bu verilerin istatistiksel analizinde rehberlik ettiği için teşekkür ederiz.
Finansman:
C.R.O. kısmen NIH T-32 Eğitim Bursu (T32CA009676) ve 1R21CA245597-01 tarafından desteklenmiştir. T.M.W. kısmen 1R21CA245597-01 ve Ul1TR002240 Ödül Numarası altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Çeviri Bilimleri İlerletme Merkezi tarafından kısmen desteklenmiştir. Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, METAvivor Vakfı ve Meme Kanseri Araştırma Vakfı ödül numarası altında malzeme ve karakterizasyon için finansman sağlanmıştır. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 1.5 mm biopsy punch with plunger | Integra LifeSciences Corporation | 33-31A-P/25 | |
| 10x MEM | Thermo Fisher Scientific | 11430030 | |
| 150 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 1x DPBS, without Ca and Mg | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| 200uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| 4 inch silicon wafer | University Wafer | 452 | |
| 48 mm wide packing tape | Fisher Scientific | 19-072-097 | |
| 50 x 75 mm glass slide | Fisher Scientific | 12-550C | |
| A1 confocal microscope | Nikon | ||
| acetone | Fisher Scientific | A9-20 | |
| antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin) | Gibco | 15240062 | |
| box cutter blade | Fisher Scientific | NC1721575 | |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| DMEM with 4.5 g/L glucose | Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| double sided tape | Fisher Scientific | NC0879005 | |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat inactivated | Corning | MT35011CV | |
| Fiji software | ImageJ | ||
| glass vial | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| hCMEC/D3 | EMD Millipore | SCC066 | |
| Jupyter notebook | Anaconda | ||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Matrigel - growth factor reduced with phenol red | Corning | CB-40230A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MDA-MB-231-BR-GFP | Dr. Patricia Steeg, NIH | ||
| N-2 growth supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| normal human astrocytes (NHA) | Lonza | CC-2565 | |
| Orange software | University of Ljubljana | ||
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Photolithography masks | Photosciences Incorporated | ||
| pLL3.7-dsRed | University of Michigan Vector Core | ||
| pLL-EV-GFP | University of Michigan Vector Core | ||
| pLOX-TERT-iresTK | Addgene | 12245 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polycarbonate membrane, 5um pore size | Millipore | TMTP04700 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| PureCol, 3 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5005 | Type I bovine collagen |
| sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | 25080094 | |
| sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Solo cup | Fisher Scientific | NC1416545 | |
| SU-8 2075 | MicroChem Corporation | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 developer | MicroChem Corporation | Y020100 4000L1PE | |
| Sylgard 184 | Ellsworth Adhesive Company | NC0162601 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 179965-1L | |
| Tricholoro perfluoro octyl silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G |
References
- Rastogi, K., et al. Palliation of Brain Metastases: Analysis of Prognostic Factors Affecting Overall Survival. Indian Journal of Palliative Care. 24 (3), 308-312 (2018).
- Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
- Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
- Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. 294, 15-22 (2005).
- Poissonnier, A., Legembre, P. Boyden Chamber Assay to Study of Cell Migration Induced by Metalloprotease Cleaved-CD95L. Methods in Molecular Biology. 1557, 117-123 (2017).
- Li, X., Yang, H., Huang, H., Zhu, T. CELLCOUNTER: novel open-source software for counting cell migration and invasion in vitro. BioMed Research International. 2014, 863564 (2014).
- Little, A. C., et al. IL-4/IL-13 Stimulated Macrophages Enhance Breast Cancer Invasion Via Rho-GTPase Regulation of Synergistic VEGF/CCL-18 Signaling. Frontiers in Oncology. 9, 456 (2019).
- Allen, S. G., et al. Macrophages Enhance Migration in Inflammatory Breast Cancer Cells via RhoC GTPase Signaling. Scientific Reports. 6, 39190 (2016).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
- Choi, Y. P., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
- Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. Journal of Neuroscience Methods. 232, 165-172 (2014).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
- Schroeder, W., Martin, K., Lorenson, B. The Visualization Toolkit. 4th edn. , Kitware. (2006).
- Wells, W. M., Grimson, W. L., Kikinis, R., Jolesz, F. A. Adaptive segmentation of MRI data. IEEE Transactions on Medical Imaging. 15 (4), 429-442 (1996).
- Agarwal, S. K., Singh, S., Ghuman, S. S., Sharma, S., Lahiri, A. K. Radiological assessment of the Indian children with congenital sensorineural hearing loss. International Journal of Otolaryngology. 2014, 808759 (2014).
- Mansfield, P., Maudsley, A. A. Medical imaging by NMR. The British Journal of Radiology. 50 (591), 188-194 (1977).
- Plewes, D. B., Kucharczyk, W. Physics of MRI: a primer. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 35 (5), 1038-1054 (2012).
- Batteux, C., Haidar, M. A., Bonnet, D. 3D-Printed Models for Surgical Planning in Complex Congenital Heart Diseases: A Systematic Review. Frontiers in Pediatrics. 7, 23 (2019).
- Thibault, F., et al. MRI for surgical planning in patients with breast cancer who undergo preoperative chemotherapy. American Journal of Roentgenology. 183 (4), 1159-1168 (2004).
- Oliver, C. R., et al. A platform for artificial intelligence based identification of the extravasation potential of cancer cells into the brain metastatic niche. Lab on a Chip. 19 (7), 1162-1173 (2019).
- Gril, B., et al. Reactive astrocytic S1P3 signaling modulates the blood-tumor barrier in brain metastases. Nature Communications. 9 (1), 2705 (2018).
- Badilescu, S., Packirisamy, M. BioMEMS: Science And Engineering Perspectives. , Taylor & Francis/CRC Press. (2011).
- Liu, C. Foundations of MEMS. 2nd edn. , Prentice Hall. (2012).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab on a Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
- Lockman, P. R., et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (23), 5664-5678 (2010).
- Ryan Oliver, C., W, T. M. Con-tom: A Jupyter Notebook for Analyzing the tumor micro-environment in confocal images. Zenodo. , Version 0.8, 3825719 (2020).
- Lorensen, W. E., Johnson, C., Kasik, D., Whitton, M. C. History of the Marching Cubes Algorithm. IEEE Computer Graphics and Applications. 40 (2), 8-15 (2020).
- Kleinbaum, D. G., Kupper, L. L. Applied regression analysis and other multivariable methods. , Duxbury Press. (1978).
- Berg, M. d Computational geometry : algorithms and applications, 2nd rev. edn. , Springer. (2000).
- Esch, M. B., Post, D. J., Shuler, M. L., Stokol, T. Characterization of in vitro endothelial linings grown within microfluidic channels. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2965-2971 (2011).
- Brinkley, B. R., et al. Variations in cell form and cytoskeleton in human breast carcinoma cells in vitro. Cancer Research. 40 (9), 3118-3129 (1980).
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 33 (2013).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 16 (2013).
- Dello Russo, C., et al. The human microglial HMC3 cell line: where do we stand? A systematic literature review. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 259 (2018).
- Dun, M. D., et al. Proteotranscriptomic Profiling of 231-BR Breast Cancer Cells: Identification of Potential Biomarkers and Therapeutic Targets for Brain Metastasis. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2316-2330 (2015).
- Xing, F., et al. Reactive astrocytes promote the metastatic growth of breast cancer stem-like cells by activating Notch signalling in brain. EMBO Molecular Medicine. 5 (3), 384-396 (2013).
- Zhang, B., Radisic, M. Organ-on-a-chip devices advance to market. Lab on a Chip. 17 (14), 2395-2420 (2017).
