Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

כימות המיקרו-סביבה של גידול גרורתי במוח באמצעות דגם תלת-מימד של שבב איבר-און-איי, למידת מכונה וטומוגרפיה קונפוקלית

Published: August 16, 2020 doi: 10.3791/61654
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 2,3,4, 1,2
1Department of Internal Medicine, University of Michigan Ann Arbor, 2Rogel Cancer Center, University of Michigan Ann Arbor, 3Department of Neurosurgery, University of Michigan Ann Arbor, 4Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan Ann Arbor
* These authors contributed equally

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת ואיסוף של מחסום דם במוח גרורתי מיקרו סביבה ולאחר מכן לכמת את מצבה באמצעות הדמיה confocal ובינה מלאכותית (למידת מכונה).

Abstract

גרורות במוח הן נגעים סרטן הקטלני ביותר; 10-30% של כל סוגי הסרטן גרורות למוח, עם הישרדות חציון של רק ~ 5-20 חודשים, בהתאם לסוג הסרטן. כדי להפחית את נטל הגידול גרורתי במוח, פערים בידע בסיסי ותרגום צריך להיות מטופל. האתגרים העיקריים כוללים בעיה של מודלים פרה-לקלינליים לשחזור וכלים קשורים. מודלים תלת מימדיים של גרורות במוח יכולים להניב את הנתונים המולקולריים והפנוטיפיים הרלוונטיים המשמשים לטיפול בצרכים אלה בשילוב עם כלי ניתוח ייעודיים. יתר על כן, בהשוואה למודלים מורין, מודלים organ-on-a-שבב של תאים סרטניים המטופל חוצה את מחסום המוח בדם לתוך microenvironment המוח ליצור תוצאות במהירות, הם מתורגמים יותר עם שיטות כמותיות, ולכן ניתן לתפוקה גבוהה. כאן אנו מתארים ומדגימים את השימוש בפלטפורמת נישת מוח מיקרו-נוזלית תלת-מית-ייחודית רומן (μmBBN), שבה ניתן לתמרץ אלמנטים מרובים של הנישה לתקופה ממושכת (מספר ימים), התמונה הפלואורסצנטית על ידי מיקרוסקופית קונפוקסלית, והתמונות השיחזרו באמצעות טכניקת טומוגרפיה חדשנית וקונספוקלית; כל שמטרתו להבין את הפיתוח של מיקרו גרורות ושינויים בסביבת מיקרו הגידול (TME) באופן חוזר וכמותי. אנו מדגימים כיצד לפברק, זרע, תמונה, ולנתח את התאים הסרטניים ואת רכיבים תאיים והומוריסטיים TME, באמצעות פלטפורמה זו. יתר על כן, אנו מראים כיצד בינה מלאכותית (AI) משמשת לזיהוי ההבדלים הפנוטיים הפנימיים של תאים סרטניים המסוגלים לעבור דרך מודל μmBBN ולהקצות להם אינדקס אובייקטיבי של פוטנציאל גרורתי במוח. ניתן להשתמש ב ערכות הנתונים שנוצרו על ידי שיטה זו כדי לענות על שאלות בסיסיות ותרגום על גרורות, היעילות של אסטרטגיות טיפוליות, ואת התפקיד של TME בשניהם.

Introduction

גרורות במוח הן נגעים סרטן הקטלני ביותר; 10-30% של כל סוגי הסרטן גרורות למוח, עם הישרדות חציון של רק ~ 5-20 חודשים, בהתאםלסוג סרטן 1,,2. שאלה עיקרית המתעוררת בעת לימוד גרורות סרטן היא כיצד שיבוטים משנה לנדוד מהסביבה ההומוריסטית של מחזור הדםלתוך איבר כגוןהמוח 3,4. שאלה זו הובילה לווריאציות רבות של הגירה, פלישה ואסהרנות. כל השיטות הללו חולקות את השלב הקריטי של ספירה או מדידה של מאפיינים של תאים הלעבור ממיקום אחד למתו בתגובה לגירוי. רוב הנדידה זמינה משמשים לחקר הגירה דו מימדית (2D) של תאים סרטניים. אלה התרעו שפע של ידע; עם זאת, הם אינם לסיכום האופי התלת מימדי של מערכת vivo כי שיטות אחרות יכולות לספק5. לכן, יש צורך ללמוד את הגידול מיקרו-סביבה (TME) במערכות תלת מימדיות (3D), אבל גישות הניתוח זמין עבור מבנים 3D מוגבלים ולעתים קרובות לא עקבי.

אחד הכלים התת-מימד הפופולריים ביותר הוא תא ביידן המורכב מממברנה התלויה בתחתית באר, המפרידה בין שני אזורים נפרדים. ביידן הציג את ההסתה כדי ללמוד leukocyte chemotaxis4. האזורים הנמוכים עשויים להיות מגוונים לפי כימיה אואמצעים אחרים 6,7 כדי לגרום לתאים באזור העליון לעבור לאזור התחתון. הגישה הנפוצה ביותר לכמת את מספר התאים שהועברו היא לשחרר את התאים מתחתית הממברנה באמצעות פתרון מאגר, לכמת אותם, ולאחר מכן לספור אותם בהתבסס על כמות תוכן ה-DNAבפתרון 7. גישה עקיפה זו נוטה לשגיאה מפעיל בשל שונות טכניקה וההליך הורס מידע על פנוטיפ הסרטן ואת המיקרו-סביבה. וריאציות של ההסדה התא Boyden כרוכות קיבעון של תאים נודדים שנותרו על הממברנה, אבל רק מספק ספירה של תאים כי הם כבר לא קיימא להמשך מחקר6,,8,9.

בשל מגבלות של תא Boyden וצמיחת חידושים בקהילה microfluidic, שבבי אסיי הגירה פותחו אשר לבחון את תנועת התאים בתגובה לגירוי בכיוון אחד ולאשלוש 10,11,12. העברה זו מקלה על שליטה בגורמים כגון זרימה אוהפרדת תאים בודדים 13,14 המאפשרים פרשנות טובה יותר של התוצאות; עם זאת, פורמט הדו-מיוד שלהם מאבד באופן בלתי נמנע מידע דינמי. מחקרים אחרונים התמקדו בהתפרזרות (כלומר, התנועה של תאים ממחזור לתוך רקמה, כגון מחסום מוח הדם) בסביבה 3D14,15. המרחק ההתרבזרות לתוך רקמה והתנהגות בדיקה המתרחשת במחסום התא / קרום הוא מעודן יותר מאשר מדידות שנאספו באמצעות תא Boyden או מכשיר הגירה מיקרופלויד 2D16. לפיכך, התקנים המאפשרים הדמיה וניתוח מתאימים של 3D מתפשטים הם קריטיים כדי ללכוד מדידות מתוחכמות אלה, אך חסרים בספרות.

ללא תלות בהדמיית הגירה, פותחו טכניקות הדמיה חזקות להדמיית תהודה מגנטית (MRI) וטומוגרפיה שמצליחות לזהות ולחזר במדויק רקמות בחלל תלת-ממדי17,,18. טכניקות אלה לרכוש תמונות z-stacks וחלקים קטע של התמונה בהתבסס על המאפיינים של הרקמה ולאחר מכן להמיר את התמונות מחולקות לתוך רשתות תלתממדיות 19,20,21. זה מאפשר לרופאים לדמיין באיברים, עצמות, וכלי דם בודדים 3D כדי לסייע בתכנון כירורגי או סיוע באבחון של סרטן או מחלותלב 22,23. כאן, נראה כי גישות אלה ניתן להתאים לשימוש על דגימות מיקרוסקופיות והתקני אקסטרפולציה 3D.

בסוף זה פיתחנו את טכניקת טומוגרפיה קונפוקלית חדשנית, המוצגת במסמך זה, אשר מאפשרת גמישות ללמוד את ההתופפות של תאים סרטניים על פני קרום על ידי התאמת כלי טומוגרפיה קיימים. גישה זו מאפשרת לחקור את מגוון רחב של התנהגויות תאים סרטניים כפי שהם אינטראקציה עם מחסום תאי, כגון שכבת תא אנדותל. תאים סרטניים להפגין התנהגויות לחקר; חלקם עלולים לפלוש אך להישאר קרובים לממברנה, בעוד שאחרים חוצים את המחסום בקלות. טכניקה זו מסוגלת להניב מידע על הפנוטיפ של התא בכל הממדים24. שימוש בגישה זו כדי ללמוד את TME הוא גם זול יחסית, קל לפרש, ו לשכפל, בהשוואה מורכב יותר במודלים מורין vivo. המתודולוגיה המוצגת צריכה לספק בסיס חזק למחקר של סוגים רבים של גידולים וסביבות מיקרו על ידי התאמת אזור סטרומה.

אנו מתארים ומדגימים את השימוש בפלטפורמת נישת דם מיקרו-נוזלית תלת-מיתד (μmBBN)(איור 1)שבה אלמנטים קריטיים של המחסום והנישה (תאי אנדותל מיקווסקול במוח ואסטרוציטים) יכולים להיות תרבותיים לתקופה ממושכת (כ-9 ימים), פלואורסצנטית התמונה על ידי מיקרוסקופית confocal, והתמונות ששוחזרו באמצעות טכניקת טומוגרפיה קונקודלית שלנו (איור 2); כל שמטרתו להבין את הפיתוח של מיקרו גרורות ושינויים בסביבת מיקרו הגידול באופן חוזר וכמותי. ממשק מחסום הדם עם נישת המוח מורכב תאי אנדותל microvascular במוח כי הם מחוזקים על ידי קרום מרתף, רגלי אסטרוציטים, pericytes25. התמקדנו באופן סלקטיבי ברכיבים אסטרוציט אנדותל בהתחשב בחשיבותם בהקמה ורגולציה של מחסום מוח הדם. אנו מדגימים כיצד לפברק, זרע, תמונה, ולנתח את התאים הסרטניים ואת הגידול מיקרו סביבה רכיבים תאיים והומוריסטיים, באמצעות פלטפורמה זו. לבסוף, אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בלמידת מכונה כדי לזהות את ההבדלים הפנוטיים הפנימיים של תאים סרטניים המסוגלים לעבור דרך מודל μmBBN ולהקצות להם אינדקס אובייקטיבי של פוטנציאלגרורתי במוח 24. ניתן להשתמש ב ערכות הנתונים שנוצרו על ידי שיטה זו כדי לענות על שאלות בסיסיות ותרגום על גרורות, אסטרטגיות טיפוליות, ואת התפקיד של TME בשניהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. להכין את תבנית נישת מחסום הדם

הערה: המכשיר culturing המשמש בפלטפורמה זו הוא פיגומים מבוססי PDMS כי אנו בונים נישה מחסום דם סלולרי על. הוא עשוי משני חלקים המופרדים על ידי קרום נקבובי. כדי להכין את נישת מחסום הדם שתי תבניות SU-8 שנעשו באמצעות פוטוליתוגרפיהנחוצים 26,27. הפרוטוקול יתואר עבור עובש עבה 100 μm הראשון ולאחר מכן הערות ינתן עבור עובש 200 μm עבה.

  1. כדי להכין את התבנית, נקה וופל סיליקון "4 באמצעות אצטון עם בקבוק לסחוט ולאחר מכן לייבש אותו עם אקדח חנקן.
    1. אופים את וופל הסיליקון על פלטה חמה במשך 10 דקות ב-200 מעלות צלזיוס כדי להסיר את כל הממסים הזירית.
    2. בתורו מרכז וופל הסיליקון על צ'אק של מעיל ספין ולחלק 1 מ"ל של SU8-2075 עבור עובש העליון. ספין עבור 5 s ב 500 סל"ד (האצה 300 סל"ד / s) כדי לפזר את photoresist ולאחר מכן 30 s ב 2200 סל"ד (האצה 300 סל"ד / s) כדי לקבל ציפוי SU-8 עבה 100 μm. ייתכן שיהיה צורך במיטוב כדי להשיג את העובי שצוין.
  2. אופים את הוופל על פלטה ב-65 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות ומיד ב-98 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
  3. מניחים את הוופל לתוך מנורת פוטוליתוגרפיה וממקמים את המסכה הממרכזת בוופל בהתאם לנוהלי התקן. לחשוף את הוופלים מצופה SU-8 עם זוהר של 230 mJ / ס"מ2 של UVB (360 ננ"± 10 ננ"מ). ניתן לבצע ניסוי מטריצת חשיפה כדי לקבוע את מינון אופטימום. עיצובי מסכות זמינים בקובץ משלים 1.
  4. בצעו אפייה לאחר החשיפה ב-65°C במשך 2 דקות ולאחר מכן מיד ב-98°C למשך 10 דקות לשיפור ההדבקה. מצננים את הוופל ל-50 מעלות צלזיוס.
  5. הסר את ההתנגדות הלא חשופה באמצעות SU-8 למפתח תמונות. לשטוף את הוופל במפתח במשך 5 דקות באמבטיה ולאחר מכן להשתמש בבקבוק ספריי מלא SU-8 מפתח במכסה מנוע כימי כדי להתסיס ולהסיר SU-8 לא מאובטח הנותרים. מיקרוסקופ 4x יכול לשמש כדי לצפות אם כל SU-8 לא מאובטח הוסר. קו לבן בשולי תכונות הפוטורסיסט מציין ש- SU-8 לא הוסר במלואו.
  6. מבצעים אפייה קשה אחרונה בתנור ב-110 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות.
  7. בצע את אותו הליך עבור עובש עבה 200 μm באמצעות SU-8 2075 אבל להתאים את הפרוטוקול להודעה הבאה:
    1. הגדרות מעיל ספין: ספין עבור 5 s ב 500 סל"ד (האצה 300 סל"ד / s) כדי לפזר את photoresist ולאחר מכן 30 s ב 1300 סל"ד (האצה 300 סל"ד / קצת) כדי לקבל ציפוי עבה 200 μm.
    2. אופים ב-65 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות ואז ב-98 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות.
    3. זמן חשיפה של 340 mJ/cm2.
    4. לאחר האפייה בחשיפה: 2 דקות ב-65°C, ולאחר מכן 98°C במשך 15 דקות.
  8. לבסוף, silanize כל וופל על ידי הצבתם בתא ואקום בתוך מכסה מנוע כימי עם מיכל פלסטיק שבו 3 טיפות (~ 150 μL) של פתרון silanizing (Trichloro perfluoro אוקטיל סילאן) הונחו. משוך ואקום ועזוב למשך הלילה כדי לאפשר לאדים לכסות את הוופל. שלב זה מפחית את ההדבקה בין SU-8 ו- PDMS, הגדלת חיי התבנית.
    התראה: טריכלורו perfluoroctyl סילאן תמיד צריך להיות מטופל ב מכסה המנוע אדים והתרחק ממקורות מים.
  9. מניחים תבניות וופל בודדות ב-150 מ"מ של צמי פטרי באמצעות שתי רצועות של סרט הדבקה דו-צדדי. ודא הוופלים שטוחים. חלופה אחרת היא לפברק תבנית אלומיניום שבה ניתן ממוקם הוופל. מכיוון שתבנית האלומיניום מוקפת, היא תייצר יציקות בעובי אחיד, בעוד ששיטת צלחת פטרי רגישה להטיה של פני השטח. השטוחות המשופרת של ה-PDMS מפחיתה את זמן ההדמיה הנואמת במורד הזרם.

2. טופס ולהרכיב את מחסום דם PDMS (BBB) התקן

  1. מערבבים 75 גרם PDMS ביחס של 1:10 (Crosslinker:Base) לפי משקל בספל פלסטיק.
  2. יוצקים את PDMS על התבניות (1 מ"מ עבה עבור עובש 200 μm עבה 4 מ"מ עבור עובש 100 μm עבה) דגה בממזר ואקום במשך שעה אחת או עד כל הבועות הוסרו. מניחים בתנור 65 מעלות למשך הלילה. ניתן לכוונן את עובי 1 מ"מ בהתבסס על מרחק העבודה של המטרה 10x במיקרוסקופ confocal.
  3. לאחר PDMS נרפא להשתמש להב לחתוך בעדינות נגד הוופל דרך PDMS סביב הקצוות. מקלפים את ה-PDMS והשתמשו בלהב כדי לחתוך לאורך המדריכים המלבניים וניקוב ביופסיה של 1.5 מ"מ כדי לפתוח את המפרכים והשקעים בהתקן. כסה את חלקי התקן PDMS עם סרט אריזה ברוחב 48 מ"מ כדי לשמור אותו נקי מאבק ופסולת.
  4. לאחר להשתמש מספריים לנתח לחתוך מלבן 5 מ"מ x 50 מ"מ של קרום פוליקרבונט עם 5 μm נקבוביות ולאחסן אותו בתוך צלחת פטרי לשימוש מאוחר יותר.
  5. לאסוף את הדברים הבאים: 200 μL פיפטה טיפ, 2 מ"ל של 1:10 PDMS מעורבב עם טולואן ביחס של 2:3 על ידי משקל בקבוקון זכוכית, פיפטה פסטר עם נורה לסחוט, PDMS מוכן חלקים על העליון והתחתון, קרום, שלוש 50 מ"מ x 75 מ"מ שקופיות זכוכית ולהעביר את כל זה למעיל מסתובב. השלבים הבאים להרכבה ותא זריעת תאים של ההתקן מתוארים באות 1.
  6. השתמש פיפטה פסטר כדי להעביר 1 מ"ל של PDMS:toluene פתרון דבק לתוך שקופית זכוכית 50 מ"מ x 75 מ"מ על צ'אק של מעיל ספין. סיבוב למשך 5 שניות ב-100 סל"ד (האצה של 300 סל"ד לשנייה) ו-30 שניות ב-2000 סל"ד (האצה של 300 סל"ד לשנייה).
  7. מקם את השקופית על שולחן וכסה אותה בתא PDMS עליון אחד ותא אחד תחתון, כך שה- PDMS פונה עם תכונות מעוצבות לתוכה ליצור קשר עם השקופית והדבק מועבר לפני PDMS, ומתאר את ההיקף של כל התכונות.
  8. הפוך את התא העליון של PDMS לשקופית אחרת עם ציפוי הדבק כלפי למעלה והצב בזהירות את הממברנה על-פני ההתקן בין המבסוף והשקעים. מניחים את קצה 200 μL בתמיסת דבק PDMS:toluene עד שיש לו מרושע כמה לתוך הקצה. גע בקצה שבין כל גורם נכנס לשקע כדי למקם טיפה קטנה ליד קצה הממברנה, שם הוא יוצר קשר עם ה-PDMS.
  9. הסר את החצי השני של ההתקן והניח אותו עם ציפוי הדבק כלפי מטה תוך יישור המברים והשקעים בשני החלקים.
  10. מניחים את ההתקן המורכב בתנור ב-37°C למשך הלילה כדי לרפא את הדבק. מעבירים לצנצנת פעמון ואקום עם מייבש ותנו להתייבש למשך יומיים. זהו צעד מכריע כדי לאפשר Toluene להתאדות ולשפר את העקביות של זריעת המכשיר על ידי ויסות אדי מים נספג באוויר המעבדה.

3. זרעו את המיקרו-סביבה המוחית לתוך המכשיר

  1. תרבות תאים ותרבית תאים: לפני תחילת פרוטוקול זה, השג את הריגנטים והתאים הבאים. לטפח את כל קווי התא באינקובטור להגדיר ב 37 °C ב 5% CO2.
    1. לשמור על קו תאי סרטן השד המשולש שלילי אדם MDA-MB-231 (ATCC HTB-26) ו MDA-MB-231-BR-GFP תאים (שהושגו פטרישיה סטיג, PhD) ב DMEM עם 4.5 גרם/ L גלוקוז, בתוספת 2 mM L-גלוטמין, 10% FBS ו 1x אנטיביוטי-אנטיקומיטי. צור תאי פלורסנט MDA-MB-231-GFP על-ידי התפתל תא MDA-MB-231 עם נגיף pLL-EV-GFP ריק. מיין את אוכלוסיית GFP+ שהופעלה באמצעות מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנה (FACS) לפני הניסויים.
    2. לשמור על תאי אנדותל מיגרו-וסקולריים אנושיים hCMEC/D3 במדיום EGM-2. צור תאי פלורסנט hCMEC/D3-DsRed על-ידי התרעה של hCMEC/D3 עם נגיף לנטי-וירוס וקטורי ריק של 3.7-dsRed. הסר את כל התאים שאינם מושרה, שאינם פלורסנט מהתרבות באמצעות FACS לפני השימוש הניסיוני.
    3. לשמור על אסטרוציטים אנושיים נורמליים (NHA) ב DMEM בתוספת 4.5 g/L גלוקוז, 10% FBS, 2 mM גלוטמקס, 1 mM נתרן pyruvate, 1x N-2 תוספת צמיחה, ו 1x אנטיביוטי אנטיביוטי אנטימיקוטי. להנציח את האסטרוציטים על ידי מתן pLOX-TERT-iresTK וקטור lentiviral (Addgene 12245). צור את הווקטור באמצעות psPAX2 פלסמיד ומעטפה פלסמיד pMD2.G (Addgene 12260 ו- 12259).
  2. הסר התקן μmBBN מ מייבש הוואקום והניח על משטח מתכת או נייר (כלומר, סרט הדבקה) כאשר המתפרכים פונים כלפי מטה והכניסו אותו לתא פלזמה. כמו כן, מניחים מגלשת זכוכית של 50 מ"מ x 75 מ"מ לתא הפלזמה. משוך ואקום ולאחר מכן לטפל עם פלזמה ב 80 W עבור 30 s.
  3. הסר במהירות את מגלשת הזכוכית והמכשיר מתא הפלזמה והנח את ההתקן עם ההתכונות כלפי למעלה אל מגלשת הזכוכית המיושרת באמצעותמדריך (קובץ משלים 2). פעולה זו תיצור קשר קבוע בין PDMS ושקופית זכוכית ולא ניתן למקם מחדש.
  4. הבא לחתוך את הטיפים את 16, 200 μL פיפטה טיפים, 2 מ"מ מהקצה. הכנס את קצות הפיפטה לכל הכניסות והשקעים. המכשיר יכול להיות ממוקם בחזרה לתוך מימש ואקום בשלב זה אם לא מוכן לזרוע את התאים.
  5. מניחים את ההתקן בחזרה בתא הפלזמה ולטפל עם פלזמה במשך 8 דקות ב 200 W. לאחר שההתקן התקרר (5 דקות) כתוצאה מתקן הטיפול בפלזמה, מקם אותו בתוך מיכל משני סטרילי, כמו תיבת קצה שקופה של פיפטה. לבצע את השלב הבא בתוך ~ 15 דקות או את היעילות של טיפול פלזמה עשוי להיות מופחת המוביל סתימה.
  6. כמה ימים לפני תרבות הניסוי פטרי מנות של 1 x 106 תאים אנדותל (hCMEC / D3-DsRed) ו 1 x 106 אסטרוקיטים (NHA). בעוד המכשיר עובר טיפול פלזמה 8 דקות, להכין פתרון קולגן המורכב 0.5 מ"ל של 3 מ"ג / מ"ל PureCol סוג אני קולגן בשר עם 64 μL של 0.8 M NaHCO3 ו 20 μL של 10x גבוה גלוקוז (250 mM) MEM. להשעות 5.0 x10 5 תאי NHA בתמיסת קולגן. שמור על הפתרון על קרח בזמן שהוא לא בשימוש.
  7. להעביר 120 μL של פתרון קולגן / astrocyte / microglia לתוך המכשיר דרך קצה פיפטה עבור התא התחתון (איור 1 חצים אדומים). אפשר לפתרון לפתיל על פני התא לתוך קצה פיפטה הנגדי. לאחר שכל ארבעת הערוצים של המכשיר התמלאו, הנח את השבב באינקובטור CO2 ב-37°C ו-5% CO2 לשעה אחת או עד שהכולגן נקבע.
  8. לאחר ערכות הקולגן, מלאו את כל קצות הפיפטה המזינה את התא התחתון בתערובת של מדיה שלמה. עבור שבבים המכילים תאים אנדותל ואסטרוציטים, נעשה שימוש בתמהיל של 50:50 של מדיה אנדותל:אסטרוציט.
  9. ציפוי התא העליון עם 2% גורם גדילה מופחת Matrigel במדיה אנדותל מלאה באמצעות קצה פיפטה התא העליון (איור 1 חצים כחולים) והמקום באינקובטור במשך 1 שעות.
  10. לשטוף את התא העליון עם תערובת מדיה שצוין לסירוגין איזה קצה הוא זרע עם תאים אנדותל (איור 1 חצים ירוקים). להשעות 1 x 106 תאים אנדותל ב 1 מ"ל של מדיה אנדותל זרע 30 μL כל 15 דקות לתוך טיפים תא עליון לסירוגין לכיסוי זוגי. תאי אנדותל זרע לתוך כל קצה תא עליון פעמיים, עבור סך של 4 פעמים לכל תא.
  11. לאחר זריעתם הסופית של תאי אנדותל, מלאו את כל הטיפים בתערובת המדיה והניחתו את ההתקן באינקובטור ב-37°C ו-5% CO 2 ,משנים את המדיהבשני התאים כל 12 שעות.

4. לפקח על ההתקדמות של היווצרות שכבת אנדותל

  1. כיסוי מלא של הערוץ על ידי שכבת אנדותל נצפתה לאחר 3 ימים. השתמש באחת משתי שיטות כדי לפקח על הכיסוי של מחסום ה אנדותל: פלואורסץ או TEER. ניתן לכמת את הפלואורסצנטיות hCMEC/D3-DsRed ובהתאם לכיסוי % על-פני אזור הערוץ באמצעות ImageJ.
    1. פתח את קובץ TIFF בנציג ImageJ של מחסום hCMEC/D3-DsRed. בתוכנה ImageJ, לחץ על קובץ > פתח כדי לבחור את הקובץ.
    2. מזג את כל שכבות ה- Z של התמונה בעוצמה המרבית מתוך פקודות ואפשרויות מפתח אלה: תמונה > ערימות > פרוייקט Z > כל פרוסות Z, עוצמה מרבית.
    3. בצע סף צבע זהה בכל השבבים המיקרו-נוזלים המוערכים בשיטה זו. לצורך המחקר שהוצג העסיקנו סף של 450. השתמש בתפריט הסף ב- ImageJ ב: תמונה > כוונן > סף.
    4. הגדר את המידות שתיוקלטו באמצעות הפקודות והאפשרויות הבאות: ניתוח > הגדרת מידות > הגבל לסף, שבר אזור.
    5. בחר אזור מייצג של הערוץ המיקרו-נוזלים שיש למדוד על-ידי ציור תיבה. כלי התיבה ממוקם בתפריט הראשי של ImageJ. מדוד 3 שכפולים טכניים ממוקמים בהתחלה, באמצע ובסוף של כל ערוץ מיקרו-נוזלים באמצעות אותו גודל תיבה.
    6. נתח כל ערוץ והקליט את שבר האזור, המייצג את הכיסוי הנטוהל %. יצא מדידות אלה כקבצי גיליון אלקטרוני כדי להתוות ולהמחות את הנתונים באופן חזותי באמצעות הפקודות הבאות: נתח > מדידת.
  2. כחלופה, השתמש TEER מבוסס ספקטרוסקופיה מכשול כדי למדוד צמתים הדוקים אנדותל לכל אזור. כימות מחסום אנדותל באמצעות TEER היא פרוקסי לשלמות שכבת ה אנדותל כמחסום.
    1. מקם שתי אלקטרודות בהכנסה ובשקע של התאים העליונים והתונים.
    2. לכמת את המכשול של מונולייטר אנדותל כשילוב של ההתנגדות, השראות, קיבוליות שבב על פי מודל המוצע על ידי Srinivasan ואח '.28,29.

5. זרע תאים סרטניים לתוך המכשיר

  1. לאחר שכבת אנדותל התבגרה, זרע תאים סרטניים לתוך המכשיר. להכין פתרון 1 מ"ל של 1 x 106 תאים סרטניים במדיה תא סרטני מלא.
  2. להחליף את התקשורת בשבב כדי לחדש את חומרים מזינים של תרבות התא.
  3. זרע כל ערוץ תא עליון עם 30 μL של תאים סרטניים בהשעיה ולאחר מכן למקם את המכשיר בחזרה באינקובטור במשך 15 דקות. תמיד לזרוע את התאים הסרטניים באותו הצד של כל ארבעת הערוצים התא העליון בתוך מכשיר יחיד.
  4. החליף את ההתקן במדיה חדשה ואת מילוי הטיפים כל 12 שעות עד להתקן בתמונה עבור התנהגות גרורתית.

6. תמונה מיקרו הסביבה הגידול על ידי הדמיה confocal

  1. בנקודת הזמן הניסיונית הרצויה (1, 2 או 9 ימים), השתמש בהדמיה קונפוקל כדי ללכוד תמונה תלת-ממדית של הערוץ. אנו מבצעים שלב זה ב- Nikon A1 באמצעות ההגדרות המתוארות כאן. שלב זה הוא אוטומטי, וכל ערוץ דורש 20-40 דקות כדי לתמונה בהתאם לכמה ערוצי פלורסנט כלולים ועומק Z הדרוש כדי לכסות את העמדות של כל התאים.
  2. הפעל את המיקרוסקופ, פתח את התוכנה והניח את כיסוי האינקובטור על המיקרוסקופ.
  3. הגדר את דוד שלב מיקרוסקופ ל 37 °C ו CO2 עד 5% אם זמין.
  4. לאחר חממת המיקרוסקופ התייצבה, למקם את המכשיר לתוך שלב מיקרוסקופ באמצעות 50 מ"מ x 75 מ"מ הר.
  5. התמקד בצד אחד של ההתקן (משמאל אם יש להשתמש בו עם תוכנת הניתוח שסופקה) עם יעד של 10x והגדר את גובה Z כאפס. תחת הגדרות z-stack, כלול טווח של 100 μm מעל ו 200 μm מתחת מישור המוקד. לאחר מכן השתמש בהגדרת התפירה כדי להגדיר את מספר שדות X ו- Y ל- 1 ו- 9 בהתאמה עם חפיפה של 15%. הגדר את חור הסיכה למינימום המומלץ שלו ואת גובה שכבת ה- z ל- 9 μm. כוונן את החשיפה לשדה הבהיר כך שה קרום הנקבובי יהיה גלוי. הפעל את לייזרי העירור עבור dsRed (561 מילימ') ו GFP (488 מילימ') ערוצים ולהתאים את כוחות לייזר פלורסנט חותך כך כל ערוץ גלוי מבלי להגזים את הפיקסלים.
  6. ודא שכל השדות נמצאים במוקד בעת מעבר. אם כן, הזן שם קובץ פלט (001.nd2) עבור התמונה והתחיל בניסוי כדי ללכוד באופן אוטומטי את התמונה ה-3D confocal.

7. למדוד את הגידול מיקרו הסביבה באמצעות טומוגרפיה confocal

  1. השתמש טומוגרפיה confocal גישה כדי להעריך קבוצה של מדדים ומדידות המתארים את התאים הבודדים ואת המיקרו-סביבה הגידול בתוך המכשיר. ניתוח טומוגרפי קונפוקלי(איור 2)ממיר z-stack confocal לייצוג תלת מימדי של התאים. באמצעות תסריט פיתון מותאם אישית בתוך הסביבה מחברת / מעבדה Jupyter, מטוס לאחר מכן מותאם לשכבה של תאים אשר יוצרים את מחסום מוח הדם כמוקרום 30. לבסוף, לעשות מדידות פנוטיפיות של אוכלוסיות תאים סרטניים (טבלה 1).
    1. בצע ניתוח זה בסוף ניסוי או לאורך קורס זמן. התקן פיתון ואת הספריות המתאימות על פי מדריך התוכנה שאליו בוצעה הפניה, ולאחר מכן פתח את התוכנה משורת הפקודה של Windows על-ידי הפעלת הפקודה "conda activate", ולאחריה "מעבדת jupyter". סביבת Jupyter תיטען בתוך דפדפן ברירת המחדל.
    2. מתוך סייר הקבצים Jupyter לחץ פעמיים על המחברת Jupyter "contom.ipynb" כדי לפתוח אותו. הפעל את התא מתחת לכותרת ייבוא ספריות, מחלקות/פונקציות מותאמות אישית והגדר את המחברת על-ידי לחיצה על תא המחברת ולאחר מכן לחיצה על לחצן ההפעלה. כל תאי המחברת שלהלן מבוצעים באותה גישה. שים לב שכאן "תא" מחברת מתייחס בלוק של קוד פיתון בתוך המחברת Jupyter.
  2. הכן את הנתונים. אלגוריתם זה משתמש ערכת הכלים של תצוגה חזותית (VTK) כדי לטפל ולהציג את z-stack ונתונים תלתמימדיים 17.
    1. מקם את המקום שסופק. קובץ XLSX ("מעקב .xlsx") באותה תיקיית חלונות שבה נמצאת מחברת Jupyter. הקובץ עוקב אחר ניסויים וממשקים עם המחברת Jupyter. מקם את קובץ ND2 ממקטע 6 בתיקיית משנה בשם "\Experiment_XXX\Confocal\" מתחת למיקום המחברת של Jupyter. ניתן להוסיף תיקיות ניסוי נוספות בתוך על-ידי התאמת ה- "XXX" למזהה המספרי שהוקצה לתיקיות חדשות.
    2. תייג את תיקיית הניסוי הראשונה "Experiment_001" ואת קובץ ND2 "001.nd2". תחילה, המר את קובץ ההדמיה ND2 לקובץ TIFF מרובה תמונות תפור המופרד באמצעות ערוץ צבע. עשה זאת על-ידי ביצוע תא המחברת מתחת לכותרת "קרא את מחסנית z confocal לזיכרון" עם הפונקציה Save_tiff_from_ND2 () ללאתשלום 30. קובץ ND2 הוא תבנית הדמיה קניינית מתוך Nikon, ולכן יש צורך להמיר אותו לתבנית שתווכנת קוד פתוח תואמת לה.
      הערה: TIFF (תבנית קובץ תמונת תג) משמש מכיוון שהוא בכל מקום, 16 סיביות תואם, מיובא בקלות לתוך VTK, ותמונות מרובות ניתן לאחסן בקובץ יחיד, אשר מתאים עבור תמונות z-stack. ביצוע תא המחברת יקרא בתמונה מקובץ ND2, לחלץ מידע של הצבע ו מיקומי XYZ ולאחר מכן לאחסן תמונה זו במערך numpy בהתאם למבנה שנקבע מראש. לאחר מכן הוא ישכור את המערך כקובץ TIFF באמצעות קובץ ה-tifffile של ספריית פיתון.
  3. המרת נתוני הדמיה למודל תלת-ממדי
    1. יבא את קובץ ה- TIFF לתוך VTK (vtkTIFFReader) באמצעות עיבוד תלת-ממדי כדי להמחש את התאים (איור 2). בחר סף המבוסס על צבע התאים בתמונה. כדי להבהיר, האובייקט VTK מייצג בלוק של פיקסלים (X, Y, Z) בחלל (עוצמת קול) אך רק פיקסלים מסוימים (ירוק או אדום) מייצגים תאים, השאר הם רקע או רעש (שחור).
    2. לכן, הגדר מסנן אטימות על אמצעי האחסון אשר מסיר את הרקע לאשר כי מה פלואורסץ נשאר הוא רק התאים. עשה זאת באמצעות תא המחברת Jupyter שכותרתו, שנה ערכי אטימות עבור כל ערוץ מיקרוסקופ על-ידי התאמת משתני ערך Channel_alpha (כלומר, GFP_alpha). הצג באופן חזותי את האפקט באמצעות תא המחברת שכותרתו הצג עיבוד תלת-ממדי כדי לוודא שהסף מוגדר כראוי.
    3. שמור את ערכי האטימות בגיליון האלקטרוני לשימוש בשלב הבא. המר את נתוני עוצמת הקול לאובייקטים תלת-ממדיים בודדים, שכל אחד מהם מייצג תא בתמונה באמצעות טכניקה הנקראת קוביות צועדות31. אלגוריתם זה מחלץ רשת מצולע של isosurface משדות סקאליים תלת מימדיים של voxels.
    4. השתמש בערך האטימות באלגוריתם קוביות הצעידה כדי להפריד כל תא מהרקע. השלם שלב זה עבור כל תאי הפלורסנט שזוהו בכל ערוץ מיקרוסקופ על-ידי הפעלת המרת תמונת voxel לרשת משולשת ושמור כקובץ VTK במחברת.
  4. התאמת מטוס לממברנה
    1. להתאים מטוס למחסום אנדותל על ידי איתור הראשון של centroids התא (תא מחברת: נתח את ערוץ RFP (מחסום אנדותל)). לעבור על רשתות השינוי של הרשימה באמצעי האחסון ולחלץ את האזורים שלא מחוברים באמצעות PolyDataConnectivityFilter מ- VTK. חשב את מרכז הרשת והוסף את המידה לרשימת הסינון של centroids עבור רשתות שינוי גדולות מדי או קטנות מדי (<50, >1000000 voxels).
    2. התאם מישור לרשימת הצנטרואידים עבור תאי אנדותל באמצעות מזעור שיטת שגיאה (תא מחברת: התאם מישור ל- RFP centroids (מחסום אנדותל) (איור 2, איור 3)32. בדוק את התאמת המטוס על-ידי התוויית המטוס והמנטרואידים והתאם באופן ידני במידת הצורך (באמצעות תטא, בטא ו-z) על-ידי הפעלת תא המחברת שכותרתו Visualize centroids RFP והתאמת מטוס.
    3. לאחר שהמטוס מותאם כראוי, שמור את הנורמלי של המטוס לקובץ מעקב הניסויים . קובץ XLSX לשימוש עתידי.
  5. נתח את התכונות התיאוריות של תאים סרטניים בודדים עבור המתארים הבאים (טבלה 1).
    הערה: אם המחשב המבצע את הניתוח מפגר, ניתוח תפוקה גבוהה באמצעות מחשוב בעל ביצועים גבוהים הוא אופציה. אלגוריתם זה שימושי במחשבים ניידים סטנדרטיים לניתוח של מספר קטן של תאים, אולם VTK אינו מתאים היטב למספר גדול של אובייקטים בודדים (>1000). לכן, הוא אופציונלי להשתמש באלגוריתם מותאם כדי לפעול באשכול מחשוב בעל ביצועים גבוהים. זה מאפשר ניתוח מהיר של ניסויים עם תאים רבים (איור 2). כל 7.5 מושגת על ידי הפעלת תאי המחברת שכותרתם נתח את ערוצי המיקרוסקופ הנותרים עבור מתארים פנוטיפיים וקריאה במידע Experiment_tracker ולנתח את הערוצים הקיימים.
    1. למדוד את ההתאפזרות של התאים הסרטניים: לאחר אפיון שכבת אנדותל עם מטוס, למדוד את הנפח של כל תא סרטני שהיגר דרך הממברנה. חתוך כל תא (בוליאני) כך רשת מתחת לממברנה נשמר ואת החלק מעל הממברנה מוסר33. לאחר מכן סגור את הרשת הפתוחה (vtkFillHoles).
      1. לחשב מחדש את הנורמלי ואת הסנטרויד החדש של הרשת הקצוע. למדוד את הנפח והמיקום של כל תא סרטניים קצץ לניתוח. אמצעי האחסון שווה ערך למספר voxels מילויי רשת השינוי של כל תא בודד. לחשב את המרחק בין מישור אנדותל ומיקום של כל תא סרטני.
    2. למדוד את הפנוטיפ התאי: לחשב את המורפולוגיה של כל תא סרטני על ידי פקטורינג הצורה שלה, נפח ומיונו.
  6. אמת את המידות ושמור בגיליון אלקטרוני או בהתוות. הפעל את תא המחברת שכותרתו בדוק כי centroids נמדדו במדויק ועיבוד יהיה צץ מראה את centroids שזוהו על גבי אמצעי האחסון התמונה לפי סוג התא. לאחר שכל הניסויים נעשים לייצא את הנתונים המלאים כקובץ גיליון אלקטרוני יחיד על-ידי הקלדת הניסויים שיכללו על-ידי מזהה experiments בתא המחברת שכותרתו יצא את הנתונים כקובץ נתונים יחיד.XLSX עבור ניסויים משתנים המחליף את מזהי הניסוי נתון. אם אמת את מערכת הנתונים שהושלמה, תכנן אותה באמצעות תא המחברת שכותרתו חלק מהתווה רצועה מתפשטת . התווייתו תופיע בסביבת המחברת ותשמור בקובץ.

8. לנתח את המאפיינים הקשורים באמצעות בינה מלאכותית

הערה: זהה תכונות פנוטיפיק גרורתיות באמצעות אלגוריתמים של בינה מלאכותית.

  1. בצע סיווג בינארי באמצעות אורנג' בהתאם לתכונה המוצגת באיון 5 ובקובץ משלים 3. הפעל את Orange משורת הפקודה השנייה של Windows על-ידי הקלדת "conda activate" ולאחר מכן "python -m Orange.canvas" ולחץ על חדש מהבקשה. כתום היא תוכנה מבוססת גרירה ושחרר, לכן לסדר את הפונקציות על ידי גרירת כל פריט מהתפריט הימני אל בד הציור כדי להתאים קובץ משלים 3. לאחר השלמת הרשימה, לחץ פעמיים על סמל הקובץ ובחר את הקובץ .XLSX נתונים.
  2. סנן את הנתונים כדי להסיר מדידות גרועות, המוגדרות כמדידות שנכשלו בפעולה בוליאנית או במתן ערכי משתנה פרמטריים מחוץ לתגבולות מוכרים באמצעות הסמל "בחר שורות". לחץ פעמיים על הסמל והגדר תנאים התואמים למסנן כגון "Sphericity היא בין 0 ל- 1". צור תנאים עבור 8.2.1, 8.2.2 ו- 8.2.3.
    1. מרחק סינון מידות מנומקות לנוע בין -100-200 μm.
    2. מדידות סינון של צורת תא לנוע בין 0-1.
    3. לסנן מדידות נפח תא סרטניים לנוע בין 0-2000 voxels.
    4. השתמש בכל המשתנים הפרמטריים(טבלה 1)כדי לסווג את MDA-MB-231-BR-GFP ו- MDA-MB-231-GFP גרורתי שאינו מוח. לחץ פעמיים על סמל בחירת עמודות מתוך בד הציור. שימוש בלחצן > כדי להעביר משתנים זמינים לתכונות, למשתנייעד או לתכונות Meta. המשתנה היחיד שאמור להיות משתנה יעד הוא תווית גרורתית המגדירה אם תאים ב- data set נחשבים גרורתיים (1) או לא (0). ניתן מיקום משתני ניסוי במקטע תכונות Meta.
  3. דוגמה לנתונים לתוך אימון (80%) ומבחן מוגדר (20%). לחץ פעמיים על סמל דוגמית נתונים ובחר סוג דגימה של חלק קבוע של נתונים: הגדר ל- 80% ובחר תיבות סימון לשכפול ולשכבה. שכבה ואימות צולב של סט האימונים באמצעות 10 קפלים כנגד כל דגם/מסווג. לחץ פעמיים על בדיקה & ציון ובחר אימות הצלב עם מספר קפלים: מוגדר כ- 10 ו- Stratified מסומן. הגדר את מחלקת היעד ל- 1.
  4. בשיטה זו, השתמש ברשתות עצביות ובאלגוריתמים של למידה אקראית של יער מכיוון שהם חזקים לנתונים. בתוך הסמל יער אקראי, בחר את מספר העצים להיות 50 ולא לבחור כל אפשרויות אחרות. בתוך סמל רשת עצבית לבחור נוירונים לכל laye מוסתרr: 100, הפעלה: ReLu, Solver: אדם, אלפא: 0.0001, ומקס איטרציות: 200. עם זאת, הגדרות אלה ישתנו באופן משמעותי על ידי מחקר ויש להבין היטב לפני היישום.
  5. לאחר הגדרת בד הציור לחץ פעמיים על כל סמל מקובץ לנתונים לדוגמה ולחץ על החל או שלח נתונים. לחץ פעמיים על Test & Score ונתוני האימון יתחילו לשמש לפיתוח מודל באמצעות האלגוריתמים. לאחר אימון מודל למידת מכונה, לפתוח מחדש מבחן & ציון ובחר מבחן על נתוני מבחן ולסגור את החלון המוקפץ כדי להבקיע את הביצועים של המודל על ידי סיווג התאים בשבב על פי ההסתברות שהם גרורתיים במוח מ 0 ל 1.
  6. שמור את ביצועי מודל למידת מכונה בקובץ (טבלה 2). כלול את האזור מתחת לעקומה (AUC) של ROC, את הדיוק ואת הציון F1. שמור קובץ שני המכיל את המדדים גרורתיים בודדים והסתברויות סיווג. לחץ פעמיים על הסמל שמור ולחץ על שמירה בשם כדי לכתוב כדי לתייק את הסתברויות הסיווג. באופן דומה, ניתן להציג את עקומת ROC על-ידי לחיצה כפולה על סמל ניתוח ROC ותו לא ניתן לחשב את ביצועי הדגם על-ידי לחיצה כפולה על סמל מטריצת בלבול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות טכניקה זו, ניתחנו סוגי תאים המסומנות בחלבונים או צבעים שונים של פלורסנט. אנו מדגימים את השימוש בגישה זו עם שבב μmBBN שפותח עם hCMEC/D3-DsRed ואסטרוציטים שאינם פלורסנט. תאי אנדותל microvascular המוח נזרעו על קרום נקבובי (5 μm מסלול נקבוביות חרוטות) והונחובאינקובטור 34 ב 37 ° C תחת 5% CO2. לאחר שלושה ימים הקונפלציה של שכבת ה אנדותל אושרה באמצעות מיקרוסקופ ולאחר מכן תאים סרטניים הונחו על גבי שכבת אנדותל. שני קווי תאים סרטניים בשד, שיבוט מחפש מוח בשם MDA-MB-231-BR-GFP, ותאי MDA-MB-231-GFP הורים הוכנסו לתוך שבב μmBBN המכיל נישה מוחית אסטרוציטרית35 , 36,37,37,38,39,,40,41. שבבי μmBBN נתונו ב- 1, 2 ו- 9 ימים באמצעות מיקרוסקופ confocal עם 3 ערוצים (dsRed, GFP ו- Brightfield) באמצעות מטרה 10x, עם Z-פרוסות כל 9 μm ו 1x9 XY תפירה כדי לכסות את כל אזור הממברנה. מיקרוסקופ זה שמר על טמפרטורה של 37 °C במהלך תהליך ההדמיה כדי למזער את הלחץ על התאים.

מוצגת תמונה מייצגת של שבב μmBBN מלא (איור 3A) וכיסוי אנדותל (איור 3B-D). מחסומי אנדותל עם כיסוי גבוה ונמוך מכמתים כדי לוודא שבבי μmBBN מתאימים לתוספת של תאים סרטניים(איור 3B). תמונות מייצגות של שבב μmBBN עם מחסום אנדותל confluent כי הוא מקובל על ניסויים (איור 3C) ושבב μmBBN עם כיסוי אנדותל עני במיוחד כי אינו מתאים לתוספת של תאים סרטניים מסופקים(איור 3D). culturing לטווח ארוך של תאים אנדותל יכול לגרום כיסוי המשתרע מעבר קרום המפריד את העליון והתחתון μmBBN שבב תאים. תאים אנדותל לעתים קרובות לגדול הן על גבי וישר מתחת קרום, אשר אינו משפיע על תנועת תאים סרטניים לתוך מרחב נישה במוח, אבל יכול לעשות את המטוס להתאים קשה. בשל השונות של ייצור שבב μmBBN וכיסוי אנדותל של הממברנה, מטוסים מייצגים מתאימים למחסום אנדותל שטוח רגיל(איור 3E), וממברנהמעוקלת לא טיפוסית מוצגים לעיון(איור 3F). ייבוש המכשיר בתנור בטמפרטורה מעל 40 מעלות צלזיוס עלול לגרום לממברנה מעוקלת כפי שהראה.

הבחנו בהבדלים פנוטיפיים של MDA-MB-231-BR-GFP וקו התא MDA-MB-231-GFP הורים כאשר נתקלים μmBBN אסטרוציטי כי היו לכמת באמצעות ניתוח תרמוגרפי confocal שפותח. 4 המתארים הפנוטיפיים המשמשים לקלט באלגוריתם למידת מכונה (טבלה 1) מוצגים באות 4.

המרחק הראוותני מייצג את המרחק בμm בין מחסום אנדותל וכל מיקום תא סרטני בשבב μmBBN(איור 4A). מחסום ה אנדותל ממוקם ב- 0 μm. מרחקים <0 μm מייצגים תאים סרטניים שנותרו בתא הזרימה. מרחקים >0 μm מצביעים על תאים סרטניים כי יש אקסטרים דרך מחסום אנדותל ונכנסו לחלל נישה במוח. לאחר יום אחד של חשיפה לμmBBN הן MDA-MB-231-BR-GFP ו MDA-MB-231-GFP היו ממוקמים בתוך מחסום אנדותל. עם זאת, לאחר 2 ו 9 ימים של אינטראקציה קבוצת משנה של MDA-MB-231-BR-GFP היגר >100 μm לתוך נישת המוח האסטרוציטי, ואילו תאי MDA-MB-231-GFP ההורים נשארו בקרבת מחסום אנדותל. פתרנו את תנוחות התא הסרטני במחסום אנדותל / ממשק נישה במוח על ידי חישוב הנפח של כל תא סרטני שעבר דרך מחסום אנדותל. האחוז שנוצר מייצג תא סרטניים מתפשט על ידי נפח(איור 4B). 0% מתפשט על ידי נפח התא מצביע על תאים סרטניים שנשארים על גבי מחסום אנדותל, החל 100% כאשר תא סרטני יש אקסטרוסטרציה לחלוטין דרך מחסום אנדותל ושוכן בחלל נישה במוח. תאי MDA-MB-231-GFP הורים בתחילה אינטראקציה עם מחסום אנדותל לאחר יום אחד של חשיפה לשבב μmBBN שהיו <50% מנופח על ידי נפח. ב 2, ו 9 ימים תאי MDA-MB-231-GFP לשמור על חלק ניכר של תאים שנותרו על גבי המחסום הרחק ממרחב נישת המוח. תאי MDA-MB-231-BR-GFP שמרו על חלק מהתאים שהיו >100% מנוהרים, במיוחד בנקודת הזמן של יומיים.

צורת התא הסרטני השתנה באופן דרמטי במהלך החשיפה μmBBN. תמונות מייצגות של התאים הסרטניים בכל נקודת זמן מתוארות איור 4C. כימות מורפולוגית של צורת התא הסרטני חושבה באמצעות כדוריות, המיינות את נפח התא ואת שטח הפנים(איור 4D). מדד הכדורית נע בין 0 ל-1, כאשר 1 מייצג כדור מושלם. שני תאי MDA-MB-231-BR-GFP ו-MDA-MB-231-GFP היו כדוריים מאוד 1 יום פוסט זריעה לתוך שבב μmBBN. לאחר 2- ו 9 ימים של אינטראקציה בשבב μmBBN, שני קווי תאים סרטניים במגמה להקטין את הכדורי שלהם בצורה, אם כי בשיעורים שונים. בנוסף לצורת התא הסרטני, הנפח voxels של כל תא סרטני הוא גם מכמת באמצעות ניתוח טומוגרפי confocal. כל קו תא סרטני היה מרובד לשתי קבוצות באיור 4E-F: "החוצה", המייצג את התאים הסרטניים שעברו דרך מחסום אנדותל (>90% מתפשט דרך המחסום) ו "פנימה", האוכלוסייה של תאים אינטראקציה עם מחסום אנדותל אבל לא מתפשט דרך (<90% אקסטרוסטר). תת-אוכלוסיות התאים הסרטניים שהתקרבו לנישה האסטרוציטית היו קטנות יותר בגודלן בהשוואה לתאים הסרטניים שנותרו באינטראקציה עם מחסום האנטותל אך לא התעזרו במלואם עד למוח.

MDA-MB-231-BR-GFP המחפשים את המוח חשפו דפוס פנוטיפי בשבבי μmBBN השונים MDA-MB-231-GFP ההורים שניתן לנצל כדי להבדיל בין מוח גרורתי ותאים סרטניים גרורתיים שאינם מוח באמצעות למידת מכונה. הנתונים הופרדו באופן אקראי לקביעות נתונים של הדרכה ואימות כדי לאמן את המודל ולבצע בדיקות אימות. כדי לאמן את המודל, נעשה שימוש בסך הכל ב-38,859 תאים לאחר סינון הנתונים והמודל נבדק מול 9,714 תאים בודדים. המודל המאומן הוחל על קווי התא הסרטני ותאים סרטניים שנוצרו PDX שנותחו שבבי μmBBN אסטרוציטים (4 מבודד מ גרורות מוח המטופל של מגוון סוגי גידולים ראשוניים, ו 1 גידול עיקרי בסרטן השד) כדי ליצור מדד של הסתברות גרורתית במוח(איור 5). שמונה שיטות שונות לסווג למידת מכונה נבדקו: מפרץ נאיבי, יער אקראי, עץ החלטה,k-השכן הקרוב ביותר(kNN), ירידה הדרגתית סטוכסטית, רשת עצבית, ו Adaboost. התוצאה של כל שיטה מוצגת בטבלה 2. רשת עצבית ו-Adaboost היו 2 שיטות הסיווג עם הביצועים הטובים ביותר המומלצות לשימוש עם נתונים שנוצרו באמצעות פלטפורמת μmBBN עם AUC של 0.920 ו- 0.928, בהתאמה. יתר על כן, הם הראו דיוק של 0.833 ו 0.853. ממוצע הדיוק וההיזכרות (F1) עבור השיטות של הרשת העצבית ו-Adaboost היה 0.847 ו-0.860. מעבודה קודמת שבה יישם גישה זו לדגימות PDX של גידול בשד לא גרורתי ודגימות גרורתיות ידועות (שד, ריאה, שחלות, לשון) מצאנו כי אותה גישה החלה על דגימות PDX אפשרה זיהוי מדויק של התאים גרורתיים מאלה שאינם גרורתיים. טבלה 2 מציגה את התוצאות עבור כל אלגוריתם למידת מכונה המוחל על נתוני PDX שבהם אותן שיטות הוכחו כחזקות ביותר (רשת עצבית ו-Adaboost (יער אקראי). מתוך 143 התאים המשמשים בבדיקות שנקבעו לדגימות PDX, 71 היו לא גרורתיים, 46 היו שד גרורתי, 11 היו לשון גרורתית, 13 היו ריאה גרורתית ו-2 היו שחלות גרורתיות. כל סוג תא הפיק דיוק כולל של 0.88 אבל הפרט היה הדיוק המשוער הבא: שד לא גרורתי: 0.96, שד גרורתי: 0.80, לשון גרורתית: 0.80, ריאה גרורתית: 0.92, שחלה גרורתית: 1.0

Figure 1
איור 1: זרימת עבודה ניסיונית. (א)ייצוג סכמטי של תהליך הרכבת התקן מיקרופלוייד. טווה משמש להפקדת סרט דק של PDMS:toluene דבק על שקופית זכוכית 50 מ"מ x 75 מ"מ. כל חצי של המכשיר μmBBN הוא מוטבע בצד ערוץ מול הדבק ולאחר מכן מורכב עם קרום פוליקרבונט (5 μm נקבוביות) בין חלקי המכשיר μmBBN. התקני μmBBN ממוקמים בתנור 37 °C במשך 24 שעות כדי לרפא את הדבק. לאחר מכן, המכשירים מיובשים בתייבשות ואקום לפחות 48 שעות לפני השימוש הניסיוני. התקן μmBBN ושקופית זכוכית 50 מ"מ x 75 מ"מ מופעלים עם טיפול פלזמה ומחוברים יחד. פיפטות P200 סטנדרטיות חתוכות בטיפים מוכנסות לכל הכניסות והשקעים של התקן μmBBN. התקן μmBBN שהושלם לאחר מכן מעוטא על ידי טיפול פלזמה 8 דקות (200 W) ולאחר מכן מועבר למכל משני סטרילי. (ב)סקירה סכמטית של ניצול פיגומים מכשיר microfluidic כדי ליצור מחסום מוח דם סלולרי ומיקרו-סביבה נישה המוח. בתוך ארון בתחום ההסבה הביולוגית, תערובת של אסטרוזיטים קולגן נזרעים לתוך תא התקן μmBBN התחתון ומותר להתגבש במשך 1 שעה ב 37 ° C. Matrigel משמש כדי לכסות את הממברנה דרך תא הזרימה העליון במשך 1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן תאי אנדותל נזרעים לקצה אחד של התא העליון ומותר לזרום ולהסתפק במשך 15 דקות. זריעה זו חוזרת על x4, צדדים לסירוגין של תא הזרימה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: סקירה כללית של ניתוח רמוגרפי קונפוקל. התוכנה מתחילה על ידי המרת תמונה Z-stack מיקרוסקופית לתוך מודל תלת-מיו של התאים באמצעות פילוח ו- 3D רשתות שינוי. לאחר מכן התוכנית מחשבת את המיקום המרכזי של כל תא (centroid) ומתאימה מישור למחסום ה אנדותל. מדידות פנוטיפיות של כל תא בודד הן לאחר מכן tabulated. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: כיסוי מחסום אנדותל והתאינות מטוס. (א)תרשים מייצג ותמונה של התקן μmBBN. הקו הלבן המקומק בתוך תרשים התצוגה העליונה מציין את האזור של ההתקן המיוצג בתצוגה חוצת המקטעים. (ב)השוואה של כיסוי אנדותל גבוה ונמוך של מכשירי μmBBN לפני היישום של תאים סרטניים. בדיקת T דו-מדגם של שני מדגם, *** p < 0.1*10-4. (ג)תמונה מייצגת של כיסוי אנדותל גבוה. התיבה הלבנה המקומקת בתוך השרטוט ההתקני של התקן μmBBN מציינת את המיקום של תאי הא אנדותל בתוך ההתקן. קנה מידה של תמונות מבט כוללות ו- inset = 200 μm. (D) תמונה מייצגת של כיסוי אנדותל נמוך. קנה מידה של תמונות מבט כוללות ו- inset = 200 μm. (E) התאמת מישור לדוגמה של מחסום אנדותל שטוח. המלבן הירוק מייצג את המיקום של מישור אנדותל. נקודות מייצגות תאים אנדותל יחיד המרכיבים את המחסום. נקודות צהובות הן תאים אנדותל מעל המטוס, ונקודות סגולות הן תאים שנופלים מתחת למטוס. תאים אנדותל מעל המטוס (נקודות צהובות) להפגין נטייה לגדול את הקירות הצדדיים ואת החלק העליון של המכשיר כדי ליצור צינור. (F)התאמת מישור לדוגמה של התקן μmBBN עם מישור מעוקל. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: כימות פנוטיפים תאיים של פנוטיפים של תאי מוח-גרורתיים והורים בשבבים מיקרו-נוזלים של נישת דם אסטרוקיטים. (A)רצועת מגרש של מרחק μm של תאים סרטניים ממחסום אנדותל ב 1, 2, ו 9-ימים. הקו השחור המנומק ב- 0 μm מייצג את מחסום ה אנדותל. תיבות אדומות מצביעות על קבוצת משנה של תאי MDA-MB-231-BR-GFP שהיגרו הרחק לתוך נישת המוח. (ב)עלילת כינור של הנפח הכולל אחוז של תאים סרטניים מתפשט דרך מחסום אנדותל ב 1, 2, ו 9 ימים. קווים מקווקו קצרים מייצגים קווים, קו מקווקו ארוך יותר מייצג את ממוצע. (ג)תמונות מייצגות של מורפולוגיה של תאים סרטניים במכשיר μmBBN. סרגל קנה מידה = 25 μm. (D) כינור עלילת של הכדורית של תאים סרטניים בהתקן μmBBN ב 1, 2, ו 9 ימים. הכדורית נעה בין 1: כדורי ל- 0: לא כדורי. (ה)חלקת תיבה של אמצעי אחסון של תא MDA-MB-231-GFP בהתקן μmBBN ב- voxels עבור תאים נחים מחוץ למחסום אנדותל (החוצה) ותאים שהתקדמו דרך המחסום (פנימה). (F) חלקת תיבה של אמצעי אחסון תא MDA-MB-231-BR-GFP בהתקן μmBBN ב- voxels עבור תאים נחים מחוץ למחסום אנדותל (החוצה) ותאים שהתקרבו דרך המחסום (פנימה). התיבה מציגה את הקווים והשפם להרחיב כדי להראות את חלקו של טווח interquartile בעבר המריבות נמוכות וגבה. Pairwise וילקוקסון ראנק סאם ו Kruskal-Wallis עם השוואות מרובות של דאן, *** p < 0.1 *10-4. שוחזר מתוךהתייחסות 24 באישור האגודה המלכותית לכימיה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: תוצאות מייצגות של סיווג למידת מכונה של תאים סרטניים. (א)סקירה כללית של למידת מכונה. מדגים תהליך של פיצול נתונים שנאספו טומוגרפיה קונפוקלית, סינון הנתונים, הכשרת אלגוריתם למידת מכונה באמצעות אימות פי 10 ולאחר מכן בדיקת המודל מול מדגם אקראי של 20% מהנתונים שהוסמך. לאחר מכן ניתן להחיל את המודל הנבחר על נתונים חדשים כדי לאסוף את האינדקס גרורתי של תאים בודדים. (ב)עקומות ROC המציגות את הביצועים של 8 אלגוריתמים שונים של למידת מכונה עבור MDA-231-BR-GFP ותרבות תאי MDA-231-GFP עבור 1, 2 ו-9 ימים לפני ההדמיה. זהו נציג של סוג העקומה שיש לנתח כדי להבין את הביצועים של המודל המאומן. (C) עקומות ROC עבור 8 אלגוריתמים שונים למידת מכונה מוחל על המטופל נגזר xenograft (PDX) תאים תברואתיים תרבותיים במשך 2 ימים. זהו נציג של סוג העקומה שיש לנתח כדי להבין את הביצועים של המודל המאומן. שוחזר מתוךהתייחסות 24 באישור האגודה המלכותית לכימיה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

תכונה מתאר
תא גידול % אקסטרוסטרציה לתוך הנישה
תא גידול אמצעי אחסון
תא גידול כדוריות (כדוריות)
תא גידול מרחק רב-ערך
תא גידול העברת תא חי 2D
מיקרו-גרורות נקבוביות (נקבוביות)
מיקרו-גרורות אינטראקציה סטרומה
מיקרו-גרורות גיל
מיקרו-גרורות קצב צמיחה
תא סטרומה אמצעי אחסון
תא סטרומה מרחק מתאי סרטן סמוכים
תא סטרומה מרחק ממחסום אנדותל
תא סטרומה צורה

טבלה 1: רשימת מתארים לפי סוג תכונה. האפיון הפנוטיפי של תאים סרטניים מיוצג באמצעות פאנל של מתארים. התיבה האדומה מציינת את המתארים ששימשו לחיזוי הסתברות גרורתית במוח באמצעות למידת מכונה.

תאים סרטניים
שיטת אוניברסיטת קליפורניה (UC) דיוק F1 (1)
רשת עצבית 0.925 0.84 0.847
הדס הדסה 0.928 0.853 0.86
יער אקראי 0.925 0.849 0.855
עץ החלטות 0.898 0.817 0.827
ת"א 35 0.775 0.702 0.718
רגרסיה לוגיסטית 0.769 0.735 0.751
ביילס הנאיבית 0.745 0.715 0.73
SGD (1200) 0.73 0.73 0.737
PDX תאים סרטניים
שיטת אוניברסיטת קליפורניה (UC) Ca F1 (1)
רשת עצבית 0.972 0.881 0.878
יער אקראי 0.964 0.888 0.887
הדס הדסה 0.957 0.881 0.879
עץ 0.954 0.867 0.865
רגרסיה לוגיסטית 0.897 0.832 0.831
ביילס הנאיבית 0.896 0.846 0.849
ת"א 35 0.882 0.818 0.814
SGD (1200) 0.861 0.86 0.853

טבלה 2: השוואה של שיטות למידת מכונה כדי לסווג תאים סרטניים ותאים סרטניים PDX על ידי פוטנציאל גרורתי במוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פיתחנו והציגנו שיטה חדשה המתאימה כלים מנוצלים לעתים קרובות בניתוחי הדמיה קלינית למדידת אקסטרווסטרציה והגירה של תאים סרטניים באמצעות מחסום אנדותל לתוך רקמת המוח. אנו מציבים גישה זו יכולה להיות שימושית הן בvio והן במדידות במבחנה; הוכחנו את השימוש בו על מערכת מיקרו-נוזלית תלת-מיודמת המשנה את כלי הדם במוח. מדידות תאים סרטניים כולל מרחק מתפשט, אחוזים מתפשטים על ידי נפח, כדוריות, ונפח מכמתים באמצעות טכניקה זו. מרחק מתפשט אחוזים מתפשטים על ידי נפח לאפשר למשתמש לשחזר את המיקום של התאים הסרטניים בתוך השבב כדי להעריך את ההתרעה על פני המחסום והגירה בתוך הרקמה. מדידות צורת תא כגון כדוריות ונפחי אחסון קשורים לתנועות הדינמיות או לפונקציה של התא בכל נקודת זמן. תאי MDA-MB-231-BR-GFP נודדים מציגים רמה גבוהה של כדוריות כאשר בתחילה הוכנסו להתקן μmBBN והפכו פחות כדוריים בצורתם כאשר הם מקטין את תנועתם ומתחילים ליישב את הנישה. נפח התא הכולל של MDA-MB-231-GFP ו- MDA-MB-231-BR-GFP שונה בשל ההבדל בצורת קווי התא. תאים סרטניים חוצים את מחסום אנדותל מגולגלים יותר מאשר התאים שלא חוצים דרך המחסום, ולכן תאים עגולים קטנים יותר עשויים להיות מסוגלים להגיע באופן יעיל יותר על פני שכבת אנדותל.

שני שלבים קריטיים קיימים בפרוטוקול המקלים על הצלחה. הראשון מתרחש במהלך ההרכבה של התקן μmBBN חלקים עליון ותחתון המופרדים על ידי קרום נקבובי. יש להזדווג בחלקי המכשיר העליונים והתונים כך שהפרצי ים והשקעים חופפים אך אינם חסונים על ידי הממברנה שבאמצע כדי לקדם זרימה נכונה. כל התקני μmBBN עם הזדווגות לקויה של חלקי המכשיר העליון והתחתון או יישור קרום נמחקים כדי למזער תנודות באיכות. האפייה הבאה כדי לרפא את PDMS:דבק טולואן להרכיב את המכשיר הוא קריטי לבצע ב 37 מעלות צלזיוס כדי לייצר התקני μmBBN עם קרום שטוח. טמפרטורות אפייה העולות על 37 °C נוטות לייצר מכשירים עם קרום מעוקל שמקשה על ניתוח תמונה, במיוחד בעת התאמת מישור למחסום ה אנדותל. השלב הקריטי השני מתרחש במהלך זריעת מחסום ה אנדותל. זריעה צריכה להתרחש במרווחי זמן של 15 דקות לפחות בין שתי ההפרצונים המזינות את החלק העליון של ההתקן כדי להבטיח הפצה אקראית של תאי אנדותל על קרום ההתקן. זריעת תערובת הקולגן המכילה אסטרוזיטים לתוך השבב עשויה לדרוש פתרון בעיות ושינוי בפרוטוקול הספציפי למעבדה. אם משטח הממברנה של המכשיר אינו הידרופובי, הקולגן ימלא הן את החלק התחתון והן את החלקים העליונים של ההתקן ויגדיר כך שהוא סותם את כל הזרימה דרך החלק העליון של המכשיר. מטרת הטיפול הסופי בגז הפלזמה היא להפוך את המכשיר פני השטח הידרופובי. במקרה זה, אנו ממליצים על התאמה של טיפול גז פלזמה של המכשיר כדי להגביר את ההידרופוביות.

ראינו כמה מגבלות עם גישה זו. לדוגמה, הגישה המשמשת ל לגרום לפלואורסצנטיות של תאים יכולה להשפיע על איכות ההדמיה. בעת שימוש בצבעי מעקב אחר תאים חיים, תבנית הפלורסנט עשויה מכתמים קטנים, בעוד ביטוי טרנס-נגוע או טרנס-מושרה של פלואורופורים מייצר תבנית אחידה. התבנית המנומקת דורשת קיבוץ באשכולות נוספים ולעתים מועדים לשגיאות של פיקסלים. בנוסף, הרגישות של המדידה תלויה בטיפול שננקט במהלך ההדמיה. תמונות ברזולוציה גבוהה יותר ופרוסות z נוספות משפרות את הרזולוציה, אך גם לוקח יותר זמן לתמונה ולנתח. תאים הנוגעים זה לזה יכולים גם להיות מנותחים באופן שגוי כתא יחיד גדול. זוהי בעיה עבור מערכות הדמיה אוטומטיות רבות, אך ניתן לטפל בה בשתי דרכים. הראשון הוא שלשכבת ה אנדותל יש תאים רבים שנוגעים בהם, אבל לשילוב שלהם יש השפעה זניחה על המיקום הסופי של המטוס החותך. השני הוא מספר התאים הסרטניים הוא נמוך מספיק כי זה נדיר שהם נוגעים. שגיאות שהוכנסו בעת התאמת המטוס עלולות להתרחש מכמה סיבות. הראשון הוא כי כמה תאים אנדותל אולי נדדו מן הממברנה המרכזית במהלך תרבות התא. הדבר עלול לגרום לתאי אנדותל לכסות את כל הערוץ או לפלוש לחלל מלא הקולגן, ובכך להטות את המדידה. מקור נוסף של שגיאה הוא, באופן פרדוקסלי, התאמה ידנית של המטוס כדי לתקן את השגיאה הקודמת. עם זאת, מחקרי חזרה ושחזור מצאו כי יש השפעה מינימלית. לבסוף, הבחנו כי בנסיבות מסוימות החיתוך הבוליאני של רשת התא עלול להיכשל או האלגוריתם כדי לסגור את רשת החיתוך עלול גם להיכשל. הטכניקות המשמשות כאן הן "המדינה של האמנות" הנוכחית, ובעיות אלה מטופלות כיום על ידי מדענים אלגוריתמיים.

התוצאות מהכשרת אלגוריתמים למידת מכונה (AI) נגד נתונים שנאספו על ידי טומוגרפיה confocal של μmBBN להוכיח כי המספר הרב של תאים בודדים שנותחו על ידי גישה זו עשוי לעזור לטפל בבעיות של לכידת הטרוגניות נמצא בתאים סרטניים. AUC גדול מ- 0.9 נחשב מסווג בעל ביצועים גבוהים. כאן הפכחנו AUC של 0.928. אנו צופים כי ככל שהשיטה תשתפר עם הביצועים תמשיך לגדול. כמו בכל שיטות הבינה המלאכותית, יש לנקוט זהירות כדי לבחור בקפידה את נתוני האימון, כך שהיא מייצגת באופן נרחב את סוג הנתונים הצפויים להיבדק מולם. מסיבה זו, אנו עשויים לצפות כי הביצועים יהיה לבזות, אם המודל הוחל ישירות על דגימות המטופל למשל מבלי לחשוף תחילה את המודל לאוסף חזק של דגימות המטופל. אנו מדגימים זאת כאן במידה מסוימת על ידי הכללת 1-יום, 2-יום, ו 9-יום מדידות עבור התאים הסרטניים במודל לעומת 2-יום המשמש לעבודה הקודמת. אנו צופים כי הדגימה הרחבה מפחיתה מעט את ביצועי הדגם ומראה עד כמה רגישים חלק משיטות הביצועים הגרועות יותר, ובכך מצביעים על כך שמשתמשים עשויים לרצות לבדוק מספר דגמים בנתונים שלהם. טבלה 2 המתארת את תוצאות PDX מציגה ביצועים טובים הכוללים. עם זאת, סוגי PDX בודדים מוכיחים כי חלקם של התאים הנמדדים מכל מדגם שונה עשוי להשפיע על הביצועים עבור כל אתר מקור. לדוגמה, דגימת השחלות הפיקה רק שני תאים עבור סט הבדיקה. לעומת זאת, סרטן שד גרורתי אשר היה אוכלוסייה גדולה יותר. סט נתונים זה נועד להוכיח כי התאים לשרוד בנישה וניתן לנתח, אבל גם מדגיש טיפול פרשני נדרש. שינויים במשתנה היעד עשויים גם להנחות חוקרים בזיהוי שיבוטים תת עם תכונות אחרות כגון אינטראקציות עם תאים סטרומה או התנהגות הרהוד.

גישה זו חשובה ככל שיותר מעבדות יאמצו מערכות קרום על שבב כגון מחסום דם במוח על שבב, ריאה על שבב ובטן עלשבב 11,42. רוב השבבים האלה מורכבים כך קרום מקביל עם מערכת ההדמיה, אשר עד כה זה אומר שזה יהיה קשה למדוד מתי וכמה תאים עברו מצד אחד של הממברנהל 15 האחר,28. יתר על כן, בהשוואה שבבים אופקית מונחה, שבבים מונחה אנכית לספק אזור קרום הרבה יותר גדול הגדלת הטווח הדינמי של הניסוי. בנוסף, מכיוון שהכיוון של הממברנה אינו קריטי עבור טכניקת ניתוח זו, טומוגרפיה קונפוקלית עלולה לאפשר ניסויים חדשים במבחנה. לדוגמה, הדמיה של הפזרנות של תאים סרטניים השד מ כרית שומן murine לתוך זרם הדם יהיה נגיש על ידי שיטות אלה. זה יכול לעזור לחוקרים לזהות כיצד התאים הסרטניים לחקור את הממשק בין השד ECM וכלי.

לסיכום, הציגנו מתודולוגיה לבניית מכשיר מיקרו-נוזל תלת-מימד המחבר את נישת מוח הדם ומדגים כיצד להשתמש בטומוגרפיה קונפוקלית ולמידת מכונה לניתוח. באמצעות פלטפורמה זו, זיהינו את מאפייני תא סרטני גרורתי במוח המבדילים בין גרורתי במוח ותאים סרטניים PDX גרורתי בהתבסס על התנהגותם בתוך המכשיר μmBBN. עבודה עתידית תשפר את הישימות הקלינית של פלטפורמה זו כאבחון לחיזוי גרורות במוח. אנו מאמינים כי לאחר שהציגפלטפורמה זו יהיה שימושי ומעניין מעבדות אשר צריך למדוד תאים מכל סוג נודד או מתפשט על פני קרום. זה הוא בעל חשיבות כמו מודלים פרה-קליניים של הגידול מיקרו-סביבה להיות יותר ויותר מתוחכם כך חייב ההנדסה של הדגמים ותוכנות תמיכה. כדי לסייע בניתוח חזק של הנתונים שארזנו כלי זה כפשוט לשימוש, מחברת פיתון משותפת עם הוראות התקנה30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין גילויים להצהיר.

Acknowledgments

אנו מודים למעבדת סטיג, במכון הלאומי לסרטן על תרומתם הנדיבה של תאי MDA-MB-231-BR-GFP. מיקרוסקופית Confocal בוצע המכון הביו-פנים של אוניברסיטת מישיגן (BI). ציתימטריית זרימה בוצעה באוניברסיטת מישיגן זרימה Cytometry Core. וקטורים ויראליים נוצרו על ידי אוניברסיטת מישיגן וקטור Core. אנו גם מודים לקלי קידוול על ההדרכה בניתוח סטטיסטי של נתונים אלה.

מימון:

C.R.O. נתמך חלקית על ידי מלגת הדרכה NIH T-32 (T32CA009676) ו 1R21CA245597-01. T.M.W. נתמך חלקית על ידי 1R21CA245597-01 והמרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר UL1TR002240. מימון חומרים ואפיון סופק על ידי המכון הלאומי לסרטן של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, קרן METAvivor, והקרן לחקר סרטן השד. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים ואינו מייצג בהכרח את השקפותיהם הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA with phenol red Thermo Fisher Scientific 25200056
1.5 mm biopsy punch with plunger Integra LifeSciences Corporation 33-31A-P/25
10x MEM Thermo Fisher Scientific 11430030
150 mm petri dishes Fisher Scientific FB0875714
1x DPBS, without Ca and Mg Thermo Fisher Scientific 14190144
200uL pipette tip Fisher Scientific 02-707-411
4 inch silicon wafer University Wafer 452
48 mm wide packing tape Fisher Scientific 19-072-097
50 x 75 mm glass slide Fisher Scientific 12-550C
A1 confocal microscope Nikon
acetone Fisher Scientific A9-20
antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin) Gibco 15240062
box cutter blade Fisher Scientific NC1721575
dissection scissors Fisher Scientific 08-951-5
DMEM with 4.5 g/L glucose Thermo Fisher Scientific 11960-044
double sided tape Fisher Scientific NC0879005
EGM-2 Lonza CC-3162
Fetal Bovine Serum, Heat inactivated Corning MT35011CV
Fiji software ImageJ
glass vial Fisher Scientific 03-341-25D
glutamax Thermo Fisher Scientific 35050061
hCMEC/D3 EMD Millipore SCC066
Jupyter notebook Anaconda
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081
Matrigel - growth factor reduced with phenol red Corning CB-40230A
MDA-MB-231 ATCC HTB-26
MDA-MB-231-BR-GFP Dr. Patricia Steeg, NIH
N-2 growth supplement Thermo Fisher Scientific 17502048
normal human astrocytes (NHA) Lonza CC-2565
Orange software University of Ljubljana
Pasteur pipette Fisher Scientific 13-711-9AM
Photolithography masks Photosciences Incorporated
pLL3.7-dsRed University of Michigan Vector Core
pLL-EV-GFP University of Michigan Vector Core
pLOX-TERT-iresTK Addgene 12245
pMD2.G Addgene 12259
polycarbonate membrane, 5um pore size Millipore TMTP04700
psPAX2 Addgene 12260
PureCol, 3 mg/mL Advanced Biomatrix 5005 Type I bovine collagen
sodium bicarbonate Thermo Fisher Scientific 25080094
sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360070
Solo cup Fisher Scientific NC1416545
SU-8 2075 MicroChem Corporation Y111074 0500L1GL
SU8 developer MicroChem Corporation Y020100 4000L1PE
Sylgard 184 Ellsworth Adhesive Company NC0162601
Toluene Sigma-Aldrich 179965-1L
Tricholoro perfluoro octyl silane Sigma-Aldrich 448931-10G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rastogi, K., et al. Palliation of Brain Metastases: Analysis of Prognostic Factors Affecting Overall Survival. Indian Journal of Palliative Care. 24 (3), 308-312 (2018).
  2. Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
  3. Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
  4. Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
  5. Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
  6. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. 294, 15-22 (2005).
  7. Poissonnier, A., Legembre, P. Boyden Chamber Assay to Study of Cell Migration Induced by Metalloprotease Cleaved-CD95L. Methods in Molecular Biology. 1557, 117-123 (2017).
  8. Li, X., Yang, H., Huang, H., Zhu, T. CELLCOUNTER: novel open-source software for counting cell migration and invasion in vitro. BioMed Research International. 2014, 863564 (2014).
  9. Little, A. C., et al. IL-4/IL-13 Stimulated Macrophages Enhance Breast Cancer Invasion Via Rho-GTPase Regulation of Synergistic VEGF/CCL-18 Signaling. Frontiers in Oncology. 9, 456 (2019).
  10. Allen, S. G., et al. Macrophages Enhance Migration in Inflammatory Breast Cancer Cells via RhoC GTPase Signaling. Scientific Reports. 6, 39190 (2016).
  11. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  12. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  13. Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
  14. Choi, Y. P., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
  15. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. Journal of Neuroscience Methods. 232, 165-172 (2014).
  16. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
  17. Schroeder, W., Martin, K., Lorenson, B. The Visualization Toolkit. 4th edn. , Kitware. (2006).
  18. Wells, W. M., Grimson, W. L., Kikinis, R., Jolesz, F. A. Adaptive segmentation of MRI data. IEEE Transactions on Medical Imaging. 15 (4), 429-442 (1996).
  19. Agarwal, S. K., Singh, S., Ghuman, S. S., Sharma, S., Lahiri, A. K. Radiological assessment of the Indian children with congenital sensorineural hearing loss. International Journal of Otolaryngology. 2014, 808759 (2014).
  20. Mansfield, P., Maudsley, A. A. Medical imaging by NMR. The British Journal of Radiology. 50 (591), 188-194 (1977).
  21. Plewes, D. B., Kucharczyk, W. Physics of MRI: a primer. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 35 (5), 1038-1054 (2012).
  22. Batteux, C., Haidar, M. A., Bonnet, D. 3D-Printed Models for Surgical Planning in Complex Congenital Heart Diseases: A Systematic Review. Frontiers in Pediatrics. 7, 23 (2019).
  23. Thibault, F., et al. MRI for surgical planning in patients with breast cancer who undergo preoperative chemotherapy. American Journal of Roentgenology. 183 (4), 1159-1168 (2004).
  24. Oliver, C. R., et al. A platform for artificial intelligence based identification of the extravasation potential of cancer cells into the brain metastatic niche. Lab on a Chip. 19 (7), 1162-1173 (2019).
  25. Gril, B., et al. Reactive astrocytic S1P3 signaling modulates the blood-tumor barrier in brain metastases. Nature Communications. 9 (1), 2705 (2018).
  26. Badilescu, S., Packirisamy, M. BioMEMS: Science And Engineering Perspectives. , Taylor & Francis/CRC Press. (2011).
  27. Liu, C. Foundations of MEMS. 2nd edn. , Prentice Hall. (2012).
  28. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab on a Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  29. Lockman, P. R., et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (23), 5664-5678 (2010).
  30. Ryan Oliver, C., W, T. M. Con-tom: A Jupyter Notebook for Analyzing the tumor micro-environment in confocal images. Zenodo. , Version 0.8, 3825719 (2020).
  31. Lorensen, W. E., Johnson, C., Kasik, D., Whitton, M. C. History of the Marching Cubes Algorithm. IEEE Computer Graphics and Applications. 40 (2), 8-15 (2020).
  32. Kleinbaum, D. G., Kupper, L. L. Applied regression analysis and other multivariable methods. , Duxbury Press. (1978).
  33. Berg, M. d Computational geometry : algorithms and applications, 2nd rev. edn. , Springer. (2000).
  34. Esch, M. B., Post, D. J., Shuler, M. L., Stokol, T. Characterization of in vitro endothelial linings grown within microfluidic channels. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2965-2971 (2011).
  35. Brinkley, B. R., et al. Variations in cell form and cytoskeleton in human breast carcinoma cells in vitro. Cancer Research. 40 (9), 3118-3129 (1980).
  36. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 33 (2013).
  37. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  38. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 16 (2013).
  39. Dello Russo, C., et al. The human microglial HMC3 cell line: where do we stand? A systematic literature review. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 259 (2018).
  40. Dun, M. D., et al. Proteotranscriptomic Profiling of 231-BR Breast Cancer Cells: Identification of Potential Biomarkers and Therapeutic Targets for Brain Metastasis. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2316-2330 (2015).
  41. Xing, F., et al. Reactive astrocytes promote the metastatic growth of breast cancer stem-like cells by activating Notch signalling in brain. EMBO Molecular Medicine. 5 (3), 384-396 (2013).
  42. Zhang, B., Radisic, M. Organ-on-a-chip devices advance to market. Lab on a Chip. 17 (14), 2395-2420 (2017).

Tags

חקר הסרטן גיליון 162 גידול מיקרו-סביבה סרטן איבר על שבב למידת מכונה בינה מלאכותית מיקרוסקופית confocal תרבות תאים לטווח ארוך
כימות המיקרו-סביבה של גידול גרורתי במוח באמצעות דגם תלת-מימד של שבב איבר-און-איי, למידת מכונה וטומוגרפיה קונפוקלית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oliver, C. R., Westerhof, T. M.,… More

Oliver, C. R., Westerhof, T. M., Castro, M. G., Merajver, S. D. Quantifying the Brain Metastatic Tumor Micro-Environment using an Organ-On-A Chip 3D Model, Machine Learning, and Confocal Tomography. J. Vis. Exp. (162), e61654, doi:10.3791/61654 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter